Đề tài: Nghiên cứu thử nghiệm quy trình nhân giống in vitro hoa đồng tiền kép

PHẦN I
ĐẶT VẤN ĐỀ
Cùng với sự phát triển không ngừng của xã hội, nhu cầu của con người
cũng ngày một tăng lên, trong đó có cả nhu cầu thưởng thức cái đẹp và những
giá trị tinh thần, thẩm mỹ. Hoa- một sản phẩm của tạo hoá dành cho con
người đã đáp ứng được yêu cầu đặc biệt ấy. Hoa không chỉ biểu thị cho nét
đẹp tinh thần của mỗi con người mà còn là thước đo sự phát triển xã hội.
Chính vì vậy, hiện nay ngành sản xuất hoa tươi đang trở thành một
ngành mang lại lợi nhuận đáng kể cho người trồng hoa, song để đáp ứng được
nhu cầu và thị hiếu ngày càng cao của người tiêu dùng thì hoa khơng chỉ đẹp
mà cịn cần phải phong phú và đa dạng về chủng loại, màu sắc.
Việt Nam là một nước có nghề trồng hoa từ lâu đời và có điều kiện
thiên nhiên ưu đãi cho ngành trồng hoa. Trong những loại hoa có mặt ở nước
ta, đồng tiền là một lồi hoa đẹp, thích nghi tốt với khí hậu nhiệt đới, đồng
thời đây cũng là loại hoa lưu niên, có giá trị kinh tế cao do ra hoa quanh năm,
độ bền hoa cắt cao và rất được ưa chuộng tại thị trường trong nước và trên thế
giới. Song ngành trồng hoa đồng tiền cũng như ngành sản xuất hoa nói chung
của Việt Nam cịn gặp nhiều khó khăn, chủ yếu do giống bản địa thường cho
hoa nhỏ, màu sắc kém đa dạng, dễ bị nhiễm bệnh khi trồng trong điều kiện
khí hậu nóng ẩm, nhanh thối hố giống và phải nhập giống từ Hà Lan, Trung
Quốc với giá thành cao.
Vì vậy, vấn đề lớn đặt ra hiện nay là nhân nhanh được những giống hoa
ưu việt, đáp ứng nhu cầu, thị hiếu của người tiêu dùng và phục vụ xuất khẩu.
Để giải quyết vấn đề trên, một hướng mới cho ngành sản xuất hoa là áp dụng
công nghệ nuôi cấy mô tế bào trong việc nhân giống hoa đồng tiền, qua đó
cung cấp hàng triệu cây giống chất lượng tốt cho thị trường, đưa ngành sản

1


xuất hoa Việt Nam trở thành một ngành sản xuất hàng hoá đem lại giá trị kinh

tế cao.
Xuất phát từ thực tế đó, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài " Nghiên
cứu thử nghiệm quy trình nhân giống in vitro hoa đồng tiền kép "
MỤC ĐÍCH :

-Thử nghiệm quy trình nhân nhanh hoa đồng tiền nhập nội, đáp ứng
nhu cầu cây giống cho sản xuất đại trà và phục vụ công tác bảo tồn giống.
YÊU CẦU:

- Thử nghiệm ảnh hưởng của hố chất vơ trùng đến khả năng ni cấy
- Thử nghiệm ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng tái sinh
mẫu
- Thử nghiệm ảnh hưởng của các giá thể đến khả năng sinh trưởng của
cây con

2


PHẦN II
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1.

Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.1.1. Khái niệm và vai trò của ni cấy mơ tế bào thực vật
Nhân giống vơ tính là hình thức nhân giống thơng qua các cơ quan dinh
dưỡng (thân, lá, vỏ, củ...) bao gồm các phương pháp giâm cành, chiết cành,
mắt ghép và nuôi cấy in vitro. Trong đó ni cấy in vitro được coi là phương
pháp hữu hiệu nhất.
Nhân giống vơ tính in vitro được tiến hành trên ngun tắc cắt ni

đoạn thân có mang chồi ở nách lá, đoạn rễ hay mảnh củ, cánh hoa, có kích
thước nhỏ phù hợp với điều kiện vơ trùng của ống nghiệm [4]
Phương pháp nhân giống in vitro đã bổ sung cho các kĩ thuật nhân
giống vơ tính cổ điển như giâm, chiết, ghép tách dòng một kĩ thuật tiến bộ với
những ưu điểm như: Tốc độ nhân giống cao từ 33 đến 1012 một năm [4], ví dụ
trong 1 ml dung dịch mơt trường có từ 100.000 - 1000.000 tế bào ni nêú ở
điều kiện thích hợp mỗi tế bào có thể chuyển hóa tạo phơi và mọc cây, từ 1ml
dung dịch mơi trường có thể taọ ra cả rừng cây [1]; Chủ động sản xuất, không
phụ thuộc vào điều kiện thời tiết, mùa vụ; Có khả năng cơng nghiệp hóa cao
do ni cấy trong điều kiện ổn định về môi trường dinh dưỡng, nhiệt độ,
ánh sáng, do đó có thể cơng nghiệp hóa hồn tồn từ khâu nhân cây giống
với số lượng lớn đến khi ươm trồng trong nhà lưới.
2.1.2. Sơ lược lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nuôi cấy mô tế bào thực vật đã trải qua một lịch sử phát triển lâu dài và
được đánh dấu bằng những sự kiện chính sau:
- Năm 1902, Harberlandt lần đầu tiên đưa ra các lý thuyết và Schneider
và Butschli (người mơ tả chính xác q trình phân chia tế bào) vào thực
nghiệm nuôi cấy mô cây 1 lá mầm nhưng không thành công.[1]

3


Năm 1929- 1933 lần lượt Bchumuker, Scheitter, Pfcifer và Lance thành
công trong việc nuôi cấy một đoạn đầu mút rễ hoàn chỉnh. [4]
- Năm 1934, Kogl lần đầu tiên xác định được vai trị của IAA, một
hooc mơn thực vật đầu tiên thuộc nhóm Auxin có khả năng kích thích sự phát
triển tăng trưởng và phân chia tế bào thực vật. [1]
- Năm 1939, Gautheret, Nobecourt và White đã đồng thời nuôi cấy mô
sẹo thành công trong thời gian dài từ mô tượng tầng, Nobetcourt nuôi cấy củ
Cà rốt và nhận được sự phân bào tạo ra khối tế bào phân chia.

