Nghiên cứu sàng lọc vật liệu cố định enzyme để ổn định hoạt tính của enzyme nattokinase

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC

NGUYỄN TÙNG LÂM

NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC VẬT LIỆU CỐ ĐỊNH ENZYME ĐỂ ỔN
ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA ENZYME NATTOKINASE
KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

HÀ NỘI – 2021


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC

NGUYỄN TÙNG LÂM

NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC VẬT LIỆU CỐ ĐỊNH ENZYME ĐỂ ỔN
ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA ENZYME NATTOKINASE
KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Khóa:

QH - 2016.Y

Người hướng dẫn: 1. TS. Nguyễn Sỹ Lê Thanh
Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học
và Công nghệ Việt Nam
2. TS. Vũ Thị Thơm
Trường Đại học Y dược – Đại học Quốc Gia Hà Nội

HÀ NỘI – 2021


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin được bày tỏ lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới
Thầy giáo TS. Nguyễn Sỹ Lê Thanh – phịng Cơng nghệ sinh học Enzyme –
Viện Công nghệ sinh học – Viên Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
và Cô giáo TS. Vũ Thị Thơm – Trưởng bộ môn Y dược học cơ sở – Trường
Đại học Y dược –ĐHQGHN là những người đã dành nhiều thời gian, tâm
huyết, tận tình hướng dẫn, quan tâm, giúp đỡ, sửa luận văn và tạo mọi điều
kiện hóa chất, thiết bị trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu khoa học.
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Thị Hiền Trang cùng
tồn thể các cán bộ trong Phịng Cơng nghệ sinh học Enzyme, Viện Công
nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã chỉ bảo,
giúp đỡ tận tình cho em trong suốt quá trình em thực hiện đề tài.
Cuối cùng, em xin bày bày tỏ lịng biết ơn đến gia đình thân u đã
ln khích lệ và ủng hộ em về mặt vật chất lẫn tinh thần để em có thể hồn
thành được luận văn này.


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Vật liệu polymer tự nhiên ................................................................. 9
Bảng 2.4. Cố định enzyme Nattokinase (NK) bằng Microcrystalline cellulose
(MCC) ............................................................................................................. 23
Bảng 3.4. Hàm lượng protein tổng số và hoạt tính thủy phân casein của mẫu
enzyme tủa bằng cồn và muối ammonium sulfate .......................................... 24
Bảng 3.7. Tóm tắt q trình tinh sạch enzyme Nattokinase từ chủng B. subtilis27
Bảng 3.19. Hiệu suất gắn của enzyme Nattokinase với các chất mang .......... 33

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của Nattokinase .................................................... 4
Hình 1.2. Cơ chế tác dụng của Nattokinase ..................................................... 5
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình nghiên cứu tìm vật liệu cố định enzyme NK........ 14
Hình 2.2. Đường chuẩn Tyrosine ................................................................... 21
Hình 2.3. Đường chuẩn Bradford ................................................................... 22
Hình 3.1. (A) Điện di SDS-PAGE mẫu enzyme sau khi kết tủa (M: marker, 1:
tủa ammonium sulfate nồng độ 30 %, 2: tủa ammonium sulfate nồng độ 70 %,
3: tủa cồn, 4: dịch enzyme trước tủa). (B) Hoạt tính thủy phân fibrinogen của
enzyme Nattokinase ........................................................................................ 25
Hình 3.2. Sắc kí đồ các phân đoạn enzyme Nattokinase sau khi qua cột
DEAE-Sepharose ............................................................................................ 26
Hình 3.3. Điện di Nattokinase sau khi qua cột DEAE ................................... 27
Hình 3.4. Điện di γ-PGA ................................................................................ 28
Hình 3.5. Hình ảnh kính hiển vi của Na-γ-PGA ở độ phóng đại 100X ......... 28
Hình 3.6. γ-PGA ở dạng natri ........................................................................ 29
Hình 3.7. Độ bền của NK và NK- Na-γ-PGA với các pH khác nhau sau 1h
(A) và 24h (B) ................................................................................................. 30
Hình 3.8. Độ bền của NK và NK-Na-γ-PGA với các nhiệt độ khác nhau Sau
1h ủ (A), Sau 24 h ủ (B) .................................................................................. 32


