Xác định đột biến trên exon 4 của gen SRD5A2 gây bệnh thiếu hụt enzym 5a reductase týp 2

TKf V*:

-u


LỜI CAM ƠN

Trong quá trinh học đại học. khóa luận tốt nghiệp chính là một dấu ấn quan
trọng trong quá trinh học tập vã nghiên cửu tại tnrờng. Thời gian liến hãnh làm
khóa luận lốt nghiệp tại khoa Kỳ Thuật Y học- Trường Đại học Y Hà Nội vừa qua
đà giúp em học hoi được nhiều điều, từ chuyên môn kiến thúc cùng như tác phong
lãm việc từ các Thầy cô. anh chị và bạn bè trong khoa.
Trước tiên, em xin bày tỏ sự cam on sâu sắc đến ThS. Lẽ Hồng Bích Nga
giang viên Bộ mơn Hóa Sinh lâm sàng. Khoa Kỹ Thuật Y học. Trường Đại học Y
Hà Nội. là người Thầy đà hướng dần. tận tính giúp đờ. ln dưa ra nhùng góp ý q
báu, sứa chừa ti mf cùng như những lịi khun hừu ích. tụo điều kiện giúp em hỗn
thiện khóa luận tốt nghiệp.
Em xin cám on Ban Giám Hiệu. Phòng Quân lý Đào tạo Đại học. Trường
Đại học Y Hà Nội dã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp cm hồn thành khóa luận.
Em xin chân thành cam ưn sâu sầc lới Ban Giám Đốc và các anh chị kỹ
thuật viên Trung tâm xét nghiệm Chemedic dà ln giúp dị cm tận lính dê cm có
thê hồn thành khóa luận này.
Em xin cam ơn đến các Thầy cị bộ mơn llóa sinh lâm sảng. Khoa Kỳ thuật
Y Học. Trường Đại học Y Hà Nội đã lạo mọi diều kiện tốt nhất cho em dược thực
hiện khóa luận
Cuối cùng, em xin gùi lời cam ơn lới gia đính, bạn bè dà quan lâm. động
viên, chia se những khỏ khăn với em trong suốt quá trinh học tập.
Hả Nội. ngày thảng nám 2020
Sinh viên

HOÀNG THỊ IIUYẾN TRANG

Cộng hịa xã hội chú nghía Việt Nam

TM/ V*:


Độc lập - Tự do - Hạnh phúc
_____****_____

LỜI CAM ĐOAN
Kính gứi: Phòng Quán lý Đào tạo Đại học -Trường Đại học Y llà Nội Hội đồng
chấm khóa luận tốt nghiệp

Tơi xin cam đoan đây là công trinh nghiên cứu cua tôi với sự giúp đờ cua
thằy cô tại Khoa Kỳ thuật Y học- Trưởng Đại học Y Hà Nội, tất cá các số liệu trong
khóa luận nãy lã trung thực vã chưa từng được cõng bố trong bất cử cóng trinh
nghiên cửu não khác.
/ỉà Nội. ngày tháng nàni 2020
Người viết khóa luận

Hồng Thị Huyền Trang

TM/ V*:


DANH MỤC VIÉT TẤT

bp

base pair

dd.NTP
DHT

Dideoxyribonucỉeotid triphosphate
Dihydrotestosteron

DNA

Deoxyribonucleic Acid

dNTP

Deoxyribonucleotid triphosphat

DSDs
EDTA
FSH
LH

Disordnerof sex development
Ethvlen diamine tetraacetic acid
•
Follicle stimulating hormone
Hormon Luteinizing

OD

Optical Density (Dộ hằp thụ quang)

PCR

Polymerase Chain Reaction (Phan
ừng khuếch dại chuỗi polymerase)

T

Testosterone

SRD5A2

Steroid 5-alpha-reductase 2

TM/ V*:


MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN
D AN H MỤC BÂN G
DANH MỤC HÌNH
DANH MỤC VIÉT TÁT
4.1........................................................................................................................
IKn I Lv/Ạỉì ••■•••■••■■•••a
■»•••■»•
TÀI LIỆU THAM KIIÃO