- Năm 1941, Overbeek và cộng sự đã sử dụng nước dừa trong nuôi cấy
phôi non ở cây cà rốt Patura.
- Năm 1955, Miller và cộng sự phát minh ra cấu trúc và sinh tổng hợp
Kinetin là 1 cytokinin đóng vai trị quan trọng trong phân bào và phân hóa
chồi ở mơ ni cấy.
- Năm 1957, Skoog và Miller tạo ra được chồi từ mảnh mô thân cây
thuốc lá đồng thời khám phá vai trò của tỷ lệ nồng độ các chất Auxin/
Cytokinin, nồng độ auxin/ nồng độ cytokinin < 1 có xu hướng tạo ra chồi.
Ngược lại khi nồng độ auxin/ nồng độ cytokinin >1 mơ có xu hướng tạo rễ.
Tỷ lệ nồng độ auxin và cytokinin thích hợp sẽ kích thích phân hóa cả chồi và
rễ, tạo cây hoàn chỉnh. [1]
- Năm 1958, Keinert và Sterward tạo được phơi và cây hồn chỉnh từ tế
bào tượng tầng tách từ cây cà rốt được nuôi cấy một dạng huyền phù. [4]
- Năm 1960, Morel đã thực hiện bước ngoặt cách mạng trong sử dụng
kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng trong nhân nhanh các loại địa lan
cymbidim.
- Năm 1960, Cooking lần đầu tiên sử dụng enzim phân giải thành tế
bào và đã tạo ra số lượng lớn tế bào trần ở những cây trồng khác nhau. [1]
- Năm 1966, Guha và cộng sự thành công trong nuôi cấy thể đơn bội ở
cà độc dược từ bao phấn.
4


- Năm 1967- 1968, lần lượt Nichkoi Nakato và cộng sự tạo được cây
đơn bội từ bao phấn thuốc lá. [3]
- Năm 1971, Takeb tái sinh thành công cây thuốc lá từ tế bào trần.
- Năm 1972, Carlson và cộng sự lần đầu tiên thực hiện lai tế bào soma
giữa các loài, tạo được cây từ dung hợp tế bào trần của 2 loài thuốc lá
Nicotiana glauca và N. langsdorfi. [1]
- Năm 1977, Chers lai thành công tế bào soma cây cà chua và cây

khoai tây. [3]
Từ năm 1977 đến nay, cơng nghệ tế bào thực vật đã có những bước tiến
vượt bậc với việc áp dụng các công nghệ cao trong chọn tạo giống cây trồng
như: đột biến tế bào soma, cứu phôi lai xa, dung hợp tế bào trần, tạo dịng
kháng thể, ni cấy bao phấn, hạt phấn trên nhiều đối tượng cây trồng. Chúng
ta đang bước vào giai đoạn thứ tư của nuôi cấy mô tế bào, đây là giai đoạn
nuôi cấy mô tế bào được ứng dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống, nhân
giống, sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học và nghiên cứu lý luận di
truyền ở thực vật bậc cao. [4]
2.1.3. Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là khái niệm chung cho tất cả các kĩ thuật
ni cấy ngun liệu thực vật hồn tồn sạch các vi sinh vật trên môi trường
dinh dưỡng nhân tạo trong điều kiện vô trùng.
Cơ sở khoa học của nuôi cấy mơ tế bào thực vật dựa trên tính tồn năng
và sự phân hố, phản phân hố của tế bào.
Tính toàn năng của tế bào được thể hiện ở “bất kỳ một tế bào của một
cơ thể đa bào nào cũng đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cây
hồn chỉnh”. [4]
Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh trở thành các tế
bào mơ chun hóa để đảm nhận các chức năng sinh lý khác nhau. Ngược lại,
sự phản phân hóa của tế bào là sự chuyển các tế bào đã chuyên hóa trở lại
5


phát triển thành phơi sinh có khả năng phân chia mạnh mẽ cho tế bào mới mà
bản chất là một q trình hoạt hóa và ức chế các gen. [4]
Theo Ngơ Xn Bình (2000) [4] q trình nhân giống in vitro thường
trải qua 5 giai đoạn:
Giai đoạn 1 là giai đoạn chuẩn bị tạo cây mẹ sạch bệnh và nuôi cấy
khởi động.

Giai đoạn 2: Chọn mẫu cấy phù hợp cho việc tái sinh nhân nhanh chồi.
Khử mô nuôi cấy sau khi đã xác định được mẫu cấy (HgCl 2, NaOCl, H2O2).
Lựa chọn môi trường nuôi cấy phù hợp để mẫu phát sinh chồi bất định hoặc
phơi vơ tính.
Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi đã tái sinh để sản xuất cây với số lượng
lớn trong thời gian ngắn.
Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh, các chồi được cảm ứng ra rễ, tạo cây
hoàn chỉnh để đưa ra trồng trong vườn ươm .
Giai đoạn 5: Đưa cây ra vườn ươm, làm cho cây in vitro thích nghi với
điều kiện thực nghiệm ngồi đồng ruộng.
2.1.4. Các kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro
Vấn đề chọn nguyên liệu ban đầu cho nhân giống là rất quan trọng, nó
khơng những quyết định sự thành cơng ban đầu mà cả q trình nhân giống
tiếp theo. Trên 1 cây có thể lấy nhiều bộ phận khác nhau để ni cấy, vì thế kĩ
thuật ni cấy cũng khá đa dạng. Tùy theo mục đích và khả năng ứng dụng
mà người ta có thể chọn phương pháp ni cấy thích hợp.
* Ni cấy phơi:
Năm 1921, Dieterich đã đưa ra kết luận là phôi nuôi cấy in vitro hồn
tồn có thể nảy mầm khơng qua giai đoạn ngủ nghỉ dựa trên cơ sở các nghiên
cứu của mình. Tuy nhiên, mơi trường dinh dưỡng cho sự tạo cây ở phôi
trưởng thành và phôi non là khác nhau, trong đó phơi non cần mơi trường
giàu dinh dưỡng hơn. [8]
6


* Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời
Năm 1946, Wetmare đã chứng minh các bộ phận của cây đều có thể
ni cấy khi gặp điều kiện thuận lợi. . [8]
Với các bộ phận khác nhau trên cây thì nhu cầu dinh dưỡng khi nuôi
cấy cũng rất khác nhau. Muốn duy trì sự sinh trưởng và phát triển mơ của cơ

quan ni cấy thì sau một khoảng thời gian nhất định mơ phải được cấy
chuyển sang mơi trường mới thích hợp. Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời
thường được ứng dụng để nghiên cứu các môi trường dinh dưỡng phù hợp với
các bộ phận khác nhau của cây, tạo mô sẹo và nhân cây in vitro.
* Nuôi cấy mô phân sinh:
Trong nuôi cấy mô phân sinh, người ta thường sử dụng các mơ đỉnh
chồi và đỉnh cành có kích thước từ 0,1 mm đến 1 mm. Các mô phân sinh dùng
để nuôi cấy thường tách ra từ các mầm non, các chồi mới hình thành và các
cành non.
Ni cấy mơ phân sinh thường được sử dụng cho mục đích tạo cây
sạch vi rút, nhân giống in vitro tạo cây đa bội thông qua xử lý colchicin [7]
* Nuôi cấy bao phấn:
Nhiều kết quả nghiên cứu đã cho thấy hạt phấn ni cấy có thể phát
triển thành cây đơn bội hoàn chỉnh trong điều kiện in vitro bằng con đường
tạo phôi trực tiếp hoặc gián tiếp qua mô sẹo và con đường cơ quan hố.
Ni cấy bao phấn có thể ứng dụng để tạo các dòng thuần, biểu hiện
các gen lặn, đặc biệt cây đơn bội thu được từ nuôi cấy bao phấn và hạt phấn là
nguồn nguyên liệu quan trọng cho chọn dịng đột biến. [1]
* Ni cấy mơ sẹo
Các mơ đã biệt hóa được tách ra dưới điều kiện thích hợp sẽ phản biệt
hóa tạo thành mơ sẹo.
Người ta có thể sử dụng bất kỳ bộ phận dinh dưỡng nào của cây như
mảnh lá, thân, rễ làm vật liệu ni cấy tạo mơ sẹo hoặc có thể sử dụng hạt
7


gieo trên mơi trường thích hợp đến khi phát triển thân mầm, tiếp tục cắt thân
thành những đoạn nhỏ và đưa vào môi trường tạo mô sẹo.
Trong nuôi cấy mô sẹo, người ta thường sử dụng mô sẹo sơ cấp để tái
sinh sẽ thu được cây đồng nhất vì tế bào mô sau khi cấy chuyển nhiều lần dễ

phát sinh các biến dị di truyền. [2]
* Nuôi cấy tế bào đơn và tế bào trần:
Năm 1960, Cooking đã sử dụng enzim phân giải tế bào và tạo ra một số
lượng lớn tế bào trần.
Tế bào đơn và tế bào trần được tách ra từ mô sẹo, là đối tượng lý tưởng
trong nghiên cứu những biến đổi di truyền ở thực vật thơng qua dung hợp tế
bào trần có nguồn gốc khác nhau để tạo ra các cây lai soma.[3]
* Nuôi cấy tế bào dung dịch lỏng (suspension culture).
Từ những năm 1959, Tulecke và Nickell đã thử nghiệm sản xuất sinh
khối mô thực vật ở qui mô lớn (134l) ằng nuôi cấy chìm. Sau đó, các nhà
khoa học đã ni tế bào ở qui mô công nghiệp phục vụ sản xuất sikonin, chọn
tạo các dòng tế bào cho sản lượng các sản phẩm thứ cấp cao hơn.
Ngày nay kỹ thuật nuôi cấy tế bào dịch lỏng đang được ứng dụng rộng
rãi để sản xuất sinh khối thực vật ở quy mô lớn trong các hệ thống nuôi cấy tự
động như trong các bioreactor dung tích lớn, đáp ứng nhân nhanh giống
thương mại cũng như sản xuất các chất có dược tính trong y học. [1] [2]
Như vậy, cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, nuôi cấy mô tế
bào thực vật đang có những bước tiến mạnh mẽ. Trong đó cơng nghệ tế bào
kết hợp với các kỹ thuật sinh học phân tử là một hướng nghiên cứu quan trọng
trong công tác lai tạo giống mới mang nhiều đặc tính ưu việt và nâng cao chất
lượng giống cây trồng.
Hướng nghiên cứu này tập trung vào những vấn đề chính sau:
- Đưa những gen cần chuyển vào thực vật tạo cây mang những đặc tính
mong muốn có thể chưa từng xuất hiện ở lồi cây đó, thậm chí trong tồn bộ
8


dòng họ. Những gen chuyển vào cây trồng phụ thuộc rất nhiều vào hệ thống
nuôi cấy tái sinh tế bào thành cây in vitro sau chuyển gen.
- Tạo những biến đổi sâu sắc có định hướng trong các tính trạng của

cây thông qua biến đổi các protein chủ chốt của tế bào, đây là điều khó đạt
được trong phương pháp cổ điển. [1]
2.1.5. Môi trường và các yếu tố ảnh hưởng đến q trình ni cấy in vitro
Thành phần hóa học của mơi trường đóng vai trị quyết định đến sự
thành công hay thất bại của nuôi cấy tế bào và mô thực vật.
Mỗi một loại vật liệu khác nhau có những địi hỏi khác nhau về thành
phần mơi trường, khi bắt đầu nghiên cứu một số loài mới hoặc giống mới cần
phải chọn lựa cho đối tượng nghiên cứu một loại môi trường cơ bản phù hợp.
Từ những năm 1933, Tukey đã nghiên cứu tạo ra môi trường nuôi cấy
thực vật, cho đến nay đã có rất nhiều loại mơi trường khác nhau được sử dụng
cho mục đích này, trong đó có một số mơi trường cơ bản được sử dụng rất
phổ biến như MS, LS, WP. Ví dụ, môi trường MS (Murashige&Skoog, 1962)
là môi trường được sử dụng rộng rãi nhất trong nuôi cấy mô của tế bào thực
vật, mơi trường MS thích hợp cho cả thực vật 1 lá mầm, 2 lá mầm. Hay môi
trường Gramborg (1965) còn gọi là B5 dùng thử nghiệm trên đậu tương, được
sử dụng trong tách và nuôi tế bào trần. [4]
Tuy có rất nhiều loại mơi trường ni cấy mơ tế bào thực vật nhưng
đều gồm một số thành phần cơ bản sau:
+ Các muối khoáng đa lượng và vi lượng
+ Nguồn cacbon
+ Các vitamin và aminoaxit
+ Chất bổ sung, chất làm thay đổi trạng thái môi trường
+ Các chất điều hịa sinh trưởng
* Các muối khống đa lượng và vi lượng

