Hoàn thiện kỹ thuật lai so sánh hệ gen aCGH trong chẩn đoán một số bất thường nhiễm sắc thể

BỢ GIÁO DỤC VÀ DÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỞNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

ĐINH THỊ MỸ LINH

HOÀN THIỆN KỸ THUẬT LAI so SÁNH
HỆ GEN aCGH TRONG CHÂN ĐOÁN
MỘT SỐ BÁT THƯỜNG NHIẺM SÁC THÉ
Ngành đào tạo : Bác sỳ đa khoa Mà số

:D720101

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP BÁC SỸ Y KHOA
KHÓA 2015-2021
Người hướng dẫn khoa học:
TS.BS. Vũ Thị Hả

HÀ NỘI-2021
LỜI CÁM ƠN

41

Với tấm lơng cùa một người học trị. bảng tắt cá sự kinh trọng và biết ơn
sáu sẩc. em xin bày tỏ lõng cam ơn tới TS.BS. Vũ Thị Hà - Giáng viên Bộ món Y
sinh học - Di truyền - Trường Đại hục Y Hà Nội đà tận lình giúp dờ. hướng dẫn.
-W-- -ÍM Qỉ ugc

tạo điều kiện tốt nhất cho em

V Hl trong quả trinh học tập và nghiên cứu đê hoãn


thành khỏa luận này.
Em cũng xin được giri lởi cám ơn tới càc thầy, cị Bộ mơn Y sinh học Di
truyền Trưởng Đại học Y Hà Nội dà giúp đờ. chi bao tận tinh; các bác sỹ và anh
chị nội trú tại Trung tàm tư vấn di truyền Bệnh viện Dại học Y Hà Nội dã tạo
điều kiện thuận lợi cho em thu thập số liệu trong thời gian hoán thảnh khóa luụn.
Em xin chân thành cám ơn Ban Giám hiệu, phòng Đảo tạo Dại học. các
phòng ban chức nâng cùa Trường Dại học Y Hà Nội đã giúp dờ. tạo điều kiện
thuận lợi cho em trong quá trinh nghiên cứu. học tập dê có thê hồn thành khóa
luận.
Vã cuối cũng, em xin dành những lời yêu thương, cam ơn đen gia dính, bạn
bỏ đã ln ở bên khích lộ. động viên, ung hộ đe em ưong suốt thời gian thực hiện
klỉõa luận này.
Hà Nội. ngày 26 thảng 5 năm 2021
Sinh viên

Đinh Thị Mỹ Lỉnh
LỜI CAM DOAN

Tôi là Đinh Thị Mỳ Linh, sinh viên ¥6 chuyên ngành Bác sỹ đa khoa, xin
cam đoan khóa luận nãy hồn tồn do tơi thực hiện. Các sổ liệu và kết quã
nghiên cứu hoàn tồn trung thực và khách quan, chưa từng được cịng bố ờ bẩt
cứ còng trinh nghiên cứu nào khác.
Hà Nội. ngày 26 thăng 5 nảtn 2021

-ÍM Qỉ ugc V
Hl

Sinh viên

Dinh Th| Mỹ Lỉnh

-ÍM Qỉ ugc V
Hl


CHỦ VIÉT TÁT

aCGH

array Comparative Genomic Hybridization

BAC

Bacterial Artificial Chromosome

BTBS

Bất thường bấm sinh

cDNA

complementary DN A

CNP

Copy Number Polymorphism

CNV

Copy Number Variant

DMA

Deoxyribonucleic Acid

FISH

Fluorescence In Situ Hybridization

HI

Haploinsufficient

MFISH

Multicolor FISH

NST

Nhiễm sac the

MLPA

Multiplex Ligation dependent Probe Amplification

PTTT

Phát triển tàm thằn

PTVĐ

Phát triền vận động

QF-PCR

Quantitive Fluorescence Polimerase Chain Reaction

SKY

Spectral karyotyping

LTD

vưs

Uniparental disomy

Variants of uncertain significance

TÀI LlịX' THAM KHÁO

MỤC LỤC

DANH .MỤC BANG

Bang I. I. So sánh độ bao phu bộ gcn vả độ phân giãi cua một sổ kỹ thuật phát

r-u -ÍM Qỉ ugc V

Hl


DANH MỤC HÌNH

r-u -ÍM Qỉ ugc V

Hl


HOÀN THIỆN KỶ THUẬT LAI so SÁNH IIẸ GEN aCGII TRONG
CHÁN ĐỐN MỘT SĨ BÁT THƯỜNG NHIÊM SÁC THÈ

TĨM TÁT

Hiện nay. các kỳ thuật di truyền dà đạt dược nhùng tiền bộ mới. đặc biệt
như kỳ thuật lai so sảnh hộ gen aCGH với độ phản giai cao trong phân tích bắt
thưởng vật chất di truyền ờ mức dộ tế bào phân tư. Kỳ thuật này khá phô biến
trẽn thề giới nhưng hiện cỏn khã mới mé ờ Việt Nam.
Mục tiêu: hoàn thiện kỳ thuật lai so sánh hệ gen trong phản tích bất thường
nhiêm sẳc the vả mỏ ta một sổ bất thường NST phát hiện đưực bang kỹ thuật lai
so sánh hệ gen.
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Mô tá cat ngang trên 24 mầu máu
vã 24 mầu dịch ối dược thực hiyn kỹ thuật aCGH tại Bộ môn Y si nil học Di
truyền. Trường Đại học Y Hà Nội.
Kct quã nghiên cửu: Tất cà cãc mầu đều du tiêu chn dê phân tích kết qua
vói ty lệ phát hiện các bắt thường vật chất di truyền NST lên tởi 292%.

