Phát hiện đột biến trên một số exon của gen RB1 ở mẫu mô của bệnh nhân u nguyên bào võng mạc

BỌ GIÁO DỤC VÀ DÀO TẠO
TRƯỜNG DẠI HỌC Y HÀ NỘI

BỌ Y TÉ

NGUYÊN THỊ MAI LINH

DÈ TÀI PHÁT HIỆN DỘT BIẾN TRÊN MỘT SĨ
EXON CỦA GEN RB1 Ờ MẢU MƠ CỦA BỆNH NHÂN
u NGUYÊN BÀO VÔNG MẠC
Chuyên ngành : Xét nghiệm V học
Mà sổ

: 1753320027

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP cú NHÂN
NGƯỜI HƯỚNG DÂN KHOA HỌC:
TS. Nguyền Hoàng Việt
TS. Phạm Lẽ .Anh Tuấn

HÀ NỘI-2021
LÒI CẢM ƠN.
Lởi đầu tiên cho phép em xin giri lời cam ơn chân thành tới TS. Nguyền
TM/ zfci V*:

4Ả 'V.


Hồng Việt. người thầy đà ln đồng hành cùng như truyền cam hứng cho em ngay
từ khi mói bất đầu tim hiêu VC bộ môn bệnh học phán tư. Em xin cam ơn Tien sí
Phạm Lè Anh Tuần đà ln giúp đỡ. chi báo em không chi trong việc thực hiện

khóa luận mà cịn dạy cho em tinh thần nghiên cứu khoa học và thực hiện nghiên
cứu khoa học.
Em cùng xin gưi lòng biết ơn đến GS.TS.BS Tạ Thành Văn. giám đốc Trưng
Tàm Nghiên cứu Gen - Protein. Đại học ¥ Hà Nội dã tạo mọi điều kiện thuận lợi
cho em tròm; quá trinh thực hiên nghiên cứu.
Em xin cám ơn PGS.TS Trần vãn Khánh, phò giâm dốc Trung Tàm Nghiên
Cứu Gen- Piữtein. Trưởng Bộ mòn Bệnh học phản tư. Dại học Y Hà Nội đà cho em
cơ hội được thực hành trên trung tâm. giúp em làm quen với môi trưởng nghiên cứu
khoa học và các trang thiết bị máy móc hiện dại.
Em xin cám ơn ThS. Lẽ Thị Phương. ThS. Nguyễn Qúy Lỉnh .người chi
người anh dà hướng dần em thực hành từ nhùng ngày dầu tiên. Cant ơn sự nhiệt
tình, tận tâm cua anh chị.
Cuối cũng, em xin cam ơn các thầy cỏ. anh chị trên trung tâm dà giúp dỡ
dộng viên em trong suốt quã trinh thực hiện khõa luận, giúp em cõ thè hoãn thành
tốt nhất.
Hà Nội ngây 11 thảng 5 nám 2021
Sinh viên

Nguyền Thị Mai Linh

LỊI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan mọi kểt q trong nghiên cúu "Phát hiện đột biển ưên một

TM/ V*:


số e.xon cua gen RBJ trên mẫu mò cua bệnh nhàn ư nguyên bào vồng mạc" là kết
qua nghiên cứu cua cá nhàn tòi. Nghiên cứu được tài trợ bởi Trung tâm nghiên cứu
Gen - Protein. Dili học Y Hâ Nội. Tỏi xin chịu mọi trádi nhiệm về lời cam đoan này.
Hà Nội ngây 11 tháng 5 năm 2021

Sinh viên

Nguyền Thị Mai Linh

TM/ V*:


MỤC LỤC


TÀI LIỆU THAM KHÁO
DANH MỤC BÁNG

TM/ zfci V*:

4Ả 'V.


DANH MỤC BIÉV DÒ
Biêu dồ 3.1: Ti lệ bệnh nhản phát hiện dột biền gen RBÌ......................................39
Biêu đồ 3.2: Ti lệ các dạng dột biếngen................................................................39


DANH AIỤC HÌNH

Hĩnh 1.1: Hĩnh ánh giai phẫu mắt bính thường và mắt cỏ khối u nguyên bão


TM/ zfci GẠ:

• -U


DANH .MỤC CHỮ VIẾT TÁT

UNBVM

u nguyên bào vỏng mạc

RB1

Retinoblastoma 1

Protein RB

Protein Retinoblastoma

Cdk

Cylin dependent kinase

PCR

Polymerase Chain Reaction

DNA

Deoxyribonucleic axit

dNTP

ddNTP
MLPA GTT
aa bp
ĐB

Deoxynucleoside triphosphate
Dideoxynucleoside triphosphate
Multiplex Ligation- Dependent Probe Amplification
Giải trinh tự
axit amin
base pair

dột biến

TM/ c*:

-u


1
0

ĐẠT VÂN ĐÈ
u nguyên bào võng mạc là khói u ác tính, thuộc nhóm u ngun bào thần
kinlỳ. Bệnh là một dụng ung thư hiếm gặp, xay ra với ti lệ 1/15000- 1/20000 ưẽ
sống2 vã chiêm 3% khối u ở tre em. u nguyên bào võng mạc là loại ung thư nội
nhàn phó biền thứ 2 chi sau u hắc mạc với ti lộ mac là 8000 ca mới mỗi năm trên
toàn thề giới3. Tại Việt Nam khoang 90-100 ca mới được chân đốn mồi nànr. Bệnh
gày ra nhùng tơn thương nghiêm trọng về mắt. hậu qua có thê dần đến khoét bó
mat. tể bão ung thư xám lấn thần kinh trung ương qua dây thần kinh thi giác, di càn

và tư vong'.
u nguyên bào vồng mạc xảy ra do đột biền gen RBỈ. Thông thưởng, các te
bào cùa cơ thê phát triên và phân chia một cách cỏ kicm soảt. cãc te bào dược
“chcl" theo chương trinh đã được lập sần vã thay vào lả các tế bào mới khoe mạnh
đê duy tri các chức nâng cua cơ thê. Khi gen RBỈ bị đột biến, san phẩm cua gen là
protein RB mắt chức nâng ửc che khối u. các tế bào tiền thân tế bảo nõn vòng mạc
tâng sinh mất kiêm sốt vã trơ thành u.
Đê hình thánh khối u. gen RB1 phai trải qua hai lần đột biến hay đột biền
mất chức năng ca hai alcn. Dột biến cỏ thè xay ra do di truyền hoặc cõ the lã đột
biến mới phát sinh trong quá trinh sinh trương. Khi ca hai alen cùa gen RBi đều xay
ra dột biến, gen khơng san xuất ra dược ban sao bính thưởng cùa protein RB.
protein dược dịch mà từ gen RB1 dột biền sè khơng cịn chửc năng ức chế khối u. ki
cm sốt chu trinh tề báo. Te bào vơng mạc mất tảng sinh mắt Idem soát tạo thành
khối u. ớ nhũng bệnh nhân có dột biến do di truyền, ti lệ cõ khối u ớ hai mát cao
hơn ơ nhùng bệnh nhàn dột biến không do di truyền.

Ư nguyên
95%.
trong
bào
trường
võngTrong
mạc chân
hợp
tí
lệti
đốn
sốngvã
ơ diều
các nước

tri sớm
phátcó
triển
thê báo
den
tồn
mắt
bị
bộnh.
khi

TM/ zfci V*:

-


2 lộ tứ vong lẽn tới 40-70% ở các nước
dang phát tricn, ti lộ tư vong >70% trài toàn thố giới •. Khối u khi khơng dược điều
trị SC phát triền và di cán. dặc biệt cỏ thế di căn nào qua đường mảu dây thẩn kinh
thị giác gáy ti lệ tứ vong cao.
Việc phát hiện đột biến gen RBJ ờ bệnh nhãn u nguyên bão võng mạc dậc
biệt quan trọng trong việc đánh giá vai trò cua đột biền gen RBI dối với u nguyên
bào võng mạc. Tông hựp từ 68 nghiên cứu trên the giới, càc nhà nghiên cửu dà phái
hiện ra 16 dột bicn "hotpot" vã các cxon thường phát hiện đột biến lã 9.10, 14. 15,
16. 17. 18.20.23 5.

Vậy bệnh
exon
nên
cùa

tịi
gen
thực
RBJ
hiện
ởphát
mầude
mổtài
cua
"Phát
bệnh
nhân
hiện
u
đột
ngun
biên
ưên
võng
mật
sổ
mục"
cua
với
mục
nhản
tiêu
u18.
ngun
hiện

bào
vơng
dột
biền
mạc
cụ
trẽn
the
gen
là
các
RBỈbào
exon
à mầu
9.10.
mơ
14.15.
16.
17.
20.
23.

CHƯƠNG I

TĨN'G QVAN’
1.1 ư ngun bão vịng mạc.
1.1.1

Tơng quan II ngun bào vịng mạc.

u ngun bào vòng mạc là một dạng ung thư hiềm gộp. xay ra ờ tể bão tiền
thân tế bào nón võng mạc s. Bệnh gáy ra khối u tụi ô mắt. nếu không được chừa trị
kịp thời cỏ thê dần đến nhùng hậu quà nghiêm trọng như khoét bờ mất. thậm chí lả
lư vong. Nguyên nhân chính gảy bệnh là do đột biền gen RB1. một gen ức chế khối
u nam tr ẽn cánh dãi nhiễm sẳc thè Sồl3ql4.2. Bệnh có thê xay ra ơ một hoậc cá hai
mắt.

