Xác định đột biến trên exon 4 của gen SRD5A2 gây bệnh thiếu hụt enzym 5a reductase týp 2

•KT

4» HỄ?


LỞI CÁM ƠN

Trong quã trinh học đại học. khóa luận tốt nghiệp chinh là một dấu ẩn
quan trọng trong quá trinh học tập và nghiên cứu tại trường. Thời gian tiến

hành làm khóa luận lốt nghiệp tại khoa Kỹ Thuật Y học- Trường Dại học Y Hà
Nội vừa qua đà giúp cin học hoi dược nhiêu điều, từ chuyên môn kiến thức

cùng như tãc phong làm việc từ các Thày cô, anh chị và hạn bè trong khoa.
Trước tiên, em xin bày tõ sự cam ơn sâu sắc đến Th$. Lê Hồng Bích Nga

giăng viên Rộ mơn Hóa Sinh lâm sảng. Khoa Kỳ Thuật Y hục. Trường Đại
học Y Hả Nội. là người Thầy đà hướng dẫn. tận lính giúp đờ. ln dưa ra
nhùng góp ý quỹ báu. sửa chừa II mf cùng như nhừng lởi khuyên hừu ích, tụo
điêu kiện giúp cm hồn thiện khoa luận tót nghiệp.
lùn xin cam ơn Ban Giảm Hiệu. Phòng Quan lý Dáo tạo Đại học.

Trương Dai học Y llà NỘI dà tao mọi diều kiện thuận lợi giúp cm hoan thanh

khóa luận.

Em xin chân thảnh cam ơn sáu sic tới Ban Giám Đốc và câc anh chị kỳ
thuật viên Trung tâm xét nghiệm Chcmedlc dà ln giúp dị cm tận tỉnh dê
em có thê hồn thành khóa luận nảy.
Em xin cám

dền cãc Thầy cô bộ môn I lõa sinh làm sảng. Khoa Kỹ

thuật Y Học, Trường Đại học Y Hà Nội đâ tạo mọi dièu kiện tốt nhất cho em
dược thực hiện khóa luân

Cuòi cùng, em xin gứi lời cam ơn tới gia dinh, ban bẽ dã quan tàm.

dộng viên, chia sc những khô khản với em trong suỡt qua trinh hục tập.

Hà Nội, nỵày thủng năm 2020

Sinh viên

HỒNG THỊ HUN TRANG

•W.- .-Tí ca:

<€

4» HỄ?


Cộng hịa xà hội chu nghía Việt Nam
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

____ ****____

LỜI CAM 1)0AN

Kính gứi: Phịng Quan lý Đào tạo Đại học - Trường Đại học Y Ilâ Nội

Hội đồng chầm khóa luận tổt nghiệp

Tơi xin cam đoan đây là công tnnh nghiên cứu cua tôi với sự giúp đờ

cua thây cô tại Khoa Kỳ thuật Y học- Truông Đụi học Y Hà Nội, tất ca cảc số
liộu trong khóa luận náy la trung thực và chưa tửng được cõng bô trong bât cử
công trinh nghiên cửu nào khác.

Hà Nội. ngày lluinịỉ nũm 2020

Ngirài vií-t khỏa luận

Hồng Thị Hun Trang

•W.- .-Tí ca:

<€

4* HỄ?


DANH MỤC VIÉT TẤT

bp

base pair

(ỉclNTP

Dideoxvribonucleotid tripỈK>sfđiate

DHT

Dihydrotestosteron

DNA

Deoxyribonucleic Acid

dNTP

Deoxyribonucleotid triphosphat

DSDs

Disordner of sex development

EDTA

Ethvlen
diamine teiraacetic acid
*

FSH

Follicle stimulating hormone

LH

Homxm Luteinizing

OD

Optical Density (Độ hấp thụ quang)

PCR

Polvmerase
Cliain Reaction
•
(Phan ứng khuếch đại chuồi

polymerase/

T

Testosterone

SRD5A2

Steroid 5-alpha-reductase 2

•W.- .-Tí ca:

<€

4» HỄ?


MỤC LỤC

LỜI CẤM ON

DANH MỤC BANG
DANH MỤC HÌNH
DANII MỤC VIÉT TÁT

DẠT VÁN DÈ___________________________________________________ 1
CHƯƠNG I: TÔNG QVAN TÀI LIẸƯ------- ---- --------------- ------ --------- 3
1.1. Bệnh thiếu en/ym 5tt- reductase ĩýp 2.......................................................... 3
1.1.1. Giời thiệu về bênh DSD

1.1.2. Độc diêm làm sàng bệnh thiêu hụt enzym 5«- reductase týp 2................ 5
1.1.3. Cơ chẽ gãy bệnh thicu hụt enzym 5<í- reductase tvp 2............................ 6
1.1.4. Đặc diêm cận lãm sảng bệnh thiếu hụt enz.ym 5(1- reductase týp 2......... 7

1.2. Tỏng quan VC gcn va protein SRD5 A2.........................................................9
1.2.1. Gen SRD5A2

1.22. cáu tnic protein SRD5A2.... ..............
1.2.3. < hưc nang cua gen SRD5A2

9
....................... •••••••■••...... •••••• 10

1.2.4. Đột biến gcn SRD5.A2........

1.3. Các kỳ thuật sinh học phân tu dược sư dụng dê phát hiên đột biền gcn . 13
1.3.1. Kỳ thuật PCR.

1.32. Kỳ thuật giái trinh lự gen (DNA sequencing!......................................... 16
CHƯƠNG II: DOI TƯỢNG VÀ PIIƯONG PHÁP NGHIấN CU____ 19

2.1. Di tng nglỡicn cu..... .................... ãããããằãôã......

19

2.2. Da diem và thời gian nghiên cứu.............................................................. 19
2.3. Phương phap nghiên cứu...................................................................

19

2.4. Quy trinh nghiên cửu
2.5. Dụng cụ. trang thiết bị vả hóa chất nghiên cứu......................................... 20

•W.- .-Tí ca:

<€

4* HỄ?


2.5.1. Dụng cụ. trang thiết bị.

•••••••••••••a.20
4» V

2.5.2. Hoa chát.....................

21

2.6. Quy trinh ky thut ã

ããããằããã ããôããô ... .1

22

2.6.1. Ly mu v thu thập thòng tin lâm sàng cua bệnh nhãn.........

22

7 6 2 Tárh rhiPt BXĨA
4»»v»4»« I civil VIIIVl 4-*» ’4 B

2.6.3. Kiêm tra chất lượng DNA tách chiết......................................

.23

2.6.4. Kỳ thuật PCR khuếch đụi một đoạn gen SRD5A2..

.23

2.6.5. Kicm tra san phàm PCR trên gel agarose................

.24

2.6.6. Giai lành tự gen và phân lích kết quả......................

26

2.7. Vàn đê đạo đức trong nghiên cứu...............................................

26

CHƯƠNG III:KÉT QUÁ________________________________

27

3.1. Kêt qua tách chict DNA...............................................................

27

3.2. Ket qua khuếch đại cxon 4 cua gen SRD5A2.............................
3.3. Kết qua giai trinh lự cxon 4 cua gen SRD5A2...........................

CHƯƠNG IV: BÀN LUẬN______________________
4.1. Kết qua lách chiết DNA

IM(I

•• •••••••••••• •••••••• •• • ••••••••••• ••••••••••

• ••••

28

29
••••••••••••• 32

• •• ••.. •32

’•B

■ ã

4.W. Kct qua Pt, l^.a.
4.3. Ket qua giai trinh tự cxon 4 gen SRD5A2..................................................35
4.4. Kết qua đột biền gen SRD5A2..

..36

KÉT LUẬN

TÀI LIỆU THAM KIIAƠ

•W.- .-Tí ca:

<€

4* HỄ?


I)A\H MỤC BÀNG

Bang 2.1. Trinh tụ mồi exon 4 cùa gen SRD5A2............................................. 21

Bang 2.2. Thành phàn tham gia phan ứng PCR................................................ 24
Bang 2.3. Chu kỳ nhiệt phan ứng PCR....... ~............ ........................................ 24

Bang 3.1. Kểt qua dơ nồng độ và độ tinh sạch cua các mảu DNA................. 27
Bang 3.2. Kết qua đột biên gen SRD5A2 trên bệnh nhân thiếu hut enzyme 5areductase týp 2

•W.- .-Tí ca:

<€

4* HỄ?


DANH MỤC HÌMI

Hình 1.1. Hình thanh cư quan sinh dục ư nam va nữ giưi.................................. 3
Hình 1.2. Biêu hiện lãm sang ơ bệnh nhàn thiếu hụt enzym 5(i-reductase týp 2

trước tuời dậy thí.........

Hình 13. Sân phâm chun hóa cua oostisol........

Hình 1.4. Vị trí cùa gen SRD5A2
Hĩnh 13. Cấu trúc tồng thê cùa protein SRD5A2.............................................. 9
Hình 1.6. Chuyến hóa cúa testosterone dưới lác dụng của 5a-reductase...... 10

Hình 1.7. Các đột biển đtrực phát hiện trên gen SRD5A2 gây bệnh thiếu hụt
5(i-reductase týp 2. Các exon SRD5A2 dược xảc định tử 1 đền 5. 12

Hình 1.9. Càu tụo phàn lư ddNTP..........................
Hình 1.10. Kỹ thuật giai trinh lự gen Sanger..................................................... 18

Hỉnh 3.1. Minh họa kết qua do mật dộ quang hợc trẽn mảy Nano Drop One
cùa mâu SRD5A2- 03 sau khi lách chiêt............................... ...........27
Hình 32. Kct qua diện di san phẩm PCR trên gel agarose 1.5%.................... 28

Hình 3.3. Minh họa kết quá giai trinh tự gcn cxon 4 cua gen SRD5A2.........30
llỉnh 3.4 Hình ánh dột biền trên exon 4 cùa gen SRD5A2 cua bệnh nhàn

$RD5 A2 - 01 mác bệnh thiếu hụt enzyme 5a-reductase týp 2....... 31
llính 3.5 Hình anh dột biền trên cxon 4 cùa gen SRD5A2 cua bệnh nhân

SRD5A2- 02 mẩc hộnh thiêu hụt enzyme 5íi-reductase týp 2........ 31

Hình 3.6. Hình anh dột biến trên cxưn 4 cua gen SRD5A2 cua bệnh nhân

SRD5A2-03 mac bệnh thiều hụt enzyme 5(1-1 eductase týp2....... 31

•W.-

<€

4* HỄ?


1

DÁT
• VÁN l)È
Bệnh rối loạn phái trién giới tính (DSDs) là một nhỏm các bệnh lý rối
loạn hiếm gặp. độc trung hai hẩt thường nhiễm săc thể, tuyến sinh dục hoặc

biểu hiện xác định sự phát triển giới lính. Tỷ lệ bệnh nhàn mÁc bệnh DSDs

chưa được thông kê rõ ràng trên thê giới,
Bệnh thiêu hụt en/.ym 5u-reducta.se týp 2 là một trong sỗ các bệnh diên

hình cua bệnh rối loạn phát triên giới tính nhóm bệnh 46.XY DSDs. Bệnh
nhân thiếu hụt cnxym 5u-rcducta.se týp 2 có các đậc diêm lãm sáng như:

dương vật nhị. ló đái thấp, bíu chẽ dơi. ẩn tinh hồn. Những bắt thường này

có thê dược xảc dịnh sớm từ trong thai kỳ nhở siêu âm, ỡ giai doạn sơ sinh,
trẻ cỏ cơ quan sinh dục không rô ràng, luyến sinh dục và cơ quan sinh dục

không phù hợp với đặc diêm bộ nhiêm sac thê giới tinh; và giai doạn dậy thỉ,

tre có bệnh lý rối loạn phát triển giói linh
Nguyên nhân gây bệnh là do thiều hụt enzym 5«i-reduclase týp 2 - một
enzym xúc tãc chun đơi testosterone (T) th a nil dihydrotestosterone (DHT),

dóng vai trờ trung lãm trong sự phàn hóa giới tính vã smh lỹ androgen, tàc
dộng trục tiếp váo sự phát triên giới lính ờ nam giói. Enzym 5u- reductase týp

2 dược mà hoa bơi gen SRD5A2. Nghiên cứu cho thấy, các bất thường trên

gen SRD5A2 lảm thay dôi. giám nồng độ vả hoạt tinh cua enzym 5ureductase tỹp 2. dán dến giâm hĩnh thảnh DI IT. gãy nên sự xuất hiện cũa cơ
quan sinh dục khơng dicn hình.

Dê chắn đốn bộnh thiểu hụt enzym 5u-rcductase týp 2, câc hác sỳ dựa
vảo đặc diêm lãm sàng bất thưởng, dặc diêm cận lâm sàng: XĨI nghiệm cảc

hormone, mơ bệnh học tuyến sinh dục. phân tích nhiêm sấc thê Dê khảng
dịnh chân đốn, bệnh nhãn nghi ngờ mắc bệnh thiêu hụt enzym 5u-reductase

tỷp 2 cân được tiên hanh phân tích dột biên gen SRD5A2. Câu true gen

•W.' .-Tí Ca:

<€

4» HỄ?


2

SRD5A2 gốm 5 exon, trong dó exon 4 đả được cịng bỗ có nhiên dột biển liên
quan dền chức năng va hoạt tính cua en/ym.
Xuất phát tư thực te trên chúng tôi thục hiện dè tài: “ Xác dịnh đột

biên cxon 4 trên gen SRD5A2 gây bịnh thiếu hụt cn/.yin 5u-reductase týp

2” với mục tièu: "P//(ữ hiên dột biền trên exon 4 cùa gen SRDỈA2 trên bệnh

nhân bị thiếu hụt enzym ĩa-reductase tỷp -

•W.- .-Tí ca:

<€

4* HỄ?


3

CHƯƠNG I: TONG QI AN TÀI LIFT

1.1.

Bệnh thlcu rnn-m Sa-reductase týp 2

ỉ.ỉ.l. Giới thiệu về bệnh DSD
Bệnh rối loạn phát triển giới tính (DSDs) lá một nhóm các bệnh lý rồi

loạn hiếm gặp thường được đặc trưng hỡi đặc điểm bẩt thường cua các nhicm

sẳc thê. tuyền sinh dục hoặc kiêu hình thường xác dinh sụ phai triền giói
tinh. Bỹnh nhan cứ đặc diêm CO' quan sinh dục bẩl thường ớ tre sơ sinh hoặc
có đặc diêm dậy thí muộn ờ thanh thiều nicn 11 ].

Sự phát triển giới lính bao gồm ba giai đoạn: (I > thiết lập giới lính di

truyền tại thời diêm thụ tinh (2) giai doạn tạo thành cơ quan sinh dục trong

quá lành biệt hõa tuyến sinh dục (3) biệt hóa kiêu hình tuyển sinh due dần
dền sự khác biệt cua các cơ quan sinh dục ngồi và xoang niệu sinh dục theo
giới tính [2].

BaMipUstlra

Btu ắ< f4ó»tW»

Hịaatia

Uib.

Hình 1.1. Hình thành cơ quan sinh dục ớ num và nữ giới

(Nguồn: Britannica/

•KT

4» HỄ?


4

Cơ quan sinh dục ngoải phát sinh từ màu sinh dục, bíu mơi phơng lên
và các nẻp niệu dạo. Ỡ nữ giới, chúng trơ thành âm vật. min lớn và mòi bé. Ở

nam giới, dưới anh hương cua dihydrotcstostcrơn. mấu sinh dục trư thanh quy

dâu cua dương vật. các nep gấp niệu sinh dục dái ra và hợp lại dè tựo thánh
trục cua dương vật. vả các hạch sinh dục nôi lén hợp nhát dê tạo thành
biu. Quá trinh hợp nhất được hoàn thành sau 70 ngày tuồi thai và sự phát triển

cua dương vật tiêp tục kéo dài [3]. Sự biệt hóa cùa nừ giới khơng bị anh
hưởng của nội tiết tổ, trong khi sự phát triển bính thường cúa cơ quan sinh

dục nam dõi hoi sự tống hợp testosterone bính thưởng, chuyển đơi thânh DHT
bơi 5u*reductase và các thụ thè androgen bính thường.

Nâm 2006. một nhóm chuycn gia Hiệp hội NỘI tiết Nhi khoa châu Âu

(ESPE) và Hiệp hội NỘI tiết Nhi Lawson Wilkins (LWPES) dà dê xuát phân
loại mới cho DSDs. Theo dó. những rồi loạn nay được chia nho thành:
- Nhóm bẩt thường nhiêm sấc thè giới lính

- Nhóm cỏ bộ nhiễm sảc thề: 46. XY DSDs (rỗi loạn phát triển tinh
hốn (ví dụ. rối loạn phát triền tuyến sinh dục hồn tỗn / một phần. DSD

buồng trứng và thoái triển tuyến sinh dục) vả rối loạn tồng hợp androgen )

• Nhõm có bộ nhiêm sấc thê: 46, XX DSDs (roi loạn phát triển buồng
trứng (ví dụ, rối loụn sinh due. DSD buồng trứng vả DSD tinh hoàn) vá rối
loạn dư thừa androgen [4].
Theo phân loại nay. bệnh thiếu hụt cn/ym 5a-rcductase týp 2 thuộc

nhóm bệnh 46. XY DSDs bao gồm nhùng rồi loạn cua tuyến sinh dục hoặc
phát Iriên tinh hốn hay suy yen tơng họp vá tac động androgen.

•W.-

<€

4* HỄ?


5

•
f
1.1 J. Dặc diem tàm sàng bệnh thiêu hụt enzynt Sa- reductase týp 2

Hình 1.2; Biêu hiện lâm xàng ỡ bịnh nhũn thiếu hụt enzym 5a-redncfase

íýp 2 trước tuổi dậy thi.
(Nguồn. Sahahtrungruang ĩ. 2008)

Bệnh thiểu hụt cnzym 5a-rcductasc týp 2 là một trong hai nguyên nhân

lớn gáy ra bệnh rối loạn phát triển giới tính ờ nam giới, với câc đậc diem lâm

sảng điên hình như: dương vạt nho, lồ đái thắp, bíu chẽ đơi, ẩn tinh hồn, nừ

hóa. Câc trưởng hựp nủy thường chậm phát triên chiều cao. phât tnên làm
thần binh thường. Tinh hoàn ơ nhùng dứa trc này có thê nảm trong túi bẹn. và

rắt hiếm khi phát hiện được khi người mẹ mang thai Tre nãy có xu hưởng
dược ni dạy như nữ giới cho đen lũi dậy thi. khi đó chung bắt dâu biêu

hiện nam lính hóa (6Ị.

Trong giai đoạn dày thí. sự gia lãng nóng dộ hormone sinh dục nam dẫn

den sự phát triển cua một sổ dậc diem giới lính phu. chăng hạn như tàng khối
lượng cơ. trầm giọng, phát triền lông mu vả tảng tốc, dương vật vâ bíu (túi da

giừ tinh hỗn) phát triền lớn hơn. Khơng giống như nhiều nam giới, những

người bị thiều hụt 5«-reductase týp 2 khơng phát triển nhiêu lơng trên mặt

•W.-

&.ÌỊK <€

4* HỄ?

6

hoặc co thê. 0 tre nừ. (hiếu hụt 5u- reductase tỹp 2 thường khơng biêu hiện
lảm sàng, tuy nhiên có ca lâm sáng don le thiêu 5(i-reductase týp 2 o nũ được

mõ ta với dấu hiệu vỏ kinh nguyên phát, vú kém phát triẻn [7].
Ị.u. Cơ chê Ịịay bệnh thiêu hụt enzym 5u-reductase týp 2

Phói thai người có kha nâng phát triên và biệt hóa thành ca hai hộ
thống sinh san nam và nữ. Vảo thời diêm tuần thứ 6 của thai kỳ. cơ quan sinh

dục bên trong cúa phôi thai giống hột nhau ca hai giới gọi là giai doạn sinh
dục tning tính, bao gồm các ống Wolff và các ống Mullcr. Khi thiếu
testosterone, thai nhi sỉ phải triển hệ thống sinh sân nử. Sự biệt hóa cua ninh

sinh dục nguyên thủy chưa phân hóa thành hệ thống sinh san đực được bát

dâu trong thời kỳ phôi thai bin gen SRY nám trẽn nhanh ngẩn cua nhiêm sắc
the Y. Testosterone do tinh hoan san xuất dàn đến sự biệt hóa cua ổng
Wolffian ờ nam đè tạo thanh co quan sinh dục bén trong cua nam bao gồm túi

linh, mão tinh vả ống dan tinh . Giai đoạn cuối là biệt hóa kiêu hình tuyến

sinh dục dẫn den sự khác biệt cua cãc cơ quan sinh dục ngoải và xoang niệu
sinh dục theo giới tinh. Giai đoạn nãy cua quá trinh biột hóa giới linh phụ
thuộc vào hoạt dộng cua testosterone và dihydrotestosterone (DHT: hormone
steroid chính cho thụ the androgen) thông qua thụ thê androgen. Cơ quan sinh

dục ngoải dền tuần thai thứ 10 vần cò các đặc diém chung cho ea hai giới. cẩu
trúc ban đau gồm cỏ 3 bộ phận cơ ban là cù sinh dục. gở sinh dục vá phèu

sinh dục. (ỉ bảo thai nam quổ trinh hình thành các phần cua co quan sinh dục
ngồi lá do tac dộng cua testosteron chuyên thanh DHT do có enzym 5a-

reductase. DHT có ai lực rai cao VỜI các thụ the androgen. DHT phát tnên

dương vật. bíu vã lien liệt tuyên và niệu dao theo giới nam. Co quan sinh dục

ngồi cua nừ biệt hoa khơng cỏ vai trị cua DHT [2].(3].

•W.-

.ZtiW <€

4* HỄ?


7

1.1.4. Dộc diêm CỘII lầm sùng bệnh thiền hụt enzynt Sa-redtidase týp 2
Củng với các đặc điểm lâm sang trên, các chi sỗ cận lâm sàng: nông độ

hormone LH. FSH; ty lệ T/DHT tnróc và sau làm test kích thích bắng hCG,
hoặc sự giam cua ti lệ An/Et. 5«-THF/THF khi đinh lượng steroid niêu bâng
kỳ thuật GC-.MS lả nhũng chi diêm diên hình để kháng dinh bênh nhãn thiểu

hụt enzvm 5a rcductasc týp 2 (4). [8].
Bệnh nhân nghi ngỡ thiếu hụt enzyrn 5a-reductase týp 2 dược tiến hành

cảc xct nghiệm hormone định lượng testosterone. I-H vả FSH. Trong cơ thê,

testoteron dược dùng dể chun hóa các dạng hormone giới tính khác nhau
quan trọng nhắt là dihyrotesloieron vồ estradiol DHT là chất chuyên hỏa được

tạo từ testosterone (T) dược chuyên hoa chu yếu từ T trong cảc cơ quan đích
như tuyên tiền liệt, da và gan |9|. Estradiol là san phâm trong quá trinh oxy hóa

testotcron xay ra ư ca nam vã nữ trong mơ mỡ. linh hỗn va bng trứng. Hai

hormone l.il va FSII đều được giái phóng tứ Ihùy trước luyến yen trong nào.
Hormon FSH ớ nam giới có vai trơ kích thích sự phát dục cua óng sinh linh vã
thửc dấy sự san sinh linh trúng. Ilormon Lil kích thích sự tịng hợp vã bải liếi

tcstotcron bơi cãc tế bào Leydig trong tinh hoàn. Lượng Lll trong mâu giám sê
làm giám bài tiềt testosteron Bệnh nhãn thiêu hụt enzvm 5«-reductase týp 2 có
sự suy giam icstotcron, FSI I, LI I trong mâu.

•W.-

.?TíCa: <€

4» HỄ?


s

11P-HSD2
Cortisone

Cortisol -

lip-HSDI


(E)
Reducta so

5u-[>hyơroc(SaDHF)

DihydrocoMisol
(DMF)

1

1

5a-TolrahydrocortiSOl
(5O-THF)

Dihydrocortisooe
(DHE)

3-Kotoreductase

Totrahydrocortsol
(THF)

Totrahydrocortisono
(THE)

Hình J.3. Sàn phẩm chuyển liỏa Clia costisol.
Xét nghiệm định lượng steroid niệu bảng GC/MS Hit him ích trong

chăn đoản thiêu 5a-reductase týp 2. Đinh lượng steroid niệu bằng OC/MS có
nhiêu tru diêm nhị chuảnbị mảu qua niu cu bước trong đó cõ qua trinh thúy
phân, tip dản xuất, tách chiết steroid tụ do và quà trinh sắc ký khi với thòi

gian dài hun so vối sac ký long khói phơ. Nhú vậy. sác ký khi khui phơ có

kha nâng phàn tách cảc dồng phản cua steroid trong mầu. mỏi steroid dược
đặc trưng bang một đinh trẽn sắc ký đồ. Enzym 5a-reductase typ 2 xúc tác
phàn ứng khư liên kết dơi giữa C4 và C5 cùa vịng A trên một sồ cơ chất như

testosterone, cortisol và progesterone. Trong dó. quan trọng nhất lã 5a-

reductase typ 2 xúc tảc phán img chuyển testosterone thành

5<í-

dihydrotestostcronc (5«-DHT). sắc ký dồ có mẫu hình dậc trưng là dinh 5o-

THF thấp hơn nhiều so với đinh THF do vạy tỳ lẽ 5d-THF/THF thấp hơn giá
tri tham chiêu hoặc tý lộ THI7$a-THF cao him khoang tham chiêu. Bẽn cạnh

dó. theo một nghiên cửu về đinh lượng streroid niệu bang GC/MS chi ra răng
ly lộ AirEt. 1 IOH-An/1 lOH-Et, 5aTlltì/THB thấp hun khoang tham chiếu ở

trc lim. Kỳ thuật định lượng steroid niêu bằng GC.'MS là liêu chuẩn chân
đoản quan trọng thiêu 5«-rcductase týp 2 thay the cho kỳ thuãt định lượng

testosterone và dihydrotestosterone bang phương pháp mien dịch có độ nhạy

thấp hơn và bị nhiều Tuy vậy. các nhả nghiên cửu nhận thấy khó chân đốn

•W.-

<€

4» HỄ?


9

bệnh thiêu hụi enym 5ii-rcductase týp 2 ở tré dưới 3 tháng tuòi do sự bài tiết

các honnon steroid rât thẩp. nên ờ tre dưới 3 thang càn phàn tích dột biến gen
SRD5A2dèchấn đốn 110].
1.2.

Tơng quan VC gen vã protein SRD5A2

1.2.1. Gen SRD5.42
Gen SRD5A2

có

tên gọi đầy đu là Steroid 5 Alpha-Reductase 2.

SRD5A2 cùng cô nhưng ten gọi khác như: 3-Oxo-5-Alpha-Steroid 4Dehydrogenase 2. Alpha Polypeptide 2 (3-Oxo-5 .Alpha- Steroid Delta 4-

Dehydrogenase Alpha 2). s Alpha-SR2, MGC I38457.SR loại 2 [11]. Gen
nằm trên nhiêm sắc thê sổ 2 (2p23), gồm 5 exon, mà hóa cho protein 5(1 -

reductase [12].
Or ?
52 5
HỆU
Ỉ 53
i

-S3Hịs

5

5

_33 3

3 5 3333 3

1

Hìnli 1.4. lị trícùagen SRD5.42.

(Nguồn: Genecards)

1.2.2. (’ầu trúc protein SRD5.42

Hình 1.5. Cấu trúc protein SRD5.42.

(Nguồn. Nature)

•KT

4» HỄ?

3 333__333 3


10

(Ba hình chiếu cua cẩu trúc SRD5A2. Bõ trụ NADP

DHF được hiên th;

dưới dạng hình câu. LI-ồ đại diộn cho sáu vịng kết nói 7-TM. Các phàn tu
NADP và DHF có màu tương ưng la lục lain nhạt vã hống nhạt.)

Họ Steroid 5u-reductase (5o-RD) bao gồm lìáin nhóm: SRD5A1 3.
GSPN2 và một protein lì được nghiên cứu có cấu trúc tương tự như GSPN2.

SRD5AI và SRD5A3 dà dược biết đến có chức náng trong quá trinh chuyến
hỏa cua các tế bào thần kinh và trong quá trinh glycosyl hóa liên kết protein.
Ca ba gen SRD5A1-3 đều nằm trong máng của lưới nội chat (ER) trong té

bào Các enzyme SRD5AI và SRD5A2 là các enzyme liên két trẽn máng tế
bào. bao gồm lần lượt lả 259 và 254 acid anún. Gằn đây. gen SRD5A thứ ba

(SRD5A3 » đà được xác định, nàm ờ VỊ trí 4ql2 cua nhiễm sác thê số 4. mà
hỏa protein có 318 acid amin (5<í-reductase tp 3), có 19% lương đồng với

SRD5AI và 20% tương dịng vin SRD5A2. Tất ca các gen SRD1-3 đều có
liên quan đen các rồi loan chuyên hoa ơ người. Trong dó SRD5A2 là gen
dược nghiên cứu nhiều nhất và cỏ cãc vai trị đặc trưng trong chun hóa

androgen và các rói loạn liên quan den androgen.

1.23. Chức Iiàiiịỉ cùa gen SRDĨA2

5u-reductase
NAOPH

dihydrotestosterone

testosterone

Hình 1.6. Chuyền htia cửa testosterone dưới tác dụng cứa 5a- reductase.

(Nguồn: Nature)

•KT


11

SRD5A2 đưực biêu hiện nhiều trong hộ thống sinh san nam đê chun

dịi testosterone thanh 5ư-di hydrotestosterone. Một sơ lưựng lớn các đột biên
được xác định trong gen SRD5A2 cỏ thè dản đền thiêu hụt DHT. đản đến rồi
loạn lận trẽn NST thường có tên là thiếu hụt enzym 5a-reductase týp 2 gây tác

động đến cơ quan sinh dục kém phát then và khơng điên hình. SRD5A thuộc
VC một nhóm lớn các chất khử steroid chăng hạn như 7-dehydrocholesterol

reductase (DIICR7) xúc tác bước cuối cùng trong quá trinh sinh tông hợp
cholesterol ớ người. Mặc dù các chất khứ steroid về trình tự khác nhau nhưng

cá hai gen SRD5AI vả SRD5A2 đều sư dụng năng lượng của NADPH làm

đứt gây các liên kềt đôi c c trong chất nen steroid cua chúng. Ca hai enzym
xúc tác cung một phan img (khư 5a-stcroiđ). nhung nẳm trên các nhiễm sắc

thê khác nhau, dóng vai trị sinh hóa đậc biệt vã dược biêu hiện ớ các mó khác
nhau. SRD5A1 dược biêu hiện ở da đầu va da băm sinh cua thai nhi. Biêu

hiện SRD5AI ỡ người lớn cao hơn tứ 5 đen 50 Ian so vời thai nhi. cho thấy

rằng enzym không liên quan dền sự phát triển của thai nhi nam. SRD5A2
được thê hiện nhiều trong các tê bào cua thai nhi. Sau khi sinh, SRD5AI dược

biểu hiện ớ nhiêu vị trí hơn. bao gồm gan. da. da đẩu vả tuyến tiền liệt trong

khi SRD5A2 dược biêu hiện ỡ tuyển tiền liệt. túi tinh, mào tinh, gan

1 5].

Testosterone vả ĐI IT cần thiết cho sự phát iricn bính thưởng cùa câc dặc
diêm giởi tính nam Trước khi sinh, testosterone chiu (rách nhiệm hình thánh

cư quan sinh dục bẽn trong nam giới, bao gốm các õng thu nhộn tinh trùng và

dưa tinh trùng ra ngồi (mão tinh hốn và ồng dàn tinh) và các tuyến giúp san
xuất tinh dịch (túi tinh). DI IT chi phối sự phai triển cùa cư quan sinh dục

ngoài, bao gốm ca dương vật và bíu. và tuyên tiền liệt. Trong giai đoạn dậy
thí. hai loai hormone nay cùng dứng vai tro quan trọng trong việc phát triên

các dặc diêm giới tính phụ cũa nam giới như mọc lơng mặt và lông trên cơ
the. táng khối lượng cư. trầm giọng [17],

•W.- .-Tí ca:

<€

4» HỄ?


12

1.2.4. Dột hiển gen SRD5A2
MỘI trong những nguyên nhãn chính gây bệnh thiêu hụt enzyme 5u-

reductase rýp 2 lá do đột biên gen SRD5 A2. Enzym 5enzym liên kết trên máng tế bào xuc lác chuyên đòi một chiều testosterone

thảnh dihydrotestosterone, bang cách sư dụng nàng lượng từ coenzyme

NADPH. Dựa vào dó. hầu het các nghiên cửu chức nàng cua protein tập trung
vào nghiên cứu động học và hoạt dộ cua enzvm. Hoạt động cùa enzyrn được
ước tính bang lốc độ phân img tói đa (Vmax) vã hâu như các the dột biền

nonsense của gen SRD5A2 nẳm trên cxon 4 đều gây ãnh hường đền Vmax

cua en/ym [18]. Dột biến gen SRD5A2 có thè làm suy giam hoạt động cùa
enzyme 5a- reductase lýp 2 được chia lam 2 nhom: nhùng đột biên anh hương

den ai lục NADPH và nhùng đột biền gây anh huong den kha nâng liên kết
VÓI phân tứ testosterone 118]. Cho den nay. hơn 100 dột biển dã được tím thầy
trên gen SRD5A2 [19].
ma
QW
R1.14«*

G2C3V
I wap
airy
Q1W5 I
piw
m I

JMt

uiwsqi

LKdCP

WWJ

Hình 1.7: Các đợi biển (lượcphứt hiện trên ỉỊen SRDSA2 gây bịnh thiển

hụt 5a-retĩuctase tuýp 2.

(Nguồn: ScĩenceDirect)
Theo một nghiên cứu đánh giá lích hợp và phân tích về sư thiếu hụt
enzym 5a-rcduclasc lýp 2 trên toán thẻ giới dà xác đinh 434 trường hợp thiếu

hụt SRD5A2 lừ 44 quỗc gia trong đó có 70% dột biến dồng hợp tư va 30®/® di
hợp tử. Dột biền được tim thấy trên cãc cxon nhưng nhiều nhất lã exon 1 vói

•W.-

RtiW <€

4* HỄ?


13

33% và exon 4 lả 25% [1]. Trong một nghiên cứu cua Tning tủm nghiên cứu
gen Bác Kinh trên 219 bệnh nhân nghi ngờ DSDs dà xác dinh dược hai dột
biển dị hợp la dột biền c.695A>G lam thay dôi axil amin 232 từ histidine

thành arginine (P-H232R) làm bát hoạt hoặc suy giam chửc năng SRD5A2 và
đột biến C.16OT. tạo ra một codon dừng (p.Ọ6X) tạo ra một protein bị cắt

ngiin. protein này dà mất kha náng liên kết với thụ thê testosteron.
Tại một nghiên cứu cho bènh nhãn Trung Quốc cơ cơ quan sinh dục

khơng rị ràng, karyotype 46 XY dược giai trỉnh tự cxon 1-5 gcn SRĐ5A2 đà
phát hiện thấy 2 dội biến liên tiềp ớ exon 4. mỏi đột biền nẳm ờ I alen khác

nhau: (1) mất đoạn nuclcotit T gày đột biến lệch khung tử codon 219. (2) đột
biển sai lệch o codon 227 lam xuất hiện dột biến R227Q 12()|.

Trong một nghiên cứu cua Nhật ban trẽn XI bệnh nhân có biêu hiện
dương vụt nho hoặc lính trụng mư hị về bộ phàn sinh dụt được tiên hanh

phân tích gen SRD5A2 trên ca 5 exon cho thầy hai dột biên sai nghĩa (G34R
vá R227Q) và một đột biên vò nghia (Y26X) cua gen SRD5A2 ở ba bệnh

nhãn bi rói loan phát triẽu giới tinh. Ilai dột biên sai lệch dà dược bão cão
trước dây ở nhùng bênh nhãn bi thiếu hụt 5«-reductase typ 2. vá cãc nghiên

cứu chức nãng đà chi ra rang cá hai dột biến đều lảm tồn hại nghiêm trong

dến hoạt dộng cua enzym. Đột biến vơ nghía đă lãm mất hoạt tinh cua enzyme
vi nõ cát ngân enzym một cách dáng kế.
1.3.

Các kỵ thuật sinh hục phân tữ được sir dụng de phát hiện dột biền

gen.

1.3.1. Kỳ thuật PCR.
NịỊuyên tỷ phán ứtiịỊ. Dưa vào nguyên tắc biên tính hay hồi tính của

phân tu D.NA boi nhicl độ.

PCR lả viết tát cua cum từ Polymerase Chain Reaction- la kỳ thuát sinh
học phàn tữ cho phẽp nhãn bàn khuếch dại một hoặc một vải đoạn DNA

•W.'

<€

* HỄ?


14

mung muốn thánh nhiều ban sao theo cap lũy thừa. Thơng thường, PCR bao

gơm một chuồi khống 2(1-40 kin biền (lối nhiệt độ lặp đi lụp lại. gọi chu kỳ.
mỏi chu kỳ thường gốm 2-3 giai đoạn nhiệt độ riêng biệt. Các chu kỳ thường

bãl đau bằng giai đoạn nhiệt độ cao (>90°C). vá sè dừng lại khi san phàm cuổi
cùng dược tòng hợp hoặc dừng lại ơ nhiệt dộ thắp dẻ lưu trừ sản phàm PCR

trong thời ngấn. Nhiệt độ và thời gian thực hiện cua mỗi chu kỳ phụ thuộc
vào nhiều yếu tổ. Nhừng yểu tổ này gồm enzyme tông hợp AON, dung dịch
dèm. dNTPs dùng trong phản ớmg. v nhit d núng chõy (Tm) cua mi

Son

1

2

1

2

4(-ô

n

ã (ằô

2ằ

Hỡnh 1.8. Phàn ừng PCR.

í Nguồn: Biomedia)
• (ỉi líaụn khai đầu: Giai đoạn cần tăng nhiệt độ lên 94-96:c (hay

98°c nếu sư dụng polymerases cực kỹ ben nhiệt) vá được tiền hành

trong 1 -9 J)hút.

•W.-

<€ 4» HỄ?


15

• Giai dtụm hiển tính, dây lã bước dâu tiên cua chu kỳ vã la quá trình

tảng nhiẹt độ lên 94-98cC trong 20-30 giây. DNA dược biến
tinh bang cách pha vờ lien ket hydro giữa các bazo. tạo thành phan tu
DNA sợi đơn.

•

Giai doụn gàn mui: nhiệt độ phàn ứng giam xuống còn 50-65 :c trong

20-40 giây dê mồi gân vào sợi DN/\ dem. Nhiệt dộ này cần phai dũ
thầp de cho phép mồi bẩt cặp vởì sợi DNA, nhimg cùng phái dù cao

cho quá trinh bẳt cập dác hiệu giúp mồi chi gắn hồn tồn với phần
trinh tự bơ sung trên mạch khuôn. Neu nhiệt độ quá tháp, mối sê

gần khơng đặc hiệu. Neu q cao. mồi có thê khơng gản. Thơng thường
nhiột độ gân mịi thường thâp him 3-5 °C’ so vin Tm cua mỗi dùng
trong phan ứng. Lien kết hydro giừa 2 SỰI nucleotide DNA

mồi chi

được hình thánh khi mồi liên kết hỗn tồn vót mạch khn.

•

Giai duịin kéo dùi: Nhiệt độ trong giai doạn nay phụ thuộc vão các
DNA polymerase sư dựng; Taq polymerase có nhiýt độ hoạt động tói

ưu ở 75-80cC vả 72°c la nhiệt dộ tối ưu thưởng dược sứ dụng với

enzyme náy Tại giai doạn này DNA polymerase tống hợp sợi
DNA mới bố sung với DNA khuôn hầng cách thèm dNTP theo nguyên

tẳc bô sung theo chiêu 5’ den 3', phán ứng trùng hợp xây ra giữa nhòm

5’ - phosphate cúa dNTP với nhóm 3’ - hydroxyl phía cuối cua sợi
DNA vừa mới dược hình thành. Thịi gian cua giai doạn kéo dài phụ

thuộc xáo DNA polymerase vã độ dai cua doọn DNA cân khuẽch dại.
Thõng thường, các DNA polymerase cõ kha nâng khuếch dại dược

háng nghìn bazo into trẽn một phút. Trong dicu kiên tồi ưu. nếu khơng
có hạn chế du giới hạn cua cơ chát hỗc chất phan ừng thí sau mỏi giai
đoạn kẽo dái. số lượng DNA dưực khuếch dại sau mỗi chu kí tn theo

hãm mù.

•W.- .-Tí ca:

<€

4» HỄ?


16

• (ìiui doạn kết thúc kéo dùi: Giai doụn này được thực hiện ớ nhiệt độ
70-74%' (dày la nhiệt độ cần tlìiềt cho hoạt dộng tối ưu cùa hàu hết các

enzyme polymerase dùng trong phan ứng PCR). vời thoi gian 5-15 phút
sau chu kỳ PCR cuối cùng đẽ dam bao răng tầt ca DNA sợi dơn cịn lại

đều dược tơng hợp hồn tồn.

•

Giai ííoạn bào qnân: Giai doạn này thực hiện ứ nhiệt dô 4-15cC trong
một thin gian đê bao quan ngằn hạn sán phàm cua phân ứng [21].

1.32. Kỹ thuật giài trinh tựgen (Ỉ).\A sequencing)
Giai trinh tự gen (DNA sequencing) là phương pháp xác dinh trinh tự

sáp xếp cua 4 loại nucleotid: A (Adenine). T (Thymine). G (Guanine) va c
(Cytosine) trẽn phàn tư DNA. Kỳ thuật giai trinh tự gcn bao gồm các phương
pháp:

- Phương pháp hơá hục cua Maxam vã Gilbert: Phàn tư DNA được đánh

dầu vá xư lý phàn cất hoá học.
- Phương pháp enzym cua Sanger (Phương pháp dideoxynucleotide);

Dưng ngẫu nhiên phan ứng lòng hợp chuỗi DNA bâng ddNTP - Phương pháp
giãi trinh tự bằng máy tự động.
- Phương pháp GTT gcn thế hê mới (NGS-Next Generation Sequencing).

Phương pháp enzyme cua Sanger hay côn gọi là phương phâp

dideoxynucleotide sư dụng ddNTP lá một phân tư nhãn tọo. cấu trúc cùa nô
lương tự như phân tử dcoxynucleotid (dNTP), tuy nhiên ơ carbon so 3 cũa

dường deoxyribose không phai là nhóm hydroxyl (

OH) mà lá

H. Các

ddNTP có nhiệm vụ dừng viộc tồng hợp mạch bị sung do khơng hình thanh
được liên kết phosphodiester Các ddNTP tham gia vào phan ửng tụi nhiều

thời diêm khác nhau vã tạo ra các sợi đơn DNA có kích thước khác nhau.

•W.- .tF’.Ca:

<€

4* HỄ?


17

C-deoxynuơeoOOe tnphosphxe

dwxynudcot'Oe tnpbosp^ale

Hình ỉ.9. Cẩu tạo phân tư ddNTP.

tNguồm Gentis)
VỞ1 các máy the hộ mới sau này, người ta dùng 4 mâu huỳnh quang

khác nhau đẽ đánh dâu 4 loại ddNTP. Nhờ vậy phan ứng giai trinh tự cô thê
thực hiện trong một ống nghiệm vã chi càn diện di trẽn một hang mà không
phai trên 4 hàng khác nhau như trước dày. hộ thống diện di thường là điện di

mao quan. Mồi khi có một vạch diện di di qua. phân tư ddNTP cuối cúng ơ
đâu 3’ cua đoạn DNA sê phát ra một máu huỳnh quang tương ứng. máy sẽ ghi

nhộn màu sầc này và chuyên VC máy tính phán tích. Dựa vào mâu huynh

quang mà máy nhận diện được loại nuclcotid. từ đó bicl dược trinh tự cùa
DNA đích.

•W.-

<€

4* HỄ?