Nghiên cứu xác định hàm lượng vitamin b1, b6 trong một số loại nấm lớn lấy từ vườn quốc gia pù mát nghệ an bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH

CAO THÚY TRINH

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG
VITAMIN B1, B6 TRONG MỘT SỐ LOẠI NẤM LỚN
LẤY TỪ VƢỜN QUỐC GIA PÙ MÁT - NGHỆ AN
BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

NGHỆ AN - 2014


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH

CAO THÚY TRINH

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG
VITAMIN B1, B6 TRONG MỘT SỐ LOẠI NẤM LỚN
LẤY TỪ VƢỜN QUỐC GIA PÙ MÁT - NGHỆ AN
BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Chun ngành: Hóa phân tích
Mã số: 60.44.0118

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

TS. ĐINH THỊ TRƢỜNG GIANG

NGHỆ AN - 2014


LỜI CẢM ƠN
Luận văn được thực hiện tại Viện Kiểm nghiệm ATVSTP Quốc Gia;
Phịng thí nghiệm chun đề Hóa phân tích - Khoa Hóa trường Đại học Vinh.
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến:
- Cơ giáo TS. Đinh Thị Trường Giang người đã trực tiếp hướng dẫn
và tạo mọi điều kiện cho tơi nghiên cứu và hồn thành luận văn.
- Thầy giáo PGS. TS. Trần Đình Thắng đã giúp đỡ định danh mẫu vật.
- Nhân dịp này, tơi xin cảm ơn đến Phịng đào tạo Sau Đại học, Ban
chủ nhiệm khoa Hóa cùng các thầy cơ giáo và các cán bộ Phịng thí nghiệm
khoa Hóa học đã giúp đỡ tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và
làm luận văn.
Và xin cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã động viên
giúp đỡ tơi hồn thành luận này.
Nghệ An, tháng 10 năm 2014
Ngƣời thực hiện

Cao Thúy Trinh


MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................ 4
1.1. GIỚI THIỆU VỀ NẤM LỚN ................................................................. 4

1.1.1. Giới thiệu về nấm .......................................................................... 4
1.1.2. Phân loại và tác dụng trị liệu của nấm Linh Chi ............................ 6
1.1.3. Nấm lớn .......................................................................................... 8
1.1.4. Nấm Linh chi .................................................................................. 9
1.1.5. Các mẫu nấm đƣợc nghiên cứu trong đề tài ................................. 10
1.2. GIỚI THIỆU VỀ VITAMIN B1, B6 .................................................... 11
1.2.1. Vitamin B1 ................................................................................... 11
1.2.2. Vitamin B6 ................................................................................... 13
1.2.3. Vai trò và nhu cầu của vitamin B1, B6 đối với cơ thể ................. 14
1.3. PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VITAMIN B1, B6 ............................... 16
1.3.1. Cơ sở lý thuyết của phƣơng pháp ................................................. 16
1.3.2. Phân loại sắc ký và ứng dụng ....................................................... 17
1.3.3. Các đại lƣợng đặc trƣng của sắc ký đồ......................................... 19
1.3.4. Hệ thống HPLC ............................................................................ 22
1.3.5. Chọn điều kiện sắc ký................................................................... 25
1.3.6. Tiến hành đo sắc ký ...................................................................... 28
1.3.7. Định lƣợng bằng phƣơng pháp HPLC.......................................... 29
CHƢƠNG 2. KĨ THUẬT THỰC NGHIỆM ............................................... 37
2.1. THIẾT BỊ, DỤNG CỤ .......................................................................... 37
2.2. CHUẨN BỊ HÓA CHẤT ...................................................................... 37
2.2.1. Yêu cầu chung .............................................................................. 37


2.2.2. Chuẩn bị hóa chất cho phép xác định vitamin B1 ........................ 37
2.2.3. Chuẩn bị hóa chất cho phép xác định vitamin B6 ........................ 38
2.3. LẤY MẪU, BẢO QUẢN VÀ CHUẨN BỊ MẪU PHÂN TÍCH ......... 39
2.3.1. Lấy mẫu và baỏ quản mẫu ............................................................ 39
2.3.2. Chuẩn bị mẫu phân tích ................................................................ 39
2.4. CÁCH TIẾN HÀNH THỰC NGHIỆM................................................ 40
2.4.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn cho phép đo HPLC với vitami B1 ..... 40

2.4.2. Xử lý mẫu nấm linh chi cho phép đo HPLC với vitamin B1 ....... 40
2.4.3. Chuẩn bị dung dịch chuẩn cho phép đo HPLC với vitamin B6..... 40
2..4.4. Xử lý mẫu nấm linh chi cho phép đo HPLC với vitamin B6 ....... 41
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................ 42
3.1. KHẢO SÁT CÁC THÔNG SỐ TỐI ƢU CHO PHÉP ĐO HPLC
XÁC ĐỊNH VITAMIN B1, B6 ................................................................... 42
3.1.1. Khảo sát bƣớc sóng ....................................................................... 42
3.1.2.

hảo sát pha động ........................................................................ 43

3.1.3.

hảo sát tốc độ dòng .................................................................... 45

3.2. KHẢO SÁT XÁC ĐỊNH KHOẢNG NỒNG ĐỘ TUYẾN TÍNH
CỦA VITAMIN B1, VITAMIN B6 ............................................................ 47
3.2.1.

hảo sát xác định khoảng nồng độ tuyến t nh của vitamin B1 ..... 47

3.2.2.