•••••••••••••• •••*«••• •••••■•«•■••••••••• M ■•••••


DANH MỤC BANG

DANH MỤC HÌNH


ĐẠT VÁN DÈ

Bệnh rối loạn phát triển giới tính (DSDs) lã một nhóm các bệnh lý rối loạn
hiếm gặp. dặc trung hoi bất thường nhiễm sắc the. tuyến sinh dục hoặc biêu hiện
xác định sự phát iricn giới tính. Tỳ lệ bệnh nhân mắc bệnh DSDs chưa được thống
kê rõ ràng trên the giới.
Bệnh thiếu hụt cnzym 5«-reductase týp 2 là một trong sổ các bệnh điên hỉnh
cùa bệnh rồi loạn phát triền giới lính nhóm bệnh 46.XY DSDs. Bệnh nhân thiếu hụt
enzym 5ơ-rcductase týp 2 có các dặc diêm lãm sàng như: dương vật nhó. lỗ đái
thấp, bíu chẽ đơi. ân tinh hồn. Những bất thường này có thê dược xãc định sớm tử
trong thai kỳ nhờ siêu âm. ỡ giai doạn sơ sinh, trê có cơ quan sinh dục không rõ
ràng, tuyên sinh dục vã cơ quan sinh dục không phũ hợp với đặc diêm bộ nhicm sac
thê giới tính; và giai doạn dậy thi. trè có bệnh lỷ rồi loạn phát triển giới tính.
Nguyên nhàn gây bệnh là do thiểu hụt cnzym 5«-reductase tỷp 2 - một
enzym xúc tác chuyên dôi testosterone (T) thành dihydrotestosterone (DHT), dỏng
vai trị trung tâm trong sự phân hóa giới tính và sinh lý androgen, tàc dộng trục tiếp
vào sự phát triên giới tính ở nam giới. F.nzym 5a- reductase týp 2 dược mà hóa bơi
gen SRD5A2. Nghiên cửu cho thấy, các bất thường trên gen SRD5A2 lãm thay dôi.
giám nồng dộ và hoạt tính cua cnzym 5«- reductase tỷp 2, dẫn đến giam hình thành
DI IT. gây nên sự xuất hiện cua cơ quan sinh dục khơng diên hình.
Đẽ chân đốn bệnh thiều hụt cnzym 5(í-rcductase tỷp 2. câc bác sỳ dựa vào
đặc diêm làm sàng bat thường, dục diêm cận lâm sàng: xét nghiệm cãc hormone,
mô bệnh học tuyến sinh dục. phản tích nhiễm sầc thê. Dê khắng dịnh chắn đoán,
bệnh nhãn nghi ngờ mắc bệnh thiều hụt enzym 5u-ređuctase týp 2 cần dược tiến
hành phân tích dột biến gen SRD5A2. cấu trủc gen

9

SRD5A2 gồm 5 exon, trong dó exon 4 dà được cịng bơ có nhiêu dột biên liên quan
dến chức nàng vã hoạt tính cua enzym.
Xuất phát từ thực tế trên chúng tơi thực hiện đề tài: *• Xác
định dột biến cxon 4 trên gen SRD5A2 gây bệnh thiếu hụt
cn/.ym 5«-reductase týp 2” với mục tiêu: "Phãt hiện đột biến
trên exon 4 cùa gen SRD5A2 trên bệnh nhàn bị thiều hụt enzym
5a-reductase tỹp 2

CHƯƠNG I: TÒNG QUAN TÀI I.IẸƯ

1.1.

Bệnh thiếu cnzvm 5«-reductase týp 2

1.1.1.

Giới thiệu về bệnh DSD

Bệnh rối loạn phát triển giới tính (DSDs) lã một nhóm các bệnh lỷ rối loạn
hiểm gặp thường dược đặc trưng bơi đặc diem bất thường của các nhièm sắc thê.
tuyển sinh dục hoặc kiêu hỉnh thường xác định sự phát triển giới tính. Bệnh nhàn cỏ
đặc diêm cơ quan sinh dục bất thường ơ tre sơ sinh hoặc có dặc diêm dậy thi' muộn
ở thanh thiểu niên [1].
Sự phát tricn giới lính bao gồm ba giai đoạn: (I) thiết lập giới tính di truyền tại
thời diêm thụ tinh (2) giai đoạn tạo thành cơ quan sinh dục trong quá trinh biệt hóa
luyến sinh dục (3) biệt hóa kiêu hình tuyến sinh dục dần đen sự khác biệt cua các

cơ quan sinh dục ngoài và xoang niệu sinh dục theo giới lính [2],
0 NỊTgÌỊpèii ri ô<!ã>* uMt.ới
Miu dc
KbtaifB

4ằ

xôp aỏa dio

IZ=

Dtrang vt

Am vt Xtpaip
Bm múi ptengltB

Xép Biệo đạo
Bm ti pùttg

10 tail

Điudxrangxịt
Móikn
Mài bi

ÀmUf

a

... . Tki«dtra»t4l Mớ Blệ«

Màimđạo

ELm.mẻa_____
Ị Khimh


10

Hình 1.1. Hình thành cơ quan sình dục ờ nam và nữ giới.
(Nguồn: Britannica)

Cơ quan sinh đục ngoài phát sinh lừ mấu sinh dục. bìu mơi phổng lên và các
nếp niệu dạo. Ớ nữ giới, chúng trớ thành âm vật. môi lớn và môi bé. ớ nam giới,
dưới ánh hưởng cùa dihydrotcstostcron. mấu sinh dục trờ thành quy đầu cúa dương
vật. các nềp gấp niệu sinh dục dài ra vả hợp lại dê tạo thành trục cua dương vật. và
các hạch sinh dục nói len hợp nhất đe tạo thành biu. Quá trinh hợp nhất được hoàn
thành sau 70 ngày tuôi thai và sự phát triển cùa dương vật tiếp tục kéo dải [3]. Sự
biệt hóa cùa nừ giới khơng bị anh hương cua nội tiết tổ. trong khi sự phát triển bính
thưởng cua cơ quan sinh dục nam địi hói sự tống hợp testosterone bính thường,
chun dỏi thành DHT bơi 5«-reductase và các thụ thê androgen bính thirờng.
Năm 2006. một nhóm chuyên gia Hiệp hội Nội tiết Nhi khoa châu Àu (ESPE)
và Hiệp hội Nội tiểt Nhi Lawson Wilkins (LWPES) dà đề xuất phán loại mới cho
DSDs. Theo đó. những rối loạn này dược chia nho thành:
- Nhóm bất thường nhiễm sẳc the giới tính
- Nhóm cỏ bộ nhiêm sắc the: 46. XY DSDs (rối loạn phát triền linh hỗn (ví
dụ. rỗi loạn phát triển luyến sinh dục hỗn tồn / một phần. DSD buồng
trứng và thối triền tuyến sinh dục) vã rối loạn tống hợp androgen)
- Nhóm có bộ nhiễm sắc thè: 46. XX ĐSDs (rối loạn phát triẽn buồng trứng
(ví dụ. rồi loạn sinh dục. DSD buồng trứng vã DSĐ tinh hoãn) vã rối loạn dư
thừa androgen [4],

