Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự gen để phát hiện đột biến vùng promoter gen TERT trên bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan

-■c -ÍM Qỉ ugc V Hl


LỜI CĂM ƠN
Lời đầu tiên, em xin bây to lòng biết on sáu sẳc tới Ban Giám hiệu trưởng Đại
học Y Hà Nội. phông Quan lý và Đào tạo. các Thầy Cô cua các bộ môn.... (là dạy dỏ.
chi bao em trong suốt những năm học tập. tu dường dưới mái trường Đại học Y Hà Nội.
Trong suốt quá trinh hục tập vã thực hiện khóa luận tại Trung tàm Nghiên cứu
Gen - Protein, em đà dược tạo mọi điều kiện thuận lụi nhất và nhộn dược sự chi bao tận
tình cua cãcThầy Cơ cùng các anh chị.
Với sự trân trọng và bict cm. cm xin gửi lòi cam ơn sâu sác tới TS. Nguyền Thu
Thủy là người trục tiếp hưởng dần em trong suốt quá trinh thực hiện khóa luận, người
đà lụn tinh giúp đò. chia sẻ cho em những kinh nghiệm hữu ich vá những gõpý tâm
huyết giúp em hỗn thành tot khóa luận cua minh.
Lởi cuối củng, em xin gưi lời cam ơn tói gia dính, bạn bẽ vã những người thân
đà ln dộng viêạ khích lộ và tạo chỗ dựa vừng chắc cho em trong suốt q trinh học
tập vã hồn thánh khóa luận nãy.
Hà Nội. tháng 05 nám 202ỉ
Sinh viên

Nguyễn Thị Anh

-ÍM Qỉ ugc V Hl


CỘNG HÒA XÃ HỢI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Dộc lập - Tự do - Hạnh phúc
______*******______

LỊI CAM ĐOAN

Kính gũrỉỉ Phịng Quan lý Đào tạo Đại hục - Trường Dại học Y Hà Nội Hội (lồng chấm
khóa luận tốt nghiệp
Tịi là Nguyen Thị Anh. sinh viên khoa Kỹ thuật y học. Trường Đại học Y llà Nội, xin
cam đoan:
1. Đây lã khóa luận do tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dan cùa TS. Nguyen
Thu Thúy.
2. Còng trinh nghiên cứu nãy khơng trùng lặp với bất kí nghiên cửu nào khác dà
được còng bố lại Việt Nam.
Hà Nội. ngày 20 tháng 05 nám 2021
Người viết khóa luận

Nguyễn Thị Anh

-c -ÍM Qỉ ugc V Hl


DANH MỤC CÁC CHỦ VIẾT TÁT

HCC

Hepatocell Carcinoma

TERT

Telomerase reverse Transcriptase

HBV

Hepatitis B virus

HCV

Hepatitis c virus
Vascular endothelial growth factor

VEGF
DNA

Dioxyribonucleotide acid

mRNA

Messenger ribonucleic acid

TF

Transcription Factor

A FBI

Aflatoxin Bl

CT

Computed Tomography-

MRI

Magnetic Resonance Imaging

ALPPS

Associating liver partition and portal vein ligation for staged
liepatectomy

OD

Optical Density

PCR

Polymerase Chain Reaction

dNTP

Deoxyribonucleotide triphosphate

ddNTP

Dideoxy ribonu Cleo tide triphosphate

bp

Base paữ
Kilo base

kb

r-u -ÍM Qỉ ugc V Hl

MỤC LỤC

-ÍM Qỉ ugc V Hl


DANH MỤC BÀNG

r-u -ÍM Qỉ ugc V Hl


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Hĩnh ảnh vi thê tế bào gan trường họp ung thư biếu mô te bảo gan.... 7
ĐẠT VÁN ĐẼ
Ngày nay. ung thư được cho là nguyên nhãn gày tư vong hãng đầu trên toàn thế
giới. Sỗ ca mắc ung ihtr vã sổ ca tư vong do ung thư dự kien sè lâng nhanh khi dân số
dang tiếp tục tảng lên. giả đi vã áp dụng các hành vi lỗi sống làm tàng nguy cơ ung thư:.
Trong các loại ung thư hiện nay, ung thư biêu mô te bào gan (Hepatocellular
carcinoma - HCC) là bệnh ung thư rat pho bicn. Theo Globocan 2020. sổ ca mắc ung thư
gan là 905677 ca, chiếm 4.7% số ca mắc càc bệnh ung thư và sổ ca tư vong do ung thư gan
là 830180 ca. chiếm 8.3% số ca tư vong do ung thư trên thề giới 2. Tý lệ mấc ung thư biêu
mõ tể bão gan thay đôi theo khu vực dịa lý và chiếm tỹ lệ cao ớ cảc khu vực kém phát
triên. Sự hình thành khối u cua ung thư bicu mõ tề bảo gan lã một quả trình phức tạp liên
quan đến nhiều yếu tố nguy cơ như: nhiềm virus viêm gan B. viêm gan c. Aflatoxin Bl. dột
biên gen. bệnh gan nhiễm mờ không do rượu,... Đen nay. cơ che gày ung thư biếu mõ tế
bào gan vẫn chưa dược làm sảng tò < Chinh vi vậy. việc xảc định nguồn gỗc tiên phát cua
bộnh là het sức quan trọng.
5
Chânde
đoản

sớm
ung
thư
biêu
mị
tế
bào
gan
cịn
gãp
lỉhiều
khó
khản
the,
bời
việc
các
xác
triệu
định
chững
dược
những
lãm
sàng
yếu
thường
tổ
nguy
xuất

cơ
tữ
hiện
bẽn
muộn.
trong
Vì
cơ
thế
(TERT)
lã
cầp
mà
hóa
thiết.
cho
tiêu
Gen
Telomerase
dơn
vị
xúc
reverse
tãc
cua
transcriptase
enzyme
phiên
mà
ngược

cua
enzym
telomerase.
telomerase
Sự
biểu
xay
ra
hiện
ởvũng
các
cua
tế
gen
bảo
TERT
mẩm
và
và
sự
ung
hoạt
thư’.
hỏa
Ỡlã
các
hoạt
tế
telomerase
bão

ung
thư.
xay
sự
ra
biêu
rất
mạnh
hiện
mè.
q
dẫn
mức
đến
cúa
sự
TERT
tâng
lãm
sinh
kích
khơng
lợi
cho
giới
sự
hạn
xảm
cua
lan

tể
và
bão
di
cân
ung
cùa
thư.
khối
từ
dớ
u.
tạo
Dột
diều
biến
kiện
vùng
thuận
promoter
phát
sinh
gen
ung
TERT
thư
biêu
dược
mị
cho

tế
là
bào
có
gan
ánh
và
hướng
các
dền
loại
q
ung
trinh
thư
khác
cần
thiết
.Xác
Việc
và
xác
có
ý
định
nghía
được
trong
đột
chân

biến
đốn
vùng
phát
promoter
hiện
gen
sớm
TERT
ung
thư.
vậy.
đê
đề
có
tài
phương
nghiên
pháp
cứu:
điều
"ỉ
ng
trị
dụng
hiệu
kỹ
qua
thuật
cho

giãi
bộnh
trìnlt
nhân.
Do
tự
gen
phát
hiệu
dột
mị
biển
vùng
promoter
”
được
thực
gen
TERT
hiện
vói
trên
mục
bệnh
tiêu:
nhân
ung
thư
định
biêu

dược
mơ
đột
tế
biển
bào
gan
promoter
gen
TERT
ưẽn
bệnh
CHlTơNG 1
TƠNG QUAN
1.1. Tồng quan về ung thir biếu mõ tế bào gan
1.1 J. Sơ lược về ung thư hiểu mô tể bào gan
Gan là một bộ phận quan trụng trong cơ thê. được cầu tạo từ 4 loại tế bão chinh: te
bào gan. tế bão nội mô. tế bão Kupffer vã tế bào hĩnh sao. Mồi loại tế bão này sơ hữu
những chức nâng l iêng biệt, hợp tác điều hỏa chức nâng gan ớ nhiều cấp độ. Gan thực
hiện nhiều chức nâng thiết yếu, bao gồm san xuất mật. điều hòa protein và glucose trong
huyết tương, chuyên hóa si nil học cua thuốc vã chất dộc. Gan là cơ quan dầu tiên tiếp xúc

-ÍM CỊỈ ugc V
Hl


với cãc chất dinh dường dược hấp thụ qua dường ruột và xcnobiotics thông qua tinh mạch
cứa 6. Do vậy. chi cẩn phối hợp lệch nhịp, chức nâng gan sè gập vần dề. Đó lã cơ hội đê
cảc bệnh lý gan tiến triền.
Ưng thư biểu mõ tế bào gan (HCC) lã ung thư gan nguyên phát phổ biển nhất,

chiếm 75% - 85% các trường hợp ung thư gan '. Quá trinh hình thành ung thư biêu mị tế
bào gan là một quá trinh pliửc tạp cớ liên quan đến một số yếu tổ cân nguycn. do dó dẫn
dền sự hoạt hóa khơng bính thưởng cùa các con dưỡng te bào và phản tư khác nhau, phá
vờ sự cân bằng giừa sự hoạt hóa vã bất hoạt cua các gcn sinh ung thư và gen ức chế ung
thư tương ứng. Ví ung thư biêu mô tế bào gan thường xây ra trên nền các bệnh lý gan hoặc
xơ gan và hầu het bệnh nhân đưục chân doán ớ giai đoạn muộn cùa bệnh, nên tiên lượng
thưởng kẽms. Ưng thư biêu mõ tề bãơ gan ngày càng gia lâng vẽ tỳ lệ mằc vã có tỷ lộ tứ
vong rẩt cao 9. Theo Globocal 2020. ớ Việt Nam, ti lệ ung thư gan mắc mới là 14.5%
(26.418 ca), phân chia theo giới thi nam chiếm 20.5% (20.256 ca) và ờ nừ là 7.4% (6.162
ca). Ti lộ tư vong cua ung thư gan trong năm 2020 ờ nước ta lên tới 20.6%. Và ung thư gan
là loại ưng thư có tý lộ mắc mới và tư vong do ung thư cao nhất trong các loại ung thư ờ
Việt Nam t0.
về tinh nhạy câm cua giới đỗi với HCC. ở tẩt cã các vùng dịa lý. nam cỏ ti lệ mắc
bệnh cao hơn nừ. Ti lệ nam : nữ xấp xi 3 : 1 hoặc 4 : 1 ớ khu vực Châu Á - Thái Bình
Dương và ư Châu Phi cận Sahara hoặc 2 : 1 ớ cãc khu vực cỏ ti lộ mầc HCC thấp hơn.
Nhưng lý do mã nam giới có nguy cơ phát triển HCC cao hơn nừ giới vần chưa được làm
sáng to. có the được giai thích một phần khi xem xét tý lệ cãc yếu tổ nguy cơ HCC ớ nam
giới như nhiễm viêm gan B (Hepatitis B virus HBV). viém gan c (Hepatitis c virus HCV).
hút thuốc vã uổng rượu thưởng cao hơn nữ giỏi và vai trở cua nội tiết tố androgen trong
việc thúc đây ticn tricn thành ung thư bicu mò te bào gan ớ nam giới cùng đang được tim
hiêu n.
1.12. Nguyên nhản gáy bệnh
Một số yếu tố nguy cơ có liên quan đến sự phát triền vã tiến triển cua HCC. đặc

-ÍM CỊỈ ugc V
Hl


biệt là xiêm gan virus màn tính, viêm gan khơng do virus, uổng rượu màn tinh, một sổ tinh
trạng bệnh nhất định (béo phi và tiêu đường), vã tiêu thụ các mặt hàng chú lực bị nhiễm

độc tổ.
1.12.1. Viẻni gan virus
Nhẻm virus viêm gan B màn tinh (HBV) lã yếu tố nguy cơ chính ở cãc nước dang
phát triên như Trung Quôc vã An Độ. (5 cãc nước dã phát triên. ung thư biêu mô tế bào
gan chu yếu phát triền từ xơ gan do virus viêm gan c và bệnh gan nhỉcm mờ khơng do
rượu 5.
Virus
gảy
raxiêm
bệnh
gan
viêm
Bmị
gan
vàgia
xirus
virus
viêm
dần!:gan
đền
c
sựlà
phát
ngun
triền
nhản
cua
chính
xơ HBV
gan

và
vã
ung
HCV
thư
cõ
thê
biêu
tham
tế
bảo
xàogan
việc
. Các
protein
cua
xirus
chiếm quyền điều khiên bộ máy tế bào. Sự tấn công cùa virus cùng cỏ the trực tiếp gảy ra
sự phát triển mỏ xơ gan thịng qua việc giai phơng cãc cytokine tiền viêm.
Ty lộ mắc I ICC đã tăng mạnh trong nhùng thập ky gần dây và dược cho lả do
nhiễm HCV màn tinh. Đo dó. nhiễm HCV mãn tính là một yếu tố nguy cơ chínlì cho sự
pliât triển HCC. Mồi năm. có tử 4-5% bệnh nhản viêm gan c màn tinh phát triên thảnh
HCC. Các dầu hiệu huyết thanh cua nhiễm HCV ơ bệnh nhân HCC dao dộng từ 27% đến
80% và nhicm HCV làm lãng nguy cơ phát triển HCC ước tinh gấp 17 lần so với những
người khoe mạnh 13.
Nhiẻm virus xiêm gan B màn tinh chiếm it nhắt 50% các trưởng hợp ung thir biêu
mõ tề bào gan ưên toàn the giới. Các yểu tổ từ virus viêm gan B thủc dẩy HCC bao gồm
nhi cm trũng kẽo dài. mức dộ sao chép virus viêm gan B tảng, sự tich họp DNA cua xirus
xảo bộ gen vật chu. các dột bicn HBV và cãc oncoprotein được mà hỏa bin hộ gen cua
HBV. Viêm gan tái phát do phan ủng miền dịch cua vật chu ưong quá trinh nhiễm HBV

màn tinh cỏ thế dần den xơ gan. dồng thời dây nhanh toe độ lảm mới te bào gan và thúc
dẩy sự tích tụ các đột biến ỉ4.
1.1.2.2.

Rượu

Uống rượu có hại cho sức khoe, lâu dần dản đến xơ gan. và sau dỏ là ung thư biêu
mò tế bào gan. Bệnh gan do rượu lả một ưong nhùng nguyên nhàn hàng dầu cua HCC.

-ÍM CỊỈ ugc V
Hl


Theo các nghiên cứu. lạm dụng rượu (uống hơn 50 - 70 g / ngày trong thởi gian dài) có
liên quan dến việc tảng nguy cơ mắc ung thư biêu mô tế bão gan gấp 2 lần

15

. Ethanol

nguyên chất không trực tiếp gáy viêm và tòn thương gan. tuy nhiên, các sân phàm phụ dộc
hại cua quá trinh dị hóa rượu như tích tụ acetaldehyde và các gốc tự do có the anh hưởng
đến quá trinh stress oxy hỏa. Ngoải ra. quã trinh dị hóa rượu tác dộng den một sổ bước
chuyến hỏa lipid, dần đến gan nhiẻm mở và ức chế quá trinh oxy hỏa axit bẽo 16.
1.12.3. Aflatoxin Bỉ
Aflatoxin được giãi phóng từ thực phàm bị nhicm nẩm Aspetgillus ílavus vả
Aspergillus parasiticus. Một loạt các biến đỏi hóa học xảy ra dần đến việc hĩnh thảnh các
chắt bò sung vả chât trung gian 26. Aflatoxin Bl chu yếu gày dột biến tại codon 249 trong
gen ức chế khối u TP53 (AGG thảnh AGT). dần đến thay the arginine thành serine ( đột
bicn R249S). diều này hiếm khi dược quan sãt thầy ờ cãc bệnh ung thư khác ngoài IICC.

Dột biến R.249S chiếm 50-90% đột biến TP53 dược tìm thấy trong các HCC từ các vũng
có mức độ phơi nhiễm aflatoxin cao. Ty lộ dột biến này giam xuống dưới 6% ờ bệnh nhàn
HCC ở Hoa Kỳ. Cùng có sự tương tác mạnh mè giừa việc tác dụng hiệp dồng cua aflatoxin
với HBV trong nguy cơ gày ung thư biểu mơ tể bào gan. Nhiễm HBV màn tính có the tạo
ra cytochrome P45OS chun hóa AFB1 khơng hoạt dộng thành AFB1 - S.9 - epoxit gãy
dột biến. Hoại tư và tải tạo tế bào gan do nhiễm HBV mãn tính cùng làm tâng xác suất đột
biến TP53 do AFB1 gãy ra
1.12. Triệu chứng tơnt sàng
Chânđau
thức
dỗn
bin
hâu
sớm
hèt
vàtãn
diều
bệnh
trị
nhản
hiệu
khơng
qua
có
HCC
triệu
vần
chứng
cỏn
lã

vã
một
biêu
thách
hiện
lãm
giai
sảng
đoạn
xay'
nặng,
ra
cảc
ơ
các
triệu
giai
chứng
doạn
và
tiền
phát
triển
hiện
cua
lâm
bệnh.
sàng
(í
bao

gồm
nghèn,
rối
bụng
loạn
mơ
hổ
vủng
huyết
hạ
vã
sườn
sốt
phai,
khơng
gan
rỏ
to.
ngun
vàng
nhản.
da
tắc
Các
triệu
chán
ân.
chứng
buồn
khơng

nơn.
dặc
thờ
hiộu
ơ
vã
của
sụt
bệnh
cân
ảc
thường
tinh
cùng
tiến
tồn
triền
tại.
như
Bệnh
biết
nhân
cũng
xư
có
gan
the
khơng
cỏ
biêu

dirợc
hiộn
phát
cua
hiện
gan
mất
hoặc
bủ.
xơ
Các
gan
biến
cịn
bú
chừng
đà
bao
gồm tấc tinh mạch gan tiến triển thành hội chủng Budd-Chiari vã thường xuyên hơn là
xâm lẩn tihh mạch cưa vã huyết khối1S.
1.1.4. Cliấn đoán ung thư biển mơ tể bào gan

-ÍM CỊỈ ugc V
Hl


/ỉừ//í /./.

á/t/t vỉf/ỉềỉê

< qmt/rinmg/fpp u/ụĩ f/ur Mêtí/mĩ fr/>àtfga/ỉ

/Nguồn: https ://th uctapngoai. wordpress. com/)
Chân đoán HCC chu yểu dựa trẽn các nghiên cứu hình anh và các xét nghiệm trong
phịng thi nghiệm. Cãc nghiên cứu hình ảnh dược su dụng nong chần đoán, lập ke hoạch
điều trị. quan lý và theo dồi HCC là siêu ám. chụp cắt lóp vi tinh (CT) và chụp cộng hương
tử (MRI). Thông thường nhắt. chụpCT láng cường cán quang vả chụp MRI được thực hiện
de xác dịnh. phàn biệt và kiêm tra khổi lượng gan. HCC thường cõ một hình anh duy nhất.
Trên các nghiên cứu CT và MRI cỏ tăng cưởng độ lương phân, sự hẩp thu thuốc can quang
ờ pha dộng mạch cao và sự rứa trịi nhanh chóng trong giai đoạn muộn dược hiên thị. mặc
dủ những đặc điểm nãy khơng có trong giai đoạn đằu hoặc trong HCC khơng biệt hóa tốt1S.
1.1.5. Diều trị ung thư biếu mò tể bào gan
Neu dược phát hiện rất sớm. ung thư biêu mò tể bão gan tliực sự có the được chừa
khơi với tiên lượng dâi hạn tốt trong đó các lựa chọn diều trị chinh lã phầu thuật cất bo
hoặc ghép gan nếu bệnh nhản lả ứng viên ghép tạng phù hợp.
ỉ.1.5. ỉ. cắt gan
Cắt bó tỏn thương HCC nên là lựa chọn điều trị chinh ờ nhưng bộnh nhàn IICC đơn
độc. Cảc kỳ thuật cat gan (hường được sư dụng nhắt là phương pháp tiếp cận trước dẻ
tránh huy động gan vã lảm vờ cảc khơi u gan lớn. điều chinh cân thận áp lực venus trung
tâm cho giam mất máu quanh phẫu thuật. Vị trí vã kích thước cũa tơn thương, sự xâm lấn
mạch mâu nên dược ước tính trước khi phảu thuật. Cảt bơ giai phẫu nên dược dự định
trong mọi trường hợp nếu khơng có chống chi định. Điều kiện tiên quyết là phần gan dược

-ÍM CỊỈ ugc V
Hl


bao tổn phai dứ. phái giừ lại đỏng chay mạch máu dầy du và không bị ung thư18.
Một kỳ thuật mới hơn, kết hụp cắt gan hai giai doạn với tắc tinh mạch cừa. Liên kết
phàn \iing gan và thất tinh mạch cổng trong phầu thuật cẩt gan theo giai đoạn (ALPPS) lã

một trong những cai tiến phẫu thuật chinh trong phảu thuật gan ngày nay. ALPPS nhằm
mục đích tăng tốc độ phí đại cua tàn dư gan bang cách thắt tinh mạch cứa bên phai và tách
tại chồ bề mật chuycn tiếp dự định xuống tinh mạch chu dưới 1S.
1.1.5.2.

Chép gan

Ghép gan là phương pháp điểu trị lý tương cho ung thư biêu mô tê bào gan. dặc
biệt lã khi có bênh gan tiềm ân. ví phương pháp nãy giúp loại bó khối u vã chữa khỏi xơ
gan tiềm ân nguy cơ phát triền ung thư bicu mò te bào gan. Tuy nhiên, hạn chế chinh cua
ghép gan lã thiếu nội tạng dẫn den tỳ lộ bơ chừa cao (12% -25% mồi năm)!8.
:s
Rat là
it
bệnh
nhàn
(dưới
20%)
cỏ
the
cẩt
vàtrí
cấy
ghép
do
những
khối
u.
khó
liên

khán
quan
liên
den
quan
mạch
đen
máu
kích
và
ngồi
gan
vị
vã
dự
và
trừ
số80%
lượng
chức
năng
lại
gan
các
do
liệu
xơ
gan.
pháp
Lira

can
thi
chọn
ộp
điều
.thước,
trị bơ
cuồi
cùng
cho
cịn

-ÍM CỊỈ ugc V
Hl


13

Ngồi ra, HCC có thế được điều tri bang sorafenib và các loại thuốc khác như
sunitinib. hrivanib, và các chẩt ức chế tạo mạch khác hiện vần dang được phát triển vã
có nhiều hứa hẹn trong việc nhầm mục tiêu vảo mạng lưới tạo mạch rộng khắp cỏ trong
gan 19.
1.2.

Tổng quanvềgen TERT

1.2.1. f 'ị tri, cẩu trúcgen

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y Mĩ

Hìnlt 1.2. ĩ 'ị trí cua gen TERT trong bộ NST người.
(Nguồn: http$://en. wikipedia.org/wiki/)
Gen TERT nảm ưèn nhiễm sac thê số 5pl533 ớ người, là một thành phằn chinh
cua holoenzyme telomerase. Gen TERT dãi 42 kb. gồm 15 intron và 16 exon vói vũng
promoter có kích thước 260bp ngược dơng từ vị trí bằt đầu dịch mà (AL'G) 2Ữ-21. Vùng
phiên mã ngược dược mà hóa bới cảc exon từ exon 5 den exon 9. Vũng promoter gen
TERT (TERTp) chứa cãc hộp GC liên kết yếu tổ phiên mả Spl. yếu tổ này lảm tâng sự
phiên mà cua TERT vả cãc hộp E (có trinh tự CACGTG) liên kết với cá yếu tổ tảng
cường và ức chế phiên mà. TERTp thiểu một hộp TATA nhưng nõ chứa các vị tri liên
kểt cho nhiều yểu tố phiên mà khác nhau-°.

-ÍM Qỉ ugc V Hl


14

Hình 1.3. ỉ'ị trí các exon và intron trên trình /ỊTCDNA cua gen TERT.
(Nguồn: ỉứĩps://acadenúc.oup.com/)
1.22. Chức nũng gen
Gen TERT mà hỏa tiêu dơn vị xúc tãc cua en/ym sao chép ngược telomerase, là
yểu tố hạn chế sự tăng sinh không giới hạn cua hầu hết cảc tế bào soma. Telomerase là
một ríbonucleoprotein polymerase, bi bat hoạt do gen TERT bị ức chề mạnh mè trong
hầu het các tế bão soma ờ người binh thưởng. chí được kích hoạt trong các tế bào gốc
pliịi. tế bào lympho hoạt hóa hoặc các tề bào lảng sinh cao khác, đỏng vai trò quan
trọng ưong sinh học tể bảo gốc. cân bằng nội môi. diều hịa miền dịch, anh hương đến
q trinh lào hóa. Sự kích hoạt telomerase thõng qua cam ứng gen TERT xay ra phô
biến trong cảc tế bào ảc tinh, lả tiền đề cho quã trinh phát sinh ung thư ơ người TERT
đâ dược chứng minh là hoạt dộng như một dơng u tỏ phiên mà đê diều hịa sự biêu
hiện cùa gen. Thông thường, TER I' tương tác với TF spl. liên kết với promoter yếu tố
tâng trương nội nk> mạch mảu (VEGF) và tạo diều kiện thuận lợi cho quã trinh phiên

mà cùa VEGF. hình thành mạch mâu trong tể bào ung thư ớ người. TERT là một trong
hai thành phần chinh cùa phức hợp telomerase, giúp kẽo dãi các telomere bang cách
thêm vào các đoạn DNA ngắn lặp lại, cụ the là 5’-TTAGGG-3’. Nhùng trinh tự lụp lại
này dược liên kết với nhau bởi phức hợp sheterĩn phức hợp đóng vai trỏ cơ bán trong
việc bao vệ các đầu mút cua nhiễm sắc thê và quy định chiều dài cùa telomere

20

.

TERT/telomase kéo dài chiều dài cua telomere, do dó mang lại kha nâng tăng sinh bền
vùng cho cả tế bào bính thường vã tế bào ung thư. Các bang chúng gần đây cũng đà chi

-W-- -ÍM
-ÍM Qỉ
Qỉ ugc
ugc V
V Hl


15

ra rang TERT/telomase cỏ the tham gia vào quá trinh sinh lý vã quá trinh sinh ung thư.
độc lập với chức nàng kéo dài telomere cua 11ĨNhư vậy. TERT dóng một vai trò quan
ưọng trong quá trinh phát sinh ung thư. dam bao sự ôn dinh cua nhiễm sác thê băng
cách duy trí độ dãi cua telomere và cho phép cãc tế bão ngăn chặn sự lảo hóa
Ngồi chức nàng duy trí độ dài cua telomere, gen TERT cũng mang nhùng chức
nàng khác không liên quan tới telomere nhir: tương tác với các con đường dần truyền
tin hiệu cùa tế bão chắt, diều hòa cấu trúc cùa chất nhiễm sắc. liên kết vã bao vệ DNA ti
thê....:o.

1.3.

Mồi quan hệ giũa gen TERT và ung thư biểu mò tế bào gan
Biêu hiện cua TERT vã hoạt dộng cua telomerase có the được phát hiện ờ 90%

cãc dòng tế bão cõ nguồn gôc ung thư ờ người và các khối u nguyên phát. Các tế bào
ung thư dương tính với TERT/tclomcrase cao hơn dâng ké so với các ycu tố khác. Diều
này cho thầy sự biếu hiện cua TERT ờ mức độ mRNA là cơ che thiết yếu đẽ kích hoạt
telomerase trong tế bào ung thư. Vùng promoter cua gen TERT dược coi là yếu tố điều
hòa quan trọng nhất cho sự biếu hiện cua TERT. Promoter gen TERT tương tác với các
yếu tổ phiên mà khác nhau, dãp ứng với nhiều tin hiộu sinh lý hoặc gảy ung thư
Dột biến
somatrẽn
gen
TERT
là hóa.
những
đột
khơng
màdủ
hóa
phơ
chúng
biển
cõdược
nhẩt
xay
ra
trong
trong

các
vùng
tế ánh
bào
mã
ungsổ
thư
nhưng
ởbiến
ngtrời.
chúng
lại
Mặc
xay
ra
TERT
phổ
dã
hơn
ờ
chứng
vủng
minh
promoter.
là
Một
hưởng
đến
dột
sự

biền
biêu
promoter
hiện cùa TERT. độ dải cúa telomere vả hoạt tính cùa telomerase bang cách phả bo sự
bất hoạt cua telomerase. Trong tế bào ung thư, đột biến vũng promoter gen TERT
thường liên quan đến mửc độ biêu hiện TERT cao him. Hai dột biến promoter gen
TERT phô biến nhất là đột biến thay thề c> T. tại vị tri -124 bp và -146 bp từ vị trí bắt
đầu phiên mà. tương ứng là C228T vã C25OT ‘°. Các đột bicn phát sinh vùng promoter
gcn TERT này được cho lã điều hòa lãng cường sự phiên mà cua TERT bang cách lạo ra
các vị rũ gẳn ETS (E-hventy six) 23 và cãc yểu tố phiên mã như EST1/2. GABP vã P52

(NFKB2) 24.

ccc AXiGG
GGGCCT7CCCC
I CJMT

-ÍM Qỉ ugc V Hl

ccc ẠẠGCỌC
GCGCCTTCCCC
f CĨSOT


16

Hình 1.4. vị trí dột biền -124OT và -146OT trên promoter gen TERT.
(Nguồn: hnps.7/jcp. bmj. com/)
Các đột biến tại C228T và C2S0T hiếm khi xay ra đồng thời và thường là dị họp
tư. xảy ra theo kiêu loại trử lần nhau vả ca hai đều tạo ra một trình tự 1 lbp giống hệt

nhau 'CCCGGAAGGGG' 25. Đột biền promoter gen TERT được phát hiện là dột biến
diem phô biền nhất ở một sổ loại ung thư như: u nguyên bào thần kinh đệm (83%). u
hắc tồ (71%). ung thư bâng quang (66%) vã ở ung thư biếu mỏ tế bảo gan là 47% 26-2'.
Trong nghiên cứu cua Hafezi. F. và D. Perez Bercoff. ti lệ dột biến trong HCC lả 29,3 %
với ti lệ đội biến tại - 124OT là 94,7% vã ti lệ đột biến tại -146OT chi là 5.3% ãô.
Nhúm bnh nhn ung th biờu m t bóo gan có dột bien promoter được xác
định có tiên lượng xẩu. Các đột biến vùng promoter gen TERT gáy ra sự chuyên dói
biêu sinh trên alcn đột biến. Do dó. các dột biển cùa promoter gen TERT có ticm nàng
trở thánh dấu ấn sinh học cùng như mục tiêu điều trị trong tương lai -1.
1.4.

Kỹ thuật giái trình tự gen

1.4.7. Nguyên Ịý
Giái trinh tự gen (DNA sequencing) lã phương pháp xác dịnh trinh tự sằp xốp
cùa 4 loại nucleotid: A (Adenine). T (Thymine). G (Guanine) và c (Cytosine) trên phản
tư DNA.

-W-- -ÍM
-ÍM Qỉ
Qỉ ugc
ugc V
V Hl


17

•

Máy giãi trinh tự gen tự dộng hồn tồn dược thiết kê tiên nguyên tảc sư dụng

ddNTP do F. Sanger và cộng sự phảt minh.

•

Trên các máy the hệ mới. người ta dùng 4 màu hujilh quang khác nhau dể đánh
dấu 4 loại ddNTP. Nhờ vậy phan ứng giai trinh tự cõ the thực hiện trong một
ống nghiệm và chi cần điện di trên một hàng mà không phãi trẽn 4 hãng khác
nhau như trước dãy. hệ thống điện di thường lã điện di mao quán.

•

Mỗi khi cỏ một vạch diện di di qua. phân tư ddNTP cuối củng ơ dầu 3’ cứa đoạn
DNA sè phát ra một màu huỳnh quang tương ứng. máy sè ghi nhặn mâu sắc nảy

và chuycn về mậy tinh phàn tích.
nucleotid.
Dụa
vào màutử
huỳnh
dó biết
quang
dược
mã trinh
mây nhận
tự cùa
diệnDNA
dược
đích.
loại

-ÍM Qỉ ugc V Hl


18

1.42. I Jig filing
• Giai trinh tự định đanh cảc loại xi khuân, virus, ký sinh trũng, vi nấm....
• Xác định các đột biển gây bệnh, dột biến kháng thuốc vá cả các đột biến tãng
tinh nhạy câm cùa thuốc.
• Giúi trinh tự gen trong nghiên cửu dậc điềm gen học. nghiên cũu sự phàn bô
kiêu gen và cãc kiêu di truyền.
Gãái
hình
trinh
thãi
tự xác
bộ
dánh
gen
giã
người,
sự yếu
khảc
xáctổ
dinh
biệt
các
giừa
nhỏm
bệnh

và
da
nhõmvề
báo
chững
cãcdơn.
đế
vấn
đồ
dịnh
sức
khoe.
cãc
nguy
cơnucleotide
và
dưa
ra canh

-c
-■c-ÍM
-ÍM
QỈCỊỈ
Hgc
ugc
VV
HlHl


CHƯƠNG 2

DĨI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu

2.1.

Thịi gian - Địa điếm nghiên cini

-

Thời gian nghiên cửu: 09/2020 - 06'2021

-

Dịa điềm nghiên cứu: Trung tâm nghiên cứu Gen & Protein. Bộ mỏn Khoa học
xét nghiệm - Trưởng Dại học Y Hà Nội.

2.2.
-

Dối tượng nghiên cứu
Nhõm nghiên cứu: gồm 30 màu mị bệnh hục cua 30 bộnh nhân được chẩn đốn
ung thư biểu mỏ tề bão gan.

-

Tiêu chuẩn chọn mẫu:

•

Bệnh nhãn được chấn đoán ung thư bĩcu mỏ tế bào gan qua mơ bệnh học.

•

Bệnh nhàn tự nguyện tham gia vào nghiên cứu.

•

Tiêu chuản loại trừ mẫu:
•Bệnh nhản bị ung thư gan thứ phát hay các bệnh ung thư khác....

•

B<-nh nhãn không đồng ý tham gia nghiên cứu.

2.3.

PhiTOTig pháp nghiên cứu

-

Nghiên cứu sử dụng phương pháp mô ta cát ngang.

-

Phương pháp lụa chọn mầu: chọn mầu thuận tiện.

2.4.

Quy trinh nghiên cứu

-

Bước 1: Thu thập mầu mỏ cúâ nhóm thâm gia nghiên cửu.

-

Bước 2: Tách DNA từ mầu mò bệnh phàm.

-

Bước 3: Thực hiện kỳ thuụt PCR khuếch dại đoạn gen vũng promoter gen
TERT.

-

Bước 4: Giai trinh tự vùng promoter gen TERT.

-

BƯỚC 5: Đọc và phàn tích kct qua đê phát hiện dột biến.

2.5.

Dụng cụ trang thiết bị hóa chất

2.5.

L Dụng cụ trang tlỉiểt bị


■ Tú lạnh thường SANYO. tủ âm sâu ARCTIKO. lú hút khí độc.

-

Pipet định mức lOOOpl. 2OOpl. lOOpl. 2()pl. lOpl. 2,5pl và dầu côn các loại.

-

Ong Eppcndorf loại l,5ml và 0.2ml.

-

Mây ly tâm đe bân (Eppendorf Centrifuge 5424R, USA).

-

Máy PCR. Máy vortex, mây Spindown. máy lắc nhiệt (Eppendorf. USA).

-

Gàng lay, giẩy thấm vỏ trùng, cốc dong, bính thúy tinh.

-

Cân diện lư AB204 (Meiller Toledo), khay dỗ gel. lị vi sóng.

-

Máy do OD Nano Drop 2000c (Thermo. USA).

-

Máy diện di EC 300XL Power Supply (Thermo. USA).

-

Mảy soi gcl vả chụp anh lự động Gel Doc™ XR- (Bio-Rad. USA).

-

Hệ thong phân lích trinh lự gen ABI 3500 Genetic Analyzer.

-

Phần mem phân lích trinh tự CLC Main Workbench 6.0.1

2.52. Hóa chất
•> Hỏa chất tách chiết DNA
• Hóa chẩt theo kit cua hãng QỈAGEN bao gồm: dung dịch ATL. dung
dịch AL. dung dịch AW1. dung dịch AW2. dung dịch ATE.
-

Xy len. cồn 100°. protease K.

❖HớứdỉắrPCK

-

Nước PCR (nước cất khư ton. không chứa DNAse. RNAsc....).

-

2X GoTaq Hot Start Green Master Mix (Promega). DMSO (dimetyl sulfoxide).

-

Cặp mồi có trinh tự như sau:
TERT- E: 5 ’-AGTGGATTCGCGGGC AC AG A- 3 ’.
TERT-R: 5'-ACGCCATGTTAACTATTACT-3'.
Hóa chắt diện dì

■ Dung dịch dộm TAE 50X. Khi sir dụng pha ihãnh IX.


21

-

BỘI agarose, 6X Loading Dye. HyperLadder™ I OObp. Ethidium bromide.
Hóa chất giãi trinh tự gen
• BigDye™ Terminator v3.1 5X Sequencing Buffer.

-

BigDye™ Terminator V3.1 Ready Reaction Mix.

-

Mồi TERT-F. cồn 70°. 100°, EDTA 125mM. Hi-di Foimamide, nước cất

2.6.

Quy trinh kỹ thuật

2.6.1.

Tĩtu thập và bão quán mâu bệnhpliũm

Lấy 2-3 manh cất mô ung thư biểu nk> tế bào gan đà đúc paratill cho vào ống
Eppendorf loại l.5ml. Mỏi mầu bệnh phẩm cùa một bệnh nhãn nên lấy vảo 2 ống tránh
trường hợp tách hóng, l ien hành bao quán các mini ở nhiệt độ phịng.
2.62.

Kỳ th uột tách DNA từ mầu mơ bệnh phtim

a. Nguyên lý
Đối với mồi loại mô. te bào quy trình tách chiết sè khác nhau. Đối với mầu mơ
đúc trong paraffin, nguycn lý tách chiết DMA gồm các bước cơ ban sau: loại bô
paraffin, pliã mãqg te bảo và màng nhàn, loại bó protein và tạp chất, tua và thu hồi acid
nucleic.
b. Quy trinh thực hiện
-

Bướci: Cho 1000 ui Xỵlen vào ổng Eppendorf chửa lát cắt màu mõ dúc paraỉìn.
vortex trong 10 giây, u 15 phút nhầm loại bo tồn bộ paraful.

-

BƯỚC 2: Ly tàm 15000 x ơng/ phút, trong 5 phút ớ nhiệt độ phòng. Loại bo phần
chất lóng phía trên, giừ lại kết túa.

-

Bước 3: Thèm 1000 pl cồn 100°. vorte.x trong 10 giãy.

-

Bước 4: Ly tàm 15000 vòng/ phút, trong 5 phút ờ nhiệt độ phòng. Loại bo phần
chất long phía trèạ giữ lụi kết tua.

-

Bước 5: Mớ nấp ống và ú ờ 56°c đến khi cồn bay hơi hết.

-

Bưóc 6: Thân ISO pl dung dịch ATL và 10 pl Proteinase K. vortex 10 giãy.

-

Bước 7: Ũ và úc ờ 56 °C qua đêm cho tới khi kết tua tan hỗn tồn.

-

Bước 8: Ù ớ 90°C trong 1 giờ. Sau u. spindown trong 5 giây.

-

Bước 9: Thêm 200 pl dung dịch AL. vortex trong 10 giây. Sau dó cho thêm 200

-ÍM CỊỈ ugc V
Hl

22

pl cồn 100°. vortex trong 10 giãy.
-

Bước 10: spindown trong 5 giây. Sau đó chun tồn bộ dịch trong ống vào cột
QIAamp MinEIute (nảm trên 1 ổng thu 2 ml) vã ly tâm 8000 vòng/ phủi trong 2
phút, chuyên cột sang một ống sạch 2 ml khác.

-

Bước 11: thèm 500 pl dung dịch AW1 vảo cột QIAamp MinElute . lỵ tâm 8000
vòng/phút trong 2 phút, chuyên cột sang một ống sạch 2 nil khác.

-

Bước 12: thêm 500 pl dung dịch AW2 vào cột QIAamp MinElute. ly tàm sooo
vòng/phút trong 2 phút, chuyên cột sang một ống sạch 2 nil khác.

-

Buck 13: Ly tàm 15000 vora*.' phút trong 3 phút đế lảm khơ hồn tốn màng.

-

Bước 14: Chuyền cột QIAamp MinElute sang ống sạch 1.5 ml và thèm vào
50.nl dung dịch ATE. ú ờ nhiệt độ phòng trong 3-5 phút.

-

Bước 15: Ly tàm 15000 vòng7 phút trong 1 phút ư nhiệt dộ phơng, bo cột
QIAamp MinElute. thu dung dịch DNA hịa tan trong óng l .5 ml bên dưởị.

-

Bước 16: Sau khi thu dược mầu DNA. tiến hãnh bão quán ở 4< trong thời gian
ngắn hoặc lưu giừ ờ -3O5C trong thời gian dái.

2.63.

Phương pháp do lỊUung

a. Nguyên lý
Nguyên lý cùa phương pháp nãy là dựa vào sự hẩp thụ mạnh ảnh sảng cua một
chất ớ một bước sóng xác dịnh. Nucleic acid hấp thụ mạnh ánh sáng tư ngoại ỡ buck
sõng 260 nm do sự có mặt cua base purine vã pyrimidine. Giã trị mật độ quang ở bước
sóng 260nm (OD^Tua) cua cãc mẫu cho phép xác dịnli nồng độ nucleic acid trong mầu.
Đe kiếm tra độ sạch cua dung dịch, máy sẽ tiến hành do thèm giá ưị OD ớ 280 nm
(ODjshun). Ớ bước sóng này. các protein và cacbonhydrat có mức hấp thụ cao nhất. Từ
dó dựa vào tỳ lộ AiỂộ/A^so đế kiêm tra chất lượng và mức độ tinh sạch cua DNA tách
chiết.
b. Kỷ thuật đo
-

Do dổi chứng: Nho 3pl dung dịch ATE vào nơi hút mầu cùa máy. đo ỡ bước
sóng 260nm. 280nm.

-

Do mẫu: Dùng giấy thấm lan lượng ATE thừa. Sau đó. nho 3ul mầu DNA đã
chuẩn bị ở trên vào noi hút mầu cua mậy. đo ờ bước sõng 260nm. 280nm.

-ÍM CỊỈ
CỊỈ ugc
ugc V
V Hl
-■c -ÍM
Hl


23

-

Đọc kết qua trên máy đo quang phố.

2.6.4. Phương pháp diện di
a. Nguyên lý
Trong dung dịch, phàn tư DNA tích diện âm. Khi có mật cùa dịng điện, phân tư
ADN sè di chuyền về phía cực dương. Các đoạn DNA kích thước kliác nhau sê chạy
với toe độ khác nhau: đoạn ngan chạy nhanh, đoạn dài chạy chậm. Dựa vào kết qua các
bâng diện di thu dược dê kiểm tra chẳt lượng DNA.
b. Quy trình thực hiện
••♦ Ch uẩn bị gel agarose
-

Gel agarose 0.8%: cản 0.16 g agarose hòa trong 20 ml dung dịch ATE 1X.

-

Gel agarose 1.5%: cản 0.375 g agarose hòa trong 25 ml dung dịch ATE IX.

-

Dun sơi hỏn hợp gel bang lị vi sóng trong khoảng 1-1.5 phút den klũ dung dịch
sơi hỗn tồn vã bột agarose tan het thành dung dịch dồng nhất.

-

Dó gcl vào khay điện di đã cỏ sằn lược để tụo giếng.

-

Dê khoang 40 phút dê gcl dơng dục hồn toảxi.

•••Tra mẫu diện di
-

Đặt ban gcl vào bê điện di. sao cho bán gcl ngập hoàn toàn trong dung dịch đệm
TAb IX.

-

Diện di DNA tông số: trộn dều 5111 mầu DNA với lul Loading Dye 6X rồi tra
vảo các giếng trên ban gcl.

-

Diện di sán phẩm PCR: tra 3pl sán phẩm PCR lần lượt vào các giếng trên ban
gcl và tra 3pl Marker DNA lOObp vào giềng dầu tiên.

••• Chạy điện di
ban gel
-Chạy
diện
0.8%
điđiện
mầu di
ưong
DNA
60tống
phútsố.
với hiệu điện the 120V với
-Chạy diện di mẫu trong 40 phút với hiệu diện thế 110V với ban gel diện di san
phàm PCR.
•ĩ*Nhuộm ban gel
-Ngâm ban gcl dà điện di vảo dung dịch nhuộm Ethidium bromide (10mg/ml)
trong 30 giây - I phút. Sau dó lấy bán gcl ra khoi dung dịch nhuộm và lha ban gel vào
dung dịch dộm TAE IX đe loại bo phần Ethidium bromide dư.

-ÍM CỊỈ ugc V
Hl


24

•••Chụp bán gd
-Ban gel sau klũ nhuộm dược soi bang tia tư ngoại. Quan sát các vạch sáng xuất

hiện trên hình anh chụp ban gcl và lưu trừ hỉnh ánh ket qua.
2.Ố.5. AỴ th uột PCR
2.6.5.1.

Thành phần phan ùng PCR

Các thành phần cua phan ứng PC R như bàng 2.1
Bâng 2.1. Thành phần phán ừng PCR
STT

Thành phần
Nước PCR (nước cất khứ ion)

1
2
3

2X GoTaq Hot Start Green Master Mix
Mồi TERT-F (5pmol/pl)

4

Mồi TERT-R (5pmol/pl)

5
6

2.6.5.2.

The tích (pl)

DMSO
DNA (50ng/jil)
Tồng the tích

1,8
5,0
0,35
0.35
0,5
2,0
10,0

Chu trình nhiệt cho phan ứng PCR

Phan ứng PCR dược thực hiện theo chu trinh nhiệt sau: 93°c 3 phút. 40 chu kỳ
(93°C/30 giây - 59°C/30 giày - 72°C/30 giây), 72°C/5 phút, san phâm PCR dược báo
quan ớ 15°C.
2.6.6.

Kỹ thuật Sequencing

2.6.6. ỉ.Thánh phần phan ủng PCR Sequencing
Cãc thảnh phần phan img trong 01 ống PCR Sequencing như bâng 2.2
Bang 22. Thành phần phan ứng PCR Sequencing
STT
1

Thành phẩn
Nước cất khư ion

The tích (pl)
5.6

2

BigDyeTM Terminator V3.1 5X Sequencing Buffer

2

3

BigDyeTM Terminator v3.1 Ready Reaction

1

4

Mồi TERT-F (5pmol/pl)

0.4

-ÍM CỊỈ
CỊỈ ugc
ugc V
V Hl
-■c -ÍM
Hl

25

San phàm PCR
Tống thê tích

6

1
10

2.6.6.2.Chu trình nhiệt phán ủng PCR Sequencing
Phan ứng PCR Sequencing được thực hiện theo chu trình sau: 96°c/l phút. 25 chu
kỳ (96°C/10 giây - 5O°C/5 giày - 60°C'4 phút), san phẩm PCR sequencing dược bao
quan Ờ4°c.
2.6.6.3.

Tinh sụch san phàm Sequencing

-

Thêm 60pL cồn 100% + 5pL EDTA 125mM vào mầu cần tinh sạch.

-

Lắc mạnh, đè trong phdng tối 15 phút, nhiệt độ phông.

-

Lấy ra ly tâm 15.000 vịngr'phút trong 15 phút. Sau đó loại bo dịch nịi.

-

Them 200ụL cồn 70%. ly tảm 15.000 võng/phũt trong 10 phút.
• Loại bó dịch nơi. dê khơ. Sau dó. thêm 20pL 111-di formamide, u ờ 95°C/5

phút.
-

Ù trong đá (0*0/5 phút.

2.6.6.4.
-

Giai trình tự trển máy tự động và phàn tích kết qua

Sán phầm giai ninh tự sau khi được tinh sạch được tiến hành giai trinh tự trẽn hệ
thống máy phản tích trinh tự gen ABI3500 Genetic Analyzer.

-

Sư dụng phần mềm CLC Main Workbench 6.0.1 dè nhận dược vã so sảnh với
gen TERT chuẩn (NG 009265) trên Genbank 6.0.1.

CHƯƠNG 3
KÉT QUẢ NGHIÊN cứu
3.1.

Đặc điềm chung của dối tưựng nghiên cứu
Bàng 3. ỉ. Dặc diêm chung của các dồi tirọìtg nghiên cứu
Số lượng

Giới

Ti lệ (%)

Nam

29

96.67

Nừ

01

3,33

-ÍM CỊỈ ugc V
Hl