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
NK

: Nattokinase

γ-PGA

: γ-Polyglutamic acid

MCC

: Microcrystalline cellulose

t-PA

: tissue plasminogen activator - yếu tố hoạt hóa plasminogen

PAI-1

: plasminogen-1

LDL

: low-density lipoprotein – lipoprotein tỉ trọng thấp

AD

: bệnh Alzheimer

TNF‐α

: Tumour necrosis factor α

IFN‐γ

: Interferon- γ

IL‐1β

: Interleukin-1β

MIP‐2

: Macrophage inflammatory protein-2

TCA

: tricloacetic acid

SDS-PAGE : sodium dodecyl sulphate–polyacrylamide gel electrophoresis
DEAE

: diethylaminoethyl


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .....................................................................................................
DANH MỤC BẢNG ...........................................................................................
DANH MỤC HÌNH ............................................................................................
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ..........................................................................
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN ............................................................................. 4
1. Tổng quan về enzyme Nattokinase ............................................................... 4
1.1. Giới thiệu chung về Nattokinase ............................................................ 4
1.2. Cơ chế và tác dụng ................................................................................. 5
2. Bacillus subtilis natto .................................................................................... 6
2.1. Giới thiệu về Bacillus subtilis natto ....................................................... 6
2.2. Đặc điểm và hình thái của Bacillus subtilis natto .................................. 6

2.3. Ứng dụng của Bacillus subtilis natto...................................................... 7
3. Vật liệu cố định enzyme ............................................................................... 8
4. Chất mang sử dụng trong nghiên cứu cố định Nattokinase.......................... 9
4.1. Poly glutamic acid (PGA) ...................................................................... 9
4.2. Microcrystalline cellulose (MCC) ........................................................ 10
5. Một số nghiên cứu về hướng của đề tài ...................................................... 10
5.1. Nghiên cứu trong nước ......................................................................... 10
5.2. Nghiên cứu trên thế giới ....................................................................... 11
CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 13
1. Vật liệu .......................................................................................................... 13
1.1. Chủng ................................................................................................... 13
1.2. Hóa chất ................................................................................................ 13
2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 13
2.1. Phương pháp nuôi cấy .......................................................................... 15
2.2. Phương pháp tinh sạch enzyme ............................................................ 16
2.3. Phương pháp cố định enzyme Nattokinase (NK)................................. 22
2.4. Xử lý số liệu ......................................................................................... 23


CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN................................................... 24
1. Tinh sạch enzyme Nattokinase và Na-γ-PGA từ B. subtilis ......................... 24
1.1. Tinh sạch enzyme Nattokinase .............................................................. 24
1.2. Tinh sạch Na-γ-PGA ............................................................................... 28
2. Xác định khả năng làm bền enzyme Nattokinase của Na-γ-PGA ................ 29
2.1. Xác định khả năng làm bền enzyme Nattokinase của Na-γ-PGA
dưới ảnh hưởng của pH.................................................................................. 29
2.2. Xác định khả năng làm bền enzyme Nattokinase của Na-γ-PGA
dưới ảnh hưởng của nhiệt độ ......................................................................... 31
3. Đánh giá hiệu suất gắn NK với chất mang Microcrystalline cellulose
(MCC) ............................................................................................................... 32

KẾT LUẬN ..................................................................................................... 35
KIẾN NGHỊ .................................................................................................... 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................
PHỤ LỤC ............................................................................................................


ĐẶT VẤN ĐỀ
Huyết khối là hiện tượng xuất hiện các cục máu đông trong động mạch
hay các tĩnh mạch nằm bên trong cơ thể. Bình thường nó có tác dụng cầm
máu trong các trường hợp chảy máu do tổn thương mạch máu. Khi q trình
đơng máu xảy ra khơng do tổn thương thì được gọi là chứng huyết khối bệnh
lý và có thể là nguyên nhân dẫn đến các bệnh như: tắc nghẽn mạch máu não,
đột quỵ, nhồi máu cơ tim…nguy hiểm hơn sẽ dẫn đến tử vong [52].
Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO) năm 2016, toàn cầu có 17,9 triệu
người tử vong do các bệnh tim mạch, nhiều hơn gấp 4 lần tổng số người tử
vong của 3 bệnh lý HIV/AIDS, sốt rét và lao phổi. Nguyên nhân chính là do
cục máu đơng và biến chứng của nó. Có nhiều phương pháp điều trị huyết
khối như sử dụng thuốc hoặc phẫu thuật. Tuy nhiên, các thuốc tan huyết khối
như Alteplase, Streptokinase, Urokinase… mặc dù có hiệu lực tức thì sau khi
tiêm tĩnh mạch nhưng thời gian bán hủy ngắn, giá thành cao và chỉ tác động
điều trị triệu chứng, không điều trị được căn nguyên của bệnh. Cả sử dụng
thuốc tiêm tĩnh mạch và phẫu thuật đều có nguy cơ biến chứng cao.
Natto, một loại thực phẩm làm từ đậu nành lên men với Bacillus
subtilis đã được tiêu thụ như một loại thực phẩm truyền thống ở các nước
châu Á trong hơn 2000 năm. Tiêu thụ natto được cho là một yếu tố đóng góp
đáng kể vào tuổi thọ của dân số Nhật Bản. Các nghiên cứu gần đây đã chứng
minh rằng ăn nhiều natto có liên quan đến việc giảm nguy cơ tử vong tổng số
bệnh tim mạch và đặc biệt là giảm nguy cơ tử vong do bệnh tim thiếu máu
cục bộ [47].
Trước những năm 1980, rất ít người biết về việc tiêu thụ natto có lợi