hảo sát xác định khoảng nồng độ tuyến t nh của vitamin B6 ..... 48

3.3. XÂY DỰNG ĐƢỜNG CHUẨN, XÁC ĐỊNH GIỚI HẠN PHÁT
HIỆN (LOD) VÀ GIỚI HẠN ĐỊNH LƢỢNG (LOQ) CỦA
VITAMIN B1, VITAMIN B6...................................................................... 49
3.3.1. Xây dựng đƣờng chuẩn, xác định giới hạn phát hiện (LOD)
và giới hạn định lƣợng (LOQ) của Vitamin B1 ........................... 49

3.3.2. Xây dựng đƣờng chuẩn, xác định giới hạn phát hiện (LOD)
và giới hạn định lƣợng (LOQ) của Vitamin B6 ........................... 51


3.4. ĐÁNH GIÁ SAI SỐ VÀ ĐỘ LẶP LẠI CỦA PHÉP ĐO DÃY
CHUẨN VITAMIN B1, VITAMIN B6 ...................................................... 54
3.5. ĐỘ LẶP LẠI TRÊN MẪU NẤM LINH CHI ...................................... 57
3.6. HIỆU SUẤT THU HỒI VITAMIN TRONG CÁC MẪU NẤM ......... 57
3.6.1. Hiệu suất thu hồi Vitamin B1 trong các mẫu nấm ....................... 58
3.6.2. Hiệu suất thu hồi vitamin B6 trong các mẫu nấm ........................ 59
3.7. TỔNG HỢP CÁC ĐIỀU KIỆN ÁP DỤNG PHÂN TÍCH ................... 59
3.8. ÁP DỤNG PHƢƠNG PHÁP ĐỂ XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG
VIATAMIN B1, VITAMIN B6 TRONG MỘT SỐ MẪU NẤM ............... 61
3.8.1. Xác định hàm lƣợng Viatamin B1................................................ 61
3.8.2. Xác định hàm lƣợng Viatamin B6................................................ 63
KẾT LUẬN ..................................................................................................... 65
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 66
PHỤ LỤC ........................................................................................................ 68


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Viết tắt

Tiếng Anh

Tiếng Việt

HPLC

High performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao

RSD

Relative standard deviation

Độ lệch chuẩn tƣơng đối

SD

Standard deviation

Độ lệch chuẩn

LOD

Limit of detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of quantification

Giới hạn định lƣợng

ppm

Part per million

Một phần triệu

ppb

Part per billion

Một phần tỉ


DANH MỤC CÁC BẢNG, HÌNH
Trang
Bảng:
Bảng 3.1.

ết quả khảo sát bƣớc sóng của Vitamin B1 .............................. 42

Bảng 3.2.

ết quả khảo sát bƣớc sóng của Vitamin B6 .............................. 43

Bảng 3.3.

ết quả khảo sát pha động của Vitamin B1 ................................ 44

Bảng 3.4.

ết quả khảo sát pha động của Vitamin B6 ................................ 45

Bảng 3.5.

ết quả khảo sát tốc độ d ng của Vitamin B1 ............................ 46

Bảng 3.6.

ết quả khảo tốc độ d ng của Vitamin B6 ................................. 46

Bảng 3.7.

hảo sát khoảng nồng độ tuyến t nh của vitamin B1 ................. 47

Bảng 3.8.

hảo sát khoảng nồng độ tuyến t nh của vitamin B6 ................. 48

Bảng 3.9.

Số liệu x y dựng đƣờng chuẩn của vitamin B1 .......................... 49

Bảng 3.10. Số liệu x y dựng đƣờng chuẩn của vitamin B6 .......................... 52
Bảng 3.11.

ết quả đánh giá sai số và độ lặp lại của phép đo vitamin B1 ....... 55

Bảng 3.12.

ết quả đánh giá sai số và độ lặp lại của phép đo vitamin B6 ..... 56

Bảng 3.13. Kết quả phân tích các mẫu thử song song ................................... 57
Bảng 3.14. Kết quả tính hiệu suất thu hồi trong phép xác định vitamin B1 ..... 58
Bảng 3.15. Kết quả tính hiệu suất thu hồi trong phép xác định vitamin B6 ..... 59

Bảng 3.16. Tổng hợp các điều kiện đo vitamin B1 phƣơng pháp HPLC ...... 60
Bảng 3.17. Tổng hợp các điều kiện đo vitamin B6 phƣơng pháp HPLC ...... 60
Bảng 3.18. Kết quả xác định hàm lƣợng Vitamin B1 trong nấm linh chi ..... 62
Bảng 3.19. Kết quả xác định hàm lƣợng Vitamin B6 trong nấm linh chi ..... 64
Hình:
H nh 3.1.

Đồ thị khảo sát khoảng nồng độ tuyến t nh của vitamin B1 ....... 47

H nh 3.2.

Đồ thị khảo sát khoảng nồng độ tuyến t nh của vitamin B6 ....... 48

H nh 3.3.

Đồ thị đƣờng chuẩn của vitamin B1 ............................................ 50

H nh 3.4.

Đồ thị đƣờng chuẩn của vitamin B6............................................ 52


1
MỞ ĐẦU
Vitamin là một nhóm các hợp chất hữu cơ có ph n tử bé, có cấu tạo hóa
học rất khác nhau do đó các t nh chất hóa học cũng nhƣ l học cũng khác
nhau, nhƣng chúng đều giống nhau ở chỗ là rất cần thiết cho hoạt động sống
của bất kỳ cơ thể nào. Hiện nay ngƣời ta đã nghiên cứu và ph n lập đƣợc trên
30 loại vitamin khác nhau, đồng thời đã nghiên cứu các thành phần, cấu tạo
và tác dụng sinh lý của chúng.