Theo
thuộc
phân
nhóm
loại
bệnh
này.
46.triển
bệnh
XY
DSDs
thiếu
bao
hụt
gồmhay
enzym
những
5a-rcduclasc
rỗi
týp
luyến
sinhđộng
tác
dục
hoặc
androgen.
phát
tinh
hồn

suy
yếuloạn
tốngcua
hợp
và2


1
1

1.12. Dục diêm lâm sàng bệnh thiêu hụt enzym 5a- reductase týp 2

Hình ì. 2: Hiếu hiện lâm sàng ở bệnh nhân thiểu hụt enzym 5a-redti(1ase
ỉýp 2 trước fit ôi dậy thi.
(Nguồn: Sahakìtrungruang T, 2008)
Bệnh thiếu hụt cnzym 5a-rcductasc týp 2 là một trong hai nguyên nhãn lởn
gây ra bệnh rối loạn phát triền giới tính ờ nam giới, với các đặc điểm lâm sàng diên
hình như: dương vật nho. lồ dải thấp, bíu che đơi. ấn tinh hồn, nử hóa. Các trường
hợp này thưởng chậm phát tricn chiêu cao. phát triển tâm thần bính thường. Tinh
hồn ơ những dứa tre này có thê nằm trong túi bẹn. và rất hiếm khi phát hiện được
khi người mẹ mang thai. Trc này có xu hướng dược ni dạy như nữ giới cho đến
tuổi dậy thí. khi dó chúng bát dầu biêu hiện nam tính hóa (6J.
Trong giai doạn dậy thỉ. sự gia táng nong độ hormone sinh dục nam dẫn den
sự phát triên cua một sỗ đặc diêm giới tính phụ. chàng hạn như tảng khói lượng cơ.
trầm giọng, phát trĩẽn lỏng mu vã tảng tốc. dương vật vã bíu (túi da giừ tinh hồn)
phát triền lởn hơn. Khơng giống như nhiều nam giới, những người bị thiều hụt 5ơreduetase týp 2 không phát triển nhiều lông trên mật hoặc cơ thê. 0 tre nừ. thiếu hụt
5u- reductase týp 2 thường khơng biêu hiện lãm sàng, tuy nhiên có ca lâm sàng dơn

TM/ V*:

4Ả 'V.


1
2

le thiều 5u-reductase týp 2 ơ nữ dược mô tá với dấu hiệu vô kinh nguyên phát, vú
kém phát triển (7Ị.
1.13. Cơchểgây bệnh thiều hụt enzym 5a-reductase tỹp 2

Phơi
hai
hệ
thai
thống
người
sinh
có
san
khá
nam
năng
và
phát
nữ.
triền
Vào
thời
và
biệt

diêm
hóa
tuần
thành
thử
6
cá
cùa
hột
thai
nhau
kỳ.
ca
hai
CƯ
quan
giới
gụi
là
giai
bèn
đoạn
trong
cùa
phơi
tning
thai
tính,
giống
bao

testosterone,
gồm
các
ống
thai
Wolff
nhi
vã
sẽ
các
phát
ổng
triển
Muller.
hệ
thổng
Khi
thiếu
sinh
sán
nữ.
Sự
thành
biệt
hộ
hóa
thống
cùa
sinh
rãnh

san
sinh
dực
dục
được
ngun
bất
thủy
đầu
trong
chưa
phân
thời
hóa
kỳ
phơi
thai
Testosterone
bơi
gen
SRY
do
tinh
nẳm
trên
hồn
nhánh
san
xuất
ngắn

dàn
cua
đến
nhiễm
sự
biệt
sầc
hóa
the
cua
Y.
ổng
cúa
Wolffian
nam
bao
gom
ờ
nam
túi
dè
tinh,
tạo
mão
thành
linh
cơ
và
quan
ống

sinh
dẫn
dục
tinh
bén
.
Giai
trong
doạn
khác
cuổi
biệt
Là
cua
biệt
các
hóa
cơ
quan
kiêu
sinh
hình
dục
tuyến
ngồi
sinh
và
dục
xoang
dần

niệu
đến
sự
sinh
dục
giới
theo
tính
giới
phụ
tính.
thuộc
Giai
vào
hoạt
đoạn
động
này
cùa
cua
q
testosterone
trinh
biệt
và
hóa
dihydrotestosterone
androgen)
thơng
qua

thụ
(DHT:
the
hormone
androgen.
steroid
Cơ
quan
chính
cho
dục
thụ
ngồi
thê
den
giới,
tuần
cầu
thai
trúc
thứ
ban
10
đầu
vần
gồm
cỏ
có
cãc
3

dặc
bộ
phận
diêm
cơ
chung
ban
cho
cú
cá
sinh
hai
dục.
hỉnh
gừ
thành
sinh
các
dục
phan
và
phều
cua
cơ
sinh
quan
dục.
sinh
ơ
bào

dục
thai
ngồi
nam
là
q
do
tác
trinh
dộng
ređuctasc.
cua
testostcron
DHT
cơ
ái
chun
lực
rất
thành
cao
với
DHT
các
do
cỏ
thụ
enzym
the
androgen.

