Nghiên cứu gen Pres, gen X của virut viêm gan B trong mô, huyết thanh và một số dấu ấn huyết thanh ở bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan

Bộ giáo dục v đo tạo bộ y tế

trờng đại học Y h nội





nguyễn thị vân anh



Nghiên cứu gen PreS, gen X
của virut viêm gan B trong mô, huyết thanh
v một số dấu ấn huyết thanh ở bệnh nhân
ung th biểu mô tế bo gan



Chuyên ngành: Miễn dịch học
Mã số: 62.72.04.20

tóm tắt luận án tiến sỹ y học

H Nội - Năm 2009


Công trình đợc hoàn thành tại: trờng đại học y hà nội


Ngời hớng dẫn khoa học: GS.TS Văn Đình Hoa
PGS.TS Nguyễn Thị Vinh Hà


Phản biện 1: GS.TSKH Trung Phn
Vin Huyt hc Truyn mỏu Trung ng

Phản biện 2: GS. TS Nguyn Bỏ c
Bnh vin K

Phản biện 3: PGS.TS Phan Th Thu Anh
Trng i hc Y H Ni

Luận án đợc bảo vệ trớc Hội đồng chấm luận án cấp Nhà nớc
Họp tại: Hi trng 1 tng 3 tũa nh A1- Trng i hc Y H Ni
Vào hồi 14 giờ 00 ngày 14 tháng 09 năm 2009


Có thể tìm hiểu luận án tại các th viện:
- Th viện Quốc gia
- Th viện trờng Đại học Y Hà Nội
- Th viện thông tin Y học Trung ơng.

Các công trình đ công bố có liên quan đến luận án


1. Nguyễn Thị Vân Anh và cs (2006), Bớc đầu nghiên cứu một số
đặc điểm của HBV- DNA trong mô ung th gan bằng PCR, Y hc Vit
Nam, (322), tr. 25-30.
2. Nguyễn Thị Vân Anh và cs (2007), Hoàn chỉnh kỹ thuật tách ADN
từ mô ung th gan và phản ứng PCR xác định HBV, Y hc thc hnh s
3, tr. 20-22.
3. Nguyễn Thị Vân Anh và cs (2007), Nhn xột mt s du n ca
virut viờm gan B trong huyt thanh bnh nhõn ung th gan,Y hc Vit
Nam,(332), tr. 47-52.
4. Nguyễn Thị Vân Anh và cs (2008). Nghiên cứu tính đa hình thái
vùng gen X của HBV trên bệnh nhân ung th biểu mô tế bào gan bằng kỹ
thuật cloning, Tạp chí Y học Việt Nam, (350), tr. 14-21.
5. Nguyễn Thị Vân Anh và cs (2008), Trình tự gen của HBV thuộc 2
kiểu gen B và C trên 2 bệnh nhân ở Việt Nam, Tạp chí Y học Việt Nam,
(351), tr.16-23.

1

Đặt vấn đề

Nhiễm virut viêm gan B (HBV) gặp ở hầu hết các nớc trên thế giới và
là mối quan tâm chung của cả cộng đồng vì những ảnh hởng về sức khoẻ,
kinh tế, xã hội do các biến chứng của nó gây ra. ở các nớc vùng Châu á,
thời gian nhiễm tiềm tàng có thể diễn biến trong 20- 30 năm vì lây nhiễm
HBV do truyền từ mẹ sang con và hoạt động tình dục là đờng lây chủ yếu.
Trong suốt quá trình mang virut kéo dài, biến chứng thành viêm gan mạn
tính, xơ gan, ung th gan chiếm từ 15%- 40% số ngời nhiễm HBV mạn
tính.
Trên 70% trờng hợp ung th biểu mô tế bào gan (HCC) có liên quan
tới nhiễm HBV.
ở Việt Nam, có 8,4 triệu ngời mang HBV mạn tính vào năm 2005,
tuy nhiên con số này có thể duy trì hoặc giảm bớt còn khoảng 8 triệu vào
năm 2025 do thực hiện tốt chơng trình tiêm chủng. Ung th gan sau quá
trình nhiễm HBV là một biến chứng cuối cùng và cũng thờng gặp ở Việt
Nam, dự báo năm 2025 sẽ có khoảng 25.000 trờng hợp mắc HCC.
Cơ chế ung th gan do HBV đã đợc nhiều tác giả trên thế giới chứng
minh bằng các nghiên cứu từ thực nghiệm trong phòng thí nghiệm và trên
động vật. Hai vùng gen quan trọng của HBV đợc thấy có liên quan nhiều
tới cơ chế gây HCC là vùng gen PreS và vùng gen X của HBV. Gen X là
V.oncogen của HBV có thể làm đột biến nhiễm sắc thể của tế bào chủ và

sản phẩm protein đợc mã hoá từ vùng gen này gây rối loạn phân bào, ức
chế apoptosis, ức chế sửa chữa ADN. Gen PreS2 mã hoá cho MHBs có
liên quan tới cơ chế tăng phân bào do kích thích liên tục tín hiệu c-raf-
1/Erk2. Đột biến ở hai vùng gen này, thờng thấy các đột biến mất đoạn
làm tăng nguy cơ HCC đã đợc chứng minh.
Một số nghiên cứu trờn th
gii cho thấy HBV có tính biến đổi cao,
thậm chí có sự khác nhau giữa mô và huyết thanh. Nghiên cứu đặc điểm
của vùng gen X, gen PreS mụ v huyt thanh nhm tỡm hiu s thay i
ca HBV bnh nhõn nhiễm HBV mạn tính, bnh nhõn ung th biu mụ
t bo gan Vit Nam cho tới nay cha c tỏc gi no cp n. Vì
vậy nghiên cứu đợc tiến hành nhằm mục tiêu:

1. Nghiên cứu tỷ lệ ADN- HBV(+), trình tự nucleotid vùng gen PreS, X trong
huyết thanh và mô ung th ở bệnh nhân ung th biểu mô tế bào gan.
2. Phát hiện một số đột biến vùng gen PreS, X ở bệnh nhân ung th biểu
mô tế bào gan.
3. Xác định tỷ lệ phân bố giữa kiểu gen của HBV với một số dấu ấn huyết
thanh bệnh nhân ung th biểu mô tế bào gan.

2

ý nghĩa khoa học v thực tiễn của luận án

1. ý nghĩa thực tiễn:
1.1. ứng dụng đợc một số kỹ thuật về sinh học phân tử: tách chiết ADN từ
mô, huyết thanh, kỹ thuật Nested- PCR, cloning, giải trình tự gen để
phục vụ cho các nghiên cứu về sinh học phân tử.
1.2. Nghiên cứu và đánh giá đợc khá đầy đủ về đặc điểm hai vùng gen X,
gen preS của HBV, làm cơ sở dữ liệu cho các nghiên cứu về HBV tại

Việt Nam.
1.3. Kết quả nghiên cứu cho thấy khả năng đột biến của HBV là rất cao, có
sự khác nhau về cấu trúc gen giữa mô và huyết thanh. Vì vậy, điều trị
các thuốc kháng virut viêm gan B sẽ gặp nhiều khó khăn.
1.4. Phát hiện nhiều dạng đột biến của vùng gen X trên bệnh nhân ung th
gan, các dạng đột biến này đã đợc chứng minh là có khả năng gây ung
th gan trên thực nghiệm. Đây có thể là cơ chế làm tăng nguy cơ ung
th gan do nhiễm HBV ở Việt Nam.
2. ý nghĩa khoa học và đóng góp mới của luận án
2.1. Phát hiện đợc sự khác nhau về trình tự nucleotid gen PreS, gen X của
HBV ở mô và huyết thanh.
2.2. Gen X của HBV tồn tại dới nhiều hình thái đột biến khác nhau: mất
đoạn, thêm đoạn, chuyển đoạn, tích hợp vào NST 14. Đột biến
A1762T/ G1764A gặp nhiều hơn ở nhóm HCC so với nhóm ngời
lành mang virut. Vì vậy, có thể đây là 2 yếu tố quan trọng giúp tiên
lợng ở những bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính.
2.3. Tỷ lệ phân bố kiểu gen B,C giữa hai nhóm bệnh nhân ung th gan và
ngời lành mang virut tơng đơng nhau
2.4. Kiểu gen C trong nhóm HCC chậm chuyển đảo huyết thanh hơn kiểu
gen B.
2.5. Với các cặp mồi đ
ợc sử dụng trong nghiên cứu, kỹ thuật Nested-PCR
cho phép đánh giá mức độ phân ly gen X, gián tiếp đánh giá khả năng
đột biến là mất đoạn hoặc thêm đoạn.