Kct luận: Hồn thiện thảnh cịng quy trinh kỳ thuật lai so sánh hộ gen với
nhiều bước thực hiện, vã sau mỏi bước đều có phương pháp kiêm chứng dam
baơ quy trinh được thực hiện thành công, chinh xác. phát hiện bất thường NST
với ty lệ cao hơn với kỳ' thuật nhiễm sắc thè dồ thông thường
Từ khóa: aCGH. lai so sánh hộ gen. bất thường nhỉễni sắc thê. chân đoán
trước sinh, nhiễm sẳc thế đồ.


7

Đ/\T VÁN ĐÈ

Bất thường nhiễm sắc thê (NST) là nhùng rối loạn về cắu trúc hoặc sổ
lượng cùa một hay nhiều NST có the xay ra trên NST thường hay NST giới tinh
hoặc ca hai. Nhiều bất thường NST đe lại hậu quã nặng ne như sấy thai, thai lưu
hay lư vong sơ sinh hoặc gày ra các bệnh lý đi truyền, dặc biệt là nguyên nhân
gây ra bất thường bẩm sinh (BTBS) [1]. Tuy nhiên cùng cớ những bat thường
NST không biêu hiện triệu chứng lảm sàng nhưng lại truyền cho the hộ sau NST
bất thường đõ và có biểu hiện kiều hình ờ thế hệ sau.
Đa sổ cãc BTBS hiện nay đều chưa có phương pháp điều ưị dặc hiệu mang
lại hiộu qua cao. Do dó. việc phát then các phương pháp thảm dỏ chắn đoán
trước sinh hay chân dỗn các BTBS có liên quan đến rối loạn vật chất di truyền
lã triền vọng mới dang dược tích cực dầu tư nghiên cửu phát triển nhằm giâm
thiêu ti lệ mắc bệnh, điều trị sớm và lư vần hôn nhân gia đỉnh hiệu quá. him chề
ti lệ bộnh di truyền cho các thế hệ sau.
Theo Tô chức Y tế The giới, ưỏc tinh cỏ khoáng 6% ưc em sinh ra với
BTBS trẽn toàn the giới mồi nám. dần tới hàng trâm nghìn ca tư vong liên quan
[2]. Tại Việt Nam. theo thòng tin từ Tống cục Dãn số - Ke hoạch hỏa gia dinh,
mỏi nãm có khống hơn 40000 trê bị dị tật bầm sinh, chiếm 1.5 2% sỗ trè mới
sinh: số trê tứ vong do bầt thưởng bầm sinh khoang hơn 1700 trẻ [3]. Các bât

thường bàm sinh lã nguyên nhàn quan ưọng dẫn dển tư vong ớ ưe sơ sinh và tre
nho. bệnh màn tính và tản tật: cỏ nhùng tác dộng dáng kẽ tới mồi cá nhân, gia
dính, hệ thống chăm sóc sức khoe và tồn xã hội.
.MỘI sổ nguyên nhân di truyền cùa BTBS là do cảc biền thế sỗ lượng ban
sao (CNV) dược xác dinh bang phương pháp lai so sánh hệ gen (aCGH). Giã trị
sàng lọc cua aCGH như xét nghiệm đầu tay ờ tre em vái nhiều BTBS dà dưực
nhiều nghiên cửu vã đổng thuận thông qua [4] cùng như lã test dũng trong chân
đoán trước sinh. Do kha năng phát hiện bất thưởng ưên tồn bộ bộ gcn nên

-ÍM Qỉ ugc V
Hl


88

aCGH đã tạo ra một cuộc cách mạng ưong chắn đốn di truyền lâm sàng. Kỳ
thuật aCGH khơng bị giới hạn ờ một gen hoặc locus tại một thời diêm, đặc biệt
cỏ già trị trong trưởng họp pliát hiện rối loạn hiếm gập. Thêm vào dó. aCGI 1
đặc hiệu cũng rắt cỏ ích trong nghiên cứu cảc vùng gen cụ thê. Neu một vũng
gen hụp dược kiêm tra. aCGH có độ phân giai cực cao tới vài trảm cập base có
thê cho phép phát hiện cãc biến thè mã các phương pháp phản tích gen kỉiác sần
cơ có the bỏ sót. Sự ứng dụng đa dạng cua kỳ thuật aCGH là rất lớn vã cỏ thê có
nhiều img dụng cùa aCGH dược nghiên cứu trong tưcmg lai [5].
ơ Việt Nam. áp dụng kỳ thuật aCGH cho chấn đoán di truyền cơn khá mới
me. kỳ thuật địi hịi thực hiện quỵ trinh phức lụp. nghiêm ngặt; dịi hói nhản lực
được đào lạo chuyên sâu trong phản tích, giai thích và lư vắn kct quá di truyền.
Củng với việc triẽn khai ãp dụng các kỹ thuật mới để nâng cao hiệu quà chân
doán bất thường di truyền, chúng tỏi thực hiện dề tải: “lioàn thiện kỹ thuật lai so
sánh hệ gen (aCGH) trong chấn đoán một sổ bắt thường nhiêm sảc the*’ nhầm
các mục tiêu sau:

7. Hoàn thiện kỳ thuật lai so sánh hệ gen (aCGH) trong phán tích bất
thường NST.

2.
Mỏ tã
một
bấthệ
thường
NST phát hiện được bằng kỳ
thuật
Ỉỉìi
sosố
sánh
gen (aCGH).

-■c -ÍM
-ÍM Qỉ
Qỉ ugc
ugc V
V

Hl Hl


CHƯƠNG 1
TƠNG QL AN

1.1.

Bất thưịìig bẩm sinh

1.1.1.

Dịnh nghĩa

Theo định nghía cùa Tổ chức Y *tế Thể giới WHO. bắt thưởng bấm sinh lã
các bất thưởng VC cấu trúc hoặc chức nâng xay ra trước sinh. có thê được phát
hiện trước sinh, ngay sau sinh hoặc ớ giai đoạn muộn him [6].
1.12. Nguyên nhàn gày ra bất thường bẩm sinh
Cân nguyên cua bất thường bâm sinh hiện vản chưa rò ràng nhưng được
cho là bệnh đa cân nguyên, bao gồm:
-

Do di truyền: chiêm khống lơ-30%. Ngun nhãn di truyền dơng vai trò
quan trọng trong nhiều bất thưởng bấm sinh. Bắt thường bâm sinh cô thê
là hậu qua cua dột biền gen hoặc do di truyền gen mà hóa bầt thường. Hịn
nhản cận huyết tâng ti lộ mắc các bầt thường bam sinh di truyền hiốn gập
vã tâng gần gấp đôi ti lộ tư vong ỡ trẻ sơ sinh vã tre nho. các khuyết tật tri
tuệ vã càc khuyết tụt khác. Một số dản tộc (người Do Thãi Ashkenazi
hoộc người Phần Lan) cỏ ti lộ tương dối cao các dột biến gen hiếm gập
trong bệnh xơ nang vã Haemophiliac.

-

Do mỏi trường: chiếm khoang 5-10%. Việc mọ tiếp xúc với một sơ loại
thuồc trừ sâu vá hóa chất khác, cùng như một sỗ loụi thuốc nhất định.
rượu, thuốc lá vả bửc xạ trong thời kì có thai có thê làm lủng nguy cư thai
nhi hoặc trỏ sơ sinh bị anh hường bin cãc bất thường bầm sinh. Làm việc
hoặc sống gần các bài đồ rác. hầm mo hoặc ló luyện cùng là một yếu tố
nguy cơ. đặc biệt khi người mẹ tiếp xúc với các yếu tố nguy cơ môi

trưởng kliãc hoặc thiếu dinh dường.

-

Do nhiễm tiling: Các bệnh nhi cm trùng thời ki tliai san như giang mai vã
rubella lã nguyên nhàn dáng kẽ gãy ra bất thường bẩm sinh ở các nước cõ


thu nhập thấp và trung binh.
-

Do di truyền đa nhân tồ (do sự tác động qua lại cua yếu tố di truyền vã
môi trường): chiếm 20-35%.

-

Nguyên nhân chưa rõ: chiêm khoang 30-45% [6]. [7],
BTBS gáy ra bởi nhiều nguyên nhân, có khi đơn độc cõ klũ phối hợp với

nhau, việc xác định chính xác cân nguyên gãy BTBS hiện lả thãch thức cho ncn
y học hiện dại. Trong cảc nguyên nhản trên. BTBS gảy ra bời yếu tổ mỏi trường
và nhiêm trùng cỏ thê phòng tránh dược bằng cách châm sóc tốt cho phụ nừ
trong độ tuổi sinh de, dặc biệt lã dồi tượng phụ nừ cỏ thai; khám tiền hôn nhân
và dicu trị nhiêm trũng sớm kịp thời... BTBS do nguyên nhãn bất thường vật chầt
di truyền cỏn gày khó khản trong cơng tác chan đốn. Sự phát triển cua y sinh
học di truyền giúp cho chấn đoán sớm BTBS ngay từ thịi kì bào thai vã đưa ra
dược các lư vấn di truyền hiệu qua nhầm giám bót ti lộ mắc. diều trị sớm BTBS.
1.Ỉ3. Dịch tề but thường bum sình
Theo WHO. BTBS ánh hưởng đền 1 ưong số 33 tre sơ sinh và dần đến
khoang 3.2 triệu khuyết tật trén toàn the giới (s]. Theo nghiên cửu gánh nặng

bệnh tật toàn cầu (GBD). BTBS lã nguyên nhàn gày ra 510400 ca tư vong trài
toàn the giỏi, chiêm 1% tỏng số ca tư vong (6% sổ ca tư vong ờ tre sơ sinh và sau
sơ sinh. 2.5% sổ ca tử vong ờ trẻ từ 1-4 tuỏi). đứng thử 23 ưong tẩt ca càc
nguyên nhãn gày tư vong [9].
Các cuộc diều tra dịch tề học về các BTBS ơ nhiều nơi trẽn thế giói với cãc
yếu tồ mơi trưởng, tinh trạng kinh tế xà hội. chúng tộc khác nhau cỏ kha năng
cung cấp thông tin quan trọng về ti lệ lưu hành, mô hỉnh và các yếu tố nguy cơ
cùa BTBS ờ các khu vực khác nhau. Theo Trung tâm kiếm sốt vã phịng ngừa
dịch bệnh Hoa kỳ (CDC). tại Mỳ B I BS dược ghi nhận khoảng 2- 5% tỏng số tré
sinh ra sống [10]. Ớ các nước Trung Dóng, nơi hơn nhân cận huyết khả phố biến,
ti lộ mắc cãc di tật bam sinh lớn được báo cáo là 2-2.5%. ti lệ cao nhất là 7%


được ghi nhận ưong các cuộc hỏn nhãn cận huyết, ó châu Phi. một số nghiên cứu
hiếm hoi về dị tật bấm sinh đà báo cáo ti lệ mác bệnh lần lượt lã 1.5% vã 2.5% ở
Ai Cập và Dông Phi (Kenya và Uganda) [11], Ti lộ BTBS ờ các nước châu Á dà
được chứng minh là khác nhau với ti lộ BTBS dược bão cảo ờ Ân Độ là 2.5% và
ờ Trung Quốc lã 1.3% [12]. [13]. Tại khu vực Dơng Nam Ã. BTBS là ngun
nhản gáy ra khống 90000 ca tứ x ong ờ tre sơ sinh mỏi nàm [S].
Theo thõng tin từ Tông cục Dàn số - Ke hoạch hóa gia dính, mồi nám Việt
Nam có khoảng him 40000 trẻ bị dị tật bấm sinh, chiếm 1.5

2% sổ tre

mới sinh; sổ tre tứ vong do bất thường bấm sinh khoáng hơn 1700 tre [2].
Theo thống kẽ cua WHO. tại Việt Nani ti lộ tứ vong do STBS theo nguyên
nhân ư tre sơ sinh lã 22.67%i (đứng thứ 2 sau de non); ỡ ưè sau SƯ sinh lá
21.84% (dứng thử nhẩt); ớ tre dưới 5 tuôi là 22.26% (dứng thứ 2 sau de non)
( Hình 1.1.1.2.1.3) [14]. [15], [16].

Hilt It 1.1. Ti lệ các nguyên nltán tứ vong ứ trê sư sinh tịii Việt Nam
(Nguồn: Tô chức Y t Th gii)
ntauMii
CMM

c

ãt

VrôA
ãã U**a*M<
oằ* V':ôãããã<


• Đsr*o*« Mann
••1»•■*><•«M »-v»ct
•Mm

Hình 1.2. Ti lệ các ngun Itltán từ vong ừ trê sau sư sinh tại tĩột Nam
(Nguồn: T chc Y t th gii)

w*

I *** *ãôằãã C4VM
ããằ >M*r>'ằ *M ằãô WWM

Hỡnh 1.3. Til cỏc nguyờn It hàn từ vong ờ trê dưới 5 tuổi tụi ỉ'iỹt Nam
(Nguồn: Tố chức Y tếthềgiởỳ
1.1.4. Một số bẩt thường bấm sinh

Chậm phảt triển tâm thằn (PTTT). chậm pỉiãt tricn vận động (PTVĐ) vã
cãc bất thường hình thái là các BTBS có căn nguyên di truyền khả cao. Tùy vảo
phương pháp phát hiện bất thường NST và đối tượng nghiên cứu mà cho tý lệ
khác nhau. Một nghiên củu trẽn 633 bệnh nhi với chậm PTTT vãhoậc chậm
PTVĐ. bang phương pháp aCGH dà phát hiện 20.06% các trường họp mang
CNV gảy bệnh [17]. Trong khi dó. bằng phương pháp lập kaiyotype trẽn 395
bệnh nhi với chậm phát triển và/hoặc bảt thường hĩnh thái có bao gồm cá hội
chứng Down (tỷ lệ phát hiện bất thường NST trisomy 21 rất cao) cho kết qua


kaiyotype bệnh lý là 61.1% nhưng loại ưừ các trường hợp cơ trisomy NST số 21
thi tỳ lộ này cịn 7.4% [1 s].
Để phát hiện vã chân đoán một tré có bất thưởng pliãt triển thưởng qua
nhiều bước. Bước đầu tiên là giám sàt (surxvil lance): thu thập vã tống hợp thõng
tin VC tiến trinh phát ưiên cua tre dựa ưẽn tiền sư. quan sãt cua cha mẹ hoặc
người châm sóc khác đống thời thâm khám định kỳ theo chiều dọc và liên tục
theo thời gian. Tiếp theo là sàng lọc băng nhùng test tiêu chuẩn ngấn, thường lã
những tiêu chuẩn đánh giá các mốc đạt dược theo từng thòi ki phát triển cua tre.
Cuổi củng là quá trinh chấn đoán, ở giai đoạn này cỏ thề thực hiện một số xét
nghiệm thích hợp. xét nghiệm về di truyền học hoậc chuyền hỏa. chần đoản hình
anh học hệ thần kinh. kiêm tra tám thần kinh cũng như tham vấn chuyên gia
[ 19).
Trong khi đó, dê phát hiện các các BTBS tnrớc sinh chu yêu thòng qua cãc
xét nghiệm cận làm sàng. Siêu âm dược coi như phương pháp không xàm lấn
hiệu quá để sàng lọc BTBS, đặc biệt lả các bất thưởng về cấu trúc. Nhưng các xẽt
nghiệm xâm lân mới dược coi là tiêu chuân vàng trong chân doán trước sinh
[20]. Sau klũ có ket qua xét nghiệm, nhiệm vụ cưa tư vắn di tmyền lã vò củng
quan trọng. Tư vấn nhăm giúp các cặp vợ chồng lụa chọn quyết định dứng đắn
về kết cục thai ki bằng cách cung cấp thông tin đầy đu. chi tiết VC biêu hiện lảm
sàng vã tiên lượng cua cãc bât thường phát hiện được, thường là các bất thường

về NST: (1) sự biển dơi kiêu gen - kiêu hình rất đa dạng thay dôi phụ thuộc vào
mức dộ khiếm khuyết di truyền; (2) sự thay dôi VC kiểu hĩnh sự tiền triển cua
một trường họp cỏ thê khác nhau rất nhiều, ngay ca giữa những người củng
mang một bất thường NST [21 ].
1.2. Nhiễm sắc thề và bất thường nhiêm sắc the
1.2J. Dịnh nghĩa
Nhiễm sẳc thê (NST) lã cẩu trúc dạng sợi năm trong nhân cua tế bão dộng


vật và thực vật. Mồi nhiễm sắc thê dược cấu tạo từ protein và 1 pliân tư acid
deoxyribonucleic (DNA).

OnXTMM CrromaM

Hình 1.4. Cun trúc nhiễm sắc thế
Đe một sinh vật phát triến và hoạt động bính thường, các tế bào phiri liên
tục phân chia đê tạo ra các tế bào mới đê thay thế cãc te bào giã. tế bào hư hỏng.
Trong quá ninh phàn chia tế bào. điều cần thiết lả DXA vằn còn nguyên vẹn vã
phân chia đồng đều giữa các tế bào. Nhiễm sắc the lã một phần quan trọng trong
quá trinh dam bao DMA được sao chép và phàn phối chính xác trong phần lớn
các lan phản chia te bảo. Tuy nhiên sai lầm vẫn xay ra trong nhùng trường hợp
hiểm hoi [22]. [23].
Õ người bính thường có 46 NST. bao gồm 22 cập NST thường và 2 NST
giới tính , đối với nam lả XY. nữ là XX.
1.2.2. Bat thưừng nhiễm sue thè liên quan ílển but thường bum sinh
Có rắt nhiêu dạng bắt thường nhiễm sắc the nhưng có thè chia thành 2 loại
chinh sau:
- Bất thường số lượng NST: thưởng xảy ra do sự thắt bại trong phản chia
NST. dần tói tế bào thiếu hoặc thửa NST. Các giao tứ với những bất thường này

có thê dẫn tới tinh trạng hội chứng Down (47 NST). hội chứng Turner (45
NST). Cảc dạng phó biến cua rối loạn bất thưởng NST là: thê tam bội. thê tam
nhiễm, the đưn bội. thê kham.
-