5aDHT
theo
phát
giới
triền
nam.
dương
Cơ
quan
vật.
sinh
bíu
dục
vã
ngồi
tiền
liệt
cua
nừ
tuyền
biệt
và
hóa
niệu
khơng
đạo
cỏ
vai
trị
cua

DHT
[2].[3].

TM/ V*:

4Ả 'V.


1

ỉ. 1.4. Dặc (tiếm cận tâm sàng bệnh thiều hụt enzym 5a-redttđase týp 2
Cúng với các dộc điềm lâm sàng trcn. các chi số cận lâm sàng: nồng độ
hormone LH. FSH; tý lệ T.'DI IT tnrớc và sau làm test kích thích băng hCG, hoặc
sự giâm cúa ti lệ An/Et. 5(X-THF/THF khi định lượng steroid niệu bằng kỹ thuật
GC-MS lã những chi diêm diên hỉnh đé khảng định bệnh nhân thiêu hụt enzym 5«
reductase týp 2 [4], [8].

Bệnh
nhân
nghi
ngờ
thiếu
hụt
cnzym
5a-reductasc
týp
2hóa
dược
tiến
và

FSH.
hành
Trong
các
xét
cơ
thê.
nghiệm
testoteron
hormone
được
định
dùng
lượng
dê
testosterone.
chun
các
LH
dạng
dihyrotestotcron
hormone
giới
và
tính
estradiol.
khác
nhau
DHT
quan

là
trọng
chất
chun
nhất
là
hóa
được
tạo
các
từ
cơ
quan
testosterone
đích
như
(T)
tuyến
dirợc
tiền
chun
liệt,
hỏa
da
chu
gan
yếu
(9).
từ
T

trong
Estradiol
ra
ơ
ca
nam
lã
vã
san
nữ
phàm
trong
trong
mơ
mỡ.
q
tinh
trinh
hồn
oxy
và
hóa
buồng
testotcron
trứng.
Hai
xay
hormone
yen
trong

l.ll
nào.
và
Hormon
FSH
đều
FSH
được
ớ
nam
giãi
giới
phóng
có
từ
vai
thủy
trị
trước
kích
thích
tuyến
trùng.
sự
phãt
Ilormon
dục
cua
Lll
ống

kích
sinh
thích
tinh
và
sự
thức
tơng
dây
hợp
sự
và
san
bài
sinh
tiết
tinh
testotcron
trong
máu
giam
bơi
câc
SC
làm
tế
bào
giam
Leydig
bãi

tiết
trong
tcstostcron.
tinh
hồn.
Bệnh
Lượng
nhân
I.H
thiều
tcstoteron,
hụt
enzym
FSII.
5a-reductase
Lll
mâu.
tỹp
2
cõ
sự
suy
giám

TM/ zfci V*: 4Ả 'V.


110-HSD2
Cortisol «
(F)

110HSD1
50^
5<1Dihydrocortisol
(5O-DHF)

(E)
Rcductaso

Dihydrocortisol
(DHF)

I
5«-T otrahỵdrocortisot
drocortíSol
(5a-THF)

T Cortisone

ị
T otrahy
(THF)

Dihydrocortisone
(DHE)
ị 3-Ketoreductase
T otrahydrocorttsono (THE)

H'utli 1.3. Sân phầin chuyến hóa cùa costisol.

Xétcó

nghiệm
định
lượng
steroid
niệu
bằng
GC/MS
Git
hữu
ích
niệu
bằng
chân
GCN1S
đốn
thiêu
có
nhiều
5«-reductase
ưu
điềm
nhờ
týp
chn
2.
Định
bị
màu
lượng
qua

steroid
nhiều
bước
chiết
trong
đó
cỏ
tự
q
do
và
trinh
q
tlv
trinh
phản,
sắc
ký’
tạo
khí
dản
vói
xuất,
thịi
tách
gian
dãi
khối
hon
phơ

so
cõ
với
kha
sắc
nâng
ký
phân
long
tách
khối
cãc
phố.
dồng
Nhờ
phản
vậy.
cua
sắc
steroid
kỹ
khi
trong
kỷ
dồ.
mầu.
Enzym
mỗi
5«-reductase
steroid

được
typ
dặc
2
xúc
trưng
tác
bằng
phan
một
ứng
đinh
khứ
trẽn
liên
sắc
kết
testosterone,
đỏi
giừa
C4
cortisol
và
C5
cua
và
vịng
progesterone.
A
trên

một
Trong
số
cơ
dó.
chất
quan
như
trọng
nhất
testosterone
là
5areductase
thành
5atyp
dihydrotestostcronc
2
xúc
tác
phán
ứng
(5«-DHT).
chun
sắc
ký
đồ
với
dinh
mẫu
THF

hình
do
đặc
vậy
trưng
tỷ
lệ
là
5a-THF/THF
dinh
5athấp
THF
thắp
hơn
giá
hơn
trị
nhiều
tham
so
chiều
cạnh
dó.
hoặc
theo
tý
lệ
một
THF/5a-THF
nghiên

cứu
cao
về
him
định
khống
lượng
tham
streroid
chiêu.
niệu
Bên
bang
5«THBTHB
GC/MS
thấp
chi
lum
ra
khoang
răng
lý
tham
lệ
An/Et,
chiếu
I
ơ
lOIỈ-An/1
tre

lớn.
Kỳ
ÌOH-Et.
thuật
định
trọng
thiêu
steroid
5«-rcductasc
niệu
bằng
GC/MS
týp
2
lã
thay
liêu
thế
chn
cho
kỹ
chân
thuật
đốn
định
quan
lượng
miền
dịch
testosterone

có
độ
nhạy
và
thấp
dihydrotestosterone
lum
vả
bị
nhiễu.
bảng
Tuy
vậy.
phương
các
pháp
nhà
nghiên
cứu
nhận
thay
khó
chăn
dốn

TM/ .ự?, V*: 4Ả 'V.


15

bệnh thiếu hụt enym 5 a-reductase týp 2 ư tre dưới 3 tháng tuòi do sự bài tiet các
hormon steroid rất thấp, nên ờ trê dưới 3 tháng cần phân tích dột biến gen
SRD5A2ÚC chân đoản [10].
1.2. Tổng quan về gcn vả protein SRD5A2
1.2.1. Gen s RDS A 2
Gen SRD5A2 có lên gọi dầy đu là Steroid 5 Alpha-Reductase 2. SRD5A2
cùng có nhùng tên gọi khác như: 3-Oxo-5-Alpha-Steroid 4- Dehydrogenase 2.
Alpha Polypeptide 2 (3-ƠXO-5 Alpha- Steroid Delta 4- Dehydrogenase Alpha 2). 5
Alpha-SR2, MGC 138457.SR loại 2 [11], Gen năm Iren nhiêm sắc thê số 2 (2p23),
gồm 5 exon. mà hóa cho protein 5a - reductase [12].
Chr 2

Hin It 1.4. Vị trí cùa gen SRD5A2.
(Nguồn: Genecards)
1.22. Cấu tr úc protein SRDSA2

Hình 1.5. Cẩu trúc protein SRD5A2.
(Nguồn: Nature)

TC .•$.

V*:


16

(Ba hình chiếu cua cẩu trúc SRD5A2. Bó trợ NADP DHE được hiên thị dưới dạng
hình cầu. LI-6 đại diện cho sáu vòng kết nồi 7-TM. Các phần tu NADP và DHF có
màu tương ứng là lục lam nhạt và hồng nhạt.)
Họ Steroid 5a-reductase (5«-RD) bao gồm năm nhõm: SRD5A1 3. GSPN2 và

một protein ít được nghiên cứu có cấu trúc lương lự như GSPN2. SRD5AI và
SRD5A3 dà được biết đến có chức năng trong q trình chun hóa cùa các tế bão
thần kinh và trong quá tri'nh glycosyl hóa liên ket protein. Ca ba gen SRD5A1-3
đều nằm trong màng cùa lưới nội chat (ER) trong tế bào. Các enzyme SRD5AI và
SRD5A2 là các enzyme liên kết trên màng tế bão. bao gồm lần lượt là 259 và 254
add amin. Gần đây. gen SRD5A thứ ba (SRDĨA3 ) đà dược xác định, năm ớ vị trí
4ql2 cua nhiễm sấc thê số 4. mà hõa protein có 318 acid amin (5tt-reductase tuýp
3). có 19% tương đồng vói SRD5A1 vã 20% tương đồng với SRD5A2. Tất cá các
gen SRD1-3 đều cõ liên quan den các rối loạn chuyên hóa ờ người. Trong đõ
SRD5A2 lã gen dược nghiên cứu nhiều nhất và có các vai trơ đậc trưng trong
chun hóa androgen và các rối loạn liên quan dền androgen .
1.23. Chức năng của gen SRD5A2

5aceductase
NADPH
testosterone

Hinh 1.6. Chuyên hóa cùa testosterone dưới tác dụng của 5a- reductase.

(Nguồn: Nature)

SRD5A2 dược biêu hiện nhiều trong hệ thống sinh san nam đê chuyên dôi

testosterone thành 5ư-dihỵdrotestosterone. Một số lượng lớn các dột biến được xác
định trong gen SRD5A2 có the dan den thiểu hụt DI IT. dẫn den rỗi loạn lặn trên
NST thường có tên là thiếu hụt enzym 5a-reductase tỷp 2 gây tác động dền cư quan

TC .•$.

V*:

17

sinh dục kém phái triển và không diên hỉnh. SRD5A thuộc về một nhóm lớn các
chất khư steroid chảng hạn như 7-dehydrocholesterol reductase (DHCR7) xúc tác
bước cuối cùng trong quá tành sinh tông hợp cholesterol ờ người. Mặc dù các chất
khư steroid VC trinh tự khác nhau nhưng cã hai gen SRD5AI vả SRD5A2 đều sứ
dụng nâng lượng của NADPH lâm đứt gày các liên kết dôi c c trong chất nền
steroid cua chúng. Ca hai enzym xúc tác cũng một phan ửng (khư 5a-steroid).
nhưng nằm trên các nhiễm sấc thê khác nhau, dóng vai trị sinh hóa đặc biệt và
dược biêu hiện ư các mỏ khác nhau. SRD5AI được biêu hiện ở da dầu và da bẩm
sinh cua thai nhi. Biêu hiện SRD5AI ứ người kin cao hơn từ 5 đến 50 lần so với thai
nhi. cho thấy rang enzym không liên quan dền sự phát triẽn cùa thai nhi nam.
SRD5A2 dược thê hiện nhiêu trong các tế bào cua thai nhi. Sau khi sinh. SRD5AI
dưực biểu hiện ơ nhiều vị trí hơn. bao gồm gan. da. da dầu và tuyền tiền liệt trong
khi SRD5A2 dược biêu hiện ơ tuyến tiền liệt, túi tinh, mào tinh, gan [14].[15].
Testosterone và DI IT cần thiết cho sự phát triển bính thưởng cùa các dặc diêm giới
tính nam. Trước khi sinh, testosterone chịu trách nhiệm hình thành cơ quan sinh dục
bèn trong nam giới, bao gồm các ống thu nhận tinh trùng và dưa tinh trùng ra ngoài
(mào tinh hoàn và ống dăn tinh) và các tuyến giúp san xuất tinh dịch (túi tinh).
DHT chi phối sự phát triền cùa cơ quan sinh dục ngồi, bao gồm ca dương vật và
bíu. và tuyến tiền liệt. Trong giai đoạn dậy thí, hai loại hormone này cùng dóng vai
trơ quan trọng trong việc phát triển các dặc diem giới tinh phụ cua nam giới như
mọc lỏng mặt và lông trên cơ thê. táng khối lượng cư. trầm giọng [17].