Bố cục luận án
Đặt vấn đề, Tổng quan 32 trang
Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu 21 trang
Kết quả 37 trang
Bàn luận, kết luận 26 trang

3

Chơng 1 :

Tổng quan ti liệu

1.1.Tình hình nhiễm HBV và các biến chứng thờng gặp:
Nhiễm HBV có thể gặp ở hầu hết các quốc gia trên thế giới, tỷ lệ nhiễm
tùy thuộc vào chủng tộc và vùng địa lý. Trên thế giới có khoảng 2 triệu
ngời bị phơi nhiễm với HBV, khoảng 400 triệu ngời mang HBV mạn tính
và 50 triệu trờng hợp đợc chẩn đoán mới mỗi năm. Nhiễm HBV hiện nay
vẫn là nguyên nhân chính gây nên các biến chứng xơ gan và ung th gan
của một số nớc nằm trong vùng dịch tễ lu hành HBV cao, đặc biệt là ở
các nớc vùng Châu á. Nguy cơ hàng năm của HCC là 0,4%-0,6% trên
bệnh nhân nhiễm HBV không có xơ gan, 2% trên bệnh nhân nhiễm HBV
có xơ gan.
Việt Nam nằm trong vùng dịch tễ lu hành HBV cao trên thế giới, tỷ lệ
nhiễm HBV trong cộng đồng cao, chiếm từ 15-20%. Trên 70% ngời mắc
ung th gan có HBsAg(+). Biến chứng viêm gan cấp, viêm gan mạn, xơ gan,
ung th gan đều có thể gặp trên các đối tợng nhiễm HBV ở Việt Nam.

1.2. Cấu trúc HBV và chức năng các kháng nguyên:
HBV thuộc nhóm Hepadnavirus cấu trúc lõi là ADN, có ái tính đặc biệt
với tế bào gan. Các kháng nguyên: HBsAg, HBeAg, HBcAg, Polymerase,
HBxAg đợc mã hoá từ 4 khung đọc mở quan trọng trong cấu trúc gen của
HBV là: PreS1/PreS2/S; PreC/C; Polymerase và gen X. Ngoài ra, còn có 2
vùng gen tăng cờng có thể đóng vai trò quan trọng trong sao chép virut:
vùng EnhI, EnhII và các vùng gen khởi động promoter kích thích mã hoá

các tiền gen.
Đặc điểm của các khung đọc mở là các đoạn gen đợc gối chồng lên
nhau trong quá trình phiên mã. Khung đọc mở mã hoá cho protein HBsAg
nằm trọn trong vùng gen polymerase, khung đọc mở vùng gen PreC/C nằm
ở một phần gen polymerase và một phần gen X, khung đọc mở vùng gen
X nằm gối trên vùng polymerase và PreC. Nh vậy, số gen cấu trúc của
HBV có kích thớc dài hơn so với cấu trúc bộ gen của HBV
Tơng ứng với các kháng nguyên cấu trúc là các kháng thể: antiHBs,
antiHBe, antiHBc, antiHBx hình thành do đáp ứng miễn dịch của cơ thể
nhiễm HBV.
HBsAg là một kháng nguyên vỏ ngoài của virut, cấu trúc từ các thành
phần SHBs, MHBs, LHBs. Do vậy, đây có thể là thành phần có liên quan
tới sự xâm nhập của virut vào tế bào gan.

4
HBcAg tạo nên vỏ capsid, giúp cho phần lõi của virut xâm nhập vào
trong nhân tế bào, tạo điều kiện cho virut tồn tại và phát triển. HBcAg là
protein có tính kháng nguyên mạnh, do đó kháng thể anti HBc thờng xuất
hiện trong huyết thanh với nồng độ cao và kéo dài sau nhiều năm bị phơi
nhiễm.
HBeAg có liên quan tới sự lẩn tránh đáp ứng miễn dịch của virut.
Những trẻ có mẹ mang HBeAg thì nhiều khả năng trở thành ngời mang
mạn tính. 89% những trờng hợp HBeAg dơng tính(+) có mức độ sao
chép virut cao.
HBx: là một protein có kích thớc nhỏ nhất, cấu trúc gồm 154 acid
amin, có vai trò quan trọng trong sao chép của virut, tích hợp gen của virut
vào gen của tế bào chủ, gây rối loạn chức năng tế bào làm tăng nguy cơ
ung th gan khi nhiễm HBV.
Hiện nay, dựa trên sự khác nhau về trình tự nucleotid của HBV, có ít nhất 8
kiểu gen đợc xác định trên thế giới, ký hiệu từ A-H, phân bố khác nhau theo

khu vực địa lý, có thể khác nhau về kích thớc, vị trí các khung đọc mở. Các
kiểu gen khác nhau có ý nghĩa khác nhau trong tiên lợng bệnh trên lâm sàng.

1.3.Diễn biễn một số dấu ấn trong huyết thanh khi nhiễm HBV:
1.3.1.Diễn biến các dấu ấn trong viêm gan B cấp:
Giai đoạn đầu trong huyết thanh xuất hiện đồng thời cả 3 dấu ấn của
HBV: HBsAg(+), HBeAg(+) và ADN-HBV. Nếu bệnh nhân hồi phục thì
các kháng nguyên sẽ mất trong vòng 6 tháng, sau đó là các kháng thể xuất
hiện. Đặc biệt IgM HBc xuất hiện sớm và giảm đi sau giai đoạn viêm cấp
vì vậy việc chẩn đoán xác định nhiễm viêm gan B cấp thờng dựa trên sự
có mặt của kháng thể này. Kháng thể (IgG HBc và IgG HBs) xuất hiện
muộn hơn nhng còn tồn tại kéo dài sau nhiều năm và các kháng thể này
đợc sử dụng để xác định quá trình phơi nhiễm của viêm gan B.
1.3.2.Diễn biến các dấu ấn huyết thanh trong viêm gan B mạn tính
Nhiễm HBV mạn tính, gặp chủ yếu do truyền dọc từ mẹ sang con ở
thời kỳ bào thai hoặc ở giai đoạn nhiễm chu sinh. Các triệu chứng lâm
sàng hầu nh không có gì thay đổi, trẻ hoàn toàn bình thờng cho tới tuổi
trởng thành nếu nh không đợc xét nghiệm máu sẽ không biết đã bị
nhiễm HBV. Nồng độ HBsAg, ADN-HBV thờng khá cao và tồn tại trong
nhiều năm, tỷ lệ trẻ mất HBsAg là rất hiếm. 15-40% sô ngời mang
HBsAg mạn tính có biến chứng viêm gan mạn, xơ gan ,ung th
gan.