9


Đối với cây trồng, các chất khoáng đa và vi lượng đóng vai trị rất quan trọng.
Ví dụ magiê là một phần của phân tử diệp lục, canxi cấu tạo màng tế bào, nitơ

là thành phần quan trọng của vitamin, amino axit và protein. Ngoài ra, các
nguyên tố vi lượng như Fe, Zn, Mo, Mn là thành phần của một số enzim cần
thiết cho hoạt động sống của tế bào. [1]
Muối khống là thành phần khơng thể thiếu trong các môi trường nuôi
cấy tế bào thực vật, làm vật liệu cho sự tổng hợp các chất hữu cơ, enzym.
Các ion của các muối hòa tan giúp ổn định áp suất thẩm thấu của mơi
trường trong tế bào, duy trì điện thế hóa của thực vật. Ví dụ: K, C rất quan
trọng trong điều hịa tính thấm lọc của tế bào. [2]
* Nguồn cacbon
Khi nuôi cấy in vitro, các tế bào thực vật thường khơng có khả năng
quang hợp, do đó đòi hỏi phải cung cấp nguồn cácbon cho các hoạt động dinh
dưỡng của tế bào.
Nguồn cacbon được ưa chuộng nhất hiện nay trong nuôi cấy là đường
sucrose, một số trường hợp sử dụng glucose và fructose thay thế cho sucrose
nhưng chúng thường nghèo hydrat cacbon so với nhu cầu của thực vật. [1]
Ngồi ra, khi khử trùng mơi trường, cần chú ý không nên kéo dài thời
gian để tránh xảy ra hiện tượng caramen hóa, làm cho mơi trường chuyển
sang màu vàng dẫn đến ức chế sự sinh trưởng và phát triển của tế bào.
* Các vitamin và axit amin
Ảnh hưởng của các vitamin lên sự phát triển của tế bào ni cấy in
vitro ở các lồi khác nhau là khác nhau.
Hầu hết tế bào ni cấy đều có khả năng tổng hợp tất cả các loại
vitamin cơ bản nhưng với số lượng dưới mức u cầu. Để mơ có thể sinh
trưởng, tốt nhất phải bổ sung thêm vào môi trường một hay nhiều loại vitamin
và amino axít. Trong các loại vitamin, B 1 được xem là vitamin quan trọng
nhất cho sự phát triển của thực vật. Axit nicotinic (B 3) và pyridoxune (B6)
10


cũng có thể được bổ sung vào mơi trường ni cấy nhằm tăng cường sức sống

cho mô
[6].
* Các chất bổ sung
Nước dừa và dịch chiết nấm men có tác dụng kích thích sự sinh trưởng
và phát triển của mơ và tế bào. Trong đó, nước dừa thường sử dụng với nồng
độ 5- 20% thể tích mơi trường, kích thích phân hóa và nhân nhánh chồi. Dịch
chiết nấm men là chế phẩm thường dùng trong nuôi cấy vi sinh vật, mô tế bào
động vật với nồng độ thích hợp.
Ngồi ra, có thể sử dụng dịch thủy phân casein hydrolyase (0,1- 1%)
hoặc bột chuối với hàm lượng 40g bột khô trong 100 g/l (xanh) nhằm tăng
cường sự phát triển của mô sẹo hay cơ quan nuôi cấy.
Trong môi trường nuôi cấy đặc, người ta thường sử dụng agar để làm
rắn hố mơi trường. Nồng độ agar sử dụng thường là 0,6- 1%, đây là loại tinh
bột đặc chế từ rong biển để tránh hiện tượng mơ chìm trong mơi trường hoặc
bị chết vì thiếu O2 nếu ni trong mơi trường lỏng và tĩnh.
Ph môi trường: Với mỗi loại cây trồng yêu cầu một loại môi trường
khác nhau nhưng PH của môi trường thường từ 5,6- 6,0
Nếu PH của môi trường thấp hơn 5 thì thạch sẽ khó đơng và cao hơn 6
sẽ làm mơi trường bị cứng [1].
* Các chất điều hịa sinh trưởng thực vật
Các chất kích thích sinh trưởng gồm 2 nhóm chính auxin và cytokinin,
ngồi ra cịn có gibberlin và etylen cũng là nhóm chất tham gia điều tiết sự
sinh trưởng phát triển và phân hóa cơ quan.
+ Nhóm auxin
Các auxin sử dụng có thể là auxin tự nhiên hoặc tổng hợp bao gồm
(IAA, NAA, 2,4D, IBA) chủ yếu được sử dụng để kích thích sự phân bào và

11

tạo rễ nhưng nếu sử dụng liều lượng quá cao dễ tạo ra các đột biến. Auxin
thường hòa tan trong etanol hoặc NaOH pha lỗng.
Auxin có vai trị kích thích sự phân chia và kéo dài tế bào, ví dụ IAA
kích thích chồi bên sản sinh ra ethylen làm ức chế sinh trưởng chồi đỉnh;
kích thích sự ra rễ ở cành giâm và phát sinh chồi phụ, có ảnh hưởng khác nhau
đến sự rụng lá, ra hoa đậu quả, sự phát triển và chín của quả. Ngồi ra, 2,4-D
cịn được sử dụng rộng rãi cho sự phát sinh mô sẹo, tạo và nhân nhanh mơ sẹo
(mơ sẹo), kích thích tạo chồi bất định ở nồng độ thấp.
+ Nhóm cytokinin
Các cytokinin có tác dụng kích thích sự phân bào và phân hóa chồi.
Trong mơi trường ni cấy, tỷ lệ auxin/ cytokinin quyết định sự phân chia tế
bào, phân hóa chồi từ mơ sẹo và tạo phơi vơ tính.
Các cytokinin được dùng gồm có kinetin, BAP, zeatin, 2iP. Kinetin (6 fafurolaminoprrine) hình thành và phát triển trong điều kiện nhiệt độ cao từ
chế phẩm ADN có tác dụng kích thích sự phát sinh chồi. Zeatin (6- hydoxy3-methylbut- 2 enl amino purin) thực chất là một dẫn xuất của adenin có tác
dụng kích thích sự tạo chồi nhưng do giá thành cao nên ít được sử dụng. BAP
(6 - benzyl amino purine) có hoạt tính cao hơn kenitin và bền với nhiệt độ
cao.
Chức năng chủ yếu của cytokinin trong quá trình phân bào là kích thích
sự phân chia tế bào, kích thích phát sinh chồi trong ni cấy, tăng diện tích
phiến lá, tạo chồi bất định (nồng độ cao) ức chế quá trình già hóa, kích thích
tạo diệp lục, ức chế sự kéo dài chồi, ức chế sự hình thành rễ, có thể làm tăng
sự phát triển mật độ khí khổng ở một số lồi ( cơng nghệ tế bào ứng dụng )
Cytokinin được pha bằng dung dịch HCl loãng.
+ Gibberilin (GA3) là chất được sử dụng nhiều hơn cả trong nhóm
gibberilin gồm hơn 20 chất. GA 3 thường ít sử dụng trong ni cấy mơ sẹo bởi
nó ức chế sự phát triển mơ sẹo và hình thành rễ bất định. GA 3 tan được trong
12