Bất thường cầu trúc NST:
+ Mẩt đoạn: hội chứng Wolf-Hirschhorn gây ra bời mất đoạn tTẻn nhánh

ngẳnNST4
+ Lặp đoạn: bệnh Charcot-Marie-Tooth cô the do sự sao chép gen mà hóa
protein ngoại vi myelin 22 (PNIP 22) trên NST 17
+ Chuyên đoạn: trong chuyển đoạn Robertsonian, tồn bộ 1 NST gan vão vị
trí tâm động cua NST khác, điều nãy chi xây ra ỞNST 13, 14. 15. 21 và 22
•+■ Dao đoạn: xày ra khi 1 đoạn NST bị dirt gày, dao ngược vã gấn lại, do
dó vật chất di tniỵềnbi dão ngược [24], [25].
1.3. Chi định xét nghiệm phát hiện bất thường NST
Các kỹ thuật phát hiện bẩt thường NST thường được chi định trong một vài
trường hựp sau:
-

Sảng lọc sơ sinh.
-Chân đoản trước sinh: loại xẽt nghiệm này dược chi dịnh cho cãc cập vợ

chổng có nguy cơ sinh con bị rối loạn di trựycn cao. cỏ the lấy mầu mô de xét
nghiệm thõng qua chục ối hoặc sinh thiết gai rau.
-

Chân đoản người mang gen bệnh: xẽt nghiệm giúp cãc cập vợ chồng phát
hiện minh có maqg gen bệnh khơng và nguy cơ di truyền cho the hộ sau

như di truyền alen lận nong bệnh xơ nang, thiểu máu hồng cầu hình liềm,
bệnh Tay-Sachs... Các xét nghiệm này thưởng dược chi định cho nhừng cá
nhân cỏ tiền sừ gia dính mắc các bệnh di truyền hoặc những người dãn tộc
thiêu sổ có nguy cơ cao mắc bệnh lý di truyền cụ thê. Neu cá bố mợ đều
được kiêm tra. xẽt nghiộm cỏ kha nâng cung cấp thông till nguy co sinh


con mẩc bệnh di truycn cua một cập vợ chồng.
-Chân đốn và theo dơi tiên lượng đáp ứng điều trị một số bệnh di truyền.
- Dụ đôn khuynh luróng cá thể cỏ the mắc bệnh trước khi bất đầu cõ triệu
chứng. Các xẽt nghiệm này đặc biệt có ích đổi với nhùng cá nhàn cỏ tiền sử gia
dính về một bệnh cụ thể và bệnh đó có sần biện pháp can thiệp đế ngăn chặn sự
khtri phát cua bộnh hoặc giam mức độ trầm trọng cua bệnh. Xét nghiệm bất
thưởng NST cỏ thê xác dịnh dược cảc bất thưởng lãm tảng nguy cơ mắc một
bệnh cụ thê. vi dụ như ung thư [26].
1.4. Các kỷ thuật phát hiện hất thường NST
1.4.1. Kỹ th uột lập karyotype
Karyotype là hĩnh anh thê hiện số lượng và hĩnh dâng cùa nhiêm sầc thê
trong nhản tế bảo. Trong karyotype, các nhiễm sấc the dược sầp xểp và dành số
thử tự theo kích thước, từ lớn nhất den nho nhất.
Quy ttình lập karyotype: các tề bào dược nuôi cấy và thu dược nhiễm sắc
thế tại kỳ giữa (metaphase) cũa quã ninh plìản bão. sau đõ nhiễm săc thê sè dược
nhuộm vói hóa chất thích hợp đẻ quan sát [27].
Một sổ kỳ thuật nhuộm bàng đê lập karyotype: bàng G. bàng R. bàng c.
bàng Q. bâng T và nhuộm bạc. trong đó kỹ thuật nhuộm băng G dtrợc sư dụng
phô biến.
Kỳ thuật
nhuộm
bảngxũng
G:

nhuộm
Giemsa
sau
quá
trinh
thúy
phản
dái
bâng
nhiễm
sắctối;
the
bằng
tối
trypsin.
thưởng
Nỏlà
tạo
vùng
ra
dị
một
nhiêm
loạt
sầc.
các
giàu
AT. sáng
Vùng
.sáng

thường
lã
xủng
nguyên
nhièm
sấc.


17

giàu GC. Phương pháp này thướng tạo ra 300-4ÍM) bàng trong bộ NST người
bỉnh thường [28].
Kỳ thuật lập karyotype có ưu điểm là quy trinh đơn gián, được sir dụng
rộng rãi vớị hệ thống danh pháp di truyền tế bão quốc tc (international system of
cytogenetic nomenclature (ISCN)) [29]. Them vảo đó kỳ thuật cho phép đánh giá
cùng lúc tốn bộ bộ NST. xác định dược các dột biển sổ lining vã cẳu trúc cua
NST. nỏ cõ thê xác định dược dột bicn NST không cân bang (thừa, thiếu NST.
the tam nhiễm...) và dột biến NST càn bang (đao đoạn, chuyên đoạn...) trong khi
các phương pháp phân tích NST khác gặp khó khàn trong phát hiện cảc đột
biềnNST càn bằng này [30].
Bẽn cạnh những ưu diem trên, lập karyotype cũng tổn tại nhiều giới hạn.
Do phán tích karyotype ơ kỳ giừa cua quá trinh phân bào khi nuôi cấy tế bào nên
kết qua thưởng khơng có Slim lum 7-14 ngày sau khi lấy mầu [31]. Quy trinh
thực hiện có nhiều bước phái làm thu cóng, khơng cõ chi sỗ kiêm sốt chất lượng
nên kết qua phụ thuộc rắt nhiều vào kỳ nâng cua người làm tiêu ban vã người
đọc kết quà. giâm tinh khách quan cua xét nghiệm [30]. Độ phân giai thấp, thông
thường cho phép phát hiện bất thường NST trong khống 5-10Mb (Mb:
megabase. ÍMb=l.000.000 bases), dơi khi có thê phát hiện sự bất thường khoang
3Mb phụ thuộc vào vùng gen liên quan và/hoặc diều kiện xét nghiệm. Các
trưởng họp bất thường nhiễm sắc the nho hơn kích thước ưẽn sẽ khơng đưuọc

phát hiện gãy bó sót chấn đốn [29]. Không thè phát hiện ra hội chừng di truyền
uniparental disomy (ƯPD) [30].
1.42. Kỷ tliuột lai huỳnh quang tại chồ (FISH: Fluorescence In Situ
Hybridization)
Kỳ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) lã một kỳ thuật di truyền tế bảo

-■c -ÍM Qỉ ugc V

Hl


18

phân tử sư dụng các đoạn dô (probes) huỳnh quang liên kết bô sung với một trinh
tụ nucleic acid nhất định cùa NST.

Hình 1.5. Sơ dồ quy trinh thực hiện FISH
Có 3 loại đẩu dị dược sử dụng rộng rài trong các phịng thí nghiệm di tnyền
lãm sảng, mỗi loại có một ứng dựng khác nhau, các loại đầu dõ nãy cùng có thê
sư dụng kết họp trong khi xác định các bất thưởng NST phức tạp:
-

Đầu dị tồn bộ NST (Wholechromosome painting - WCP): giãi mà các
bầt thường di truyền tế bào. dùng đề lai với toàn bộ NST qua tám

-

Đầu dô định lượng tàm động (Centromeric enumeration probes - CEPs):
lai với các trinh lự lặp lại cua vệ tinh alpha (hoặc beta) trong câc vùng tâm
dộng cụ thê cua mồi NST vã dirực dùng de dem NST.

-

Đầu dò xãc định locus dặc liiộu (Locus-specific identifier LSI probes):
xác định các bắt thường NST nhắt dịnh [27].

So nõ
với
kỹdó.
thuật
lập
karyotype.
FISH
có
một
ưu
diem
dâng
ke
là
clũa.
cõ
do
thê
dó
dược
diều
ứng
kiện
dụng

thuận
trong
lợi
cãc
cho
tế
bào
việc
khơng
khao
phân
sát
ưực
tiếp
Thêm
NST
vào
trong
mầu
các
xét
chề
nghiệm
phẩm
tề thê
cõ
bão
học
lã
NST

vã
cãc
ở
kỳ
phần
giữa
mị.
hoặc
trong
nhân
ờtạo

tế bào gian kỳ nên có thê khơng tổn thời gian ni cấy tể bào và cõ thê thu dược
kết quá sớm trong vơng 24-4S giờ. Do các đầu dị DNA dưực gắn huỳnh quang ờ
kích thước 100 800 Kb (1Kb = 1000 bases) nén FISH cỏ dộ phán giãi cao vã cho
phép sang lọc nhanh các bầi thường số lượng NST. FISH cịn có kha năng xác
dịnli sự tồn tại cua cảc bất thường nhiễm sac thể nho hoặc ân ỡ nhùng bệnh nhàn
cỏ dịng võ tính nho (minor clones). Một lượng lớn tề bào cõ thế dược đánh giá

-■c -ÍM Qỉ ugc V

Hl


19

với clù phi phòng thi nghiệm tương dối rc hon so với kỹ thuật karyotype.
Tuy nhiên, hạn chế chính cúa FISH là nỏ chi phát hiện càc sai lệch về cấu
tníc hoặc số lượng nhiễm sẩc thê cụ thê tại vị tri cụ thê. vi vậy nhùng bất thường
nhiềm sắc thê liên quan đến các vùng khác có thè bị bo qua. khơng có sẳn doạn

dơ cho tất ca cãc NST. Một sổ mất doạn nho vả không thường gập cỏ thế bị bị
sót. phụ thuộc vào độ dặc hiệu cua đoạn dò huỳnh quang. FISH hạn chề trong
phát hiện một số mẳt đoạn nhó trong một số hội chứng di truyền như hội chúng
AngelmaiL hộĩ chứng Prader-Willi, hội chứng Sotos, hội chứng SmithMagenis... Không phát hiện dược các đột biến nho. đao đoạn NST, hội chúng di
truyền uniparental disomy.Do quy trình kỳ thuật nên FISH cơn gãy ra sự chồng
lắp tín hiệu trên vi trường, gãy khơ khán trong nhận định kết qua và nhiều [27],
[29]. [30], [31]. [32]. [33]. [34],
Dê giảm bót sự chồng lấp tin hiệu, Multicolor FISH (MFISH) vã Spectral
karyotyping (SKY). hai cõng nghộ huỳnh quang da sẳc dà được phát triên. lã
phương pháp tạo karyotype phô sứ dụng thuốc nhuộm huỳnh quang liên kết với
càc vủng cụ thê cua nhi cm sắc the. Bang cách sứ dụng một loạt các đầu dỏ đặc
hiệu với các lượng thuốc nhuộm khác nhau, các cặp nhiễm sắc thê khác nhau thê
hiện các đậc diêm phố riêng biệt. Các kliàc biệt nhẹ về máu sầc. không thê phát
hiện bang mát người, dược phãt hiện bởi một chương trinh máy tính vã sau dó
thay dơi lại màu săc dế dè phân biệt từng cặp nhiễm sấc thê. Ket qua lã một hĩnh
anh kỳ thuật sổ chứ không phai phim với đầy du màu sắc. Việc ghép cập cũa các
nhiẻm sẩc thê dem gian lum ví các cặp tương dồng có màu giống nhau vả các
hiện tượng sai lệch vả trao dồi chéo NST de nhận biết hơn. Ngoài ra. karyotype
phổ đà dược sư dụng đế phát hiện các chuyên vị khơng thê nhận ra bang phán
tích karyotype truyền thống.
1.43. Kỹ thuật định lượng huỳnh quang PCR (QF-PCR: Quantitative
Fluorescence PCR)

-■c -ÍM Qỉ ugc V

Hl


20

Kỳ thuật QF-PCR sư dụng đoạn mồi có gắn huỳnh quang để khuếch đại các
\iing STR (short tandem repeat sequences: các trình tự lặp tiếp nối ngẩn). Các
vùng S I R được khuếch đại sè tạo ra các san phàm PCR huỳnh quang khác nhau
và dược dịnh lượng bang điện di mao quan ưên hộ thông máy sequencing ABI.
Kct qua sè hiển thị bảng các dinh [35],
Một mầu lường bội bính thường có sự dóng góp cua hai ưong số các nhiễm
sãc thê được khao sãt. Hai alen cua một điểm dành dâu dộc hiệu cua nhiễm sắc
thê được phảt hiện dưới dạng hai đinh theo tỳ lệ 1:1 khi chất dãnh dắu là dị hợp
tư và lã một dinh khi chất đánh dấu là dỗng hợp tư (cô câc alen củng chiều dài).
Việc pint hiện một alen bỗ sung dưới (king ba đinh theo ty lệ 1:1:1 hoặc hai đinh
theo tỷ lộ 2:1/1:2 cho thấy sụ hiện diện cua một bàn sao đảnh dấu bồ sung có the
tương ứng với một nhiẻm sẳc the bó sung, như trong trường hợp cua tam nhiễm
Đối tượng lã dồng họp tư hoục đơn tính dối với một diêm đánh dắu cụ thê sè chi
hiên thị một dinh (hình 1.6) [36].

-■c -ÍM Qỉ ugc V

Hl


21

Hìnli 1.6. Biếu thị kết quả của kỹ thuật QF-PCR
Kỹ thuật QF-PCR mang lụi ưu điếm phát hiện cãc rổi loụn số lượng nhiễm
sắc thê chính (NST 13. 18, 21. X và Y) trong vãi giờ sau khi thu thập cãc mẫu
(thường trỏng võng 48h). Dó tự dộng hóa quy trinh nên chó phép xét nghiệm số
lượng mẫu lớn với chi phí thấp.
Nhược diêm cùa kỳ thuật QF-PCR lã khơng phát hiện được các bất thường
so lượng cùa NST khác vã đột biến cấu trúc NST. một số trường hợp khám;
khơng cho phép đánh giá lồn bộ bộ NST [37].

ỉ. 4.4.
Probe
Amplification)
Kỹ th uột MLPA (Multiplex Ligation - dependent

-■c -ÍM Qỉ ugc V

Hl


22

Kỳ thuật Multiplex Ligation dependent Probe Amplification (MLPA) lã kỳ
thuật khuếch đại đầu dò da mồi dựa vào phan ửng nói là một biển thê cua phan
ửng PCR đa mồi (Multiplex Polymerase Chain Reaction) [38].
Nguyên lý kỳ thuật: MLPA dựa trẽn phan úng nổi cũa 2 nứa đoạn dô nhận
biết trình tự dặc hiệu đích. Phản ứng nối chi xay ra khi ca 2 nứa đoạn dò dirợc lai
đặc hiệu với trinh tự đích và chi những đoạn dị dược noi hỗn chinh mới được
khuếch dại dồng thịi trong phan ứng PCR. Bời vỉ các dâu dị chứa trình tự tận
giống hệt nhau, các sán phàm cùa phân úng nối có thê được khuểch đại dồng thời
với một đoạn mồi duy nhất. Một trong hai đoạn mồi trong phàn ứng PCR dược
đánh dấu huỳnh quang làm cho các san phàm khuếch dại có thế được nhìn thấy
trong q trình phân lách đoạn bang diện di mao quan. Mồi đoạn dò dược thiết
ke đê có một chiều dãi duy nhất và sự khác biệt tương đối VC chiều cao đinh
tương ứng với những thay đối cua sổ ban sao [39].
Với nguyên lý kỳ thuật như trẽn, kỹ thuật MLPA mang lại nhiều điểm mạnh
so với các phương pháp di trụyền phân tứ như nỏ có thê định lượng dược sơ ban
sao cua nhiều trinh tự gen lẽn tới 60 trinh tự đích trong một phan ứng. kỳ thuật
dẻ thực hiện, dịi hoi it thời gian de thực hành, cỏ the có dược kết qua nhanh
trong 24h. Vã kỹ thuật chi yêu cẩu thiết bị tiêu chuân có mật ờ hầu hết các phòng

tlũ nghiệm xét nghiệm DNA nên dễ dàng thực hiện ở hầu hết các khoa xét
nghiệm.
Nhược
diêm
chinh
cua
phương
pháp
MLPA
cùng
như
FISHcân
và
QFPCR
hiện
là
dưực
khơng
mức
cho
dộcác
phép
khâm
đánh
thắp,
giã
thê
tồn
tam
bộ

bội
hộ
nừgeiL
(female
khơng
phát
bảng
triploidies)
như
dao
vã
đoạn
vãbất
chuyển
thường
đoạn
số
[40].
lượng
ban
saoNST
1. Denaturation and Hybridization

HytxtdưMkXí teqiMncc (Mt)

HybtKUJtion Mqu««K« (right)

2. Ligation

-ÍM Qỉ ugc V

Hl


23

3. PCR with universal primers X and Y
• ■pocvntul amfiKc^taon ci

P«o6c*
X

Y

4. Fragment analysis

Hitt II 1.7. Các hước tiền hãrt It kỹ tit lull MLPA
1.5. Kỹ thuật array CGH
Kỹ thuật lai bộ gen Sỡ sành (CGH) là một phương pháp tiếp cận hiộu qua
de sàng lọc trên toàn bộ bộ gen dối với những thay dôi số lượng ban sao nhiễm
sắc thê (tàng sổ lượng NST/lập đoạn NST vả giam số lượng NST/mẩt đoạn
NST). CGII dã dược sir dụng đê nghiên cứu các bất thường về nhi cm sầc thê
xáy ra trong các khối u đặc và các khối u ác tính khác. Kỳ thuật CGH dựa trên
định lượng FISH hai màu vả khắc phục cảc vấn đề thất bại trong ni cẩy mị
cua FISH ví phương pháp này dựa ưèn việc sứ dụng DNA khối u dược chiết xuất
trục tiếp từ mò tươi hoặc lưu trừ. Ưu diêm chinh cua CGH so với các kỳ thuật
FISH tiêu chuẩn lã chi cần DNA từ các tế bào khối u để phân tích, tránh những
khó khản trong việc thu thập các NST ờ pha giữa trong qua trinh phân bào có
hỉnh thái và dộ phản giãi tốt đê phân lích. Do dó. CGH cỏ the được ãp dụng như
một kỳ thuật di truyền tế bão phân tư dê tim kiếm các bất thường tiềm ân trong
DNA bộ gen bang cách so sánh DNA đích (DNA cua bệnh nhản) với DNA chứng

từ một tinh nguyện xiên khoe mạnh hoặc kit thương mại cõ sần. Kỹ thuật này
cho phép sàng lọc bộ gen về sự mất cản bằng nhiễm NST mà không cằn biết
trước về cảc vùng gen quan tâm

-ÍM Qỉ ugc V
Hl


24

Mặc dù CGH đà làm tăng kha nàng xác địiứi các bất thường NST. kỳ thuật
nảy tốn thòi gian và khơng cài thiện dáng kê độ phàn giài (>3X'íb) so với lụp
karyotype bàng G thông thường. Gân dây hơn, sự phát triẽn cua phương pháp
aCGH liên quan đen việc thay thế các mục tiêu lai ghép - các NST ớ pha giữa,
với trình tự DNA đtrợc gần trên lam kính đà làm tảng độ phân giái đê phát hiện
những thay đồi số lượng bàn sao trong bộ gen người, và điều này dần đen thõng
tin chi tiết lum về bắt thưởng táng hay giam NST cùa bộ gen. Độ phàn giai cua
nó lẽn tởi 100 Kb đến 1Mb [27].
1.5.1. Nguyên Ịý và quy trinh kỹ thuật
Array
CGH
dựa
trên
tẩc
giồng
như
CGH
giữa
truyền
mầu

chứng
thống.
và
DNA
Trong
bộngun
ca quang
gen
hai
từ
kỳkhác
bệnh
thuật,
nhân
tồn
dược
bộpha
đánh
DNA
dấu
bộ
phán
gencảc
từ
cảc
biệt
đoạn
với
hai
dị

cho
mảu
lai
huỳnh
dồng
thời
cạnh
nhau
tranh
xà
với
dược
nhau
sứ
dụng
trẽn
như

đích axit nucleic. Trong CGH pha giừa truyền thống, đích là các DNA pha giừa
tham chiếu. Trong array CGH. các đích này có thê là oligonucleotide. cDNA
lioặc các đoạn gcn được nhàn bán trong nhiều vcctơ như plasmid, cosmíd. BAC
hoặc nhiễm sẳc thè nhãn tạo P1 [27]. [41].
Các hước cơ bàn trong kỳ thuật aCGH: Toàn bộ DNA bộ gen từ dổi chúng
hoặc tham chiếu (trái) và DNA bộ gen từ xét nghiệm hoặc bệnh nhãn (phai) dược
dành dấu phàn biệt với hai dấu ấn huỳnh quang khác nhau. Hai mầu DMA bộ
gcn dược lai dồng thời, cạnh tranh với nhau các đoạn dò DNA đà được in bang
robot lén microarray (giừa). Phẩn mềm chuyên dụng trên máy tinh sẽ đánh giã
mức dộ ti lộ huỳnh quang tương đòi cua từng DNA dổi với tùng mục tiêu trẽn
microarray (phía dưới bẽn nái). Tý lộ giữa DNA chứng và xét nghiệm cho mồi
dõng cỏ thê dược vè tuyền tính bang cách sư dụng phần mềm phàn tích dừ liệu

dê ưực quan hóa cảc biến the liều lượng (phía dưới bẽn phai). dược biếu thị bang
độ lệch so với log2 tỹ lệ bính thường lả 0 (hĩnh 1.7) [41].

-ÍM Qỉ ugc V
Hl


25

Hình 1.8. Sư (lồ thề hiện các hước chính trong kỹ thuật aCGH
1.52.

Phán loại array CGH

Hiện tại CÓ rất nhiều loại đoạn dộ dược sử dụng trong kỳ thuật aCGi I dơ
phát hiện bắt thường cùa NST:

- Ek>ạn
dị
là
các
NST
ũ
khn
nhân
(BAC
bacterial
artificial
với
kích

thước
chromosome)
thay
đỗi.
chửa
Ưulèn
diêm
các
đoạn
cua
đoạn
ngắn
dị
DNA
BAC
cualà
người
có
độ
phân
dầu
dị
giai
cỏ
klìã
mục
cao
(có
(tilling
thê

the
tới
genome).
50
Kbtạo
den
1Mb
150Kb
vói
dầu
dối
dị
với
doạn
phu
tồn
dị
BACs.
bộ
bộtiêu
gendơng
(spaced
at
intervals)).
Nhược
diêm
cua

-ÍM Qỉ ugc V
Hl