TC .•$.

V*:

18

1.2.4. Dột biến gen SRD5A2
Một trong những nguyên nhãn chính gây bệnh thiếu hụt enzyme 5«- reductase
týp 2 lả do đột biến gen SRD5A2. Enzym 5«-ređuctase týp 2 là một cnzym liên kểt
trên màng tế bào xúc tác chuyên đối một chiều testosterone thành
dihydrotestosterone, bang cách str dụng năng lượng tir coenzyme NADPH. Dựa
vào dó. hầu hết các nghiên cứu chức năng cua protein tập trung vào nghiên cứu
dộng học và hoạt độ cua enzym. Hoạt dộng cua enzym được ước tính bang tốc độ
phân ứng tồi da (Vmax) vả hầu như các the dột biền nonsense cùa gen SRD5A2
năm trên exon 4 đều gây anh hường đến Vmax cùa enzym (IS). Dột biến gen
SRD5A2 có the làm suy giam hoạt động cùa enzyme 5ct- reductase týp 2 dược chia
lãm 2 nhóm: nhửng đột biến anh hường đến ái lực NADPH và nhưng đột biến gây
anh hướng đen kha nâng liên kết vói phần tứ testosterone [IS]. Cho đến nay. hơn
100 dột biến dã dưực tím thấy
trài gen SRD5A2 [19].
wrx RWO

íSniR

Hình 1.7: Các đột biển lỉirực phút hiện trên gen SRD5A2 gây bệnh thiểu
hụt 5a-reductase tp 2.
(Nguồn: ScienceDirecĩ)

Theođịnh
thiểu
một
hụtcỏ
nghiên

enzym
cứu
5a«trcn
đánh
reductase
giácxon
tích
týpnhưng
hợp
2 trẽn
vã
phàn
tồn
lích
thẻ
giói
về
sự
đà 1
xác
trong
dó
434
70%
trường
dột
hựp
biến
thiếu
dồng

hụt
hợp
SRD5A2
tứ
vã
30%
tử
44
di
quốc
hợp
lử.
gia
Dột
với
biến
dược
tim
thấy
các
nhiều
nhất
là
exon

33% và exon 4 lả 25% [1]. Trong một nghiên cứu cua Trung tâm nghiên cứu gen
Bầc Kinh trên 219 bệnh nhân nghi ngờ DSDs đà xác định được hai đột biến dị hợp
là đột biển C.695A>G làm thay đối axil amin 232 tử histidine thành arginine (PH232R) làm bầt hoạt hoặc suy giám chức năng SRD5A2 và đột biển C.16OT. tạo ra
một codon dừng (p.Q6X) tạo ra một protein bị cat ngăn, protein này đả mất kha

TC .•$.

V*:


19

nâng liên kết với thụ thế testosteron.
Tại một nghiên cửu cho bộnh nhân Trung Quốc có cơ quan sinh dục khơng
rị rang, karyotype 46 XY dược giái trinh tự cxon 1-5 gen SRD5A2 đã phát hiện
thấy 2 đột biến liên tiếp ờ exon 4. mỏi đột biển năm ớ I alen khác nhau: (1) mất
đoạn nucleotit T gày dột biến lệch khung tử codon 219. (2) đột biến sai lệch ờ
codon 227 làm xuất hiện đột biến R227Q [20].
Trong một nghiên cứu cua Nhật ban trẽn 81 bệnh nhân có biêu hiện dương vật
nhó hoặc tinh trạng mơ hồ về bộ phận sinh dục dược tiến hành phân lích gen
SRD5A2 trên cá 5 exon cho thầy hai dột biền sai nghfa (G34R và R.227Q) và một
dột biến vò nghfa (Y26X) cua gen SRD5A2 ơ ba bệnh nhãn bỊ rồi loạn phát triển
giới tinh. Hai dột biền sai lệch dà dưực báo cão trước dây ơ nhùng bệnh nhãn bị
thiếu hụt 5a-reductase typ 2. vả càc nghiên cữu chức nâng đà chi ra rằng ca hai dột
biến dcu làm tòn hại nghiêm trọng đen hoạt dộng cua enzym Dột biến vỏ nghía dà
lãm mất hoạt tinh cua enzyme vi nõ cút ngẩn enzym một cảch dáng kế.
Ỉ.3. Các kỹ thuật sinh học phân tữ dược sứ dụng dế phát hiện dột biền gen.
1.3 J. Kỳ thuật PCR.
Nguyên lý phan ứng: Dựa vào nguyên tắc biến tính hay hồi tinh cua phân tư
DNA bơi nhiệt độ.

TC .•$.

V*:

20

PCR là viết tắt cua cụm từ Polymerase Chain Reaction- là kỳ thuật sinh học
phân tử cho phép nhàn ban khuếch dại một hoặc một vài doạn DNAmong muốn
thành nhiều ban sao theo cấp lũy thừa. Thông thường, PCR. bao gồm một chuỗi
khống 20-40 lần biến đơi nhiệt độ lặp di lặp lại, gọi chu kỳ. mỏi chu kỳ thường
gồm 2-3 giai đoạn nhiệt độ ricng biệt. Các chu kỳ thường bắt đầu bằng giai đoạn
nhiệt độ cao (>90°C), vã sè dừng lại khi san phẩm cuối cùng dược tỏng hựp hoặc
dừng lại Ư nhiệt dộ thấp dè lưu trừ sàn phàm PCR trong thời ngan. Nhiệt độ và thời
gian thực hiện cua mỏi chu kỳ phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Nhùng yếu tố này gồm
enzyme tống hợp AON. dung dịch đệm, dNTPs dùng trong phân ứng, và nhiệt độ
nóng chay (Tm) cùa mồi.
Prtxpk of ơx Pol^iwu Cfu«n RrMOon PCR.I MrT-oa

—8

ộ

MMNI

c*u

Set-vp

/ dNTP. . / z
t1

Denaiưiùcn
Start

1

1

2
4(3 2-*)

2

3

n

8(3 2’)

r

Cy
cle
Ho.
ON
A
No.

Hìnli 1.8. Phân ứng PCR.
(Nguồn: Biomedia)
• Giai đoạn khởi đầu: Giai doạn cần tâng nhiệt độ lên 94-96-C (hay 98°c nếu sử
dụng polymerases cực kỳ ben nhiệt) và dược tiền hành trong 1-9 phút.
•

Giai đoạn biển tính, dây là bước dầu tiên cùa chu kỳ vã lả quá trinh tảng

TC .•$.

V*:


21

nhiệt độ Icn 94-98*C trong 20-30 giày. DNA dược biển tính bảng cách phá
vờ lien kct hydro giữa các bazo. tạo thành phân tứ DNA sợi dơn.
•

Giai đoạn gắn mồi: nhiệt độ phán ứng giam xuồng còn 50-65-C trong 20-40
giây dê mồi gản vào sợi DNA dơn. Nhiệt độ này cần phai du thấp đê cho
phcp mồi bắt cập với sợi DNA. nhưng cùng phai du cao cho quá trinh bất
cạp đậc hiệu giúp mồi chi gắn hỗn tồn với phần trinh tự bo sung trên mạch
khuôn. Neu nhiệt dộ quá thấp, mồi sẽ gắn không dặc hiệu. Neu quá cao. mồi
có thè khơng gân. Thơng thưởng nhiệt độ gân mỗi thưởng thấp hơn 3-5 °C so
với I'm cua mồi dùng trong phan ứng. Lien kết hydro giữa 2 sợi nucleotide
DNA mỗi chi được hình thành khi mồi liên kết hồn tồn với mạch khn.

Giaimỗi
vào
các
đoạn
DNA
kéo
polymerase
dài:

Nhiệt
sư
độ
dụng:
trong
Taq
giai
polymerase
doạn
này
cỏ
phụ
nhiệt
thuộc
độ
hoạt
thường
động
dược
tối
sư
ưu
dụng
ờdộ
75-80*
với
enzyme
c
và
72*c

này.
lả
Tại
nhiệt
giai
dộ
đoạn
tối
này
ưu
DNA
polymerase
cách
thèm
dNTP
tổng
theo
hvp
ngun
sợi
DNA
lẳc
mới
bỏ
bó
sung
sung
theo
với
chiều

DNA
khn
5'
đen
bang
3'.
phan
với
nhóm
ững
trúng
3’
hydroxyl
hợp
xay
ra
phía
giữa
cuối
nhỏm
cua
5'
sợi
DNA
phosphate
vừa
mới
cùa
dược
dNTP

hỉnh
DNA
polymerase
thành.
Thời
và
gian
dài
cua
cua
giai
doạn
doạn
DNA
kéo
cần
dài
khuếch
phụ
thuộc
dại.
vào
Thịng
thường,
nghìn
bazo
cãc
nito
DNA
trẽn

polymerase
một
phút.
cơ
khá
Trong
nàng
diều
khuếch
kiện
dại
tối
được
ưu,
nếu
hãng
khơng
thỉ
sau
có
mỗi
hạn
giai
chê
do
đoạn
giới
kẽo
hạn
dãi.

cua
số
cơ
lượng
chất
DNA
hoặc
dược
chất
khuếch
phan
ửng
dại
sau
chu
kỉ
tuần
theo
hâm
mù.

•

Giai doạn kểt thúc kẻo dùi'. Giai đoạn này được thực hiện ớ nhiệt độ 7074°C (đây là nhiệt độ cần thiết cho hoạt dộng tối ưu cua hầu het các enzyme
polymerase dùng trong phan ứng PCR). với thời gian 5-15 phút sau chu kỹ
PCR cuối cũng dế đám bão rằng tất cà DNA sợi dơn cịn lại đều dược tơng
hợp hồn tồn.

•

ỮMW* doụn hao qn: Giai đoạn này thực hiện ơ nhiệt dộ 4-15 cC ưong một
thời gian dè bao quan ngăn hạn san phàm cua phan ứng [21].