Vitamin đƣợc cung cấp vào cơ thể con ngƣời để đáp ứng nhu cầu dinh
dƣỡng giúp cơ thể khỏe mạnh. Trong nhiều thế kỉ, do thiếu một số vitamin
g y nên các bệnh mù l a (thiếu vitamin A), bệnh beri-beri (thiếu vitamin B1),
bệnh scobut (thiếu vitamin C), thiếu axit folic trong thời k thai nghén g y
khuyết tật ống thần kinh ở thai nhi. Ngƣời thiếu vitamin khi hàm lƣợng
vitamin trong cơ thể ở mức thấp (bệnh giảm vitamin). Trạng thái giảm
vitamin rất phổ biến ở ngay trong những ngƣời mới thoạt nh n là hồn tồn
khoẻ mạnh. Có thể g y ra những rối loạn của hệ thần kinh. Họ dễ bị k ch
th ch, dễ bị mất b nh tĩnh do những nguyên nh n rất nhỏ nhặt, họ rất dễ mẫn
cảm với m thanh của radio, đối với tiếng ồn ào của trẻ con, bị bệnh mất ngủ,
giảm khả năng lao động.
Việc cung cấp không đầy đủ vitamin cho cơ thể sẽ có ảnh hƣởng xấu
khơng những với hệ thần kinh mà c n với một loạt cơ quan khác ở trong cơ
thể. V thế điều rất quan trọng là khẩu phần ăn của ngƣời khoẻ mạnh, và đặc
biệt là ngƣời ốm cần phải có giá trị hồn chỉnh không những về phƣơng diện
calo, về phƣơng diện chất đạm mà c n về phƣơng diện vitamin nữa . Nhiều
ngƣời c n cho rằng vitamin là thần dƣợc chữa ung thƣ và kéo dài tuổi thọ.
hoa học hiện nay đang tiến hành những nghiên cứu thực nghiệm trên
quy mô rộng lớn về vitamin, trong đó vitamin B1 và B6 là một trong những
đối tƣợng đƣợc nghiên cứu.


2
Vitamin B1 c n gọi là thiamine (dƣỡng chất năng lƣợng) có vai tr vơ
cùng quan trọng trong việc duy tr các hoạt động tƣơng tác của tế bào trong cơ
thể, nhất là việc sản xuất năng lƣợng. Trong đó các tế bào của cơ thể đã dùng
ôxy để chuyển hóa carbohydrate và các loại đƣờng thành năng lƣợng. Bởi
vậy, nếu khơng có vitamin B1 hoặc thiếu hụt nguồn dƣỡng chất này th hiệu
quả sản xuất năng lƣợng có thể sẽ bị suy giảm hoặc bị vơ hiệu hóa. Ngồi ra,
vitamin B1 c n có tác dụng hỗ trợ và bảo vệ hệ thống thần kinh trƣớc nguy cơ

bị tổn thƣơng và thối hóa.
Vitamin B6 là một loại vitamin h a tan trong nƣớc và là một phần của
nhóm vitamin B. Vitamin B6 hoạt động nhƣ một coenzym giúp chuyển hóa
tryptophan thành niacin. Nó c n đóng vai tr quan trọng trong việc chuyển
hóa chất đạm, chất béo,carbohydrate. Sự thiếu hụt vitamin B6 có thể g y ra
nhiều triệu chứng: mệt mỏi, mất ngủ, khó chịu, rối loạn t m thần, mơi nứt nẻ,
da khơ, rụng tóc. Ở trẻ em thiếu vitamin B6 thƣờng chậm lớn và có thể có
những cơn co giật.
Với vai tr và tầm quan trọng đó, vitamin B1 và B6 đã đƣợc nghiên
cứu và phát hiện có trong nhiều loại thực phẩm nói chung và trong các loại
nấm Linh chi.
Xuất phát từ chức năng của vitamin nói chung và vitamin B1, B6 nói
riêng trong cơ thể, đồng thời góp phần vào cơng tác đảm bảo chất lƣợng nấm
dùng để làm dƣợc liệu, chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu xác định hàm
lượng vitamin B1, B6 trong một số loại nấm Lớn lấy từ vườn quốc gia Pù
Mát - Nghệ An bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao" làm luận văn
tốt nghiệp của m nh.
1. Nhiệm vụ nghiên cứu trong luận văn:
- Xác định các điều kiện tối ƣu để đo sắc đồ HPLC của B1, B6.
- Xác định hàm lƣợng vitamin B1, B6 theo phƣơng pháp ngoại chuẩn.


3
- hảo sát giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ) của
phƣơng pháp ph n t ch.
- hảo sát độ lặp.
- Xác định hiệu suất thu hồi.
- Ph n t ch, xử lý số liệu
- T nh toán kết quả thực nghiệm
2. Đối tƣợng nghiên cứu: một số loại nấm Lớn lấy từ vƣờn quốc gia Pù

Mát - Nghệ An
3. Phƣơng pháp nghiên cứu: Các kết quả nghiên cứu đã đƣợc tiến hành
bằng thực nghiệm. Phƣơng pháp thực nghiệm đƣợc sử dụng là phƣơng pháp
sắc ký lỏng hiệu năng cao HLC (High Performance Liquid Chromatography).
4. Những đóng góp của đề tài: đã góp phần xác định thành phần dinh
dƣỡng của một số loại nấm lớn.