cho sức khỏe tim mạch tổng thể. Năm 1987, Sumi và cộng sự đã phát hiện ra
rằng natto có chứa một loại enzyme tiêu sợi huyết mạnh có tên là Nattokinase
(NK) [59]. Kể từ đó, một số lượng đáng kể nghiên cứu NK đã được thực hiện

1


ở Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc và Hoa Kỳ, và những nghiên cứu này đã
xác nhận rằng NK có nhiều tác dụng thuận lợi đối với sức khỏe tim mạch. NK
không liên quan đến bất kỳ kinase nào đã biết mà là một serine protease được
tinh chế và chiết xuất từ natto [64].
Ngồi ra, ưu điểm của NK cịn bao gồm sự an toàn và tiện lợi khi sử
dụng đường uống, quy trình sản xuất đơn giản với chi phí thấp hơn các loại
thuốc chống huyết khối và hạ huyết áp khác. Tại Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn
Quốc và các nước phương Tây bao gồm Úc, Hoa Kỳ, Canada và Châu Âu,
các sản phẩm NK được sử dụng rộng rãi dưới dạng viên nén hoặc viên nang
như các chất bổ sung dinh dưỡng để tăng cường sức khỏe bao gồm làm lỗng
máu, ngăn ngừa cục máu đơng và cải thiện tuần hồn [15].
Tuy nhiên, chưa có dữ liệu thuyết phục để chứng minh tính sinh khả
dụng và chuyển hóa của NK qua đường uống. Hiệu quả của enzyme trong
máu và tiêu hóa địi hỏi nhiều nghiên cứu hơn để cải thiện độ ổn định của
enzyme dưới điều kiện nhiệt độ và độ pH thay đổi bằng cách tăng cường các
điều kiện cho bảo quản và sản xuất NK [17, 39].
Hiện nay, có nhiều phương pháp để ổn định và tăng cường hoạt động
của enzyme như sử dụng các vật liệu để cố định enzyme hoặc biến đổi
enzyme. Trong đó, cố định enzyme là phương pháp được sử dụng nhiều hơn.
Enzyme cố định có ưu điểm hơn các enzyme tự do như được tái sử dụng
nhiều lần trong thời gian dài, bền hơn với nhiệt, pH và các dung môi hữu cơ.
Xuất phát từ những lý do trên, tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu sàng
lọc vật liệu cố định enzyme để ổn định hoạt tính của enzyme Nattokinase”

nhằm mục tiêu:
1. Tinh sạch được enzyme Nattokinase (NK) được lên men từ vi khuẩn B.
subtilis

2


2. Khảo sát được độ bền với pH và nhiệt độ của NK khi gắn với các chất
mang giúp cố định enzyme.

3


CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1.
1.1.

Tổng quan về enzyme Nattokinase
Giới thiệu chung về Nattokinase
Nattokinase lần đầu tiên được phát hiện vào năm 1980 bởi bác sĩ

Hyroyuki Sumi. Khi tiến hành nghiên cứu khả năng làm tan cục máu đông
của các loại thực phẩm, ông phát hiện ra dịch chiết từ natto - một loại sản
phẩm truyền thống của Nhật Bản lên men từ đậu nành có khả năng làm tan
cục máu đơng nhanh, mạnh và gọi đó là enzyme “nattokinase” có nghĩa
“enzyme trong natto”. Nattokinase là enzyme có khả năng chống đơng máu
mạnh hơn cả các urokinase. Enzyme này đã được chứng minh là an toàn và
được sử dụng ở Nhật Bản trong hơn 20 năm qua [59].

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của Nattokinase [69]

Nattokinase hay còn gọi là subtilisin NAT là một enzyme có khả năng
tiêu sợi huyết hiệu quả được sản xuất từ Bacillus subtilis. Nattokinase là một
serine protease có cấu trúc là một chuỗi polypeptide đơn gồm 275 gốc acid
amin, khối lượng phân tử là 27,728 kDa và điểm đẳng điện là pI=8,6
[69].Trung tâm hoạt động của N là bộ 3 xúc tác gồm nhóm hydroxyl của
Ser221, imidazol của His64 và nhóm cacboxyl của Asp32. Cơ chất đặc hiệu của
4


Nattokinase là cơ chất đặc hiệu chung của subtilisin: Suc-Ala-Ala-Pro-PhepNA [48]. Nattokinase ổn định trong khoảng pH từ 6-10 và nhiệt độ 30-60°C,
mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 70°C [22, 44]
1.2.

Cơ chế và tác dụng

Hình 1.2. Cơ chế tác dụng của Nattokinase [27]
Nattokinase có đặc điểm sinh học giống như plasmin, phân hủy fibrin
trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua 3 con đường (Hình 1.2):
- Nattokinase phân hủy fibrin trực tiếp (A)
- Nattokinase

tăng

cường

plasmin

thơng

qua

hoạt

hóa

prourokinase (nội sinh) thành urokinase (B)
- Nattokinase làm tăng nồng độ t-PA (tissue plasminogen
activators -yếu tố hoạt hóa plasminogen) (C) [27, 41].
Ngồi tác dụng tiêu sợi huyết, chống huyết khối mạnh mẽ [58, 59], NK
còn cho nhiều tác dụng như: tác dụng chống xơ vữa động mạch và hạ lipid
máu [18, 53], tác dụng hạ huyết áp [23, 36], tác dụng chống kết tập tiểu cầu,
chống đông máu [32], và các tác dụng bảo vệ thần kinh [20, 34].
5


Tuy nhiên, NK bất ổn định với sự thay đổi của nhiệt độ và pH, cần thiết
phải có những nghiên cứu thêm để NK đạt độ ổn định cao hơn, tạo điều kiện
thuận cho quá trình sản xuất, bảo quản NK, hơn nữa giúp enzyme bền hơn
trong trình tiêu hóa cũng sẽ giúp tăng hiệu quả hoạt động của enzyme trong
máu [17, 39].
2.
2.1.

Bacillus subtilis natto
Giới thiệu về Bacillus subtilis natto
Năm 1913, Tiến sĩ S. Sawamura đã phân lập được trực khuẩn natto và

đặt tên là Bacillus subtilis natto. Natto đầu tiên sử dụng phương pháp nuôi cấy
thuần chủng B. subtilis đã được bán bởi Giáo sư J. Hanzawa vào năm 1928
[69].

Bacillus subtilis natto thuộc loài Bacillus sutilis để lên men đậu tương
luộc tạo natto. B. subtilis natto có cả dạng tế bào sinh dưỡng và dạng bào tử.
Các bào tử thích hợp hơn để bảo quản. Vẫn chưa có bằng chứng chứng minh
tác dụng riêng có lợi của vi khuẩn này. Tuy nhiên, đến nay chưa có chủng B.
subtilis nào khác có thể lên men ra natto. Điều này là do natto với các đặc tính
chỉ có thể được sản xuất với các chủng B. subtilis. Sử dụng các chủng B.
subtilis tạo ra natto có mùi thơm đặc biệt, lớp vi khuẩn nhăn trên bề mặt đậu
nành và độ dính mong muốn [51].
2.2.

Đặc điểm và hình thái của Bacillus subtilis natto
B. subtilis natto là một loại vi khuẩn hình thành bào tử Gram (+) tự

nhiên và được coi là an tồn [31]. Vì là vi khuẩn hiếu khí nên trong q trình
ni cấy B. subtilis natto cần phải bổ sung oxy. Nhiệt độ tối ưu là 37˚C - 43˚C
và ngừng sinh trưởng ở 55˚C [46].

6


2.3.

Ứng dụng của Bacillus subtilis natto
B. subtilis natto được sử dụng để sản xuất Fructooligosaccharides

(FOSs) là các oligomer của fructose với mức độ trùng hợp thấp (DP) và được
sử dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm do
liên tạo ra các đặc tính y sinh như cải thiện hấp thụ khoáng chất [42], chống
ung thư [54], các hoạt động chống đái tháo đường [9], chống oxy hóa và bảo
vệ gan [13].

B. subtilis natto cũng được sử dụng như một chủng sinh tổng hợp
vitamin K2. Bằng cách phát hiện sự thay đổi điện thế oxy hóa khử trong quá
trình sinh trưởng của B. subtilis, một nguồn cung cấp oxy tốt và trạng thái của
màng tế bào được cho là có lợi cho q trình tổng hợp vitamin K2 [7, 66].
Bacillus subtilis natto cịn có ảnh hưởng tốt đối với động vật nhai lại.
Nó có tiềm năng được ứng dụng như một chế phẩm sinh học dùng cho bị sữa.
Uống B.subtilis natto đã được chứng minh có tác dụng thúc đẩy sự tăng
trưởng và chức năng miễn dịch của bê sữa [61], tăng sự phát triển dạ cỏ của
bê [60], cải thiện sản lượng sữa và thay đổi q trình lên men dạ cỏ của bị
sữa [50, 62].
Ngồi ra, B. subtilis natto có tác dụng điều hịa miễn dịch đối với đại
thực bào. Nghiên cứu đo việc sản xuất TNF‐α, IFN‐γ, IL‐1β, IL‐6, IL‐12, IL‐
10 và MIP‐2 bởi các tế bào RAW 264,7 được xử lý bằng B. subtilis natto để
đánh giá các phản ứng miễn dịch và viêm của đại thực bào. Từ đó thấy rằng
B. subtilis natto tăng cường chức năng miễn dịch của đại thực bào bằng cách
thúc đẩy các phản ứng miễn dịch và viêm.
Ứng dụng chính của B. subtilis natto là lên men đậu nành luộc tạo natto
thu enzyme Nattokinase [65] và sản xuất γ-Polyglutamic acid (γ-PGA) là một
loại polymer tan trong nước được sử dụng làm chất tạo màng sinh học ứng
dụng trong các ngành công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm [14]. γ7


Polyglutamic acid (γ-PGA) là một trong những vật liệu tạo nên độ dính của
chế phẩm natto [49].
3.

Vật liệu cố định enzyme
Các vật liệu được sử dụng để cố định enzyme được gọi là chất mang

hoặc ma trận hỗ trợ. Các đặc điểm của ma trận là quan trọng hàng đầu quyết

định sự thành công và kết quả của enzyme cố định.
Chất mang lý tưởng cần bao gồm các đặc điểm như chi phí thấp và thân
thiện với mơi trường, hồn tồn trơ sau khi cố định và khơng cản trở các phản
ứng mong muốn, có khả năng chống nhiệt, cơ học và cho phép enzyme hoạt
động trong các điều kiện khác nhau. Ngồi ra, chất mang cần có độ ổn định
cao, giúp tăng cường tính đặc hiệu của enzyme, có thể làm thay đổi pH tối ưu
của enzyme để nó hoạt động đến giá trị mong muốn [57].
Trên cơ sở thành phần hóa học của chất mang, chúng được phân loại
thành 2 nhóm chính: vật liệu cố định vơ cơ và vật liệu cố định hữu cơ.
Vật liệu cố định vơ cơ thường bền với các tác động bên ngồi, khả năng
chịu nhiệt và cơ học cao, không bị vi sinh vật ăn mòn, phân hủy, nhưng việc
gắn với enzyme thường khó khăn. Tính năng đặc trưng là cung cấp độ cứng
và độ xốp cho enzyme cố định [28, 57]. Một số vật liệu vô cơ thông dụng
như: thủy tinh xốp, silica gel, aluminium, oxit kim loại, zirconia (oxit kim loại
của zirconium) và nhiều các vật liệu khác…
Vật liệu cố định hữu cơ là những chất có các nhóm hoạt động hóa học
như: -NH2, -COOH, -OH… nên có thể dễ dàng gắn với enzyme. Tuy nhiên,
độ bền với các tác động của môi trường không cao, đặc biệt là các polymer
sinh học rất dễ bị vi sinh vật xâm nhập và tấn công. Vật liệu cố định hữu cơ
được chia làm các polymer tự nhiên (Bảng 1.1) và các polymer tổng hợp.
Các polymer tổng hợp là nhựa trao đổi ion có bề mặt xốp và khơng hịa
tan trong tự nhiên. Những polymer này, vì cấu trúc của chúng nên có thể cố
8


định enzyme rất mạnh. Chúng trơ trước sự tấn công của vi sinh vật. Một số
polymer tổng hợp cố định enzyme như: Amberlite và DEAE cellulose được
sử dụng để cố định α-amylase [37], PVC được sử dụng để cố định
cyclodextrin glucosyltransferase, ngăn chặn sự bất hoạt do nhiệt của enzyme
[3]…

Bảng 1.1. Vật liệu polymer tự nhiên
Polymer tự nhiên

Tính chất

Alginate

Có thể tái sử dụng, cải thiện sự ổn định của enzyme [19, 21].

Chitosan và chitin

Được dùng kết hợp với alginate. Ít bị rửa trôi, hơn thế nữa
đáng tin cậy để sử dụng cho bẫy enzyme, ở dạng hạt, có thể
bẫy được nhiều enzyme hơn [8, 12].

Collagen

Giữ lại đáng kể hoạt động sau nhiều chu kì tái sử dụng [16,
35].

Carrageenan
Cải thiện sự ổn định, rẻ, bền và hiệu quả [33, 63].
(tuyến tính sunfat
hóa
polysaccharide)
Gelatin

Khả năng hấp phụ cao, thúc đẩy tải hiệu quả [55].

Cellulose

Thường sử dụng để hấp phụ, liên kết ion, liên kết cộng hóa trị
hoặc bẫy trong gel [4, 10, 45].

Tinh bột

Ổn định.

Sepharose

Xốp, dễ hấp phụ, giữ được tính chất xúc tác ở các cực pH,
nhiệt độ, nồng độ muối cao [29].

Pectin

Được sử dụng cùng với glycerol làm chất hóa dẻo để giảm độ
giòn của chất hỗ trợ Pectin-chitin và pectin-canxi alginate đã
tăng cường khả năng chịu nhiệt, biến tính và các đặc tính xúc
tác [11, 24].

4.
4.1.

Chất mang sử dụng trong nghiên cứu cố định Nattokinase
Poly glutamic acid (PGA)
Poly glutamic acid (PGA) là một polyme sinh học hịa tan trong nước

có khả năng tự phân hủy, được tạo thành từ các đơn vị D- và L-glutamic acid

9

[56]. PGA được chia thành hai dạng α-PGA và γ-PGA tùy thuộc vào việc gắn
nhóm caboxyl. So với α-PGA, γ-PGA được sản xuất rộng rãi hơn bởi vi
khuẩn đặc biệt là những loài thuộc chi Bacillus. Với ưu thế là một polyme tự
nhiên, không độc với con người, không gây đáp ứng miễn dịch nên γ-PGA
được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực ví dụ như: trong cơng nghiệp mơi
trường γ-PGA được sử dụng làm chất kết tụ, hỗ trợ quá trình lắng; trong sản
xuất thực phẩm γ-PGA được sử dụng như một dạng phụ gia ổn định chất
lượng sản phẩm, chất chống kết tinh…; trong y dược γ-PGA được dùng như
các chất mang, chất giữ ẩm… [70]. PGA đã đươc chứng minh có khả năng
làm bền một số enzyme trong đó có cả Nattokinase [30, 40]. Hơn nữa, PGA
cũng là sản phẩm thu được trong quá trình lên men natto sản xuất nattokinase
từ Bacillus subtillis, do đó thực sự thích hợp trong việc làm chất mang phối
trộn với nattokinase tăng độ bền enzyme trong quá trình sản xuất chế phẩm
Nattokinase.
4.2.

Microcrystalline cellulose (MCC)
Cellulose bản chất là polysaccharide cấu tạo nên vách tế bào thực vật

và là hợp chất hữu cơ có nhiều nhất trong sinh quyển. Cellulose và dẫn xuất
của nó như CM cellulose, DEAE cellulose, triacetate cellulose, diacetate
cellulose, micrystalline cellulose (MCC)… được sử dụng rộng rãi làm chất
mang để cố định enzyme. Cellulose có tính chất cơ lý khá tốt, giá rẻ có thể sử
dụng ở dạng sợi và dạng vi hạt, dạng màng.
5.
5.1.

Một số nghiên cứu về hướng của đề tài

Nghiên cứu trong nước
Ở Việt Nam hiện nay cũng đã có một số cơng trình nghiên cứu của

trường đại học Bách khoa – Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh,
trường đại học Sư phạm- Đại học Đà Nẵng về vấn đề cố định enzyme bằng
chất mang Chitosan và chất mang Cacboxymethylcellulose (CMC)-alginate.

10


Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu về cố định enzyme để ổn định hoạt tính của
enzyme Nattokinase.
Bùi Xn Đơng và cộng sự (2018) đã tiến hành nghiên cứu ezyme
lipase cố định trên chất mang Chitosan-Fe3O4 bằng liên kết cộng hóa trị. Chất
mang là phức hợp các hạt nano Fe3O4 được hấp phụ trên chitosan nên có từ
tính. Enzyme liên kết với vi hạt thông qua cầu nối trung gian là
glutaraldehyde. Kết quả cố định trên vi hạt chitosan-Fe3O4 đã được chế tạo
thành công với hiệu suất gắn lipase lên chất mang đạt 75,1% so với lượng
lipase tự do ban đầu [1].
Huỳnh Ngọc Oanh và cộng sự (2007) đã tiến hành khảo sát quá trình cố
định enzyme α-amylase (termamyl) bởi chất mang CMC-alginate. Kết quả đạt
được là hoạt tính của enzyme α-amylase (termamyl) cố định bởi gel CMCalginate cao tại nồng độ alginate 75%, nồng độ CaCl2 6%. Nồng độ CMC
thích hợp để cố định enzyme Termamyl là 2%. Hoạt tính enzyme Termamyl
cố định phụ thuộc vào cơ chất, pH và nhiệt độ phản ứng. Kết quả cho thấy
khả năng chịu nhiệt của enzyme cố định còn phụ thuộc vào chất mang. Cơ
chất có kích thước càng nhỏ càng dễ tiếp xúc enzyme cố định. Tuy nhiên
enzyme cố định sẽ bị thất thốt sau q trình tái sử dụng, ở lần sử dụng thứ 10
hoạt tính giảm một nửa [2].
5.2.

Nghiên cứu trên thế giới
Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về tìm vật liệu tăng cường sự ổn

định cho hoạt động của enzyme.
Lee và cộng sự (2010) đã tiến hành nghiên cứu tăng cường hoạt động
và sự ổn định của enzyme bằng γ-Polyglutamic acid. γ-PGA ngăn chặn hiệu
quả sự biến tính của enzyme bằng cách xử lý nhiệt và lặp lại q trình đơng
lạnh-rã đơng [40].

11


Deepak và cộng sự (2009) tiến hành tinh chế, cố định và xác định đặc
tính của Nattokinase trên các hạt nano polyhydroxybutyrate (PHB). Trong
nghiên cứu này, nattokinase được tinh chế từ Bacillus subtilis bằng sắc ký
trao đổi ion và cố định trên các hạt nano polyhydroxybutyrate (PHB). Việc cố
định Nattokinase trên các hạt nano PHB làm tăng 20% hoạt tính của
enzyme. Sự cố định cũng góp phần tăng cường tính ổn định của enzyme. Hơn
nữa, hoạt tính hồn tồn được giữ lại khi bảo quản ở 4°C trong 25
ngày. Phương pháp này đã được chứng minh là rất đơn giản và có thể được
thực hiện cho các enzym khác. [17].
Law và cộng sự (2007) đã nghiên cứu phát triển một cơng thức mới
nhằm ổn định enzyme Nattokinase và kiểm sốt tốc độ giải phóng của nó khi
qua đường tiêu hóa bằng cách nén enzyme Nattokinase cùng các tá dược
thành viên nén sau đó được phủ bởi hỗn hợp Eudragit® L100-55 (EL100-55)
và Hydroxypropylcellulose (HPC) bằng cách nén trực tiếp [39].

12

CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Vật liệu
1.1.

Chủng
Chủng được sử dụng là chủng vi khuẩn B. subtilis được thu nhận từ

phịng Cơng nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt nam (VAST).
1.2.

Hóa chất
Hóa chất sử dụng trong phịng thí nghiệm đều ở dạng tinh khiết, một số

hóa chất chính như: cao nấm men, pepton, agar, xanh methylene, Ethanol,
tricloacetic acid (TCA), Folin, Microcrystalline cellulose (MCC) (AladdinTrung Quốc).
2. Phương pháp nghiên cứu

13


Quy trình nghiên cứu vật liệu cố định enzyme Nattokinase được
tóm tắt trên hình 2.1.

Hình 2.1. Sơ đồ quy trình nghiên cứu tìm vật liệu cố định enzyme NK

14


2.1.

Phương pháp nuôi cấy

2.1.1. Phương pháp tinh chế thu enzyme Nattokinase từ chủng vi khuẩn
B. subtilis
Chủng vi khuẩn B. subtilis bảo quản ở điều kiện -84°C được hoạt hóa
lại trên môi trường LB đặc ở 37°C trong 24 giờ. Một khuẩn lạc riêng rẽ từ đĩa
hoạt hóa được cấy chuyển vào 3 ml môi trường LB lỏng. Mẫu được nuôi lắc ở
37°C, 200 vòng/phút (rpm) trong 24 giờ. Chủng B. subtilis tiếp tục được
chuyển vào bình lên men lớn 1 lít quy mơ phịng thí nghiệm chứa 250 ml mơi
trường LB lỏng, sau đó ni lắc bình ở 37°C với tốc độ 200 rpm trong 48 giờ.
Sau đó tiến hành ly tâm 5000 rpm trong 15 phút để thu dịch nổi phía trên
chứa enzyme NK thơ.
2.1.2. Phương pháp tinh chế γ-Polyglutamic acid (γ-PGA) từ chủng B.
subtilis
Chủng B. subtilis bảo quản ở điều kiện -84°C được hoạt hóa lại trên
mơi trường GSP đặc ở 37°C trong 24 giờ. Một khuẩn lạc riêng rẽ từ đĩa hoạt
hóa được cấy vào 3 ml môi trường GSP lỏng, nuôi lắc ở 37°C, 200 rpm, 24
giờ. Chủng B. subtilis tiếp tục được chuyển vào bình lên men lớn 500 ml chứa
100 ml môi trường GSP lỏng, nuôi lắc ở 37°C, 200 rpm và 24 giờ. Sau khi
nuôi lắc, tiến hành ly tâm 10000 rpm trong 10 phút ở 4°C thu dịch nổi chứa γPGA. Chất lỏng chứa γ-PGA được tinh chế bằng cách thêm NaCl 5M và
Ethanol theo tỉ lệ 1:1,25:2,5. Sau đó, ly tâm 12.000 rpm trong 10 phút. Kết tủa
của γ-PGA được làm khơ ở nhiệt độ phịng và hịa tan trong đệm PBS 1X.
2.1.3. Điều chế Na-γ-PGA
Để điều chế γ-PGA ở dạng muối natri, γ-PGA được trộn với NaOH 0,1
M ở máy lắc với tốc độ 200 rpm trong 24 giờ, sau đó hỗn hợp được thẩm tích
trong bình nước cất lạnh 24 giờ.

15

2.2.

Phương pháp tinh sạch enzyme

2.2.1. Phương pháp tủa bằng muối ammonium sulfate
Phương pháp này dựa trên khả năng tạo kết tủa của các protein (bao
gồm enzyme) ở một nồng độ muối xác định (tính theo % nồng độ bão hịa) để
loại bỏ bước đầu protein tạp trong dịch enzyme thô ban đầu. Muối tốt nhất
được sử dụng là (NH4)2SO4 vì nó có tác dụng làm ổn định phần lớn các loại
enzyme.
Dịch enzyme thô được tủa muối ammonium sulfate ở các nồng độ bão
hòa 30 % và 70 % trong 30 phút ở 4°C. Sau đó ly tâm 12000 rpm trong 15
phút ở 4°C. Tủa thu được phơi khô ở nhiệt độ phòng, tiến hành hòa tủa với
đệm PBS 1X để xác định hàm lượng protein và hoạt độ của enzyme NK.
Lượng ammonium sulfate thêm vào dịch được xác định theo cơng thức
[68]
G=

515 ×( X−𝑋0 )

100−(0,27×X)

Trong đó: G: số gram muối ammonium sulfate thêm vào dịch enzyme
thô
X: nồng độ muối bão hòa cần thiết
X0: nồng độ muối ban đầu
2.2.2. Phương pháp tủa bằng cồn
Pha lỗng dịch enzyme NK thơ với cồn tuyệt đối tỉ lệ 1 NK: 4 EtOH
trong 4 giờ ở -20°C. Sau đó ly tâm dịch 12000 rpm trong 15 phút ở 4°C. Tủa

sau khi thu được phơi khô ở nhiệt độ phòng. Hòa tủa với đệm PBS 1X để xác
định hàm lượng protein và hoạt độ của enzyme NK.

16


2.2.3. Phương pháp thẩm tích
Phương pháp thẩm tích dùng để loại bỏ ammonium sulfate sau kết tủa
ra khỏi dịch enzyme. Túi thẩm tích được hoạt hóa bằng đệm hoạt hóa túi thẩm
tích, dịch tủa thu được cho vào túi đã hoạt hóa, đặt túi thẩm tích vào cốc nước
cất khử trùng lạnh, khuấy nhẹ trên máy khuấy từ. Trong quá trình thẩm tích,
nước cất lạnh được thay ba lần, hai lần đầu cách nhau 3 giờ, lần thứ ba để qua
đêm.
2.2.4. Phương pháp điện di SDS-PAGE
Độ tinh sạch của dịch enzyme được đánh giá bằng phương pháp điện di
trên gel polyacrylamide 12,5 % theo phương pháp điện di biến tính của
Laemmli và cộng sự (1970) [38]. Theo đó, trong mơi trường chứa SDS các
phân tử protein bị phá vỡ cấu trúc khơng gian và tích điện âm, do đó sẽ di
chuyển về cực dương trong điện trường với tốc độ phụ thuộc vào khối lượng
phân tử của chúng.
Tiến hành
Chuẩn bị bản gel: bản gel gồm hai lớp gel tách và gel co, lớp dưới là
gel tách được đổ cách mặt trên 1,5 cm, để đơng hồn tồn trong 30 phút, sau
đó đổ tiếp gel co ở phía trên, cài lược để định vị từng giếng riêng biệt, để 30
phút cho bản gel đơng hồn tồn và ổn định.
Biến tính mẫu: Mẫu protein được bổ sung đệm xử lý mẫu dye 5x với tỷ
lệ mẫu/dye là 5:1, biến tính ở 95°C, 10 phút, sau đó để tủ -20°C trong 1 phút.
Điện di: Bản gel lắp vào hệ thống điện di và chạy với cường độ là 20
mA (10 - 15 phút) cho lớp gel co và 25 mA cho lớp gel tách đến khi hàng
mẫu chạy xuống đáy bản gel. Sau điện di, bản gel được tách khỏi phiến kính

rồi nhuộm bằng Coomassie Brilliant Blue trong 1,5 - 3 giờ, tẩy màu bằng
dung dịch tẩy PAGE. Sau khi tẩy màu kiểm tra kết quả bằng mắt thường.

17