1.4.Cơ chế tổn thơng mô bệnh học ở gan khi nhiễm HBV
Cơ thể nhiễm HBV sẽ loại thải virut bằng cả hệ thống đáp ứng miễn
dịch tự nhiên và đáp ứng miễn dịch đặc hiệu. Hoạt động của các yếu tố

5
miễn dịch, các tế bào miễn dịch, các cytokin sẽ kích thích quá trình viêm
trong gan làm cho nguy cơ huỷ hoại tế bào gan tăng lên. Tuỳ thuộc mức

độ hoạt động viêm mà ảnh hởng tới chức năng gan và cấu trúc mô học
của gan. Viêm mạn tính làm tăng nguy cơ ung th gan.

1.5.Cơ chế ung th gan liên quan tới nhiễm HBV
- Các yếu tố thuận lợi làm phát triển HCC trên bệnh nhân nhiễm HBV
mạn tính:
- Dịch tễ: ở các nớc có tỷ lệ lu hành HBV cao thì tần xuất mắc HCC cao.
- Giới: Nam giới mắc HCC luôn chiếm tỷ lệ cao hơn nữ trên 3 lần
- Gia đình: Gia đình có trên 2 ngời mắc HCC thì nguy cơ HCC tăng 5,55 lần.
- Tuổi: Nguy cơ HCC cũng tăng dần theo tuổi, tuổi càng cao thì nguy cơ mắc
càng cao.
- Mức độ sao chép của virut: Nguy cơ HCC ở ngời có nồng độ ADN-
HBV >10
5
copies/ml cao gấp 10,2 lần so với ngời có nồng độ ADN-
HBV thấp.
- Vai trò của các dấu ấn huyết thanh: HBeAg là dấu ấn tiên lợng, có tới
89% bệnh nhân HBeAg (+) dơng tính có nồng độ ADN- HBV tồn tại cao
> 10
5
copies/ ml.
- Kiểu gen: kiểu gen B, C thờng gặp ở Châu á, có nguy cơ HCC cao hơn
các kiểu gen khác.
- Tổn thơng tế bào mạn tính, xơ gan làm tăng nguy cơ HCC.
Ngoài ra các yếu tố: nghiện rợu, aflatoxin, thuốc lá, đồng nhiễm các loại
virut viêm gan khác cũng làm tăng nguy cơ HCC.
- Bằng chứng phân tử gây ung th gan do HBV:
Vai trò của gen X và protein gen X (HBx) trong cơ chế HCC
Gen X là một gen đa chức năng, có vai trò quan trọng trong sao chép
virut, tích hợp gen của virut vào gen của tế bào chủ. Có nhiều loại đột biến

có thể gặp ở vùng gen X trên bệnh nhân HCC nh cắt đoạn, đảo đoạn,
chuyển đoạn, thêm đoạn. Đột biến điểm ở vị trí A1762T/G1764A của
vùng gen X đợc thấy xuất hiện trớc khi phát triển HCC.
Tích hợp gen của HBV vào ADN của tế bào chủ làm hoạt động gen
của tế bào chủ bị rối loạn, đặc biệt ở những gen quan trọng cho tăng
trởng và biệt hoá tế bào gan, hoặc tăng cờng biểu lộ các protein tham
gia vào quá trình phân bào và ức chế apoptosis. Mặt khác, tích hợp gen
cũng làm tăng cờng biểu lộ gen và đột biến gen của HBV, đặc biệt
thờng thấy ở vùng PreS, X của HBV hơn các vùng gen khác ở các bệnh
nhân HCC. Các protein thay đổi chức năng đợc sản xuất từ các vùng gen
bị đột biến cũng làm tăng nguy cơ HCC.

6

HBx là một protein điều hòa đa chức năng,
tác động trực tiếp hoặc gián
tiếp vào nhiều chức năng của tế bào vật chủ nh: điều khiển các tín hiệu
chuyển dạng làm tăng sinh tế bào, kích thích khởi động mạng lới cytokin
gây viêm cấp và mạn tính, làm thay đổi chức năng bảo vệ tự nhiên của các tế
bào, có thể tham gia tác động vào hầu hết các cơ chế hình thành HCC:

Vai trò đột biến cắt đoạn gen Pre S2/S của HBV trong ung th gan:
Trên thực nghiệm, vùng PreS2 kết hợp với vùng gen S mã hoá cho
MHBs của HBV, nếu thay đổi sẽ hoạt hoá liên tục tín hiệu phân bào c-raf-
1/Erk2 dẫn đến tăng sinh tế bào gan. Protein đợc sản xuất từ vùng PreS/S
nếu bị đột biến cắt đoạn vùng kết thúc COO có thể kích thích bộc lộ gen
tiền gen sinh u là c-fos từ 5 tới 10 lần. Đột biến cắt đoạn gen PreS cũng đã
đợc tìm thấy trên bệnh nhân HCC ở Việt Nam.
Ung th gan trên bệnh nhân không có HBsAg:
Nhờ sự phát triển của các kỹ thuật sinh học phân tử trong những năm
gần đây đã phát hiện đợc một số trờng hợp viêm gan mạn, ung th gan
nhng HBsAg trong huyết thanh âm tính. Nhiều ý kiến cho rằng các
trờng hợp này thuộc nhóm nhiễm HBV tiềm tàng. Tỷ lệ bệnh nhân HCC
thuộc nhóm nhiễm HBV tiềm tàng cũng gặp ở trên lâm sàng. Có nhiều giả
thiết về cơ chế giải thích cho sự vắng mặt của HBsAg trong huyết thanh
những bệnh nhân này là: sụt giảm sao chép HBV, đột biến gen của
HBsAg, do tác động yếu tố ngoại môi. Trong một số bệnh nhân HCC mà
HBsAg âm tính, ngời ta cũng phát hiện thấy có mặt HBx trong mô ung
th gan nghĩa là vẫn có vai trò của HBV trong cơ chế ung th gan ở những
bệnh nhân này và HBV vẫn tích hợp, duy trì gen trong nhiễm sắc thể của
tế bào chủ mặc dù không sản xuất các protein cấu trúc.

Đích
HBx tác
động
Hoạt hoá
phiên mã


Điều hoà

con
đờng tín
hiệu
Điều hoà
chu kỳ tế
bào
Điều hoà
apoptosis
Điều hoà
tạo mạch
máu
ức chế
sửa chữa
lỗi ADN

Điều hoà
chức
năng
telomere
Cân bằng
liên kết t
ế

bào

7
Chơng 2

Đối tợng v phơng pháp nghiên cứu

2.1. Đối tợng:
2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân:
Nhóm nghiên cứu: ung th biểu mô tế bào gan có nhiễm HBV
- Các bệnh nhân đợc xét nghiệm có HBsAg(+).
- Các bệnh nhân đợc chọc hút tế bào gan hoặc sinh thiết mô có kết quả
chẩn đoán giải phẫu bệnh là ung th biểu mô tế bào gan.
- Các bệnh nhân đều đợc lấy huyết thanh và mẫu mô theo cặp tại cùng
thời điểm.
Nhóm chứng: ngời lành mang virut viêm gan B
- HBsAg(+) phát hiện trong khi kiểm tra sức khoẻ.
- ALT, AST <50 U/L
- Siêu âm gan có hình ảnh nhu mô gan bình thờng.
- Thể trạng bình thờng, vẫn lao động bình thờng.
- Bệnh nhân đợc lấy máu, tách huyết thanh
2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ: antiHIV, antiHCV dơng tính và không đủ các
tiêu chuẩn trên.