4
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. GIỚI THIỆU VỀ NẤM LỚN
1.1.1. Giới thiệu về nấm
Nấm là một giới riêng biệt rất lớn với khoảng 1,5 triệu lồi (chỉ đứng
sau cơn trùng: 10 triệu lồi về số lƣợng lồi) trong đó mơ tả đƣợc 69.000 loài
sống khắp nơi trên trái đất, bao gồm nấm men, nấm mốc và các loài nấm lớn.
Sở dĩ nấm đƣợc xếp vào giới riêng mà không đƣợc xếp vào giới thực
vật hay động vật v Nấm có nhiều đặc điểm khác thực vật nhƣ:
-

hơng có lục lạp, khơng có sắc tố quang hợp nên khơng thể tự động

tạo các chất hữu cơ cho cơ thể khác nhƣ thực vật.
- hơng có sự ph n hóa cơ quan thành th n, rễ, lá, hoa.
- Phần lớn nấm không chứa xenlulozo trong vách tế bào mà chủ yếu
bằng Chitin và glucan. Chitin là chất gặp ở động vật nhiều hơn thực vật, chủ
yếu ở nhóm giáp xác và cơn trùng, tạo thành lớp vỏ hoặc cánh cứng cho các
loài này.
- Nấm dự trữ đƣờng dƣới dạng glycozen, thay v tinh bột nhƣ thực vật.
Nấm cũng không đƣợc xếp vào giới động vật v :

- Nấm sinh sản chủ yếu bằng bào tử (hữu t nh hay vô t nh) giống hạt
phấn của thực vật.
- Sự dinh dƣỡng của Nấm liên quan đến hệ sợi nấm. Nấm lấy các
chất dinh dƣỡng thông qua màng tế bào của sợi nấm (tƣơng tự nhƣ cơ chế
ở rễ thực vật)
1.1.2. Phân loại Nấm
Giới Nấm đƣợc chia làm 4 giới phụ:
- Giới phụ nấm nhầy - Gymnomycetoida
- Giới phụ nấm tảo - phycomycetoida


5
- Giới phụ estomycetoida
- Giới phụ nấm thật - Eumycetoida
1.1.3. Nấm lớn
Tới thời điểm hiện nay, có khoảng 2500 lồi nấm đã đƣợc ghi nhận cho
lãnh thổ Việt Nam, trong số đó khoảng 1400 lồi thuộc 120 chi là những loài
nấm lớn (Macro fungi). Các loài nấm Đảm (Basidiomycota) chiếm ƣu thế rõ
rệt với hơn 90% tổng số loài; sau đó là nấm Nang (Ascomycota) chiếm
khoảng 8%; nấm Nhầy (Myxomycota) chiếm 1,5% và nấm Nội cộng sinh
(Glomeromycota) chiếm khoảng 0,5%. Trong ngành nấm Đảm th tuyệt đại
đa số nấm lớn thuộc ngành phụ Agaricomycotina Doweld (2001); chỉ có một
số rất t loài thuộc 2 ngành phụ Pucciniomycotina R. Baeuer, Beregow…(với
12

loài

thuộc

chi

Septobasidium

thuộc

bộ

Septobasidioles)

và

Ustilagomycotina Doweld (2001) với các lớp thuộc Ustilagomycetes (với 2
đại diện thuộc lớp nấm Than là Ustilago maydis trên ngô và Ustilago
esculenta trên củ niễng đều ăn đƣợc) và Exobasidiomycetes (với một vài loài
thuộc chi nấm Đảm ngoài Exobasidium g y bệnh phồng lá). Trong ngành phụ
Agaricomycotina, đại đa số nấm lớn thuộc về lớp Agaricomycetes. Hai lớp
c n lại chỉ có số lƣợng lồi rất khiêm tốn là Tremellomycetes (17 loài thuộc
bộ Tremellales) và lớp Dacrymycetes ( với 5 loài thuộc bộ Dacrymycetales).
Trong lớp Agaricomycetes, các bộ có số lƣợng loài nhiều nhất là
Aphyllophorales sensu lato (hơn 300 loài), Agaricales sensu lato (gần 300
loài), Boletales (gần 60 loài), Russulales (gần 40 lồi). Các bộ có t lồi nhất
là Hymenogastrales (1 loài), Ceratiomycetales (1 loài).
1.1.4. Nấm linh chi
Nấm linh chi, tên khoa học là Ganoderma lucidum, thuộc họ Nấm lim
(Ganodermataceae). Nấm linh chi c n có những tên khác nhƣ Tiên
thảo, Nấm trƣờng thọ, Vạn niên nhung.


6
Mỗi tên gọi của Linh chi gắn liền với một giá trị dƣợc liệu của nó. Tên

gọi Linh chi bắt nguồn từ Trung Quốc, hay tiếng Nhật là Reishi hoặc
Mannentake, tên gọi Latinh: Ganoderma lucidum.

