Xác định đồng thời ba bufadieolid trong một số mẫu phẩm từ cóc bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép nối khối phổ hai lần (lc ms

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH

LÊ THỊ THU HÀ

XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI BA BUFADIEOLID TRONG
MỘT SỐ MẪU PHẨM TỪ CÓC BẰNG PHƢƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG GHÉP NỐI KHỐI PHỔ HAI LẦN
(LC –MS/MS)

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

NGHỆ AN - 2014


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH

LÊ THỊ THU HÀ

XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI BA BUFADIEOLID TRONG
MỘT SỐ MẪU PHẨM TỪ CÓC BẰNG PHƢƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG GHÉP NỐI KHỐI PHỔ HAI LẦN
(LC –MS/MS)

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 60.44.01.18

Người hướng dẫn khoa học:

TS. NGUYỄN TRUNG DŨNG

NGHỆ AN - 2014


LỜI CẢM ƠN
Bản luận văn này được thực hiện tại Viện kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh
Thực phẩm Quốc gia, 48B Tăng Bạt Hổ, Hai Bà Trưng, Hà Nội và hoàn thành
tại trường Đại học Vinh với sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Trung Dũng. Tơi xin
bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới:
TS. Nguyễn Trung Dũng, Bộ môn Kỹ thuật Mơi trường, Khoa Hóa Lý
kỹ thuật, Học viện Kỹ thuật Quân sự đã giao đề tài cũng như hết lịng hướng
dẫn, chỉ bảo tận tình, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm q báu cho tơi trong
suốt q trình thực hiện bản luận văn.
PGS.TS Nguyễn Hoa Du và PGS.TS Trần Đình Thắng đã dành nhiều
thời gian đọc và viết nhận xét cho luận văn.
Ban lãnh đạo Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh Thực phẩm Quốc Gia
đã tạo điều kiện thuận lợi cho tơi học tập và hồn thành đề tài này.
Ths. Trần Cao Sơn, CN. Đỗ Thị Thu Hằng cùng tồn thể các anh chị
trong labo Hóa đã nhiệt tình chỉ bảo, hướng dẫn, động viên tơi trong suốt q
trình làm thực nghiệm.
Các thầy, cơ giảng dạy tại khoa Hóa học, đặc biệt là các thầy cơ trong bộ
mơn Hóa Phân tích, đã cho tơi những kiến thức q giá, tạo điều kiện cho tôi học
tập và nghiên cứu trong môi trường khoa học, hiện đại.
Và cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã quan tâm
động viên tơi trong q trình học tập và thực hiện luận văn.
Vinh, tháng 10 năm 2014
Học viên

Lê Thị Thu Hà

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ......................... ................................................................................. ...1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ................................................................................ 3
1.1. Giới thiệu về bufadienolid .............................................................................. 3
1.1.1. Giới thiệu chung về họ cóc và độc tố cóc. ..................................................... 3
1.1.2. Cấu tạo và tính chất của bufalin, cinobufagin, resibufogenin . ..................... 5
1.1.3. Tác dụng và độc tính của các bufadienolid. ..................................................... 7
1.1.4. Ngộ độc do ăn cóc và các sản phẩm chế biến từ cóc ..................................... 7
1.1.5. Các sản phẩm có nguồn gốc từ cóc.................................................................. 9
1.1.6. Nghiên cứu bufadienolid trong nước .............................................................. 10
1.2 Các phương pháp xác định bufadienolid ...................................................... 11
1.3. Phương pháp LC - MS/MS ........................................................................... 24
1.3.1. Nguyên lý hoạt động......................................................................................... 24
1.3.2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)................................................................. 25
1.3.3. Khối phổ (Mass Spectrometry - MS) ......................................................... 26
1.4. Phương pháp chiết pha rắn ............................................................................ 33
1.5. Đánh giá phương pháp phân tích .................................................................. 35
CHƢƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................ 39
2.1. Đối tượng, mục tiêu, nội dung và phương pháp nghiên cứu. ....................... 39
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu................................................................................. 39
2.1.2. Mục tiêu nghiên cứu................................................................................... 39
2.1.3. Nội dung nghiên cứu thực nghiệm. ............................................................ 39
2.1.4. Phương pháp nghiên cứu............................................................................ 40
2.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất ........................................................................ 43


2.2.1. Thiết bị, dụng cụ................................................................................................ 43