2.2. Phơng pháp và kỹ thuật nghiên cứu
2.2.1.Thiết kế nghiên cứu:
Nhóm HCC Nhóm chứng


Mô Huyết thanh Huyết thanh
So sánh So sánh




Sơ đồ 2.1.Mô hình thiết kế nghiên cứu
2.2.2. Số mẫu nghiên cứu:

Nhóm ung th gan (n = 35) gồm:
- 13 mẫu mô gan lấy sau phẫu thuật cắt ung th gan tại Bệnh viện Việt Đức.
- 22 mẫu mô lấy từ chọc hút tế bào gan tại Bệnh viện TWQĐ -108.
Nested PCR vùng gen X, Pre
S
Trình tự Nu, acid amin, đột biến

8
Nhóm chứng (n=32) gồm:
- Các đối tợng HBsAg(+) đợc lấy từ Bệnh viện E và Bộ môn Miễn
dịch- Sinh lý bệnh, Đại học Y Hà Nội.
2.2.3. Địa điểm tiến hành nghiên cứu:
- Bộ môn Miễn dịch- Sinh lý bệnh Trờng Đại học Y Hà Nội
- Dep.Viral infection and International Health Trờng Đại học Y
Kanazawa Nhật Bản.
2.2.4. Các kỹ thuật nghiên cứu:
2.2.4.1.Kỹ thuật tách ADN:
Kỹ thuật tách ADN huyết thanh: Sinh phẩm của Qiagen
Kỹ thuật tách ADN mô gan: Bộ sinh phẩm của Promega Mỹ
2.2.4.2.Kỹ thuật ELISA: xét nghiệm xác định các dấu ấn của HBV trong
huyết thanh sử dụng sinh phẩm Phamatech
2.2.4.3.Kỹ thuật Nested-PCR: sinh phẩm Invitrogen- Nhật Bản
Mồi vùng gen PreS dựa trên thiết kế nghiên cứu của Stuyver L và mồi
vùng gen X dựa trên thiết kế nghiên cứu của Wang Y
2.2.4.4. Kỹ thuật giải trình tự trực tiếp: Big Dye Terminator sử dụng sinh
phẩm của hãng Applied Biosystems- Mỹ
2.2.4.5. Kỹ thuật cloning: sinh phẩm Invitrogen- Nhật
2.3.Các biến số nghiên cứu:
- Các chỉ số đánh giá chung: Tuổi, Giới
- Các chỉ số về dấu ấn của HBV mang ý nghĩa tiên lợng :HBeAg, anti HBe

- Các chỉ số đánh giá ý nghĩa tiên lợng: AFP, ALT, AST
- Các chỉ số đánh giá sự thay đổi của virut:
+ Tỷ lệ ADN-HBV vùng gen preS
+ Tỷ lệ ADN HBV vùng gen X
+ Kiểu gen của HBV trong huyết thanh
+ Trình tự gen của HBV trong mô gan và huyết thanh vùng gen PreS, X
+ Đột biến A1762T/G1764A
+ Đột biến G1896A
2.4. Phân tích kết quả:
Các kết quả phân tích gen bằng phần mềm Genetyx, sử lý thống kê bằng
chơng trình Epi info 6.04.
2.5. Hạn chế sai số : xét nghiệm đợc thực hiện tại labo chuẩn quốc tế.
2.6. Đạo đức trong nghiên cứu:
Các mẫu bệnh phẩm đều đợc lấy với sự chấp thuận của bệnh nhân,
lãnh đạo các Bệnh viện. Các kết quả đợc kiểm tra lặp lại ngẫu nhiên, tính
toán dựa trên chơng trình phân tích số liệu thông dụng nhất cho ngành Y tế
nên đảm bảo độ tin cậy của số liệu trong nghiên cứu.

9
Chơng 3:

Kết quả nghiên cứu

3.1.Phân bố tuổi, giới, các dấu ấn huyết thanh của nhóm bệnh nhân HCC:
- Tuổi trung bình : 50,02 9,97, số bệnh nhân HCC từ 41- 60 chiếm đa số
25/35 (.
- Tỷ lệ nam/nữ là 10/1.
Bảng 3.1: Kết quả dấu ấn anti HBs, HBeAg, antiHBe, antiHBc
Kết quả antiHBs HBeAg antiHBe antiHBc
(+) 0 2(5,7%) 23 (65,7%) 35(100%)

(-) 35 (100%) 33 (94,3%) 12 (34,3%) 0 (0%)
Tổng 35 (100%)
Nhận xét:
Tỷ lệ HBeAg(+) chiếm 5,7%, tỷ lệ xuất hiện antiHBe(+) là 65,7%. Số
bệnh nhân antiHBe (-) là 34,3%. 100% bệnh nhân HBsAg(+) có antiHBs(-).

Nhận xét:
Trong nhóm tuổi từ 40-60 có 2 bệnh nhân HCC HBeAg(+) và 11 bệnh
nhân cha xuất hiện antiHBe. Số bệnh nhân cha có antiHBe là những
bệnh nhân cha có chuyển đảo huyết thanh.



0
2
0
4
24
5
3

15
5
1

11
0
0

5

10
15
20
25
30
40
40-60 >60
Tuổi
HBeAg(+)
HBeAg(-)
antiHBe(+)
antiHBe(-)
Số BN
Biểu đồ 3.3: So sánh biểu hiện dấu ấn HBeAg, antiHBe của HBV ở nhóm tuổi

10
Bảng 3.2: Kết quả so sánh AFP, ALT, AST với antiHBe
AFP (ng/ml) ALT (U/L) AST(U/L)
antiHBe
<20 20 <50 50 <50 50
(+) 8
(22,9%)
15
(42,9%)
10
(28,6%)
13
(37,1%)
12
(34,3%)

11
(31,4%)
(-) 6
(17,1%)
6
(17,1%)
5
(14,3%)
7
(20,0%)
5
(14,3%)
7
(20,0%)
Tổng 14
(40,0%)
21
(60,0%)
15
(42,9%)
20
(57,1%)
17
(48,6%)
18
(51,4%)
Giá trị p p > 0,05 p > 0,05 p > 0,05
Nhận xét:
Không có sự khác biệt giữa AFP, AST, ALT với antiHBe (p > 0,05).
Đánh giá các chỉ tiêu nhóm HCC và nhóm chứng:

Các dấu ấn của HBV: HBeAg, antiHBe, antiHBc, antiHBs; nhóm tuổi
đợc lựa chọn tơng đơng giữa nhóm bệnh và nhóm chứng .

3.2. Kết quả nghiên cứu gen PreS, gen X của HBV ở mô và huyết thanh:
3.2.1.Kết quả Nested-PCR, PCR vùng gen PreS, X ở mô và HT:
3.2.1.1.Kết quả Nested PCR vùng gen PreS:






Hình 3.1: Sản phẩm PCR gen PreS điện di trên agarose 1,5%
Nhận xét:
Băng xuất hiện ở vị trí ~ 400bp đợc đánh giá là có ADN-HBV(+),
không có băng hoặc không đúng vị trí là ADN-HBV(-).
Bảng 3.5: Kết quả phát hiện gen vùng PreS ở mô và HT bệnh nhân HCC
Huyết thanh Mô
Kết quả
phản ứng
Số BN Tỷ lệ Số BN Tỷ lệ
ADN- HBV(+) 33 94,3% 20 57,1%
ADN- HBV(-) 2 5,7% 15 42,9%
Tổng số 35 100% 35 100%
Thang chuẩn(M)

800
700
600
500

400
300
200
100
400b
p

11
Nhận xét:
Có sự khác nhau về kết quả nested-PCR giữa mô và huyết thanh. Tỷ lệ
dơng tính gen vùng PreS của HBV trong huyết thanh bệnh nhân HCC
chiếm 94,3%, tại mô gan chiếm 57,1%.
3.2.1.2. Kết quả sản phẩm Nested-PCR vùng gen từ 1286 -1948:
M 9 11 18 19 20 21 22 50 52 53 5456 19M50M52M54M







Nhận xét:
Có nhiều băng sản phẩm ở cùng một mẫu bệnh phẩm. Sản phẩm có
vị trí, kích thớc là 663bp đợc xác định là ADN-HBV(+). Các vị trí băng
khác xuất hiện kèm theo đợc đánh giá là dơng tính và có đoạn ADN
phân ly.
Bảng 3.6: Kết quả Nested- PCR gen X ở mô và HT bệnh nhân HCC:
Huyết thanh Mô
Kết quả
phản ứng

Số BN Tỷ lệ Số BN Tỷ lệ
ADN-HBV (+) 8 22,9% 10 28,6%
ADN-HBV(+)phân ly 13 37,1% 3 8,6%
ADN- HBV(-) 14 40% 22 62,8%
Tổng số 35 100% 35 100%
Nhận xét:
Có sự khác nhau về kết quả nested- PCR giữa mô và huyết thanh. Số
bệnh nhân có ADN-HBV(-) ở mô gan cao hơn ở huyết thanh (62,8% và
40%). Tỷ lệ phân ly trong huyết thanh nhiều hơn ở mô.

3.2.2. Kết quả trình tự Nu của gen PreS, gen X ở mô và HT:
Kết quả so sánh trình tự gen PreS ở mô và HT bệnh nhân HCC:


Thang chuẩn(M)

1000
800
700
600
500
400
300
200
100
Hình 3.2: Sản phẩm Nested- PCR điện di trên agarose 1,5%
663b
p
Phân l
y

12

Bảng 3.7: Nhận xét số vị trí Nu và aa khác nhau giữa mô và huyết thanh
của 9 bệnh nhân HCC
Ký hiệu mẫu nghiên cứu
Số vị trí
thay đổi
5 69 80 86 87 97 64 88 91
Trình tự Nu 12 1 2 0 2 1 9 3 11
Trình tự aa 5 1 1 0 1 0 2 2 8
Nhận xét:
Các mẫu bệnh nhân đợc sắp xếp theo cặp huyết thanh và mô. So sánh
trình tự nu, trình tự acid amin vùng gen preS giữa mô gan và huyết thanh
nhóm HCC, cho thấy tỷ lệ khác nhau về Nu giữa hai kiểu gen là 41/312
(13,2%), số vị trí Nu thay đổi giữa mô và huyết thanh ở mẫu nhiều nhất là 12
vị trí và 8 vị trí thay đổi của acid amin.

Phát hiện các đột biến gen X của HBV ở mô và HT bằng kỹ thuật cloning:

Kết quả sàng lọc PCR sau cloning một số mẫu có phân ly xùng gen X:






Hình 3.3 và 3.4: Sản phẩm điện di trên thạch các clon mẫu số 18 ở HT và mô

Hình 3.5: Sản phẩm điện di các clon mẫu số 80HCC huyết thanh và mô

428b
p

663bp
663bp
600bp
438b
p

663b
p

663b
p
621b
p

13








Hình 3.6: Sản phẩm điện di các clon mẫu số 64 HCC huyết thanh và mô

Hình 3.7: Hình ảnh điện di các clon của mẫu 22HCC ở mô và huyết thanh
Nhận xét:
Các kết quả gen X trên hình ảnh điện di khi sàng lọc PCR bằng mồi
X1 và CR2 đợc tách dòng với các dạng khác nhau. Ký hiệu trên các sản
phẩm là kích thớc đợc xác định sau khi đã đợc giải trình tự.
Bảng 3.8: Một số đặc điểm của các clon khác nhau phát hiện ở vùng gen X
trong 8 cặp mẫu mô - huyết thanh bệnh nhân HCC:
Kích thớc gen Kiểu gen Đặc điểm giải trình tự gen
Số mẫu
Mô HT Mô HT Mô HT
10HCC 663, 663 C C X X
12HCC 663,592 663 C C X,X xoá đoạn X
18HCC 663,355 663,428 B, B X, X/gen ngời/PreC X,Xxoá đoạn
22HCC 685,768 663 B B X chèn đoạn X
62HCC 663 663, B B X X
64HCC 663,508 663,438 C C X,X xoá đoạn X,Xxoá đoạn
69HCC 663 663 B B X X
80HCC 663,621 663,438 B B X,X xoá đoạn X,Xxoá đoạn
Nhận xét:
663b
p

438b
p

663b
p
508b
p
685b
p
663b
p
800b
p
663b
p

14
1 220 NST 14 ngời PreC/C
Trong 8 cặp mẫu mô gan và huyết thanh của bệnh nhân HCC, sau
khi thực hiện kỹ thuật cloning, ở mỗi mẫu mô và huyết thanh cho thấy có
nhiều loại sản phẩm gen X xuất hiện. Vùng gen tơng ứng với kích thớc
của các chủng chuẩn trên ngân hàng là 663bp có ở 7/8 mẫu huyết thanh và
8/8 mẫu mô. Tuy nhiên, đi kèm với sản phẩm này xuất hiện thêm một số
sản phẩm bất thờng:
- Xoá đoạn: kích thớc sản phẩm còn 621, 592, 508, 438, 353; Thêm
đoạn: 685, 768; Tích hợp gen ngời; chuyển đoạn
- 8/8 trờng hợp không thấy thay đổi về kiểu gen giữa mô và huyết thanh
Kết quả giải trình tự một số clon xuất hiện đặc biệt trên bệnh nhân HCC:

Tóm tắt các sơ đồ giải trình tự gen (sơ đồ: 3.3; 3.4; 3.5; 3.6; 3.7; 3.8; 3.9)

3.3. Kết quả kiểu gen, một số đột biến của HBV nhóm HCC và nhóm
chứng:
Kiểu gen và phân bố kiểu gen ở nhóm HCC và nhóm chứng:
Bảng 3.9: Tỷ lệ kiểu gen trong HT giữa nhóm HCC và nhóm chứng:
Nhóm HCC (n=35) Nhóm chứng (n=32)
Kết quả
B C KXĐ B C KXĐ
Số BN 22 11 2 22 8 2
Tỷ lệ 62,9% 31,4% 5,7% 68,8% 25,0% 6,2%
Giá trị p>0,05
Nhận xét:
1286 1506 1948
Xoá đo
ạ
n
41b
p
151b
p
224b

p
Chèn đo
ạ
n
Chèn đo
ạ
n
1286 1948
1286
1286
1948
1948
Mẫu số18
Mẫu số 80
Mẫu số 64
Mẫu số 22
21b
p
100b
p
Chu
y
ển đo
ạ
n

15
Số bệnh nhân genotype B trong nhóm HCC chiếm 62,9%, nhóm
chứng chiếm 68,8%. Số bệnh nhân genotype C trong nhóm HCC chiếm tỷ
lệ 31,4%, trong nhóm chứng chiếm tỷ lệ 25,0%.

Không thấy có sự khác
biệt về kiểu gen đợc phân bố giữa 2 nhóm (p > 0,05). Số mẫu không xác
định (KXĐ) đợc kiểu gen do không có sản phẩm PCR.
Kết quả so sánh đặc điểm Nu, acid amin vùng gen Surface promoter
2 (3021-3180) ở nhóm HCC và nhóm chứng:
Trong 21/22 mẫu HCC, 21/22 mẫu chứng thuộc kiểu gen B và 8 mẫu
chứng, 11 mẫu bệnh nhân HCC thuộc kiểu gen C đợc giải trình tự
vùng gen
từ vị trí 3021-3180. Kết quả cho thấy các điểm Nu khác nhau giữa các mẫu
phân bố rải rác trong nhóm HCC và nhóm chứng. Không tìm thấy đột biến
có liên quan giữa nhóm HCC và nhóm chứng trong đoạn gen đợc so sánh .

Kết quả đánh giá vùng tăng cờng EnhII (vị trí từ 1636- 1774)
Bảng 3.10: Kết quả Nested- PCR gen X trong HT nhóm HCC và nhóm chứng
Nhóm HCC Nhóm Chứng
Kết quả
phản ứng
Số BN Tỷ lệ Số BN Tỷ lệ

Giá trị
ADN-HBV (+) 8 22,9% 15 46,9%
ADN-HBV(+) phân ly 13 37,1% 7 21,9%
p < 0,05
ADN-HBV(-) 14 40% 10 31,2%
Tổng s
ố
35 100% 32 100%

Nhận xét:
Tỷ lệ có ADN-HBV(+) không phân ly chiếm 22,9% ở nhóm HCC và

46,9% ở nhóm chứng. Sự khác biệt về đặc điểm dơng tính của 2 nhóm có
ý nghĩa thống kê với p < 0,05.
Bảng 3.11: Đột biến A1762T/G1764A nhóm HCC và nhóm chứng:
Nhóm HCC Nhóm chứng
Kết quả
Số BN Tỷ lệ Số BN Tỷ lệ
Giá trị
A1762T/G1764A 12 80,0% 5 41,7%
Không đột biến 3 20,0% 7 58,3%
Số mẫu 15 100% 12 100%
p < 0,05
Nhận xét:

16
Số bệnh nhân có đột biến ở vị trí 1762/1764 chiếm 80% trong nhóm
HCC, chiếm 41,7% trong nhóm chứng. Sự khác biệt giữa nhóm HCC và nhóm
chứng có ý nghĩa thống kê với p < 0,05.
Bảng 3.12: Kết quả đột biến G1896A nhóm HCC và nhóm chứng
Nhóm HCC Nhóm chứng
Kết quả
Số BN Tỷ lệ Số BN Tỷ lệ
Giá trị
G1896A 6 40,0% 5 41,7%
Không đột biến 9 60% 7 58,3%
Số mẫu 15 100% 12 100%
p > 0,05
Nhận xét:
Tỷ lệ đột biến vùng Precore trong nhóm HCC là 40%, nhóm chứng là
41,7%. Tỷ lệ không đột biến trong nhóm HCC là 60%, nhóm chứng là
58,3%. Không thấy có sự khác biệt giữa hai nhóm nghiên cứu (p > 0,05).

Bảng 3.13: So sánh đột biến G1896A ở hai kiểu gen B và C
Kết quả Kiểu gen B Kiểu gen C Giá trị
G1896A 11(68,8%) 0
Không đột biến 5 (31,2%) 11(100%)
Tổng số 16 (100%) 11 (100%)
p <0,001
Nhận xét:
Kiểu gen B đột biến nhiều hơn kiểu gen C, sự khác biệt có ý nghĩa
thống kê với p<0,001.
3.4. Kết quả so sánh kiểu gen với một số dấu ấn:
Bảng 3.14: Kết quả so sánh kiểu gen với HBeAg và antiHBe
Nhóm HCC Nhóm chứng
HBeAg antiHBe HBeAg antiHBe

Kết quả
(+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-)
Kiểu gen B

0 22
66,7%
19
57,6%
3
9,1%
4
13,3%
18
60,0%
14
46,7%

8
26,7%
Kiểu gen C

2
6%
9
27,3%
2
6,1%
9
27,2%
1
3,3%
7
23,4%
6
20,0%
2
6,6%
Giá trị p > 0,05 p < 0,001 p > 0,05 p > 0,05

17
Nhận xét:
Trong nhóm HCC, có 2/2 bệnh nhân HBeAg(+) đều mang kiểu gen C.
Tỷ lệ anti HBe(-) ở kiểu gen C là 27,2% cao hơn kiểu gen B là 9,1%, sự
khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,001.

Bảng 3.15: Kết quả so sánh giữa kiểu gen với AFP, ALT, AST ở nhóm HCC
AFP (ng/ml) ALT (U/L) AST(U/L)

Kết quả
<20 20 <50 50 <50 50
Kiểu gen B 5
15,2%
17
51,5%
9
27,3%
13
39,4%
10
30,3%
12
36,4%
Kiểu gen C 8
24,2%
3
9,1%
4
12,1%
7
21,2%
5
15,1%
6
18,2%
Giá trị p <0,01 p > 0,05 p > 0,05
Nhận xét:
Kiểu gen B có tăng AFP nhiều hơn kiểu gen C, sự khác biệt có ý
nghĩa thống kê với p <0,01. Sự khác biệt giữa AST,ALT với antiHBe

không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05 ở cả 2 kiểu gen.

Bảng 3.16: Kết quả so sánh kiểu gen với nhóm tuổi:
Nhóm HCC Nhóm chứng
Tuổi
Kiểu gen B Kiểu gen C Kiểu gen B Kiểu gen C
< 50 8
24,2%
6
18,2%
12
40%
4
13,3%
50 14
42,4%
5
15,2%
10
33,4%
4
13,3%
Giá trị p > 0,05 p > 0,05
Nhận xét:
Không thấy có sự khác biệt phân bố tuổi của 2 kiểu gen ở hai nhóm
nghiên cứu (p >0,05)

18

Chơng 4

Bn luận

4.1.Tuổi, giới, một số dấu ấn trong huyết thanh bệnh nhân HCC:

Tuổi trung bình trong nhóm nghiên cứu là 50,02 9,97, tuổi thấp nhất
là 33 và cao nhất là 75. Số bệnh nhân HCC tập trung nhiều nhất ở độ tuổi
từ 41- 60 chiếm đa số các trờng hợp (25/35). Theo nghiên cứu Liu CJ,
nguy cơ ung th gan ở ngời nhiễm HBV tăng theo tuổi. Trong nghiên
cứu, số bệnh nhân HCC có tuổi trên 60 chiếm ít (5/35), còn lại đa số là ở
tuổi dới 60 (30/35), nh vậy là nhiều bệnh nhân HCC còn khá trẻ. Một
trong những đờng lây truyền chủ yếu của HBV ở Việt Nam là từ mẹ sang
con nên tình trạng nhiễm HBV ở nớc ta có thể kéo dài trong nhiều năm,
đây là yếu tố thuận lợi cho quá trình viêm mạn tính, phát sinh các đột
biến, hình thành các oncogen gây ung th.
Giới: tỷ lệ nam/nữ là 10/1, đây có thể là một yếu tố nguy cơ có liên
quan đến cơ địa, nghề nghiệp, thói quen sinh hoạt hoặc sự khác biệt về nội
tiết của nam giới so với nữ giới .
Đặc điểm các dấu ấn trong huyết thanh nhóm HCC:
Dấu ấn HBeAg đợc đánh giá là có liên quan với nồng độ ADN của
virut trong máu. Việt Nam cũng giống nh các nớc vùng Châu á thờng
tồn tại HBeAg kéo dài, có thể sau tuổi dậy thì và làm tăng nguy cơ HCC.
Kết quả nghiên cứu ở bảng 3.1 cho thấy số bệnh nhân HCC có HBeAg(+)
không nhiều, chỉ chiếm 2/35 bệnh nhân (5,7%) nhng số bệnh nhân
antiHBe(-) chiếm 12/35 (34,3%) cho thấy ở những bệnh nhân này có thể
HBeAg mới chỉ bắt đầu giảm xuống thấp dới ngỡng phát hiện hoặc mới

mất đi, và kháng thể trong máu còn cha tăng, tập trung nhiều ở bệnh
nhân trên 40 tuổi chứng tỏ sự tồn tại HBeAg(+) ở ngời Việt Nam diễn
biến kéo dài sau tuổi trởng thành là th
ờng gặp. Theo nghiên cứu của
Yang HI ở Trung Quốc, tỷ lệ ung th gan trên ngời mang một dấu ấn
HBsAg là 324/100.00/năm và mang cả hai dấu ấn HBsAg, HBeAg là
1169/100.000/năm. Nh vậy, nguy cơ HCC ở ngời mang HBeAg tăng
hơn so với ngời chỉ mang HBsAg khoảng trên 6 lần.
So sánh giữa kết quả của antiHBe với các chỉ số tiên lợng: AFP, ALT,
AST trong huyết thanh bệnh nhân HCC. Kết quả bảng 3.2 cho thấy không
có sự khác biệt giữa nhóm antiHBe(+) và antiHBe(-). Nh vậy, dù bệnh
nhân ở thể ổn định có antiHBe(+) hay cha ổn định antiHBe(-) thì vẫn có
thể tăng hoặc không tăng các chỉ số này. Điều này cho thấy rằng

19
antiHBe(+) cha phải là dấu hiệu tiên lợng tốt cho bệnh nhân. Một số kết
quả nghiên cứu gần đây đã cho thấy, bệnh nhân chỉ bắt đầu có tổn thơng
gan vào giai đoạn sau chuyển đảo huyết thanh , có thể là do vai trò ức chế
miễn dịch của HBeAg không còn, nhng đáp ứng miễn dịch của cơ thể
chủ lại tăng lên để loại bỏ virut dẫn đến tổn thơng tế bào gan.
Hiện nay, xác định một số dấu ấn của HBV cũng nh AFP, AST, ALT
để tiên lợng bệnh nhân mang HBV mạn tính còn hạn chế. Vì vậy, xác
định sự biến đổi của virut viêm gan B có liên quan tới ung th gan đợc
nhiều nghiên cứu đề cập đến.

4.2. So sánh trình tự gen PreS, gen X giữa mô và huyết thanh:
4.2.1. Phân tích đột biến vùng PreS:
Dựa trên cơ sở quá trình sao chép và tái tạo lại các hạt virut HBV, giả
thiết đợc nghĩ tới là có thể xuất hiện sai sót của ADNpolymerase trong
quá trình sao chép để tái tạo lại virut trong tế bào gan dẫn đến hình thành

các đột biến của HBV khi ra ngoài huyết thanh. Một số nghiên cứu so
sánh trình tự gen của HBV ở mô giữa các vùng mô khác nhau, giữa mô và
huyết thanh của các tác giả trên thế giới: Nghiên cứu của Momosaki xác
định ADN trong mô gan ung th và vùng mô cận ung th ở các vùng gen
khác nhau cho thấy tỷ lệ ADN-HBV(+) cũng khác nhau giữa các vùng gen
S, C và Polymerase. Nghiên cứu Cho SW , Policino cho thấy khả năng
phát hiện HBV khác nhau giữa các vùng gen, trình tự Nu, các đột biến
cũng khác nhau giữa các vùng mô ung th và không ung th. Nghiên cứu
của Lee PI cho thấy có sự khác nhau giữa trình tự Nu vùng gen S giữa trẻ
và mẹ. Điều này chứng tỏ HBV là một virut có tính biến đổi cao, sự khác
nhau về trình tự gen giữa mô và huyết thanh trên các bệnh nhân ở Việt
Nam cũng có thể xảy ra.
Giải trình tự gen theo cặp mô và huyết thanh ở 9 mẫu bệnh nhân HCC
tại vùng gen PreS để so sánh sự khác nhau về trình tự Nu giữa mô và huyết
thanh (Bảng 3.7) cho thấy có 1 mẫu không có thay đổi về trình tự Nu, 2
mẫu có 1 vị trí thay đổi và số vị trí Nu thay đổi nhiều nhất là 12 vị trí. Số
vị trí aa thay đổi nhiều nhất là 8 vị trí. Mặc dù có sự thay đổi cả về trình tự
aa và Nu nhng kết quả nghiên cứu không thấy có sự thay đổi về phân loại
kiểu gen giữa các mẫu mô so với ở huyết thanh và cũng không có kết quả
nào nghiên cứu nào tơng tự để đối chiếu, nh
ng đã cho thấy về khả năng
thay đổi trình tự gen của HBV từ mô ra đến huyết thanh là có thể xảy ra.
MHBs là cấu trúc protein kích thớc trung bình của hạt HBsAg, đợc
mã hoá từ vùng PreS và vùng S, MHBs thay đổi sẽ làm hoạt hoá liên tục
tín hiệu phân bào c-raf-1/Erk2 dẫn đến tăng sinh tế bào gan, protein đợc
sản xuất từ vùng PreS/S nếu bị đột biến cắt đoạn vùng kết thúc COO có
thể kích thích bộc lộ tiền gen sinh u là c-fos từ 5 tới 10 lần.

20
Kích thích sản xuất các protein từ vùng gen cấu trúc thờng phụ thuộc

vào đoạn gen khởi động (promoter). Nghiên cứu so sánh trình tự đoạn
promoter của vùng gen PreS2 giữa các bệnh nhân nhóm HCC và nhóm
chứng, kết quả so sánh đã không tìm thấy vị trí đột biến khác biệt nào giữa
hai nhóm nghiên cứu. Nh vậy, đột biến kích thích sản xuất MHBs có thể là
ngẫu nhiên, không bị ảnh hởng từ vùng gen khởi động, hoặc phụ thuộc vào
yếu tố khác.
4.2.2. Các đột biến gen X với bệnh ung th gan ở Việt Nam:

Do sản phẩm gen X phân ly nhiều (bảng 3.6) nên nghiên cứu sử dụng kỹ
thuật tách dòng (cloning) sản phẩm Nested-PCR thu đợc từ vùng gen X,
nhận dạng đặc điểm của các clon bằng screening PCR với mồi X1 và CR2,
lựa chọn các clon có kích thớc khác nhau để giải trình tự bằng mồi có
trình tự của vector để xác định trình tự Nu vùng gen X. Các trình tự Nu sẽ
bao gồm cả hai đầu của mồi X1 và CR2.
Trong 8 cặp mẫu mô và huyết thanh nghiên cứu, sau khi giải trình tự, so
sánh trình tự mẫu với ngân hàng gen (Bảng 3.8, sơ đồ 3.3, 3.4, 3.5, 3.6,
3.7, 3.8, 3.9) kết quả nghiên cứu cho thấy: vùng gen tơng ứng với kích
thớc của các chủng chuẩn trên ngân hàng là 663bp có ở 7/8 mẫu huyết
thanh và 8/8 mẫu mô. Tuy nhiên, đi kèm với sản phẩm này xuất hiện thêm
một số sản phẩm khác: xoá đoạn, thêm đoạn, tích hợp gen ngời NST 14,
chuyển đoạn, nhng 8/8 trờng hợp không thấy có thay đổi về kiểu gen ở
mô và huyết thanh. Trong nghiên cứu, đa số là các đột biến xoá đoạn đợc
phát hiện, các sản phẩm xoá có kích thớc khác nhau đã đợc phát hiện.
HBx là sản phẩm mã hoá của vùng gen X, là một protein điều hoà đa
chức năng, tác động vào nhiều đích của vật chủ với vai trò trực tiếp hoặc
gián tiếp làm tăng nguy cơ HCC: điều khiển các tín hiệu chuyển dạng làm
tăng sinh tế bào, kích thích khởi động mạng lới cytokin gây viêm cấp và
mạn tính, hoạt hoá oncogen ras, myc, làm mất chức năng p53.
Đột biến xóa vùng gen X ở đầu 3 sẽ tạo ra các sản phẩm protein HBx
bất thờng, bị thay đổi các đặc tính sinh học làm tăng nguy cơ HCC đã

đợc thấy ở nhiều nghiên cứu trên thực nghiệm. Theo nghiên cứu của
WangY thì chỉ cần đột biến mất khoảng 14aa đã làm biến đổi HBx. Trong
nghiên cứu này, mặc dù số lợng nghiên cứu còn cha nhiều nhng cũng
cho thấy vùng gen X của HBV có rất nhiều dạng đột biến, có thể gặp
nhiều dạng trong cùng một bệnh nhân. Đây có thể là cơ chế quan trọng
liên quan tới ung th gan do HBV.
Các dạng đột biến vùng gen X trong nghiên cứu cũng thấy có sự khác
nhau giữa mô và huyết thanh. Trong số các mẫu nghiên cứu 64HCC,
80HCC, 18HCC đều cho thấy cắt đoạn ở mô ít hơn ở trong huyết thanh.

21
Nh vậy, sao chép của HBV có sự biến đổi từ mô ra huyết thanh và có thể
có hiện tợng tái sắp xếp gen đợc thấy trong nghiên cứu của Wang Y.
Phân tích gen PreS, gen X ở mô và huyết thanh theo cặp, khẳng định
đợc tính đột biến cao của HBV, thậm chí khác nhau từ mô tới huyết
thanh.

4.3.Đánh giá một số đột biến điểm vùng gen X thờng gặp có liên
quan tới HCC trên lâm sàng:
4.3.1.Đột biến BCP (A1762T/G1764A):
Đột biến corepromoter ở vị trí A1762T/ G1764A là các vị trí đợc
nghiên cứu nhiều, cho thấy có liên quan tới tổn thơng gan và HCC. .
Dạng đột biến tại vị trí BCP (1762/1764) có thể thấy khác nhau giữa các
kiểu gen, kiểu gen A, D, F thờng rất hiếm thấy dạng đột biến này, kiểu
gen B, C thờng gặp hơn và có liên quan tới HCC. Nghiên cứu của Liu CJ
cho thấy có thể gặp > 80% loại đột biến này ở bệnh nhân HCC ở cả hai
kiểu gen B và C và nguy cơ HCC của các bệnh nhân mang đột biến này
cao hơn 12,8 lần ngời mang chủng hoang dại (không đột biến).
Kết quả nghiên cứu ở bảng 3.11 cho thấy sự khác nhau giữa nhóm HCC
và nhóm chứng ở vị trí đột biến BCP là có ý nghĩa thống kê với p < 0,05.

Đột biến BCP chiếm tỷ lệ 80% bệnh nhân HCC cao hơn nhóm chứng
(41,7%). Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của BX Trờng, TTT
Huy và một số nghiên cứu xác định đột biến này trên kiểu gen B và C ở
trên thế giới và theo LH Song, TX Chơng thì đột biến này ít thấy trên
bệnh nhân viêm gan mạn tính và cấp tính ở Việt Nam.
Nh vậy, đột biến BCP trên kiểu gen B, C thờng gặp ở nhóm HCC
sẽ làm tăng nguy cơ HCC, hay đột biến này có ý nghĩa quan trọng trong
tiên lợng trên bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính.
4.3.2. Đột biến tiền lõi: G1896A
Tỷ lệ đột biến ở nhóm HCC chiếm 40% và nhóm chứng là 41,7%
(Bảng 3.12). Không thấy sự khác biệt giữa hai nhóm với p > 0,05. Hầu hết
kiểu gen C gặp ở dạng không đột biến, kiểu gen B thờng thấy đột biến
nhiều hơn kiểu gen C, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p<0,001( Bảng
3.13). Trong số mẫu HCC thuộc kiểu gen C của nghiên cứu chỉ có 1 mẫu
là HBeAg(+), do đó bệnh nhân HBeAg(-) vẫn có thể gặp dạng không đột
biến. Điều này chứng tỏ vị trí G1896A không phải là vị trí duy nhất làm
dừng tổng hợp HBeAg mà có thể còn nhiều vị trí khác nữa. Nh vậy, đột
biến này có thể liên quan tới kiểu gen nhiều hơn mà ít có ý nghĩa trong
đánh giá tiên lợng trên bệnh nhân viêm gan mạn ở Việt Nam, phù hợp
với kết quả bảng 3.14 cho thấy kiểu gen C chuyển đảo huyết thanh ít hơn
kiểu gen B ở nhóm bệnh nhân HCC.


22
4.4. Kiểu gen của HBV và một số yếu tố nguy cơ:
4.4.1.Phân bố kiểu gen ở nhóm HCC và nhóm chứng:
Kết quả xác định kiểu gen dựa trên vùng PreS cho thấy kiểu gen B gặp
nhiều hơn kiểu gen C ở cả nhóm HCC và nhóm chứng (bảng 3.9). Trong
nhóm HCC: kiểu gen B chiếm 62,9%, kiểu gen C chiếm 31,4%. Trong nhóm
chứng: kiểu gen B chiếm 68,8%, kiểu gen C chiếm 25%. Kết quả này phù

hợp với nghiên cứu của BX Trờng, TTT Huy và đặc điểm dịch tễ của vùng
Châu á.
4.4.2. So sánh kiểu gen với một số yếu tố nguy cơ có liên quan:
Kiểu gen nào của HBV cũng có nguy cơ gây HCC, tuy nhiên kiểu gen B
và C thờng gây biến chứng nhiều hơn và đây cũng chính là các kiểu gen
đang lu hành chủ yếu ở Việt Nam.
Kết quả nghiên cứu ở bảng 3.9 cho thấy không có sự khác biệt về phân
bố kiểu gen B và C của HBV giữa nhóm HCC và nhóm chứng. Do vậy,
kiểu gen có thể mang ý nghĩa về dịch tễ nhiều hơn, hoặc vai trò của kiểu
gen B và C ở Việt Nam có thể tác động nh nhau về cơ chế bệnh sinh tới
các bệnh lý về gan do nhiễm virut viêm gan B ở nớc ta.
Bệnh nhân HCC, kiểu gen C có tỷ lệ antiHBe(-) chiếm 27,2% nhiều hơn
so với kiểu gen B (9,1%). Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với
p<0,001(bảng 3.14). Điều này cũng cho thấy ở kiểu gen C có thể chuyển
đảo huyết thanh muộn hơn kiểu gen B. Tuy nhiên, mức độ gây tổn thơng
tế bào, biểu hiện qua chỉ số enzym gan của hai kiểu gen còn cha rõ ràng,
không có sự khác biệt giữa kiểu gen và kết quả AST, ALT trong nghiên
cứu. Số bệnh nhân chuyển đảo ở kiểu gen B trong nhóm HCC nhiều hơn
trong nhóm chứng. Nhng kiểu gen C thì ngợc lại, chuyển đảo xuất hiện ở
nhóm chứng nhiều hơn. Phải chăng cơ chế HCC khác nhau giữa hai kiểu gen.
Kiểu gen B trong nhóm HCC có tăng AFP (Bảng 3.15) chiếm tỷ lệ cao
hơn so với kiểu gen C, sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p < 0,01.
Nh vậy, kiểu gen B trên bệnh nhân HCC có thể có tiên lợng không tốt
bằng kiểu gen C.

4.5. Đánh giá kết quả ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu:
4.5.1. Đánh giá kết quả Nested- PCR:
Các mẫu ADN đều đợc kiểm tra chất lợng ADN trớc khi thực hiện
kỹ thuật. Đánh giá kết quả Nested- PCR với vùng gen X (Bảng 3.10), cho
thấy có nhiều sản phẩm PCR trên cùng một mẫu bệnh nhân, đợc đánh giá

là có sự phân ly vùng gen X. Tỷ lệ bệnh nhân có ADN(+) phân ly vùng
gen X trong huyết thanh gặp ở nhóm HCC cao hơn nhóm chứng và ngợc
lại, số bệnh nhân nhóm chứng có tỷ lệ ADN(+) không phân ly nhiều hơn.
Sự khác biệt giữa hai nhóm có ý nghĩa thống kê với p < 0,05. Các sản