1.32. Kỹ thuật giãi trình tựgen (DNA sequencing)
Giai trinh tự gen (DNA sequencing) kì phương pháp xác định trinh tự sắp
xếp cua 4 loại nucleotid: A (Adenine). T (Thymine). G (Guanine) và c (Cytosine)
trên phân tư DNA. Kỳ thuật giai tành lự gcn bao gom các phương pháp:
-

Phương pháp hoá học cua Maxam và Gilbert: Phân tư DNA dược đánh dắu
và xư lý phân cat hoá học.

-

Phương pháp enzym cua Sanger (Phương pháp didcoxynuclcotidc): Dừng
ngẫu nhiên phan ứng tống hợp chuỗi DNA bằng ddNTP - Phương pháp giái
trinh lự bằng máy tự động.

-

Phương pháp GTT gen thế hệ mới (NGS-Next Generation Sequencing).
Phương pháp enzyme cua Sanger hay cơn gọi lã phương pháp

TC .•$.

V*:


22

dideoxynucleotide sư dụng ddNTP lã một phàn tư nhân tạo. cầu trúc cua nó tương
tự như phàn tư dcoxynuclcotid (dNTP). tuy nhiên ơ carbon sỗ 3 cua dường
deoxyribose không phai là nhóm hydroxyl ( OH) mà lã H. Cảc ddNTP có nhiệm vụ
dừng việc tổng hợp mạch bo sung do khơng hình thành dược liên kết
phosphodiestcr. Các ddNTP tham gia vào phán ứng tại nhiều thời diêm khác nhau
và tạo ra các sợi dơn DNA có kích thước khác nhau.

TC .•$.

V*:


23

9
9
II
LI _ H
HO-P-O-P-O-P-O

9

deoxynucfcot»dc tnpbosphate

dideoxynudeobổc tnpbosphate

Hitt II 1.9. Cấu tạo phân từddNTP.
(Nguồn: Gentìs)

Với điện

quang
các
khác
máy
nhau
the
hộ
dê
mới
đánh
sau
dấu
nây.
4quang
loại
người
ddNTP.
ta
dùng
Nhờ
4diện
vậy
màu
phan
huỳnh
ứng
giái
can
trinh
di

tự
trên
thê
thực
hàng
hiện
mà
khơng
trong
phái
một
trên
ong
nghiệm
4
hàng
và
khác
chi
nhau
quan.
như
Mỗi
trước
khi
có
đây.
một
hệ
vạch

thống
diện
diện
di
di
thường
qua.
phân
là
điện
từ
ddNTP
di
mao
cuối
cùng
tương
ư
ứng.
dằu
3*
mảy
cùa
sẽ
đoạn
ghi
nhộn
DNA
sè
màu

phát
sắc
ra
này
một
và
màu
chuycn
huỳnh
về
quang
máy
tính
loại
phân
tích.
nuclcotid.
Đựa
vào
từ
màu
đỏ
biết
huỳnh
dược
trinh
mà
máy
tự
cùa

nhận
DNA
đích.
dược

TC .•$.

V*:


24

Hình 1.10. Kỹ thuật giài trinh tựgen.
(Nguồn: Khanacademv)

ưu thuật.
thực
diem
hiện
cùa
trong
phương
một
pháp
ong
nghiệm
này
là gian,
và
phan

chi
ứng
can
giái
diện
trinh
di
trên
tự
có
một
the
hãng
enzym
mà
cua
khơng
Sanger,
phái
phần
trên
mem
bổn
máy
hàng
lính
khác
sẽ
nhau
tự

dộng
nhu
phương
giải
trình
phãp
lự
dử
trinh
liệu
tự.
từ
từ
hệ
dó
thống
tiết
điện
kiệm
di
thịi
vã
cho
hình
cơng
ánh
sức
kết
cùa
q

người
giai
lãm
kỳ

CHƯƠNG n

DOI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu

2.1.

Dối tượng nghiên cứu

Cờ mầu: lấy mầu thuận tiện
Tiêu chuẩn lựa chọn:
-

Mầu bệnh: mẫu máu cùa bệnh nhân nghi ngờ mấc bệnh thiếu hụt cnzym 5ctrcductasc týp 2 xác định với các đặc diêm lâm sàng như dương vật nhò. dị tật
lỗ niệu đạo thấp, nìr hóa và cận lâm sàng với kết qua sàng lọc định lượng
steroid niệu với tý lệ 5a-THF/THF thấp và xét nghiệm karyotype 46.XY.

-

Mầu chứng: mẫu máu cua tré bính thường, khơng mẳc các bệnh roi loạn phát
trién giới tính.

2.2.

Dịa diêm và thời gian nghiên cứu

❖ Dịa điểm:

Tầng 5 khoa Kỳ thuật Y học. Trường Dại học Y I là Nội.

TM/ V*:


25

- Phòng xét nghiệm sinh học phân tư - Trung tám xét nghiệm Chemedic.
❖ Thời gian: Từ tháng 9/2020 đến tháng 5/2021.

2.3.

Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp dược sư dụng trong nghiên cửu này là phương pháp mị ta cãt
ngang.
2.4.

Quỵ trình nghiên cứu

2.5.

Dụng cụ. trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu

2.5.

/. Dụng cụ, trung thiết bị

• Tu lạnh thưởng và tủ âm sâu
-

Máy ly tâm

-

Máyvotex

-

Õng Eppcndoft loại 0.5 ml; 1.0 ml vả 1.5 ml

-

Pipct định mức và đầu côn các loại 500pl. 200pl. lOOpl. 20pl. lOpl

-

Cân diện tứ

-

Óng đong, cốc mo

TM/ V*: