CÔNG NGHỆ SINH HỌC: CHƯƠNG 3 ĐỘNG VẬT BIẾN ĐỔI GEN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
KHOA CNSH - CNTP

CHƯƠNG 3

ĐỘNG VẬT BIẾN ĐỔI GEN

Thái Nguyên, 2011
(Slides assembled from diverse sources)


NỘI DUNG







Khái niệm chung
Công nghệ tạo động vật biến đổi gen
Những hướng nghiên cứu chính và thành
tựu trong lĩnh vực chuyển gen động vật
Ứng dụng của động vật chuyển gen
Các vấn đề đặt ra đối với động vật chuyển
gen


1.KHÁI NIỆM CHUNG



Động vật chuyển gen
Lịch sử phát triển


1.1. Động vật chuyển gen




Chuyển gen (transgenesis) là đưa một
đoạn DNA ngoại lai vào genome của một
cơ thể đa bào, sau đó đoạn DNA ngoại lai
này sẽ có mặt ở hầu hết các tế bào và
được truyền lại cho thế hệ sau.
Những động vật có hệ gen bị biến đổi
bằng cách đưa thêm DNA ngoại lai gắn
vào hệ gen của nó gọi là động vật chuyển
gen (transgenic animal).


1.1. Động vật chuyển gen






Đoạn DNA ngoại lai dùng để đưa vào cơ
thể khác gọi là gen chuyển (transgene).

Gen ngoại lai này phải được truyền lại cho
tất cả mọi tế bào, kể cả các tế bào sinh
sản mầm
Việc chuyển gen ngoại lai vào động vật chỉ
thành công khi các gen này di truyền lại
cho thế hệ sau.


1.1. Động vật chuyển gen




Các gen chuyển được sử dụng để tạo
động vật, thực vật chuyển gen có nguồn
gốc từ các loài sinh vật khác nhau: động
vật, thực vật, vi sinh vật và cả con người.
Ví dụ: gen của người được đưa vào chuột
và các vật nuôi khác như lợn, bò, cừu,
chim.


1.1. Động vật chuyển gen






Việc chuyển gen vào tế bào động vật nuôi cấy

hay vào cơ thể động vật nhằm mục đích nghiên
cứu cơ bản và nghiên cứu ứng dụng.
Chuyển gen ở vật ni chủ yếu nhằm mục đích
tạo ra những dịng vật ni có những đặc tính
q mong muốn một cách nhanh chóng, khắc
phục được những trở ngại trong lai tạo tự nhiên
như việc lai xa giữa hai loài động vật khác nhau.
Động vật chuyển gen có thể có những đặc tính
mới, vượt qua cả giới hạn phạm vi lồi, mà
nhiều khi các phương pháp lai tạo truyền thống
khơng thể thực hiện được.


1.1. Lịch sử phát triển






Vào thập kỷ 1970, các thí nghiệm nghiên cứu đã được
thực hiện với các tế bào ung thư biểu bì phơi và các tế
bào ung thư quái thai để tạo nên chuột thể khảm.
Trong các động vật thể khảm này, các tế bào nuôi cấy
lấy từ một dịng chuột được đưa vào phơi của một dịng
chuột khác bằng quần tụ phôi trực tiếp (direct embryo
aggregation) hoặc bằng cách tiêm vào phôi ở giai đoạn
phôi nang (blastocyst).
Chuột thể khảm trưởng thành có thể được sinh ra bằng
sự đóng góp tế bào từ các bố mẹ khác nhau và sẽ biểu

hiện tính trạng của mỗi dịng.


1.1. Lịch sử phát triển




Một kiểu chuyển genome khác ở động vật
là chuyển nhân nguyên từ một phôi vào tế
bào trứng chưa thụ tinh của một dòng
nhận khác một cách trực tiếp.
Bước phát triển tiếp theo của kỹ thuật
chuyển gen được thực hiện bằng cách
tiêm retrovirus vào các phôi chuột đã
được nuôi cấy trước.


1.1. Lịch sử phát triển


Trong những năm gần đây, một số kỹ thuật tạo
động vật chuyển gen khác đã được công bố:








phương pháp chuyển gen bằng cách sử dụng tế bào
gốc phôi.
phương pháp chuyển các đoạn nhiễm sắc thể
nguyên.
chuyển gen trực tiếp vào tinh trùng kết hợp với thụ
tinh in vitro.
phương pháp vi tiêm DNA vào tiền nhân của hợp tử


II. CÔNG NGHỆ TẠO ĐỘNG VẬT
BIẾN ĐỔI GEN








Tách chiết, phân lập gen mong muốn
Tạo tổ hợp gen biểu hiện trong tế bào động vật;
Tạo cơ sở vật liệu biến nạp gen;
Biến nạp gen vào phôi động vật;
Nuôi cấy phôi và cấy truyền hợp tử (đối với
động vật bậc cao);
Phân tích đánh giá tính ổn định và sự biểu hiện
của gen lạ và tạo ra dòng động vật chuyển gen
gốc một cách liên tục, sản xuất động vật chuyển
gen.

Sơ đồ nguyên lý quy trình tạo động vật chuyển gen


2.1. Tách chiết, phân lập gen mong muốn và
tạo tổ hợp gen biểu hiện trong tế bào ĐV



Tách chiết, phân lập gen mong muốn
Tạo tổ hợp gen chuyển biểu hiện trong tế
bào động vật


2.1.1. Tách chiết, phân lập gen
mong muốn



Tách dòng gen
Phân lập gen từ sản phẩm của chúng
(mARN hoặc protein)


2.1.1. Tách chiết, phân lập gen
mong muốn

So sánh hai dạng gen chuyển

2.1.2. Tạo tổ hợp gen chuyển biểu
hiện trong tế bào động vật




Ðể tạo tổ hợp gen chuyển biểu hiện trong
tế bào động vật, các vùng chức năng khác
nhau của gen có nguồn gốc từ các lồi
khác nhau có thể được kết hợp lại với
nhau trong ống nghiệm bằng cách sử
dụng enzyme hạn chế và ligase.
Tất cả các thành phần của gen có thể
được tách chiết và tái tổ hợp để tạo thành
một cấu trúc gen chuyển biểu hiện.


2.1.2. Tạo tổ hợp gen chuyển biểu
hiện trong tế bào động vật

Sơ đồ cấu trúc gen chuyển biểu hiện
enhancer: gen tăng cường
ATG: vị trí khởi đầu phiên mã
SIG: trình tự tín hiệu
AAA: đi polyA


2.2. Tạo cơ sở vật liệu biến nạp
gen







Ở động vật có vú thì giai đoạn biến nạp gen
thích hợp nhất là trứng ở giai đoạn tiền nhân
(pronucleus), giai đoạn mà nhân của tinh trùng
và trứng chưa dung hợp (fusion) với nhau.
Ở giai đoạn này tổ hợp gen lạ có cơ hội xâm
nhập vào genome của động vật nhờ sự tái tổ
hợp DNA của tinh trùng và của trứng
Do tế bào phơi chưa phân chia và phân hố nên
tổ hợp gen lạ được biến nạp vào giai đoạn này
sẽ có mặt ở tất cả các tế bào kể cả tế bào sinh
sản của động vật trưởng thành sau này.


2.2. Tạo cơ sở vật liệu biến nạp
gen




Ðối với động vật có vú, trứng chín được thu
nhận bằng phương pháp sử dụng kích dục tố
hoặc bằng phương pháp ni cấy trứng trong
ống nghiệm. Sau đó thụ tinh nhân tạo để tạo ra
trứng tiền nhân.

Ðối với cá, giai đoạn biến nạp thích hợp là phơi
ở giai đoạn 1- 4 tế bào. Giai đọan này được tạo
ra bằng thu nhận trứng, tinh dịch bằng phương
pháp sử dụng kích dục tố (kích thích tố trong
nhau thai của người (HCG) hoặc não thuỳ thể cá
chép...), rồi thụ tinh nhân tạo.


2.2. Tạo cơ sở vật liệu biến nạp
gen






Các phương pháp sử dụng hiện nay để
chuyển gen vào tế bào chủ nói chung là
hiệu quả khơng cao.
Ðể tạo ra một động vật chuyển gen, yêu
cầu cần phải sử dụng hàng trăm thậm chí
hàng ngàn trứng thụ tinh.
Sự hiểu biết về sự kiểm soát chức năng
buồng trứng tăng lên đang cải tiến hiệu
quả để có đủ số lượng trứng thụ tinh.


2.2. Tạo cơ sở vật liệu biến nạp
gen






Có lẽ sự phát triển quan trọng nhất trong sinh lý
học buồng trứng trong những năm mới đây là sự
khám phá ra hormone inhibin.
Inhibin là hormone ức chế sự rụng trứng, nó làm
giảm tỉ lệ rụng trứng.
Các gen kiểm tra sự sản xuất inhibin đã được
tạo dòng và khả năng tạo ra động vật chuyển
gen mà trong đó các gen này bị ức chế hoặc bị
loại bỏ là hồn tồn có thể.


2.2. Tạo cơ sở vật liệu biến nạp
gen


Hiện nay các xử lý gây siêu rụng trứng sử
dụng các hormone có độ tinh khiết cao
đựơc sản xuất bằng kỹ thuật DNA tái tổ
hợp và đã tạo ra trung bình khoảng 10
trứng có thể phát triển đối với một lần xử
lý (trong khi đó một con bị bình thường
mỗi lần rụng trứng tạo ra 1 trứng có thể
phát triển).

2.2. Tạo cơ sở vật liệu biến nạp
gen






Sự thành thục và thụ tinh nhân tạo của trứng đã tăng
lên nhờ sự gây siêu rụng trứng, cung cấp một phương
tiện khắc phục vấn đề sinh sản ít hiệu quả của vật ni.
Thơng thường một buồng trứng bị chứa khoảng 50.000
trứng chưa thành thục. Tuy nhiên, trung bình chỉ 3-4
trong số trứng này sẽ có kết quả trong việc sinh sản ra
các bê con trong suốt thời gian sống của một bò mẹ.
Các phương pháp gây siêu rụng trứng hiện nay, từ một
con bị đã xử lý có thể thu nhận được 10 trứng có thể
phát triển và một nửa số trứng này phát triển thành
phơi thích hợp cho chuyển gen.


2.2. Tạo cơ sở vật liệu biến nạp
gen




Sự thụ tinh nhân tạo chỉ xảy ra khi một tinh
trùng đã chuẩn bị một cách đặc biệt để xâm
nhập vào tế bào trứng gặp một trứng ở trạng

thái thành thục tối ưu.
Ðối với cá, giai đoạn biến nạp thích hợp là phơi
ở giai đoạn 1- 4 tế bào. Giai đọan này được tạo
ra bằng thu nhận trứng, tinh dịch bằng phương
pháp sử dụng kích dục tố (kích thích tố trong
nhau thai của người (HCG) hoặc não thuỳ thể cá
chép...), rồi thụ tinh nhân tạo.


3.Chuyển gen vào động vật




Việc đạt được mục đích của việc tạo ra
động vật chuyển gen đòi hỏi sự phát triển
của các phương pháp có hiệu quả để
chuyển gen mong muốn vào phơi.
Chuyển gen ở động vật có thể bằng nhiều
phương pháp khác nhau như chuyển gen
bằng chuyển nhiễm, vi tiêm, liposome,
virus, tế bào gốc, tinh trùng