Healthy Eye

Retinoblastoma

Hinli l.lỉHình (inh giãi phân mãt hínli thường và ntăt có khơi n nguyên

TM/ V*:


Hình 1.2: Tình hìnlt dịch tề bệnh retinoblastoma trên thế giới (nguồn:
Retinoblastoma3)
Chưa có bang chứng cho thấy ti lộ mắc u nguyên bào vông mạc liên quan tới
chung tộc và giới tính6. Tuy nhiên ti lệ sống sót trên 5 năm giừa các quốc gia cỏ sự
khác biệt rất lớn. Việc này cõ the giai thích do sự chênh lệch về kinh tế và diều kiện
tiếp xúc vói y học. Ớ các nước phát triển, ti lệ sổng cô thê lên den him 95%. Tại
Mỳ. trong 30 nảm kê từ năm 1975 đen nám 2004. ti lộ sống trên nảm cua bệnh nhân
u nguyên bào võng mạc tảng từ 92.3% lên 96.5% '. Trong khi dó ớ các nước đang
phát triển. chu yểu tại châu Phi vã châu Á không có Nhật Ban. ti lộ tư vong 3070%s.

Ư ngun
bảo
vồng
mạc

thường
dược
chân
đốn
trước
5
ti.
T1
lộ
nhản
bệnh
u thảnh
một
nhãn
mat.
ƯNBVM
tuổi
dược
trung
chán
bính
đốn
dược
trước
chân
5the
tuổi
dốn
>95%.
làởnhản

24
ơ
tháng
bệnh
với
đốn
bệnh
là
12
nhân
tháng.
u ca
Tuy
hai
nhiên
bẽn
mát
ƯNBVM
tuổi
vần
trung
cõ
bính
gập
được
người
chân
trương
sau
20

tuổi
với
ti
lệ
rất
hiếm.
Bệnh
u

nguyên bào võng mạc lem tuổi nhất được chấn đoản là một phụ nừ 74 tuổi, được
báo cào bơi Finlay và Biron năm 1962
1.1.3

Dặc diêm lâm sàng.

Ư nguyên bào võng mạc phát sinh hình thành khối u cùa mat. Điều đó cùng
dề dàng chửng minh cho việc bệnh gây ra một loạt các triệu chứng ở mat. Triệu
chứng thường thấy nhất là ánh dồng tư trắng vã lác
Ánh dồng tư trắng (leukocoria) hay còn gọi lã ánh mắt mèo ( cat eyes pupil)
lã triệu chứng điên hình cùng như thường gặp nhất ơ bệnh nhân UNBVM. ớ người
bính thường, khi chiểu ánh sáng vào mát. phan xạ đo phát ra từ hai mắt phai đổi
xứng về màu sắc và độ tương phan. Đối với bệnh nhàn u nguyên bào vông mạc. khi
khối u dà phát tricn den giai đoạn nhất định, sự phan xạ đỏ do mạch mâu qua mõi
trường trường trong suốt lã thúy tinh thê. đồng tư và giác mạc bị cân trơ bới khối u
TM/ V*:


dần đến triệu chứng ánh đồng tư trẵng điến hình :0.

Hình 1.3: Hình anh ánh dồng từ trắng (trái) ( nguồn: Retinoblastoma6)

Ti lộ u nguyên bào võng mạc có triệu chửng ảnh dồng tư ưẳng là 60% [9].
Tuy nhiên ánh dồng tứ trắng khỏng phai dặc trưng cho u nguyên bào vơng mạc.
Một sỗ bộnh cùng có thê có triệu chúng này. diên hình như đục thúy ti nil thê. bệnh
vòng mạc ơ tre sinh non. bệnh giãn mạch võng mạc (Coat), nhi cm kỹ sinh trũng
cua loài chỏ ( Toxocara)1-0. Khi tre có ưiệu chứng ánh dồng tứ trắng, dù không đau
nhức hay giám thị lực. đều cần dược Idem tra và chân đoán xác định nhanh nhất cỏ
thể đe cỏ có phương ân điều trị kịp thịi, giâm tối đa tốn thương cho bộnh nhân.
Đứng thử hai chi xểp sau ánh đổng từ trắng là lác gồm cỏ lác trong và lác
ngoài. Triệu chúng nãy gụp ờ 20% bệnh nhãn u nguyên bào võng mạc I0. Tuy nhiên
lác là triệu chững khơng điên hình vả gập trong nhiều bệnh lý VC mát cá bâm sinh
và thứ phát.
Ngoái ra u nguyên bào vòng mạc còn xuất hiện một số bicu hiện le te khác
với ti lệ thầp nhir giam thị lực. đỏ và đau nhức mắt. viêm cãc tổ chức cua mắt,....
Tuy nhiên tại các quốc gia dang và kém phái triền, triệu chứng thường gặp
nhất là lồi mắt. u xuầt ngoại do chân đoán muộn. Lúc này u nguyên bão võng mạc
đà phát tricn đến giai đoạn muộn cua bệnh, khối u chèn ép ồ mat gây ra những tốn
thương nặng nề cho bệnh nhản như mất thị lực. không bao tổn được mấtII.
/. 1.4 Cúc giai doạn ti nguyên bào vông mạc.
Nhầm đánh giá. thống nhất trong sự mõ tá tiến triển bệnh vã khối u giừa cãc
bác st thí việc phàn chia giai đoạn bệnh và phán nhỏm khối u nguyên bảo vỏng mục
là cần thiết.
Thể ký XX. ky nguyên cua xạ trị. xạ trị lã phương pháp phơ biến nhất trong
điều trị ung thư. Ví vậy. hệ thống phân nhóm ƯNBVM dằu tiên dược xảy dựng bới
Reese và Ellsworth vào năm I960 nhảm đánh giá khối u trước phẫu thuật, tữ dô tiên
lượng kha nàng báo ton mat sau xạ trị. Dựa vào sỗ lượng, vị trí vã kích thước đê
TM/ V*:


chia tinh ưạng u nguyên bào vồng mạc thành 5 nhóm và 10 dưới nhóm 52 [13] [14).
s Nhóm I: Rất thuận lợi.

Ia: tại
Khốinưa
u dem
hơn 4 lần đường kinh gai thị vả khu
trú
saudộc.
nhànnho
cầu.

Ib: Đa khối u. tất ca các khối u đều nhỏ lum 4 lằn đường kinh gai thi và khu

trú tại nưa sau nhàn cầu.
z

Nhóm II: Thuận lợi.
Ila: Khối u đơn độc. kích thước từ 4-10 lần dường kinh gai thị. khu tni tại

nưa sau nhàn cẩu.
Ilb: Đa khối ụ tất ca các khối u đều có kích thước từ 4-10 lần dường kinh gai
thị. khu trú tại nưa sau nhàn cầu.
J Nhóm III: Nghi ngờ.
nia: Đã cỏ lịn thương phía nứa trước nhăn cầu.
Illb: Cõ khối u kích thước lớn lum 10 lan đường kinh gai thị và nầm nưa sau
nhàn cầu.
✓ Nhỏm IV: xấu.

I Va: Da khói u. một sổ có kích thước lớn lum 10 lằn đường kinh gai thị.
IVb: Tốn thương mỡ rộng ra phía trước tới vùng miệng that ( Ora serrata).
J Nhõm V: Tiên lượng rắt xấu.

Va: Khối u lớn quà nứa vông mạc.
Vb: Cỏ te bão reo rầc vào dịch kinh.
Tuy nhiên, hộ thống phân loại cua Reense vã Ellsworth không phán ánh
dược tinh trạng phãt tân tế bào u vào dịch kính. I lơn nửa cơ nghiên cứu chi ra rằng,
cỏ mối tương quan giừa việc phát sinh khối u nguyên phát ác tinh thứ hai ớ bệnh
nhân ƯNBVM mang đột biền di truyền ( germline) dược điều trị bằng tia xạ !i.
Cùng với đó là nhũng biến chửng do diều trị bằng tia xạ den xương và vông mạc
nên phương pháp này dà dần bi thay thề. Do vậy. hộ thống Rccnse và Ellsworth
cùng khơng cịn thê hiện dược ứng dụng phân loại nữa.
Ngày nay sơ đồ phán nhóm u nguyên bào vỏng mạc quốc the ( International
Classification Retinoblastoma) dã được bỗ sung và phát triển. Dựa vào kích thước,
vị tn khối u vả một sổ dặc điểm khác như sự reo rắc tế bão u vào thúy tinh thê hay
sự bong tróc tế bào vồng mạc, đưọc chia thành 5 nhỏm từ A den E
Nhóm A: Khối u < 3mm. khu trú tại vòng mạc, cách diêm vàng trên 3mm và
cách đáy thằn kinh thị giác trên 1.5mm. Khơng có tế bào reo rẳc vào dịch kính.
Nhóm B: Khổi u lớn hơn 3mm nhưng vần ờ vỏng mạc.
TM/ V*:


Nhóm C: Khối u lan ra. tạo thành hạt dưới võng m?c.
Nhóm D: Khổi u lỏn. dịch kính và võng mạc bong ra khơi mật sau cua mắt
Nhóm E: Khối u rắt lởn. lan ra mặt trước cùa mất. plrá huy cấu trúc cua mat. Từ
nhóm A den nhóm E. nguy cơ nữ ro tảng dần tử rất thấp. thấp, trung binh, cao và rầt
cao. Nhỏm A đến c có khá năng kiêm soát bệnh tốt > 90%. Nhỏm D kha nâng này
chi cơn dưới 50%. Nhóm E là nhóm nguy CƯ rất cao. den giai đoạn nảy. kha nàng
bao tồn mầt hầu như không côn. cần phẫu thuật lo;ú bo mat đế bao tồn sự sống cho
bệnh nhãn l'16 4.
1.1.

ỉ Chun đốn

1.1.

Ỉ.1 Chân đồn lâm sàng.

Chân đốn u ngun bão võng mạc cần kết họp các triệu chửng lảm sàng
cùng với kết qua cua những phương pháp cận lảm sàng.
Hiện nay. cõ the dùng nhiều phương pháp cận lãm sàng đe chân đoán u
nguyên bảo vồng mạc it xám lần và dộ chính xác cao như siêu ám. chụp cắt kíp vi
tinh (CT- scanner), chụp cộng hương từ (MRI).

Siêu âm
hình
âm:sẽ
anh
Siêu
của
các
âmxạ
làlại
cơ
phương
quan
trong
phápcơ
sưthê.
dụngKhi
sóng
phát
âm hiện

dê lạo
khối
ra u.
sóng
phan

tiếng vang khác với mơ bính thường. Nhờ vậy bác sf lâm sàng có thê phát hiện
dưực sự cõ mật cùa khối u và vị tii cùa chúng.
Chụp cắt lớp vi tinh là kỳ thuật sử dụng chum tia X liên tục đi qua cơ thê.
Tùy theo the hộ mảy 4 lát. 16 lát. 64 lát....mà hình ánh thu được sau khi đã qua xứ
lý cua hộ thịng máy tính có độ sac nét khác nhau.
Chụp cộng hường từ hiện nay lả kỳ thuật dược sư dụng nhiều ờ nhùng trung
tám lớn ví tru diêm mà phương pháp này mang lại. Chụp cộng hường từ lả kỳ thuật
sử dụng tử trưởng và sóng vị tuyến. Đổi với bệnh nhản u ngun bào vịng mạc nói
riêng, khi phát sinh khói u. sự phân bố nước trong ố mắt thay dôi dản dền hoạt dộng
từ cua nước trong mẳt thay dơi. Nhờ dó, chúng la có the phát hiện được sự có mặt.
vị trí và kích thước khối u. So với chụp cất lớp vi tinh, chụp cộng hưởng từ không
sư dụng tia xạ nên cõ thê hạn che sư tích lũy lia xạ, báo vệ sức khóe cho bệnh nhản.
MỘI ưu diem nừa là MRI cho hình anh rò nét. độ lương phan cao nên dược sư dụng
trong tò chức thần kinh, sọ nào. Chụp cộng hương từ dề dàng cho các ta thấy dưực
cãc khối u xẩm lấn tồ chức khác trong ổ mắt. rất có giã trị trong xác định di cãn
thần kinh thị giác. [16]

TM/ V*:


Hình 1.4a

Hình l,4b

H'mhl.4: Hình (inh khỏi n chụp cộng h trâng từ.1
1.1.5.2Chân đoàn cận làm sàng.
Xét nghiệm gen di truyền cho biết chinh xác tòn thương cua gen. nguyên
nhân cốt lồi gảy nên bệnh u nguyên bào vỏng mạc. Xãc định đột biến gen có vai
trị rất quan trọng trong xác định yếu tố di truyền, dự phông. Bệnh nhàn ƯNBVM
có 40% mang đột biển mầm và 10% có yểu tồ gia đính. Trong trường hợp bệnh
nhãn nhận dược gcn đột biến từ bồ hoặc mẹ. anh chị em cua bệnh nhàn cùng có
50% mang gcn. Dột biến gáy bệnh này có the di truyền cho con cái. cằn xác định
dột biến di truyền, tư vấn cho gia đinh bệnh nhân để phòng ngira hạn chề phát sinh
ca bệnh mới. có phương ân chân dốn sớm. kiêm tra thưởng xun dối với thành
xiên mang gen.
1.2 Gen RB1.
1.2.1vị tri, cầu trúc, chức nùng.
Gen RBỈ được biểt dền là gen ức chế khối u đầu tiên được phát hiện và là
một ưong những gen thường xuyên dột biến nhất ở bệnh nhân ung thư :s.
Gen RB1 nầm trên cánh dài nhiễm sắc thè số 13. ki hiệu 13ql4.2. gồm
178.240 cặp base, kẻo dãi từ cặp base 48.303.747 tới 48.481.986. Gen RB1 gồm
27 exon và 26 intron.
Chr 13
ẫa3

3ỉ5

§ mmũ

—z—

[.

T

Hình 1.5: vị trí gen RB1 trên nhiễm sắc thế 13 ( nguồn:
h ttps://H'ww.gen eca rds.org/csi-

O
0
0
bỉn/carddi
sp.pl
- dext=
The°o20protein°o20encoded
h
isFl.)
.protein
í?genẹ-RBl-:
o20by
ợ2Qt
°ó2 Of a ctor °o2
0E2
t20binds%20transcrìption

TM/ V*:


1
7

12

367

17

18

5-i

27 cf

|-3

gonomíc DNA

Hình 1.6: Cull trúc gen RBI (nguồn:19)
Gen RBI cỏ chức năng diều hòa chu trinh tế bão bằng cách san xuất protein
RB tham gia trực tiếp vảo chu trinh tể bão cua tề bào vỏng mạc. Khi gen RB1 mất
chức năng, các tế bào tiền thản vỏng mạc sè tâng lẽn khơng kiêm sốt và tạo ra khối
u.
1.22 Protein Retinoblastoma.
Protein retinoblastoma (protein RB) gồm 928 axil amin gồm ba mien chinh:
-

Mien N- terminal (RbN): Liên kết với một số protein, bao gồm chất ửc che
lương tác RB với yếu tố ức chế phiên mà nhiễm sắc.

-

Miền túi ( pocket): Miền túi gồm 2 miền phụ A và B. còn được hièu là miền
A/B. Là vị tri gắn cua nhiều protein bao gồm yếu tố sao chép E2F.

-

Miền c-terminal (RbC): là vị trí gắn cho các Cdk và các enzyme kích hoạt
protein RB phosphatase?'
RBN HRBN^T Pocket TT pSckcTT
1 S3

245 267 355 380

581

643

787 829 864 928

Hình 1.7: cấu trúc protein RB ( nguồn: Ị
Protein RB cỏ vai trò rất quan trụng trong việc ngàn chặn sir hỉnh thành khối
u. Bằng cách liên kct với yếu tồ sao chép E2F till vũng AB. protein RB làm cho chu
trinh tẻ bào dừng lại tại diêm chuyên pha Gl/S. do dó thực hiện chức năng ức che sự
phân clũa tế bào.20

TM/ V*:


1
8

Hình 1.8: Ch tre nàng l ũa protein RB.
Sự phát sinh tể bảo mới lừ tể bào cũ và giống tể bào cù còn dược gọi là
nguyên phàn. Nguyên phàn gồm hai giai đoạn chinh: kỳ chung gian va nguyên

phân. Chức nâng ức che hĩnh thành khối u cua pRB dược thê hiộn ứ kỳ trung gian,
cụ thê là cuối giai đoạn chuyên từ pha GI (Gapl) sang pha s. Pha s. G2. và nguyên
phân là những giai đoạn tương dối ổn định, nhiều sự biền thiên gián đoạn thường
hay xay ra ờ pha Gl. Khi chu kỳ dừng tại pha GI do phức hợp E2F.DP1/RB. tể bão
bước vào giai đoạn GO vã cần kích thích dê trư lại giai đoạn Gl. Khi cỏ tín hiệu
táng trưởng, protein RB sè bị phosphoryl hóa và tách ra khỏi phức họp với E2F.
F.2F thốt ra và thưc hiện chức nâng kích thích sao chép, chu trinh te bào tiếp tục
dièn ra vả tạo ra te bão mới

Như
nàng
vậy.
điều
dẻ
hịa
cócua
thề
nhận
thầy,
RB.bão
dột
khiến
bicn
cho
gen
qvõ
RB1
trinh
làm
nhản

mất
lên
chửc
cua tế
hĩnh
thảnh
bão
mất
khối
kiềm
u.protein
sốt,
tề
lảng
sinh
dộ
dần
tói
sự

TM/ V*:


19

Nhiều nghiên cứu đà liên quan đến việc mất chức nâng cua protein RB
không chi với u nguyên bào võng mạc mà côn với nhiều khối u àc tinh không phài ờ
mat. bao gồm u xương, u hắc tố da vả sarcoma mò mềm 23.
1.3 Cơ chế sinh bệnh.
Cơ chế phát sinh u nguyên bào võng mạc có thê do di truyền hoặc khơng di

truyền. Trong đó ngun nhân di truyền chiếm 40% và không di truyền là 60% 2".
Trong tất cà các ca bệnh, chi cỏ 10% cỏ yếu tố gia đính, tức là trong gia đính có
người có tiền sứ mắc bệnh. Các bệnh nhân này đểu thuộc nhóm mang đột biền di
trụyền.
Đột biến di truyền cỏ thê do được thừa hường từ bộ gen cua bổ mẹ hoặc do
dột biến gcn trong giai doạn dầu phát sinh giao tư. Đột biến này cỏ thê di truyền cho
the hộ sau. Theo thuyết "two hit" cúa Knudson, vi tẩt cả các te bảo cùa cơ the đều
mang một đột biến nén te bão tiền thán võng mạc chi cần thêm một đột biến đà gây
thành bệnh, do vậy ti lệ mắc bệnh và mang bộnh ơ ca hai mat cua nhóm cỏ dột biên
di trun cao hơn nhóm khơng di trụyền. Đồng thời tuồi khơi phát và chắn đoán
cùng sởm hơn bệnh nhàn khơng có đột biên di truyền. Trong nghiên cữu cua nhôm
nghiên cứu Thãi Lan. cô 22/25 bệnh nhãn ƯNBVM hai mắt cỏ dột biến di truyền,
chiêm đến 92%2Í. Tuy nhiên bệnh nhãn mang đột biến di truyền vã mang bệnh một
bẽn mát vàn chiêm ti lộ 10-15% trong tông số câc ca bệnh26.
Đột bion không di truyền, tữc là bệnh nhân mang hai dột biến đều là đột biến
soma xay ra trong quá trinh phát tricn. không di truyền từ bố mọ và không từ quà
trinh phát sinh giao từ. Te bảo trai qua hai lần dột biến dần tới mất chức năng gen
RB1 dản tới mất hoặc bầt hoạt chức nàng protein RB. Đột biền nảy không di truyền
cho dời sau và không tim thấy đột biến trong màu.
Q trình tàng methyl hóa khơng bỉnh thường cua vùng promoter được phát
hiện là một cơ chề mới. trong một số khối u. lãm bất hoạt gen mã khơng thay đổi
trinh tự DNA cùa 11Ĩ25.