nước nhưng trong mơi trường axit, nhiệt độ cao thì GA 3 mất họat tính sinh

học. Trong mơi trường kiềm, GA3 chuyển thành dạng điện phân không hoạt
động.
+ Axit absisic (ABA) có tác dụng tạo phơi, kích thích sự chín phơi, kích
thích sự phát chồi ở nhiều lồi thực vật, giúp phát huy khả năng chống chọi
của tế bào với ngoại cảnh bất thuận (gây ra đóng khí khổng).
+ Ethylen là chất ức chế sinh trưởng gây già hóa, rụng lá, quả, làm
chín, kích thích nở hoa, đóng vai trị trong sự lão hóa ở thực vật [1]
2.2.

Giới thiệu chung về hoa đồng tiền

2.2.1. Nguồn gốc, vị trí, phân loại
Hoa đồng tiền là 1 trong 10 loại hoa quan trọng nhất trên thế giới, sau
hồng, cúc, lan, cẩm chướng, lay ơn...
Trong các loại hoa đồng tiền đã và đang được trồng tại Việt Nam thì
hoa đồng tiền kép nhập nội là một trong những cây cho hiệu quả kinh tế cao
nhất. Từ một sào hoa đồng tiền giống mới chăm sóc đúng kĩ thuật có thể cho
thu nhập gần 50 triệu/sào [5]
Cây hoa đồng tiền có tên khoa học là Gerbera jameanii Bolexaclam có
nguồn gốc từ Nam Phi. Theo hệ thống học thực vật mới nhất, cây hoa đồng
tiền được phân loại như sau*:
Giới:

Plantae

Ngành:

Magnoliophyta

Lớp:

Magnoliopsida (lớp 2 lá mầm)

Bộ:

Asteraceae (họ cúc)

Phân họ: Mutisioideae
Chi:

Gerbera
Theo plantfact.com (2005)

13


Chi đồng tiền Gerbera có khoảng 40 lồi. Các giống trồng hiện nay là
con lai giữa G. viridifilia Schult Bip và G. jamesonii với các giống lai tự
nhiên ở Nam Phi.
Năm 1889, đồng tiền được Hooker miêu tả lần đầu tiên trong tạp chí tư
vấn Curtis dưới tên gọi Cúc Transrace hay Cúc barbetan.
Theo Hà Tiểu Đệ và cộng sự (2000) [13], cây hoa đồng tiền là cây thân
thảo, rễ chùm, cao 50-60cm. Thân có lơng, lá đứng, hình dạng lá thay đổi theo
sự sinh trưởng từ dạng trứng đến trứng dài, lá dài từ 15- 25 cm, rộng 5- 8 cm
hình xẻ thùy rộng và sâu, mặt dưới lá có lớp lơng nhung.
Hoa đồng tiền có dạng cụm, hoa đầu lớn, cụm hoa dạng đầu bề ngoài
dường là một bông hoa trên thực tế là một tập hợp hàng trăm bơng hoa nhỏ
riêng biệt. Phía ngồi hoa hình lưỡi tương đối lớn mọc xếp thành một hoặc vài
vòng. Do sự thay đổi hình thái và màu sắc nên tâm hoa rất được chú ý trong
chọn tạo giống mới. Hoa đồng tiền nở theo thứ tự từ ngoài vào trong, hoa

hình lưỡi nở trước, hoa hình tia nở sau theo từng vịng một.
Quả đồng tiền thuộc loại quả bế có lơng, khơng có nội nhũ, hạt rất nhỏ
màu nâu (1 gram hạt có 280- 300 hạt).
Hoa đồng tiền có khoảng 40 loài thuộc loại hoa lưu niên ra hoa
quanh năm, độ bền hoa cắt cao, được coi là 1 loài hoa đẹp trong thế giới
hoa. Dựa vào hình thái hoa, người ta chia thành 3 nhóm: Hoa kép, hoa
đơn và hoa đơn nhị kép.
Nhóm 1- Đồng tiền đơn: Hoa chỉ có một hoặc 2 tầng cánh, xếp xen kẽ
nhau tạo vòng tròn. Hoa mỏng và yếu hơn hoa kép, màu sắc hoa ít hơn, điển
hình là trắng, đỏ, tím, hồng.
Nhóm 2- Hoa đồng tiền kép: Cánh hoa to gồm hơn 2 tầng, bơng to,
đường kính có thể đạt tới 12- 15 cm, cánh hoa tụ lại thành bông nằm ở đầu
trục chính, cuống dài 40- 60 cm. Màu sắc đa dạng như trắng, đỏ, vàng, hồng,
gạch cua.
14


Nhóm 3- Hoa đơn nhị kép: Bên ngồi cùng cánh đơn, bên trong cánh
kép dày đặc, thường màu trắng trong lớp cánh kép màu cánh sen nhưng nhóm
này khơng đẹp bằng hoa kép.
Như vậy, trong ba nhóm hoa trên, đồng tiền kép là nhóm hoa có giá trị
cao, được ưa chuộng hơn cả và cũng là đối tượng lý tưởng của nuôi cấy mô tế
bào thực vật.
2.2.2. Giá trị sử dụng và giá trị kinh tế của cây hoa đồng tiền
Với đặc điểm hình thái và màu sắc đa dạng, phong phú, hoa đồng tiền
thường được sử dụng để làm hoa trang trí và hoa nghệ thuật. Ngồi ra, đồng
tiền cũng có thể trồng trong chậu suốt một thời gian dài đặt tại hội nghị,
phòng làm việc, phòng khách vào dịp trọng đại hoặc lễ tết.
Không những thế, đồng tiền còn mang lại sản lượng và giá trị kinh tế
rất cao cho người trồng hoa. Trong điều kiện phù hợp, đồng tiền có thể ra hoa

quanh năm, tỷ lệ hoa cắt và hoa thành phẩm đều rất cao. Ngoài ra, kỹ thuật
chăm sóc đơn giản, ít tốn cơng, đầu tư cho thu hoạch dài.
Nghề trồng hoa đồng tiền mang lại thu nhập cao nhất trong các lồi hoa
thơng dụng hiện nay. Một sào hoa chăm sóc đúng yêu cầu kĩ thuật hàng năm
có thể thu được 50.000- 60.000 bơng/sào (2000 cây/sào) với giá bán 1000
đồng/bông [6]
Bởi vậy, nghề trồng hoa đồng tiền đang ngày càng được mở rộng do
lượng tiêu thụ và giá cả ngày một tăng.
2.2.3. Tình hình sản xuất và phát triển hoa đồng tiền trên thế giới và Việt
Nam
* Trên thế giới
Trong những năm gần đây, ngành sản xuất hoa cắt trên thế giới đang
phát triển rất mạnh mẽ và mang tính thương mại hóa cao. Ngành trồng hoa đã
mang lại nguồn lợi nhuận khổng lồ cho ngành nơng nghiệp nói riêng và nền
kinh tế nói chung tại các cường quốc hoa. Năm 1997, giá trị sản lượng hoa
15


trên thế giới đạt 27 tỉ USD (Roger and Alan, 1998), đến năm 2001 con số này
đã là 33 tỷ USD, trong đó ba nước sản xuất hoa lớn nhất chiếm 50% sản
lượng hoa trên thế giới là Nhật Bản (khoảng 4,65 tỷ USD), Hà Lan (5,6 tỷ
USD) và Mỹ (3,8 tỷ USD) [15].
Hiện nay nhu cầu hoa cắt trên thế giới tăng 6- 9% mỗi năm, do đó giá
trị xuất nhập khẩu hoa trên thế giới cũng tăng hàng năm. Năm 1982, giá trị
xuất khẩu hoa đạt 2,5 tỷ USD, sau đó tăng lên 5,6 tỷ USD năm 1996. Trong
đó Hà Lan là nước xuất khẩu hoa lớn nhất thế giới, tiếp đến là Kenya,
Ecuado, Colombia và Israel.
Là một lồi hoa đẹp, ra quanh năm có tỷ lệ cắt cành và tỷ lệ hoa thành
phẩm rất cao, hoa đồng tiền có thể đem lại một giá trị và sản lượng cao cho
người trồng hoa khi được chăm sóc trong điều kiện thích hợp.

Trồng hoa đồng tiền ít tốn cơng, chiếu sáng đơn giản, đầu tư một năm
có thể đạt hiệu quả trong nhiều năm. Hoa đồng tiền đẹp, bền, có giá trị thẩm
mĩ cao, nhu cầu tiêu thụ hoa đồng tiền trên thế giới ngày một tăng, diện tích
trồng hoa đồng tiền trên thế giới cũng vì thế ngày càng mở rộng.
Trên thế giới có một số nước sản xuất hoa đồng tiền chính như Hà Lan,
Ba Lan, Trung Quốc. Trong đó, Hà Lan là nước nghiên cứu và sản xuất hoa
đồng tiền lớn nhất trên thế giới
Theo Hà Tiểu Đệ, (2000) [13], diện tích trồng hoa của Hà Lan là 8.017
ha, đạt giá trị sản lượng 3.590 triệu USD. Hầu hết các giống hoa đồng tiền tại
Hà Lan là những giống hoa lai, hoa to, được những nhà chọn tạo giống của
Hà Lan lai tạo ra, trong đó công ty Florist của Hà Lan là một cơ sở quan trọng
về nghiên cứu, buôn bán và sản xuất hoa đồng tiền của thế giới.
Ở Ba Lan, hoa đồng tiền được trồng chủ yếu là sản phẩm của nuôi cấy
mô, đây cũng chính là loại hoa quan trọng nhất chiếm khoảng 90% tổng sản
phẩm hoa từ nuôi cấy mô năm 1984. Tại Trung Quốc, ngay từ những năm
1920, hoa đồng tiền cắt cành đã được sản xuất ở Mai Long, Thượng Hải song
16


phát triển rất kém do giống bị thối hóa trầm trọng. Từ năm 1987 đến nay,
nhờ ứng dụng kỹ thuật ni cấy mơ nên đã khắc phục được tình trạng thối
hóa giống, qua đó diện tích trồng hoa đồng tiền ngày một mở rộng và phát
triển. Cơ sở trồng hoa đầu tiên ở Thượng Hải có 35 ha, Giang Tơ 6 ha, sau đó
Viện nghiên cứu khoa học rau quả và nông trường Liên Vân lần đầu tiên thử
nghiệm trên quy mô lớn.
* Tại Việt Nam
Việt Nam là một quốc gia trồng hoa từ lâu đời với rất nhiều làng hoa
nổi tiếng nhưng nghề trồng hoa ở Việt Nam mới chỉ thực sự phát triển mạnh
trong khoảng 20 năm gần đây kể từ ngày đổi mới.
Từ những năm 40 của thế kỷ trước, hoa đồng tiền đơn đã được nhập

vào Việt Nam lần đầu tiên. Đặc điểm của giống hoa này là khả năng sinh
trưởng khá, thích nghi tốt với điều kiện mơi trường, nhưng có nhược điểm là
hoa nhỏ, cánh đơn, màu sắc đơn điệu.
Đến năm 1990, một số nhà trồng hoa và công ty hoa Việt Nam bắt đầu
nhập nội các giống đồng tiền lai (hoa kép) từ Hà Lan, Trung Quốc, Đài Loan.
Các giống hoa mới tỏ ra ưu vượt hơn hẳn giống hoa đơn do hoa to, cánh dày,
nhiều tầng, màu sắc phong phú, hình dáng hoa cân đối và cho sản lượng cao.
Các giống hoa này đã được nhân rộng rãi và phát triển mạnh mẽ khắp các
vùng trong cả nước.
Hiện nay, Việt Nam đã có một số vùng đã phát triển tập trung quy mô
lớn từ vài ha đến vài chục ha như Đà Lạt (Lâm Đồng), thị xã Bắc Giang, Bắc
Ninh, Hà Nội. Song ngành trồng hoa đồng tiền cũng như ngành sản xuất hoa
nói chung của Việt Nam cịn gặp nhiều khó khăn, chủ yếu do giống bản địa
thường cho hoa nhỏ, màu sắc kém đa dạng, dễ bị nhiễm bệnh khi trồng trong
điều kiện khí hậu nóng ẩm, nhanh thối hố giống và phải nhập giống mới từ
Hà Lan, Trung Quốc với giá thành cao.