Linh chi có tới 2000 loại và phổ biến nhất là Ganoderma lucidum và
Ganoderma zaponicum.
Ở Việt Nam, lồi nấm Linh chi Ganoderma lucidum mới đƣợc ni
trồng thành công trong ph ng th nghiệm (1978). Năm 1994 loài nấm lim một chủng Linh chi đỏ đặc sắc của các rừng Lim Bắc Việt đã đƣợc Phạm
Quang Thụ đƣa vào nuôi trồng chủ động. Đến hiện nay, việc nuôi trồng nấm
Linh chi đỏ đã đƣợc phổ biến tại các trang trại, đặc biệt là các vùng ven thành
phố Huế.
1.1.4.1. Phân loại và tác dụng trị liệu của nấm Linh Chi
Nấm Linh chi là một dƣợc liệu mà con ngƣời từ xa xƣa đã biết dùng
làm thuốc. Trong "Thần nông bản thảo" xếp Linh chi vào loại siêu thƣợng
phẩm hơn cả nh n s m; trong "Bản thảo cƣơng mục" coi Linh chi là loại
thuốc quý, có tác dụng bảo can (bảo vệ gan), giải độc, cƣờng t m, kiện nảo
(bổ óc), tiêu đờm, lợi niệu, ch vị (bổ dạ dày); gần đ y các nhà khoa học


7
Trung Quốc và Nhật phát hiện nấm linh chi c n có tác dụng ph ng và chống
ung thƣ, chống lão hóa làm tăng tuổi thọ.
Theo y học cổ truyền, nấm linh chi có vị nhạt, t nh ấm, có tác dụng tƣ
bổ cƣờng tráng, bổ can ch , an thần, tăng tr nhớ.
Ở các nƣớc Đông Nam Á (Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài
Loan…) việc nghiên cứu, phát triển và sử dụng nấm Linh chi đang đƣợc công
nghiệp hóa với quy mơ lớn về ph n loại, ni trồng chủ động, chế biến và bào
chế dƣợc phẩm, đồng thời nghiên cứu hóa dƣợc các hoạt chất, tác dụng dƣợc
lý và phƣơng pháp điều trị l m sàng.
Giá trị dƣợc lý của Linh chi càng đƣợc khẳng định khi Hội nghị nấm
học thế giới thành lập Viện nghiên cứu Linh chi Quốc tế tại New Yord. Qua

phân tích về các mặt dƣợc t nh, dƣợc lý và sử dụng nấm Linh chi, ngƣời ta
thấy Linh chi có tác dụng rất tốt với các bệnh nhƣ: bệnh tim mạch, hô hấp,
tăng khả năng miễn dịch, trị bệnh gan, có hiệu quả trong chống ung thƣ, khả
năng kháng HIV…, ngoài ra các hoạt chất sinh học trong nấm Linh chi có khả
năng khử một số gốc tự do sinh ra trong quá tr nh lão hóa cơ thể hay do nhiễm
xạ. Chúng làm phục hồi các tổ chức bị tổn thƣơng và không g y hiệu ứng phụ
nào cho cơ thể.
Nấm Linh Chi cơ bản có các loại nhƣ sau:


Hồng Chi (c n gọi là

im Chi). Nấm có màu vàng, vị ngọt, không

độc, t nh b nh, an thần, ch t kh .


Bạch Chi (c n gọi là Ngọc Chi). Đ y là loại nấm Linh Chi màu

trắng, có vị cay, t nh b nh, không độc, ch phổi, thông mũi, an thần, trị ho
nghịch hơi.


Thanh chi (c n gọi là Long Chi). Nấm này có màu xanh, t nh b nh, vị

chua.Tác dụng làm sáng mắt, ăn thần, tăng tr nhớ, bổ gan kh .


8


Hắc chi (c n gọi là Huyền Chi). Nấm có màu đen, vị mặn, t nh b nh,

không độc. Tác dụng trị chứng b tiểu, ch thận kh .


Tử chi (c n gọi là Mộc Chi). Nấm này có màu t m, vị ngọt, t nh b nh,

không độc. Trị các chứng đau nhức xƣơng khớp và g n cốt.


Linh Chi đỏ (c n gọi là X ch Chi, Đơn Chi, Hồng Chi). Nấm có màu

đỏ tƣơi khi c n non, trƣởng thành có lớp bào tử màu n u trên bề mặt. Nấm có
vị đắng, khơng độc, t nh b nh, tăng tr nhớ, dƣỡng tim, bổ gan, chữa bệnh tiểu
đƣờng, huyết áp và tim mạch.
Mặc dù có tới 6 loại nấm Linh Chi khác nhau, nhƣng tất cả đƣợc ph n
loại theo màu sắc, y học coi nấm Linh Chi đỏ là loại có dƣợc t nh đa dạng và
mạnh nhất, do đó nó là loại Linh Chi đƣợc dùng phổ biến nhất trên thế giới.
Vô số các tài liệu, trang web khi đề cập đến nấm Linh chi nói chung, là mặc
định nói về nấm Linh chi đỏ. Nấm Linh chi trồng phổ biến ở Việt nam là nấm
Linh chi đỏ. Loại nấm Linh chi trồng tại Hàn Quốc, Nhật Bản, hay Trung
Quốc, cũng là nấm Linh chi đỏ.Tuy nhiên, chất lƣợng nấm Linh chi (đỏ) mỗi
nơi mỗi khác nhau do ảnh hƣởng bởi các yếu tố về giống, điều kiện môi
trƣờng, phƣơng pháp gieo trồng, cách chăm sóc, thu hoạch...
1.1.4.2. Những yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh trƣởng và phát triển
của nấm Linh chi
- Nhiệt độ: giai đoạn nuôi sợi, nấm Linh chi sinh trƣởng và phát triển
tốt ở nhiệt độ 2030oC, giai đoạn hình thành quả thể nhiệt độ thích hợp
2228oC.

- Độ ẩm: độ ẩm cơ chất khoảng 6065%. Độ ẩm khơng khí của nhà
nuôi 8095%.
- Ánh sáng: Giai đoạn nuôi sợi cần k n gió, độ sáng vừa phải. Giai đoạn
quả thể phát triển: cần ánh sáng tán xạ (ánh sáng đọc sách đƣợc), ánh sáng
đƣợc c n đối từ mọi phía.


9
- Độ pH: Linh Chi th ch nghi trong môi trƣờng trung t nh đến axit yếu
(pH 5,5-7).
- Độ thoáng: trong quá tr nh sinh trƣởng và phát triển nấm Linh chi cần
độ thơng thống tốt.
1.1.4.3. Thành phần hóa học Nấm Linh Chi
Có nhiều cơng tr nh nghiên cứu trên thế giới đã định danh đƣợc các
hoạt chất và xác định tác dụng dƣợc lý của nấm linh chi nhƣ: Germanium,
acid ganoderic, acid ganodermic, acid oleic, ganodosteron, ganoderans,
adenosin, beta-D-glucan, (đặc biệt trong nấm Linh chi, có hàm lƣợng
germanium cao hơn trong nh n s m đến 5 - 8 lần). Các nhà khoa học Việt
Nam t m thấy trong nấm Linh chi có chứa 21 nguyên tố vi lƣợng cần thiết cho
sự vận hành và chuyển hóa của cơ thể nhƣ: đồng, sắt, kalium, magnesium,
natrium, calcium.
Sau đ y là những thành phần hóa học chính của nấm Linh chi:
- Hợp chất đa đƣờng (45% số lƣợng): arabinogalactane, beta-Dglucane; ganoderane A, B, C.
- Triterpene: axit ganoderic A, B, C, D, F, H, K, M, R, S, và Y.
- Ganodermadiol phân sinh của loại axit lanostaoic.
- Esteroides: Ganodosterone.
- Axit béo chƣa bão hịa
- Chất đạm protide: Ling Zhi-8, glycoproteine (lactine).
- Khống chất: Ca, Ge, Co, Mg, Fe, Mn, Zn, Be, Cu, Ag, Al, Na…
- Những chất khác: manitole, adenine, trechalose, uracine, lysine…

Qua ph n t ch về các mặt dƣợc t nh, dƣợc lý và sử dụng nấm Linh chi,
ngƣời ta thấy Linh chi có tác dụng rất tốt với các bệnh nhƣ: bệnh tim mạch,
hô hấp, tăng khả năng miễn dịch, trị bệnh gan, có hiệu quả trong chống ung
thƣ, khả năng kháng HIV…, ngoài ra các hoạt chất sinh học trong nấm Linh
chi có khả năng khử một số gốc tự do sinh ra trong quá tr nh lão hóa cơ thể


10
hay do nhiễm xạ. Chúng làm phục hồi các tổ chức bị tổn thƣơng và không g y
hiệu ứng phụ nào cho cơ thể.
1.1.5. Các mẫu nấm đƣợc nghiên cứu trong đề tài

MN 206: Ganoderma triangulatum

MN 205: Phellinus melanodermus

MN202: Ganoderma applanatum

MN 203: Ganoderma lucidum

MN 210: Phellinus setulosus

MN 201: Hexagonia apiaria


11
MN 207: Nigrofomes melanporus

MN 204: Ganoderma philippii

MN 209: Ganoderma fulvellum

MN 211: Ganoderma lobatum

1.2. GIỚI THIỆU VỀ VITAMIN B1, B6
Tên gọi "vitamin" có từ năm 1912 do nhà khoa học Ba Lan Funk với ý
nghĩa đó là những "amin sống". Chúng đƣợc chia thành 2 nhóm lớn.
- Các vitamin tan trong nƣớc: Các vitamin nhóm B, vitamin C,
vitamin PP, vitamin P, chủ yếu tham gia vào các quá trình liên quan tới sự
giải phóng năng lƣợng nhƣ q trình oxi hố khử, quá trình phân giải các
hợp chất hữu cơ.
- Các vitamin tan trong dầu: Vitamin A, D, E, K tham gia vào các phản
ứng tạo nên các chất có chức năng cấu trúc các mơ, các cơ quan.
Vitamin nhóm B là hợp chất rất quan trọng trong tế bào sống nhƣ là
thành phần cần thiết cho sự phát triển.
1.2.1. Vitamin B1
• Tên gọi khác: Thiamin, aneurine hydrochloride
• Tên IUPAC: 2-[3-[(4-amino- 2-methyl- pyrimidin- 5-yl) methyl]- 4methyl- thiazol- 5-yl] ethanol
• Cơng thức ph n tử: C12H17N4OS+Cl-.HCl
• hối lƣợng ph n tử: 337.27
• pKa1 =4.8, pKa2 =9.0
• Cơng thức cấu tạo:


12

Ngồi ra thiamin cịn tồn tại dƣới dạng photphat este gồm
thiaminmonophotphat

(TMP),

thiamin

triphotphat

(TTP),

thiamin

pyrophotphat (TPP) là dạng mà vị trí OH sẽ đƣợc đ nh vào hoặc 1, 2 hoặc 3
gốc photphat (R).
1.2.1.1. Tính chất vật lý
Vitamin B1 là những tinh thể trắng hình kim hay ở dạng vẩy, có mùi
đặc trƣng.