2.2.2. Hóa chất.............................................................................................................. 45
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................47
3.1. Thiết lập điều kiện phân tích các bufadienolid bằng LC-MS/MS ................ 47
3.1.1. Tối ưu các điều kiện detector khối phổ (MS) ................................................ 47
3.1.2. Tối ưu hóa các điều kiện chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ............ 51
3.2. Xây dựng quy trình xử lý mẫu ...................................................................... 59
3.2.1. Chọn quy trình xử lý mẫu. ............................................................................... 59
3.2.2. Khảo sát dung môi chiết ................................................................................... 61
3.2.3. Khảo sát thể tích dung mơi chiết ..................................................................... 64
3.2.4. Khảo sát cột chiết pha rắn ................................................................................ 67
3.2.5. Khảo sát dung môi rửa giải. ............................................................................. 68
3.2.6. Khảo sát thể tích dung mơi rửa giải. ............................................................... 70
3.3. Thẩm định phương pháp. .............................................................................. 74
3.3.1. Tính đặc hiệu/ chọn lọc. ................................................................................... 74
3.3.2. Xác định khoảng tuyến tính và đường chuẩn. .............................................. 76
3.3.3. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ). .......................... 79
3.3.4. Độ lặp lại và độ thu hồi .................................................................................... 80
3.4. Phân tích mẫu thực tế .................................................................................... 84
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................... 86
Kết luận ................................................................................................................ 86
Kiến nghị .............................................................................................................. 87
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 88
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Hình 1.1: Một số lồi cóc có độc trên thế giới...................................................... 4
Hình 1.2: Một số sản phẩm có nguồn gốc từ cóc ................................................. 10
Hình 1.3: Mơ hình hệ thống LC - MS/MS ............................................................ 25
Hình 1.4: Kỹ thuật APCI với chế độ bắn phá ion dương ..................................... 27

Hình 1.5: Chế độ ion hóa phun điện tử ESI .......................................................... 28
Hình 1.6: Cấu tạo của bộ phân tích khối tứ cực chập ba ................................. ....31
Hình 1.7: Các bước của quá trình chiết pha rắn.................................................... 33
Hình 2.1: Hệ thống máy LC - MS/MS............................................................... ...44
Hình 3.1: Cơ chế phân mảnh của bufalin........................................................... ...49
Hình 3.2: Sắc đồ tổng ion của mẫu chất chuẩn của ba bufadienolid 500
ng/ ml và hai ion của bufalin ................................................................ 51
Hình 3.3: Sắc đồ của ba bufadienolid khi dùng dung mơi pha động là
acid HCOOH 0,1% ............................................................................... 54
Hình 3.4: Sắc đồ của các bufadienolid ở chế độ gradient 1.................................. 56
Hình 3.5: Sắc đồ rửa giải các bufadienolid với tốc độ dịng 1 ml/ phút ............... 58
Hình 3.6: Quy trình xử lý mẫu dự kiến ................................................................. 61
Hình 3.7: Ảnh hưởng của dung môi chiết đến hiệu suất thu hồi các
bufadienolid trong mẫu bột cóc ............................................................ 63
Hình 3.8: Ảnh hưởng của dung môi chiết đến hiệu suất thu hồi các
bufadienolid trong mẫu xương cóc ....................................................... 64
Hình 3.9: Ảnh hưởng của thể tích dung mơi chiết đến hiệu suất chiết
các bufadienolid trong mẫu bột cóc ...................................................... 65
Hình 3.10: Ảnh hưởng của thể tích dung mơi chiết đến hiệu suất chiết
các bufadienolid trong mẫu xương cóc................................................ 66


Hình 3.11: Ảnh hưởng của dung mơi rửa giải đến hiệu suất thu hồi các
bufadienolid trong mẫu bột cóc ............................................................ 69
Hình 3.12: Ảnh hưởng của dung mơi rửa giải đến hiệu suất thu hồi các
bufadienolid trong mẫu xương cóc ....................................................... 70
Hình 3.13: Ảnh hưởng của thể tích dung mơi rửa giải đến suất thu hồi
các bufadienolid trong mẫu bột cóc ...................................................... 71
Hình 3.14: Ảnh hưởng của thể tích dung mơi rửa giải đến suất thu hồi
các bufadienolid trong mẫu xương cóc................................................. 72

Hình3.15: Quy trình xử lý mẫu tối ưu ................................................................... 73
Hình 3.16: Sắc đồ mẫu trắng bột cóc ...................................................................... 75
Hình 3.17: Sắc đồ mẫu trắng bột có thêm chuẩn .................................................... 75
Hình 3.18: Sắc đồ mẫu chuẩn hỗn hợp ba bufadienolid 500 ng /ml ....................... 75
Hình 3.19: Đường chuẩn của bufalin trong mẫu bột cóc ..................................... ...76
Hình 3.20: Đường chuẩn của cinobufagin trong mẫu bột cóc ............................. ...77
Hình 3.21: Đường chuẩn của resibufogenin trong mẫu bột cóc ......................... ...77
Hình 3.22: Đường chuẩn của bufalin trong mẫu xương cóc............................... ...78
Hình 3.23: Đường chuẩn của cinobufagin trong mẫu xương cóc ....................... ...78
Hình 3.24: Đường chuẩn của resibufogenin trong mẫu xương cóc .................... ...78
Hình 3.25: Sắc đồ bufalin tại giới hạn phát hiện LOD 1,25 µg/kg ......................... 75
Hình 3.26: Sắc đồ resibufogenin tại giới hạn phát hiện LOD 2,5 µg/kg ............... 80
Hình 3.27: Sắc đồ cinobufagin tại giới hạn định lượng LOQ 5,0 µg/kg ............... 80
Hình 3.28: Sắc đồ resibufogenin tại giới hạn định lượng LOD 10,0 µg/kg.................... 80
Hình 3.29: Sắc đồ mẫu bột cóc và thêm chuẩn 3 bufadienolid tại mức
nồng độ 500 µg/kg ............................................................................. ...82
Hình 3.30: Sắc đồ mẫu xương cóc và thêm chuẩn 3 bufadienolid tại mức
nồng độ 500 µg/kg ............................................................................. 83


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1:

Cấu tạo và tính chất của bufalin, cinobufagin, resibufogenin .......... 5

Bảng 1.2:

Thống kê các vụ ngộ độc do ăn cóc và các sản phẩm chế biến
từ cóc .................................................................................................. 8

Bảng 1.3:

Các phương pháp xác định nhóm độc tố bufadienolid ....................12

Bảng 1.4:

Đánh giá độ lặp lại của phương pháp theo hội đồng Châu Âu
2002/657/EC .................................................................................. 37

Bảng 1.5:

Đánh giá độ đúng của phương pháp theo hội đồng Châu Âu
2002/657/EC .................................................................................. 38

Bảng 2.1:

Thông tin về mẫu nghiên cứu ........................................................ 41

Bảng 3.1:

Các thơng số tối ưu hóa điều kiện phân mảnh... ..............................48

Bảng 3.2:

Các thơng số tối ưu MS/MS ............................................................51

Bảng 3.3:

Chương trình chạy gradient .............................................................53

Bảng 3.4:

Ảnh hưởng của dung môi pha động đến thời gian lưu và diện
tích pic..............................................................................................53

Bảng 3.5:

Khảo sát các chương trình chạy gradient.........................................55

Bảng 3.6:

Kết quả khảo sát gradient.................................................................56

Bảng 3.7:

Khảo sát tốc độ dịng pha động........................................................57

Bảng 3.8:

Chương trình gradient tối ưu ...........................................................58

Bảng 3.9:

Khảo sát quy trình xử lý mẫu...........................................................60

Bảng 3.10: Khảo sát dung mơi chiết với mẫu bột cóc .......................................62
Bảng 3.11: Khảo sát dung mơi chiết với mẫu xương cóc ..................................63
Bảng 3.12: Khảo sát thể tích dung mơi chiết với mẫu bột cóc ..........................65
Bảng 3.13: Khảo sát thể tích dung mơi chiết với mẫu xương cóc .....................66
Bảng 3.14: Khảo sát cột chiết pha rắn ................................................................67

Bảng 3.15: Khảo sát dung môi rửa giải với mẫu bột cóc ...................................68
Bảng 3.16: Khảo sát dung mơi rửa giải với mẫu xương cóc..............................69
Bảng 3.17: Khảo sát thể tích dung mơi rửa giải với mẫu bột cóc .....................71
Bảng 3.18: Khảo sát thể tích dung mơi rửa giải với mẫu xương cóc................72
Bảng 3.19: Ion mẹ và 2 ion con của các bufadienolid .......................................74
Bảng 3.20: Phương trình đường chuẩn của 3 bufadienolid trên mẫu bột cóc.. .........76
Bảng 3.21: Phương trình đường chuẩn của 3 bufadienolid trên mẫu
xương cóc .........................................................................................77
Bảng 3.22: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của các
bufadienolid.. ...................................................................................79
Bảng 3.23: Độ lặp lại và hiệu suất thu hồi của các bufadienolid trên mẫu
bột cóc .............................................................................................81
Bảng 3.24: Độ lặp lại và hiệu suất thu hồi của các bufadienolid trên mẫu
xương cóc .........................................................................................82
Bảng 3.25: Kết quả phân tích các bufadienolid trong các mẫu phẩm làm từ cóc.......84


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC TỪ VIẾT TẮT
Kí hiệu

Tiếng Anh

Tiếng Việt

ACN

Acetonitrile

Acetonitril

Association of Official Analytical

Hiệp hội cộng đồng phân

Community

tích chính thức

Atmospheric pressure chemical

Chế độ ion hóa ở áp suất

ionization

khí quyển

EI

Electron Impact

Va chạm electron

ESI

Electrospray ionization

Ion hóa phun điện tử

AOAC

APCI

GC-MS

HPLC

Gas chromatography mass
spectrometry
High performance liquid
chromatography

Sắc ký khí khối phổ
Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Normal phase high performance

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

liquid chromatography

pha thuận

Reversed phase high performance

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

liquid chromatography

pha đảo

High speed countercurrent

Sắc kí ngược dịng tốc độ

chromatography

cao

Liquid chromatography tandem

Sắc ký lỏng ghép khối phổ

mass spectrometry

hai lần

LD50

Lethal Dose

Liều gây chết trung bình

LOD

Limit of detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of quantification

Giới hạn định lượng

NP-HPLC

RP-HPLC

HSCCC

LC-MS/MS


MeOH

Methanol

Methanol

MS

Mass spectrometry

Khối phổ

PDA

Photodiode array

Dãy diod quang

TLC

Thin layer chromatography

Sắc ký bản mỏng

TOF

Time of flight analyser

Bộ phân tích thời gian bay

RSD

Relative standard devition

Độ lệch chuẩn tương đối

SD

Standard deviation

Độ lệch chuẩn

SDS

Sodium dodecyl sulfate

Natri dodecyl sulfat

SPE

Solid phase extraction

Chiết pha rắn

LLE

Liquid liquid extraction

Chiết lỏng lỏng

R(%)

Recovery

Hiệu suất thu hồi

UFLC

Ultra fast liquid chromatography

Sắc ký lỏng siêu nhanh

UPLC

Ultra performance liquid

chromatography

Sắc ký lỏng siêu hiệu năng


1
MỞ ĐẦU
Hiện nay, vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm đã và đang nhận được sự quan
tâm rất lớn của toàn xã hội. Các vụ ngộ độc thực phẩm ngày càng gia tăng, trong
đó có ngộ độc do ăn các sản phẩm từ cóc nhiễm độc tố cóc dẫn đến nhiều trường
hợp tử vong và bùng lên nỗi lo âu cho người tiêu dùng.
Bufadienolid là nhóm các hợp chất steroids 24C chứa vịng pyron tại C-17
trong đó số lượng cao nhất và đa dạng của các chất đã được chứng minh trong
một số lồi cóc. Cóc là động vật lưỡng cư, thuộc họ Bufonidae có 529 lồi khác
nhau, cư trú ở khắp mọi nơi trên thế giới [17]. Thịt cóc rất giàu dinh dưỡng
(53,37% protit, 12,66% lipit), có nhiều acid amin cần thiết (asparagin, histidin,
tyrosin, methionin, leucin), hàm lượng một số nguyên tố vi lượng như kẽm,
mangan cao hơn rất nhiều so với các loài động vật khác. Thịt cóc hỗ trợ tăng
cường dinh dưỡng cho người sau ốm dậy, thực phẩm bổ dưỡng cho người già,
trẻ em suy dinh dưỡng, chán ăn, chậm lớn, cịi xương. Trong Đơng y và dân
gian, nhựa cóc, gan cóc được sử dụng để chống sưng, tiêu viêm dưới dạng cao,
dùng ngoài da điều trị nhọt độc, đầu đinh, sưng tấy [2].
Tuy nhiên, trong số 529 lồi cóc có 16 lồi chứa chất độc bufotoxin, trong
đó có lồi cóc nhà Việt Nam Bufo melanostictus Schneider. Độc tố bufotoxin
thường gặp ở các bộ phận da, trứng, gan, ruột và nhựa cóc (ở tuyến sau tai, tuyến
trên mắt và các tuyến trên da cóc). Các bufadienolid thường gặp trong độc tố cóc
là bufalin, cinobufagin resibufogenin, bufotalin, 19-hydroxy bufalin và một số
hợp chất khác. Các bufotoxin này là nguyên nhân chính của phần lớn các vụ ngộ
độc do ăn các sản phẩm làm từ cóc [7, 8].
Trên thế giới có rất nhiều phương pháp xác định đồng thời các

bufadienolid trong các đối tượng khác nhau như phương pháp như sắc ký bản


2
mỏng, sắc ký phân bố ngược dòng tốc độ cao, sắc ký khí ghép khối phổ và sắc
ký lỏng hiệu năng cao (ghép nối với các detector UV, PDA, MS, MS/MS).
Phương pháp sắc ký lỏng ghép nối khối phổ hai lần có nhiều ưu điểm như rất
chọn lọc, độ nhạy và độ chính xác cao, đặc biệt khi phân tích đồng thời các chất
trong nền mẫu sinh học phức tạp. Hiện nay, tại Việt Nam chưa có một nghiên
cứu nào xác định đồng thời các bufadienolid trong các mẫu phẩm từ cóc. Vì vậy,
để góp phần kiểm sốt các nguy cơ tiềm ẩn ngộ độc độc tố cóc chúng tơi đã chọn
đề tài: ―Xác định đồng thời ba bufadienolid trong một số mẫu phẩm từ cóc
bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép nối khối phổ hai lần (LC - MS/MS)”.


3
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1.

Giới thiệu về bufadienolid
1.1.1. Giới thiệu chung về họ cóc và độc tố cóc
Bufadienolid là nhóm các hợp chất steroids 24C chứa vịng pyron tại C-17,

có nguồn gốc từ một số loài động vật và họ thực vật. Trong động vật,
bufadienolid được tìm thấy chủ yếu ở cóc (Bufo), đom đóm (Photinus) và rắn
(Rhabdophis), trong đó số lượng cao nhất và đa dạng của các chất đã được chứng
minh trong một số lồi cóc [8, 17].
Cóc là động vật lưỡng cư, thuộc họ Bufonidae có 529 lồi khác nhau, cư
trú ở khắp mọi nơi trên thế giới. Trong số 529 lồi có 16 lồi có chất độc
bufotoxin, trong đó có lồi cóc nhà Việt Nam Bufo melanostictus Schneider. Độc

tố cóc (bufotoxin) chỉ có ở một số bộ phận cơ thể: nhựa cóc (ở tuyến sau tai,
tuyến trên mắt và các tuyến trên da cóc), trong gan và buồng trứng. Bufotoxin
gồm hơn 40 hợp chất có hoạt tính sinh học khác nhau: bufalin, cinobufagin,
resibufogenin, bufagin, bufogenin, bufothionin, epinephrine, norepinephrin,
serotonin…Trong đó có những chất được xếp vào nhóm khơng gây độc bao gồm
cholesterol, provitamin D, ergosterol và gamma sitosteral. Những chất gây độc
được xếp thành 3 nhóm:
- Nhóm 1: Các glycosis có tác dụng lên tim (hay bufadienolid) chủ yếu gồm
bufalin, cinobufagin và resibufogenin có tác động trên hệ tim mạch của động
vật và con người.
- Nhóm 2: Phenethylamines và dẫn xuất. Bao gồm các catecholamines như:
dopamin, norepinephrin và epinephrin.


4
- Nhóm 3: Tryptamines và dẫn xuất: serotonin, bufotenin, 5-methoxy-N,Ndimethyltryptamin (5-MeO-DMT) chúng có tác dụng tăng huyết áp và gây ảo
giác và hưng thần (psychoactive) [13].

Hình 1.1: Một số lồi cóc có độc trên thế giới


5
1.1.2. Cấu tạo và tính chất của bufalin, cinobufagin, resibufogenin
Bảng 1.1: Cấu tạo và tính chất hóa lý của bufalin, cinobufagin, resibufogenin
Cơng thức phân tử, khối
STT

Bufadienolid

lƣợng phân tử (g/mol) và

Tính chất hóa lý

cơng thức cấu tạo

- Chất bột màu trắng
C24H34O4; 386,5
Bufalin
1

(3β,5β)-3,14-Dihydroxybufa20,22-dienolide, 5β,20(22)bufadienolide-3β,14-diol)

- Tỷ trọng: 1,23g/cm3
- Nhiệt độ nóng chảy: 235-236oC
- Nhiệt độ sôi: 556,56°C ở 760
mmHg
- Tan

trong

methanol, ethanol,

dimethylsulfoxid,
[40].

chloroform


6
- Chất bột màu trắng

Cinobufagin

C26H34O6; 442,2
- Tỷ trọng: 1,29g/cm3

(14,15β-Epoxy-3β,16β2

- Nhiệt độ nóng chảy: 211oC

dihydroxy-5β,20(22)- Nhiệt độ sơi: 595,42°C ở 760

bufadienolide16-acetate,

mmHg

5β,20(22)-Bufadienolide-3β,16βdiol-14,15β-epoxy 16-acetate )

- Tan trong methanol chloroform,
tan một phần trong nước [41].
- Chất bột màu trắng
C24H32O4; 384,5
- Tỷ trọng: 1,25g/cm3

Resibufogenin
3

(3β,5β,15β)-14,15-Epoxy-3hydroxy-5-bufa-20,22-dienolide)

- Nhiệt độ nóng chảy: 113-140oC
- Nhiệt độ sơi: 554.93°C ở 760

mmHg
- Tan trong methanol chloroform,
tan một phần trong nước [42].


7
1.1.3. Tác dụng và độc tính của các bufadienolid
Bufadienolid có tác dụng trên tim giống digoxin [7, 36]: Ức chế kênh Na+K+-ATPase (giúp trao đổi giữa K+ ngoài tế bào và Na+ trong tế bào), khi kênh bị
ức chế, nồng độ Na+ trong tế bào tăng dẫn đến giảm hoạt tính của bơm Na+/Ca2+
(bơm này trao đổi Na+ ngồi tế bào và Ca2+ trong tế bào). Hậu quả là tăng nồng
độ Ca2+ nội bào dẫn tới co cơ, tăng điện thế màng lúc nghỉ dẫn tới tăng tốc độ
khử cực tự nhiên và tăng tính tự động, tăng trương lực đối giao cảm và giảm hoạt
tính giao cảm trong mơ cơ tim. Ngoài ra, bufadienolid ức chế kênh Na+-K+ATPase làm giảm sự trao đổi Na+ và K+ dẫn tới tăng K+ máu.
Tác giả Yasuharu Hirai và các cộng sự đã nghiên cứu so sánh hoạt lực của
bufadienolid tác dụng trên kênh Na+-K+-ATPase tại tế bào cơ tim của chuột với
các glycosis tim khác, kết quả như sau: bufalin > digoxin > digitoxin >
telocinobufagin > gamabufotalin > cinobufotalin > cinobufagin > g-strophanthin
> digitoxingenin > resibufogenin [33].
LD50 thực hiện trên chuột tiêm theo đường tĩnh mạch của bufalin,
cinobufagin, resibufogenin tương ứng là 0,74 mg/kg, 1,21 mg/kg, 4,25 mg/kg
khối lượng cơ thể, rất độc đối với tim gây sung huyết tế bào cơ tim. Hiện nay,
chưa có quy định về LD50 trên người [40, 41,42].
1.1.4. Ngộ độc do ăn cóc và các sản phẩm chế biến từ cóc
Tính tới ngày 8/ 9/ 2010, toàn quốc ghi nhận 06 vụ ngộ độc do độc tố
trong cóc (bufotoxin) xảy ra trên địa bàn 6 tỉnh/ thành phố làm 17 người mắc, 13
người nhập viện và 05 người chết. Đặc biệt là vụ ngộ độc dẫn đến 02 cái chết
thương tâm tại Đồng Tháp vào ngày 5/ 9/ 2010 do sử dụng trứng cóc [1].


8

Bảng 1.2: Thống kê các vụ ngộ độc do ăn cóc và các sản phẩm chế biến từ cóc
STT

Chỉ số

Năm 2008

Năm 2009

Năm 2010

1

Số tỉnh xảy ra ngộ độc

2

2

6

2

Số vụ

2

2

6

3

Số người mắc

5

6

17

4

Số tử vong

1

1

3

Nguyên nhân của ngộ độc cóc là do ăn thịt cóc bị nhiễm độc tố cóc và có
trường hợp do ăn gan, trứng cóc. Triệu chứng ngộ độc độc tố cóc biểu hiện cấp
tính, xuất hiện từ 1 - 2 giờ sau khi ăn (có thể sớm hơn nếu uống rượu, bia) với
các biểu hiện sau:
- Rối loạn tiêu hoá: Bệnh nhân bị chướng bụng, đau bụng trên rốn; kèm
theo nơn mửa dữ dội; có thể bị tiêu chảy.
- Rối loạn tim mạch: Bệnh nhân hồi hộp, đánh trống ngực, tim đập nhanh;
sau đó loạn nhịp tim (ngoại tâm thu thất, cơn nhịp nhanh thất), rung thất, block
nhĩ - thất dẫn đến truỵ tim mạch; huyết áp lúc đầu cao sau đó tụt.

- Rối loạn tâm thần kinh: Bệnh nhân rối loạn cảm giác (đau như kim chích
ở đầu ngón tay, ngón chân, tê mơi...), chóng mặt, ảo giác, vã mồ hơi lạnh, tăng
tiết nước bọt; có thể khó thở, ngừng thở, ngừng tim.
- Rối loạn tiểu tiện: Bệnh nhân xuất hiện bí đái, thiểu niệu, vơ niệu và nặng
dẫn đến suy thận cấp.


9
- Một số triệu chứng khác: Bệnh nhân xuất hiện bỏng rát, phù nề niêm
mạc, mắt nếu bị nhựa cóc bắn dính vào trực tiếp niêm mạc.
1.1.5. Các sản phẩm có nguồn gốc từ cóc
- Thuốc dân gian: Nhựa cóc là 1 trong 6 vị của đơn thuốc ―Lục thần
hoàn‖. Dân gian dùng nhựa cóc chữa giảm đau, tán thuỷ, dùng chữa phát bối,
đinh độc, yết hầu sưng đau, đau răng. Thịt cóc khơ dùng với liều 2 – 3g tán bột
uống hoặc làm thành thuốc viên, chữa gầy còm, chậm lớn, kém ăn, suy dinh
dưỡng [2].
- Thuốc cổ truyền: Sản phẩm mới nhất làm từ cóc dùng để hỗ trợ điều trị
ung thư ở Việt Nam hiện nay là Linh Đan Thiềm ơ châu (ngun liệu là cóc cả
con, được luyện theo phương pháp bí truyền tạo thành linh đan – những viên
ngọc màu đen) của cơ sở Nam Y Đạo Pháp – DS. Lương y Đào Kim Long. Linh
đan Thiềm ô châu đã được sử dụng kết hợp với các vị thuốc Nam từ nhiều năm
nay và cho kết quả rất tốt trong điều trị nhiều bệnh ung thư (ung thư phổi, ung
thư gan, ung thư vòm họng, ung thư trực tràng, ung thư tuyến giáp, ung thư vú,
ung thư tử cung, các bệnh bạch cầu cấp tính mãn tính dịng L và dịng M, bệnh
suy tiểu cầu…)
Chansu là một loại thuốc cổ truyền được sử dụng rộng rãi tại Trung Quốc,
Hàn Quốc, Ấn Độ và một số quốc gia Châu Á khác để điều trị các bệnh nhiễm
trùng, bệnh thấp khớp, viêm nhiễm, suy tim, loạn nhịp tim và ung thư như gan,
mật, tụy, phổi, ruột kết. Chansu được chiết từ nhựa cóc Bufo bufo gargarizans
Cantor (rất phổ biến ở Trung Quốc) hoặc Bufo melanosticus Schneider (phổ biến

ở Ấn Độ và Việt Nam). Kết quả nghiên cứu cho thấy có hơn 40 bufadienolid
được phát hiện trong loại thuốc cổ truyền này [11, 28].


10
- Thực phẩm dinh dưỡng: Bột đạm cóc - Viện Dinh Dưỡng, Bột cóc royal
baby - Cơng ty cổ phần Dược và cơng nghệ Hóa sinh Hà Nội… sử dụng để chữa
bệnh suy dinh dưỡng, còi xương và bổ sung chất dinh dưỡng cho trẻ em.

Hình 1.2: Một số sản phẩm có nguồn gốc từ cóc
1.1.6. Nghiên cứu bufadienolid trong nước
Năm 1963 - 1964, tác giả Đào Kim Long đã xác định lồi cóc thường thấy
ở Việt Nam là lồi Bufo melanostictus, đó là mốc đánh dấu bước phát triển mới
trong nghiên cứu lồi cóc nhà Việt Nam, trong thời gian tiếp theo, ông đã tiến
hành một số nghiên cứu khác như cơ chế tiết nhựa, tính độc của nhựa cóc trên
động vật… Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nào về thành thành phần hóa học
trong nhựa cóc.


11
Năm 1973, nhóm nghiên cứu do tác giả Phan Quốc Kinh làm chủ đề tài đã
nghiên cứu về thành phần hóa học trong nhựa cóc Việt Nam – Bufo
melanostictus, các tác giả chỉ ra rằng chủ yếu chứa các chất có cấu trúc nhân
sterol. Trong báo cáo về các hợp chất nhân sterol năm 1979 ở Thụy Sĩ, các tác
giả đã xác định trong nhựa cóc có resibugigenin, bufotalin, 19-hydroxy bufalin
và nhiều bufadienolids khác, trong đó 19-hydroxy bufalin là thành phần chính.
Đây là điểm khác biệt so với cóc Trung Quốc – Bufo bufo gargarizans (trong
nhựa có chứa cinobufagin là thành phần chính). Như vậy, cóc Việt Nam – Bufo
melanostictus và Trung Quốc Bufo bufo gargarizans là hai loài khác nhau, có
thành phần bufadienolid khác nhau [8, 27].

Trong năm 2009, nhóm nghiên cứu (Phan Quốc Kinh, Hà Huy Kế, Đào
Kim Long, Đào Anh Hồng) đã định tính và định lượng 1 số kim loại nặng: As,
Ba, Bi, Cu, Mn, Pb, Se, Tl, Zn, Hg có trong từng bộ phận của cóc Việt Nam Bufo melanostictus bằng phương pháp quang phổ phát xạ nguyên tử.
Như vậy, tại Việt Nam chưa có một nghiên cứu nào tiến hành xác định hàm
lượng các độc tố nhóm bufadienolid trong các sản phẩm có nguồn gốc từ cóc
Việt Nam.
1.2. Các phƣơng pháp xác định bufadienolid
Trên thế giới rất nhiều các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu nhóm
độc tố bufadienolid bằng nhiều phương pháp như sắc ký bản mỏng (TLC), sắc
ký ngược dòng tốc độ cao (HSCCC), sắc ký khí ghép khối phổ ( GC – MS/MS),
sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC – UV, PDA), đặc biệt là sắc ký lỏng ghép nối
khối phổ (LC - MS, LC – MS/MS) trên các đối tượng khác nhau như: thuốc cổ
truyền Chansu, dung dịch sinh học (huyết tương chó, huyết tương chuột), mẫu
sinh học (gan người)... Bảng 1.3 tóm tắt một số phương pháp đã được sử dụng để
tiến hành xác định nhóm độc tố bufadienolid.


12

Bảng 1.3: Các phương pháp xác định nhóm độc tố bufadienolid
Phƣơng
pháp

Đối tƣợng phân tích

Điều kiện phân tích

Đánh giá phƣơng pháp

TLTK

- Bản mỏng silicagel 60 GF254

TLC

HSCCC và
HPLC điều
chế

Bufalin , cinobufagin , - Pha động: chloroform – aceton (10:3)
resibufogenin,
- Hiện màu bằng dung dịch acid sulfuric
cinobufotalin trong nhựa
10%.
cóc
- Bước sóng phát hiện: 296 nm

8 bufadienolid trong
thuốc cổ truyền Chansu
( trong đó có
bufalin,cinobufagin và
resibufogenin )

-

Dung môi: ether dầu hỏa–ethyl
acetat–methanol–nước với tỉ lệ:
4:6:4:6 (v/v) và 4:6:5:5 (v/v).

-

Tốc độ dòng : 2 ml/ phút
HPLC điều chế

-

[14]

Độ tinh khiết:
-

Cột tách: YMC-Pack ODS-A (250 × 10 mm, 5 μm)
Tốc độ dòng : 2,5ml/ phút
Pha động: : Acetonitril - nước (0,3
% CH3COOH) theo chế độ gradient

Bufalin : 99,5%
[15]
Resibufogenin: 98,5%
Cinobufagin: 99,1%


13

-

Bước sóng phát hiện: 296 nm

- Dung mơi: n-hexan/ethyl
acetat/methanol/nước tỉ lệ 4:6:2:4 v/v,

4:6:2.5:4 v/v và 4:6:3.2:4 v/v
- Tốc độ dòng 1,5ml/phút
HSCCC và
HPLC điều
chế

CE

6 bufadienolid trong
thuốc cổ truyền Chansu
( trong đó có bufalin ,
cinobufagin)

Resibufagin và
cinobufagin thuốc cổ
truyền Chansu

- Cột: Agilent ODS C18 (250 mm x
4.6 mm, 5 μm)
-

- Cinobufagin: 94,9%

[16]

Pha động: Acetonitril - nước (0,3 %
- Bufalin : 99,4%
CH3COOH) theo chế độ gradient

-

Tốc độ dòng :0,8ml/ phút

-

Nhiệt độ cột tách: 30oC

-

Bước sóng phát hiện: 296 nm

-

Phương pháp chiết lỏng – lỏng

-

Dung môi chiết: cloroform

-

Độ tinh khiết:

- Độ thu hồi: 97,25-101,2%

Cột mao quản:50µm x 60,5 x 50cm
- RSD (%): 1,73 - 3,05%
chiều dài hiệu dụng

[20]

14

-

Điều kiện tối ưu: heptan 0,81%
(w/w), SDS 3,31%(w/w), butan-1-ol
6,61%(w/w)

-

Dung dịch đệm: 10 mmol/l

natri

tetraborat trong nước, pH 9,2
-

Bước sóng phát hiện: 298nm

- Phương pháp chiết lỏng – lỏng

GC – MS

HPLC PDA

Cinobufagin, ,
reisibufogenin trong
thuốc cổ truyền Chansu

12 bufalinolides trong
thuốc cổ truyền Chansu
(trong đó có
bufalin,cinobufagin,

-

Dung mơi chiết: methanol

-

-

Cột: HP-5MS 30m x 0,25mm x
0,25µm

Hệ số tương quan tuyến
tính R2 >0,99

-

LOD = 0,4 – 0,5 ng

-

Nhiệt độ lị: 280oC

-

LOQ = 1,2 -1,5 ng

-

Khí mang: Heli

-

RSD (%) < 7,5%

-

Tốc độ khí mang: 1,2 ml/phút

-

Độ thu hồi: 94 – 96%

-

Phương pháp chiết lỏng – lỏng

-

Dung môi chiết: methanol: H2O
(70:30)
-

-

Hệ số tương quan tuyến
tính R2 = 0,9992
LOD = 0,48 -6ng/ml

[29]

[11]