17


Vì vậy, vấn đề lớn đặt ra hiện nay là phải nhân nhanh được những
giống hoa ưu việt, đáp ứng nhu cầu, thị hiếu của người tiêu dùng và phục vụ
xuất khẩu. Để giải quyết vấn đề trên, một hướng mới cho ngành sản xuất hoa
là áp dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào trong việc nhân giống hoa đồng tiền,
qua đó cung cấp hàng triệu cây giống chất lượng tốt cho thị trường, đưa
ngành sản xuất hoa Việt Nam thực sự trở thành một ngành công nghiệp đem
lại giá trị kinh tế cao. Mặt khác, theo nhiều tác giả, dường như ni cấy mơ
cịn là cơng nghệ cứu cánh cho việc nhân giống hoa đồng tiền do cây đồng
tiền nuôi cấy mô sạch bệnh, sinh trưởng, phát triển nhanh và cho hoa có chất
lượng cao. Các cây đồng tiền giống hiện có trên thị trường đều được cung cấp

thông qua nuôi cấy mô tế bào thực vật.
Hiện nay, có rất nhiều kỹ thuật ni cấy mơ được áp dụng trong nhân
nhanh các giống đồng tiền nhập nội có giá trị kinh tế cao như nuôi cấy đỉnh
chồi, nuôi cấy đốt thân… Trong đó, kỹ thuật nhân giống đồng tiền thông qua
mô sẹo từ lát cắt mỏng nụ hoa non đang là một hướng nghiên cứu mới, hiệu
quả, cho hệ số nhân giống rất cao do đặc điểm của mơ sẹo là khối tế bào đã
phản biệt hố, phát triển vơ hạn, nhờ vậy có thể đạt được số lượng chồi rất lớn
chỉ trong một thời gian ngắn. Đồng thời, nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra rằng
việc nhân giống qua mô sẹo sơ cấp đảm bảo cây tái sinh mang những đặc
điểm giống hệt cây ban đầu, tránh được rủi ro do biến dị di truyền. Vì vậy,
phương pháp này không những cho hệ số nhân giống cao mà cịn nhân được
những giống ưu việt, có giá trị kinh tế cao, phục vụ sản xuất giống quy mô
lớn.
Mục tiêu của Việt Nam đến năm 2010 là phát triển thêm 8.400 ha hoa
và cây cảnh, đưa diện tích trồng hoa cây cảnh lên hơn 10.000 ha với số lượng
hoa cắt trên 3,5 tỷ cành hoa các loại, trong đó xuất khẩu 1 tỷ cành, tiêu thụ nội
địa 2,5 tỷ cành. Mức đầu tư để phát triển đến năm 2010 cho cây cảnh và hoa
ước tính khoảng 5 tỷ USD và thu hút 110.000 lao động [6].
18


Muốn thực hiện đựơc mục tiêu đó, cần có sự hợp tác của 3 nhà là nhà
khoa học, nhà nông và nhà kinh tế để nghiên cứu, áp dụng các biện pháp kĩ
thuật trong chọn tạo giống, trồng trọt và phát triển các giống hoa mới có giá
trị kinh tế cao như hoa hồng, hoa đồng tiền, hoa loa kèn.

19


PHẦN III

ĐỐI TƯỢNG VÀ NỘI DUNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là giống hoa đồng tiền Gerbera jamesonii nhập
nội từ Hà Lan, sử dụng các lát cắt mỏng kích thước 1- 1,5 mm từ nụ hoa non
đã khử trùng.
- Các thí nghiệm được thực hiện tại Phịng thí nghiệm trọng điểm Cơng
nghệ tế bào thực vật- Viện Di truyền Nông nghiệp.
- Các điều kiện cho q trình ni cấy như sau:
Ánh sáng:

2000- 2500 lux

Thời gian chiếu sáng:

8- 10 h/ngày

Nhiệt độ:

25 ± 20C

Độ ẩm :

60- 70%

Các thí nghiệm ra cây bố trí trong nhà có mái che, lưới che, nhiệt độ, độ
ẩm phụ thuộc môi trường.
3.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Nội dung:
Qu¸ trình nghiên cứu đợc thực hiện theo quy trình sau:

Hoa non (lát cắt hoa non)
Khử trùng (HgCl2, H2O2)

Tạo mô sẹo trên môi trường bổ sung 2,4-D
Nhân mô sẹo (tái sinh mô sẹo) trên môi trường lỏng lắc,
bánlỏng, đặc, môi trường bổ sung casein, malt extract)
Tạo cụm chồi và nhân nhanh chồi
Ra rễ
Vườn ươm
20


* Nội dung 1: Thử nghiệm ảnh hưởng của chất khử trùng đến tỉ lệ sống
của mẫu nuôi cấy
Nụ hoa non được lấy vào ngày nắng ráo, đưa nhanh vào phịng thí nghiệm,
rửa mẫu bằng xà phịng, xả dưới vịi nước chảy, rồi lắc trong cồn 70 0 và tráng
lại bằng nước vô trùng nhiều lần (4 - 5 lần), sau đó chia đều vào các cơng
thức thí nghiệm khử trùng bằng hai loại hố chất:
Thí nghiệm 1 : HgCl2 nồng độ là 0,1% trong thời gian: 5- 10- 15 phút.
Thí nghiệm 2 : H2O2 ở các nồng độ là 5%- 10%- 15% trong thời gian
10 phút.
Sau khi khử trùng theo các cơng thức thí nghiệm khác nhau, rửa sạch
mẫu bằng nước cất vô trùng nhiều lần, cắt mẫu thành những lát cắt mỏng và
đưa vào môi trường nuôi cấy.
*Nội dung 2: Thử nghiệm ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến tái sinh
mẫu
Thí nghiệm 3: Thử nghiệm ảnh hưởng của nồng độ 2,4 D đến khả năng hình
thành mơ sẹo của mẫu cấy
Các mẫu thí nghiệm sau khi được khử trùng cắt thành các lát mỏng với
kích thước 1- 1,5 mm rồi đưa vào môi trường nuôi cấy mô sẹo gồm mơi

trường khống cơ bản MS (Murashige&Skoog, 1962) bổ sung 30 g/l đường
sucrose, 6,5 g/l agar (MT tạo mô sẹo) và 2,4- D ở các nồng độ khác nhau
CT1: MT tạo mô sẹo + 0 (mg/l) 2,4.D
CT2: MT tạo mô sẹo + 0,5 (mg/l) 2,4.D
CT3: MT tạo mô sẹo + 1,0 (mg/l) 2,4.D
CT4: MT tạo mô sẹo + 1,5 (mg/l) 2,4.D
CT5: MT tạo mô sẹo + 2,0 (mg/l) 2,4.D
CT6: MT tạo mô sẹo + 2,5 (mg/l) 2,4.D
CT7: MT tạo mô sẹo + 3 (mg/l) 2,4.D

21


Thí nghiệm 4: Thử nghiệm ảnh hưởng của các chất bổ sung khác nhau lên q
trình nhân mơ sẹo
Trên mơi trường MS bổ sung 1 mg/l 2,4- D và 6,5 g/l agar, chúng tôi sử dụng
các chất bổ sung khác nhau trong giai đoạn nhân nhanh mô sẹo như sau:
CT1: 1 g/l casein hydrolysate
CT2: 1 g/l malt extract
CT3: 30 g/l maltose + 30 g/l sucrose
CT4: 30 g/l glucose + 30 g/l sucrose
CT5: 60 g/l sucrose
Thí nghiệm 5: Thử nghiệm ảnh hưởng của phương thức ni cấy khác lên q
trình nhân nhanh mô sẹo
Để nhân nhanh mô sẹo, chúng tôi sử dụng mơi trường MS có 30 g/l
đường và agar với các hàm lượng khác nhau:
6 g/l (môi trường đặc)- 3 g/l (môi trường bán lỏng)- 0 g/l (môi trường
lỏng lắc).
*Nội dung 3: Thử nghiệm ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả
năng tái sinh chồi của mẫu

Thí nghiệm 6: Thử nghiệm ảnh hưởng của nồng độ BAP đến sự tái sinh của
mẫu cấy
Mơ sẹo hình thành được chuyển sang mơi trường thích hợp để tái sinh chồi là
mơi trường MS có 30 g/l đường sucrose, 6,5 g/l agar (MT tái sinh ) và BAP ở
các nồng độ khác nhau:
CT1: MT tái sinh + 0 mg/l BAP
CT2: MT tái sinh + 0,5mg/l BAP
CT3: MT tái sinh + 1,0 mg/l BAP
CT4: MT tái sinh + 1,5mg/l BAP
CT5: MT tái sinh + 2,0mg/l BAP
CT6: MT tái sinh + 2,5 mg/l BAP
22


CT7: MT tái sinh + 3,0 mg/l BAP
Thí nghiệm 7: Thử nghiệm ảnh hưởng của nồng độ BAP đến hệ số nhân chồi
tái sinh
Để tiếp tục nâng cao chất lượng chồi in vitro, chúng tôi tiến hành
nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến hệ số nhân chồi của hoa đồng tiền. Môi
trường cơ bản là MS bổ sung 6,5 g/l agar, 30 g/l đường, 15% nước dừa (MT
nhân nhanh) và BAP ở các nồng độ khác nhau:
CT1: MT nhân nhanh + 0 mg/l BAP
CT2: MT nhân nhanh + 0,5mg/l BAP
CT3: MT nhân nhanh + 1,0 mg/l BAP
CT4: MT nhân nhanh + 1,5mg/l BAP
CT5: MT nhân nhanh + 2,0 mg/l BAP
CT6: MT nhân nhanh + 2,5 mg/l BAP
CT7: MT nhân nhanh + 3,0 mg/l BAP
Thí nghiệm 8: Thử nghiệm ảnh hưởng của GA3 và nồng độ BAP đến sự tăng
trưởng chồi hoa đồng tiền

Các chồi tái sinh được chúng tôi đưa vào mơi trường thích hợp để kéo dài
chồi, mơi trường gồm MS bổ sung 30 g/l đường, 6,5 g/l agar, 15% nước dừa,
GA3 nồng độ 0,5 mg/l (MT nuôi cấy) và BAP ở các nồng độ khác nhau:
CT1: MT nuôi cấy + 0 mg/l BAP
CT2 : MT nuôi cấy + 0,1 mg/l BAP
CT3 : MT nuôi cấy + 0,2 mg/l BAP
CT4 : MT nuôi cấy + 0,3 mg/l BAP
CT5 : MT nuôi cấy + 0,4 mg/l BAP
CT6 : MT nuôi cấy + 0,5 mg/l BAP

23


CT7 : MT nuôi cấy + 1 mg/l BAP
* Nội dung 4: Tạo cây hồn chỉnh
Thí nghiệm 9: Thử nghiệm ảnh hưởng của nồng độ NAA đến tỉ lệ hình
thành rễ của cây con
Những chồi có chiều cao thích hợp được chuyển sang môi trường ra rễ
là môi trường bán lỏng MS có 30 g/l đường, 3g/l agar và NAA ở các nồng độ
khác nhau:
0 mg/l(CT1) - 0,1 mg/l(CT2) - 0,2 mg/l(CT3) - 0,3 mg/l(CT4) - 0,5
mg/l(CT5)
*Nội dung 5: Giai đoạn vườn ươm
Thí nghiệm 10:. Thử nghiệm ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây
con
Thí nghiệm gồm 5 công thức :
CT1: Cát
CT2: 1đất : 1 cát
CT3: 1 đất : 1 cát : 2 trấu
CT4: 1 đất : 1 cát : 1 trấu hun : 1/4 phân vi sinh

CT5: 1 đất : 1 cát : 2 trấu hun : 1 mùn
3.2.2 Phương pháp đánh giá và tính tốn số liệu
* Phương pháp đánh giá
- Đánh giá kết quả khử trùng
Tỷ lệ mẫu sống (%)

=

Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) =

Tỷ lệ mẫu chết (%)

=

Σ Số mẫu sống x 100
Σ Số mẫu đưa vào
Σ Số mẫu nhiễm
Σ Số mẫu đưa vào
Σ Số mẫu chết
Σ Số mẫu đưa vào

24

x 100

x 100


- Đánh giá tỷ lệ tạo mô sẹo (%):
Tỷ lệ hình thành mơ sẹo

=
(%)
- Đánh giá khả năng phơi hóa mô sẹo

Σ Số mẫu tạo mô sẹo
Σ Số mẫu nuôi cấy

x 100

Đánh giá tăng trưởng của mơ sẹo phơi hóa trên các phương thức nuôi
cấy khác nhau: thời gian sau 15 ngày, 30 ngày, 45 ngày, 60 ngày.
mtăng = msau – mtrước
- Đánh giá kết quả nhân chồi:
Hệ số nhân chồi (lần) =

Σ Số chồi thu được
Σ Số chồi ban đầu

x 100

- Đánh giá kết quả kéo dài chồi
Tăng chiều cao chồi = Chiều cao sau khi nuôi cấy – chiều cao ban đầu
- Đánh giá sự hình thành rễ:
Tỷ lệ tạo rễ (%) =

Σ Số cây ra rễ
Σ Số cây ban đầu

x 100

* Xử lý số liệu
Các số liệu thu được xử lý thống kê bằng phần mềm excel và chương
trình xử lý Irristar.

25