hi tiếp xúc với khơng khí, chế phẩm khan nhanh chóng hút ẩm

(khoảng 4% nƣớc).
Vitamin B1 có tính axit, hồ tan tốt trong mơi trƣờng nƣớc, axit axetic,
nhƣng khó tan trong ethanol 96% và methanol, không tan trong ete, benzen
hay chloroform và chịu nhiệt khá nên không bị phân huỷ khi nấu nƣớng.
Vitamin B1 nóng chảy ở 2330C-2520C. Vitamin B1 bền trong mơi trƣờng
axit, cịn trong mơi trƣờng kiềm nó rất dễ bị phân huỷ khi đun nóng. Trong
mơi trƣờng khơng phân cực vitamin B1 hấp thụ tại 2 bƣớc sóng λmax1=246.9
nm và λmax2 =264.5 nm.
1.2.1.2. Tính chất hóa học
Thiamin bị oxy hóa bởi K3[Fe (CN)6] trong mơi trƣờng kiềm tạo
thành thiocrom màu vàng phát huỳnh quang màu xanh da trời, tính chất này
đƣợc dùng để xác định B1 bằng phƣơng pháp đo huỳnh quang.
CH2CH2OH

S
N

H3C
N

NH2
CH2

CH2CH2OH
N


N

CH3

N
H3C

Thiamin

N

N

Thiocrom

CH3

13

Thiamin tạo kết tủa khi phản ứng với tannin, thủy ngân (II) clorua,
axit picric.Trong cơ thể, vitamin B1 tham gia vào nhiều phản ứng chuyển
hóa, đặc biệt là chuyển hóa glucid.
1.2.2. Vitamin B6
• Tên IUPAC: 4,5-di (hydroxymethyl)-2-methylpyridin-3-ol
• Cơng thức ph n tử: C8H11NO3.HCl
• hối lƣợng ph n tử: 169,18 đvC
• pKa1 =2.7, pKa2 = 4.8
• Cơng thức cấu tạo: Vitamin B6 tồn tại trong cơ thể ở 3 dạng khác
nhau: Piridoxol, Pyridoxal, Pyridoxamin. Ba dạng này có thể chuyển hố
lẫn nhau.

1.2.2.1. Tính chất vật lý
Vitamin B6 là tinh thể khơng màu, vị hơi đắng, hòa tan tốt trong nƣớc
và trong rƣợu, chịu nhiệt, nhạy cảm với ánh sáng, pyridoxin bazơ có nhiệt độ
nóng chảy ở 1600C, pyridoxin hydrochloric nóng chảy ở 204 -2060C, bền
vững khi đun nóng. Bền khi đun sơi trong axit hay kiềm, khơng bền trong mơi
trƣờng có tính oxy hóa.
Vitamin B6 nhạy cảm với ánh sáng, chúng phân hủy nhanh khi chiếu
sáng ở môi trƣờng kiềm hay trung tính, cịn trong mơi trƣờng axit thì
pyridoxin, pyridoxan và pyridoxamin bền hơn. Tính chất vật lý của vitamin
B6 đƣợc tóm tắt ở bảng dƣới.


14
Bảng 1.1: Tính chất của 3 dạng vitamin B6

Tên hoạt chất

Pyridoxin.HCl Pyridoxan.HCl Pyridoxamin.HCl

KLPT

205,64

303,63

241,12

CTPT

C8H12ClNO3

C8H9NO3.HCl

C8H12N2O2.HCl

Nhiệt độ nóng chảy (0C)

204 - 206

160

226 - 227

λmax (nm)

292; 290; 253

390; 318

328; 253

1.2.2.2. Tính chất hóa học của vitamin B6
Tất cả 3 chất trên đều có t nh bazơ do nh n pyridin g y ra tác dụng với
các axit tạo thành muối. Chế phẩm dƣợc dùng là pyridoxin hydroclohidrat dễ tan
trong nƣớc, tạo muối, kết tủa với axit silicovonframic, axitphotphovonframic, dễ
hòa tan trong các dung dịch kiềm.
Vitamin B6 dễ bị oxy hóa, tác nhân xúc tác quá trình này là ánh sáng
tia tử ngoại, vitamin B6 tác dụng với Fe (III) cho muối phức màu đỏ. Vitamin
B6 ở dạng dẫn xuất photphat nhƣ pyridoxan photphat tham gia nhóm ngoại
(coenzyme) của nhiều men nhƣ: transaminase, decacboxylase, dehydro
desylfuarase… tham gia trong các quá tr nh chuyển hóa axit amin, lipid,
glucid, chuyển protein sang glucid.
Vitamin B6 giữ vai tr đặc biệt trong chuyển hóa acid amin:
COOH
CHNH2

CH3

+

CH2

CO
COOH

COOH

acid aspartic

enzym chứa

COOH
CO

vitamin B6

CH3

+

CH2

CHNH2
COOH

COOH

acid pyruvic

acid oxalacetic

alanin

1.2.3. Vai trò và nhu cầu của vitamin B1, B6 đối với cơ thể
 Vitamin B1

- Vitamin B1 c n gọi là thiamine (dƣỡng chất năng lƣợng) có vai tr vô
cùng quan trọng trong việc duy tr các hoạt động tƣơng tác của tế bào trong cơ


15
thể, nhất là việc sản xuất năng lƣợng. Trong đó các tế bào của cơ thể đã dùng
ôxy để chuyển hóa carbohydrate và các loại đƣờng thành năng lƣợng.
Bởi vậy, nếu khơng có vitamin B1 hoặc thiếu hụt nguồn dƣỡng chất này
th hiệu quả sản xuất năng lƣợng có thể sẽ bị suy giảm hoặc bị vơ hiệu hóa.
- Vitamin B1 c n có tác dụng hỗ trợ và bảo vệ hệ thống thần kinh trƣớc
nguy cơ bị tổn thƣơng và thối hóa.
- Ngồi ra vitamin B1 c n hỗ trợ các bộ phận trong cơ thể và hệ thần
kinh ngắt các thông báo truyền gửi cho nhau
- Vitamin B1 chữa một số biểu hiện thần kinh, viêm dây thần kinh (do
rƣợu, rối loạn tiêu hoá, nhiễm độc do nhiễm khuẩn…) do đau thấp khớp, zona.
Những bệnh về tim và tiêu hoá, gan, đi lỏng, xơ gan, thoái hoá mỡ, trong những
trƣờng hợp nhiễm khuẩn đƣợc điều trị bằng kháng sinh, salicylat, sulfamid….
- Nhu cầu về vitamin B1 phụ thuộc vào các điều kiện khác nhau nhƣ
trạng thái sinh lý của cơ thể, chế độ thức ăn, làm việc… Trung b nh cơ thể
ngƣời cần từ 200mcg -1,3 mg vitamin B1/ngày.
 Vitamin B6
- Vitamin B6 là một loại vitamin h a tan trong nƣớc và là một phần của
nhóm vitamin B. Vitamin B6 hoạt động nhƣ một coenzym giúp chuyển hóa
tryptophan thành niacin.
- Nó c n đóng vai tr quan trọng trong việc chuyển hóa chất đạm, chất
béo, carbohydrate. Vitamin B6 tham gia vào quá tr nh tổng hợp hemoglobin
và sự bài tiết của tuyến thƣợng thận.
- Vitamin này c n cần thiết cho phản ứng lên men tạo glucose từ
glycogen, góp phần duy tr lƣợng đƣờng huyết trong máu ổn định; giúp
bảo vệ tim mạch, tăng cƣờng hệ miễn dịch và duy tr chức năng não

khỏe mạnh.


16
- Thiếu hụt vitamin B6 có thể dẫn đến thiếu máu nguyên bào sắt, viêm
dây thần kinh ngoại vi, viêm da, tăng bã nhờn, khô nứt môi. Vitamin B6 dùng
điều trị nhiễm độc isoniazid hoặc cycloserin.
-

Lƣợng vitamin khuyến cáo dùng mỗi ngày khác nhau tùy theo giới

t nh và độ tuổi và sẽ ngày càng tăng khi già đi. Trung b nh cơ thể ngƣời cần từ
100mcg -2,0 mg vitamin B6/ngày.
1.3. PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VITAMIN B1, B6
Hiện nay có nhiều phƣơng pháp để nghiên cứu xác định hàm lƣợng
vitamin nhƣ: Phƣơng pháp cực phổ, Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng
cao, phƣơng pháp phổ đạo hàm bậc, phƣơng pháp trắc quang… Tuy
nhiên, để chọn phƣơng pháp vừa đảm bảo độ chính xác, tính kinh tế và
tính khả thi phù hợp với nhiều phịng thí nghiệm, thì trong luận văn này
chúng tôi đã chọn phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) vì nó
có nhiều ƣu điểm nhƣ: ph n t ch đồng thời nhiều hợp chất, không cần làm
bay hơi mẫu, độ nhạy, độ phân giải cao, nhanh chóng, dễ dàng kết nối với
khối phổ…
1.3.1. Cơ sở lý thuyết của phƣơng pháp
HPLC là chữ viết tắt của 04 chữ cái đầu bằng Tiếng Anh của phƣơng
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography),
trƣớc kia gọi là phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid
Chromatography).
Phƣơng pháp này ra đời từ năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải
tiến từ phƣơng pháp sắc ký cột cổ điển. Hiện nay, phƣơng pháp HPLC ngày

càng phát triển và hiện đại hóa cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành
chế tạo máy ph n t ch. Hiện nay đ y là phƣơng pháp áp dụng rất lớn trong
nhiều ngành kiểm nghiệm đặc biệt là ứng dụng cho ngành kiểm nghiệm


17
thuốc, là công cụ đắc lực trong ph n t ch các thuốc đa thành phần cho phép
định t nh và định lƣợng.
Ƣu điểm của HPLC:
- Điều kiện ph n t ch khá dễ dàng.
- Dễ dàng thu hồi chất ph n t ch với độ tinh khiết cao.
- Độ lặp lại cao.
- Thƣờng không ph n hủy mẫu trong quá tr nh ph n t ch.
Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phƣơng pháp chia tách trong đó pha
động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã đƣợc ph n chia
dƣới dạng tiểu ph n hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một
chất mang đã đƣợc biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ.
Quá tr nh sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, ph n bố, trao đổi ion hay ph n
loại theo k ch cỡ (R y ph n tử).
Trong luận văn này chúng tôi sử dụng Hệ thống sắc ký Alliance với
bơm 2690, detector huỳnh quang 2475 (Hãng Waters, Mỹ)
1.3.2. Phân loại sắc ký và ứng dụng
Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá tr nh sắc
ký và loại sắc ký. Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ th ta có sắc ký hấp phụ pha
thuận hay pha đảo. Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion th ta có Sắc ký trao đổi
ion. Nếu pha tĩnh là chất lỏng th ta có sắc ký ph n bố hay sắc ký chiết. Nếu
pha tĩnh là Gel th ta có sắc ký Gel hay R y ph n tử. Cùng với pha tĩnh để rửa
giải chất ph n t ch ra khỏi cột chúng ta cần có một pha động. Nhƣ vậy, nếu
chúng ta nạp mẫu ph n t ch gồm hỗn hợp chất ph n t ch A, B, C.. Vào cột
ph n t ch, kết quả các chất A, B, C.. sẽ đƣợc tách ra khỏi nhau sau khi đi qua

cột. Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký ở đ y là tổng hợp các tƣơng tác
F1, F2 và F3.
Chất ph n tích A + B + C