TM/ .ựt. V*:

4Ả 'V.


20

Năm 2013. một trường hợp u nguyên bảo vỏng mạc không di truyền khơi
phát do khuếch dại MYCN mức cao và gen RBỈ bính thường 23. MYCN là một
oncogene, chiếm một tỷ lệ nhó khoảng 2% nguyên nhản gảy ra UNBVM 2 . Trong
nghiên cứu cùa Kathryn G Ewens vả cộng sự. số ca không phát hiện đột biến trẽn
gen RB1 là 13/245 ca. số ban copy' cùa gen MYCN nấm ữong khoảng 29 đến 110
copy2S. Tại một nghiên cửu khác cua Diane E Rushlow vả cộng sự. con sổ này là
29/1068 và 28 den 121 ban copy cua gen MYCN
1.4 Phương pháp sinh học phán tứ xác định dột biến gen RB1.
1.4.1

Kftftuật PCR.

Nảm 1983, Kary Mullis, người phát minh ra ki' thuật PCR ( Plymerase Chain
Reaction) dà giành dược giai Nobel hỏa hục cho thành tựu nãy. K1' thuật PCR dã
mớ ra một ki nguyên mới cho nghiên cứu y sinh học đi truyền, trờ thảnh một thành
lựu mang tinh cột mốc cùa the ki XX30.
PCR lả kf thuật nhãn ban DNA trong ống nghiệm. Nõ cho phép san xuầt ra
số lượng đoạn gen mong muốn lên gấp nhiều lần do dượcc tâng lén theo cấp số
nhãn qua mỏi chu ki. nhỡ dó có thê thu dược lượng lớn sán phàm đích phục vụ cho
mục đích nghiẻn cứu tiểp theo.
Kí thuật gồm ba giai đoạn: biến tinh, gần mỗi vã kẽo dài. Đỗi với PCR. thay
vi sư dụng các enzyme xúc tảc quá trinh nhân lẽn DNA cua tế bào sổng, kí thuật đà
thãnlì cõng trong việc thay thế chức náng cua cãc enzyme nãy bang nhiệt dộ. Bang
cách sư dụng máy luán nhiệt và bồ sung cãc thành phần cần thiết, ba giai doạn cua
phan ứng dược diễn ra luân phiên, cho ra lưựng lẻm sản phàm trong thời gian
ngan31.

TM/
TM/ V*:
.ựt. V*:

- 4Ả 'V.


21

Hìnlí 1.9: Clíti kỳ phân ửngPCR.
Mơ đầu cho PCR là sự biển tinh toàn mạch cua DNA. Ỡ nhiệt độ 94- 95°c .
DNA mạch đôi sè tách ra tạo thảnh hai mạch đơn.
Sau khi DNA khuôn tách thành 2 mạch đơn. nhiệt độ SC được hạ xuống 4072°C ( thưởng là 55°C) lá nhiệt độ lỗi tru đe cập mơi cỏ thê gắn vào DNA mạch
dơn. Nhiệt độ gằn mơi phụ thuộc vảo trinh tự mồi. tuy nhiên thông thường nhiệt độ
gắn mơi sè thấp hơn Tm cua mồi 2-5°C.
Giai đoạn ba cua quy trinh là kéo dài. Nhiệt độ dược nàng lẽn 72°c. dây là
nhiệt độ hoạt dộng tơi ưu cua enzyme DNA polymerase. Enzyme Taq polymerase
có nhiệt độ bân húy là 40 phút ơ 95°c. tương ứng 50 chu kỳ cùa phan ứng. tuy nhiên
thông thường phan ứng PCR chi duy tri ơ 25-40 chu kỳ [27].

Sau cãc
72°C/5
phút,
chu
kỳ
dam
phàn
bao
ứng.
tẩt
thường
ca
mạch

có
dơn
giai
đềuđoạn
đà dc
kt kt
thỳcthỳc
kộo kộo
di
di.
San
phm
dc
bao
quan

4-15c.

l(D

y-



\
X

/

y

ã

â

l

y

â

y_____

1

r

1

y

y

TM/ .t. V*:

4 'V.

X

*
5--- X

22

\
a

ỳ•
r——
5'

y—
y

r

ry
ry
—■ ■ ------------------

•r
r

y

V

r
1

♦

r
r 5’
—'•

r
r

y

y
•

y

Hìnlt 1.10: Diễn biến phân ứng PCR trong ồng nghiệm.
1.4.2

Kì thuật giãi trình tirgen Sanger.

Giãi trinh tự gen là kỳ- thuật nhầm xác dịnh trinh tự sắp xếp cua 4 loại
nucleotide Adenin. Thymine. Guanine. Cytosine.
DdNTPs lã phản tư nhản tạo. cõ cẩu trúc giồng vói nucleotide, tuy nhiên
cacbon số ba cùa gốc dường mất một o khiến cho mạch kéo đài dừng phán ứng do
không tạo dược liên kết với nucleotide tiếp theo.
ooo

Hình 1.11: So sánh d.STP và ddNTP
ơ giai đoạn kẽo dài 72°c cua phan ứng PCR. phan ímg tạo liẻn kết

phosphodiester giữa gỗc 3'-OH cua nucleotide trước vã gốc 5'-phosphate xay ra.
Tuy nhiên ờ phan ứng PCR sequencing, khi có ddNTP dược gắn vào mạch, do
nhỏm 3'-OH mất them 1 oxy trở thành 3’-H khiến cho sự tạo thành liên kết
phosphodieste không được tạo thành dần tỏi phán ứng kéo dài bị kết thúc

TM/
TM/ V*:
.ựt. V*:

- 4Ả 'V.


23

Hinli 1.12: Liên kêt giữa các nucleotide
(nguồn: ltnp$:/Aietnainen.H'ordpres$.coin/tag/san£er-fnetliođ/) Cãc ddNTP
gắn phông xạ huỳnh quang khác nhau được gấn ngầu nhiên
vào chuồi kẽo dài và lảm kết thúc tồng hợp chuồi. Do vậy. sau phàn ứng PCR
sequencing, các san phẩm hơn kém nhau một nucleotide được tạo ra. Khi cho hồn
hợp san phàm điện di qua gel polyacrylamide, các san phàm lằn lượt di qua hộ
thống phát hiện cùa máy diện di mao quân vả phát ra tín hiệu huỳnh quang tương
img với ddNTP kết thúc. Hộ thống thu nhận tin hiệu ghi nhận lưu thành một đinh (
peak). Các peak liên tiếp nhau, tồng hợp lại cho ra trinh tự cua doạn DN A phân
tích.

TM/ .ựt. V*:

4Ả 'V.

24

Hìnli 1.13: Sơ đồ nguyên lý giãi trinh tựgen Sanger
1.43 Kỳ thuật MLPA.
Xóa đoạn exon 13-17 lã diem nóng của mội số khối u như u xương, ung thư
vú. sacoma và ca UNBVM [28]. MLPA lả một kỳ thuật dáng tin cậy dê phãt hiện sự
mắt hoặc lập đoạn lớn cua gen RB1. nâng cao chất lượng chan đoản -5.
MLPA ( Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) là một kỹ thuật
Multiplex PCR mò ta lần đầu ticn vào năm 2002 bời Schouten J.P vã cộng sự. lã kỳ
thuật khuếch đại các doạn đàu dỏ phụ thu()C vào phan ứng nối. Phương pháp sir
dụng các đoạn dầu dị ( Probe) có kha năng lai hóa với DNA đích dậc hiệu.

5l
Mộtcác
gụi
probe
lã
đoạn
gồm
dị
2xi
chuồi
và
oligonucleotide
ngược.
Nhờ
kích
có
thước
trinh

khác
tự
giống
nhau
nhau
cà
ở càc
probe
vị
sau
trí
khi
trên
dược
đoạn
lai
dị
hóa
xi
dặc
và
hiệu
đoạn
dị
ngược
DNA
đích
mà
tất
sẻ

được
khuếch
dại
bang
một
cập
mải
duy
nhất
.với

TM/
TM/ V*:
.ựt. V*:

- 4Ả 'V.


25

San phàm sau phán ứng PCR là các đoạn trinh tự nucleotide có độ dài ngắn
khác nhau và có gắn huỳnh quang, có thê phán tích bang kỳ thuất điện di mao quan.
Kồt quá cũa mầu khảo sát dược dối chiểu từng exon so với mầu chứng. Độ cao các
peak cùa mảu chứng lãm cơ sờ xác định các đột biến xõa đoạn lặp đoạn.
Nhở ứng dụng kháo sát dồng thời nhiều đoạn gen mong muốn, ngây nay kỳ
thuật MI.PA dược ứng đụng rất nhiều trong chân đoán các bệnh di truyền cùa
người, di truyền tế bào. bệnh lý. ung thư....

Hình 1.14 Nguyên lý kỳ thuật MLPA

re V*: