Nghiên cứu thu nhận enzyme chitinase từ chủng nấm trichoderma hazianum trên môi trường rắn và khảo sát khả năng chuyển hóa chitin trong quá trình lên men đồ án tốt nghiệp

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH
KHOA HÓA HỌC
===  ===

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Đề tài:
NGHI£N CøU THU NHËN ENZYME CHITINASE
Tõ CHñNG NÊM TRICHODERMA HAZIANUM TRÊN MÔI
TRƯờNG RắN
Và KHảO SáT KHả NĂNG CHUYểN HóA CHITIN
TRONG QUá TRìNH LÊN MEN

Giỏo viờn hng dn:

ThS. o Th Thanh Xuân

Sinh viên thực hiện:

Lê Thị Phƣơng

Lớp:

49K - Công nghệ thực phẩm

Mã số sinh viên:

0852040456

NGHỆ AN - 2012

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH

ĐỘC LẬP - TỰ DO - HẠNH PHÚC

NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Họ và tên sinh viên: Lê Thị Phƣơng

Số hiệu sinh viên: 0852040456

Khóa:

49

Ngành:

Cơng Nghệ thực phẩm

1.

Tên đề tài:

“Nghiên cứu thu nhận enzyme chitinase từ chủng nấm

Trichoderma hazianum trên môi trường rắn và khảo sát khả năng chuyển
hóa chitin trong q trình lên men”
2.

Nội dung nghiên cứu, thiết kế tốt nghiệp:
……………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………

3.

Họ tên cán bộ hƣớng dẫn:

ThS. Đào Thị Thanh Xuân

4.

Ngày giao nhiệm vụ đồ án:

Ngày

tháng

năm

5.

Ngày hồn thành đồ án:

Ngày

tháng

năm
Ngày

tháng

năm 2012

Chủ nhiệm bộ mơn

Cán bộ hƣớng dẫn

(Ký, ghi rõ họ, tên)

(Ký, ghi rõ họ, tên)

Sinh viên đã hoàn thành và nộp đồ án tốt nghiệp ngày

tháng

năm 2012

Ngƣời duyệt
(Ký, ghi rõ họ, tên)


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH

ĐỘC LẬP - TỰ DO - HẠNH PHÚC

BẢN NHẬN XÉT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Họ và tên sinh viên: Lê Thị Phƣơng

Số hiệu sinh viên:

Khóa:

Ngành: Cơng nghệ thực phẩm

49

0852040456

Cán bộ hướng dẫn: ThS. Đào Thị Thanh Xuân
Cán bộ duyệt:
1.

Nội dung nghiên cứu, thiết kế:
……………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………

2.

Nhận xét của cán bộ hƣớng dẫn:

……………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………
………………………………........................……………………………………
Ngày

tháng

năm 2012

Cán bộ hƣớng dẫn
(Ký, ghi rõ họ, tên)


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH

ĐỘC LẬP - TỰ DO - HẠNH PHÚC

BẢN NHẬN XÉT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Họ và tên sinh viên: Lê Thị Phƣơng

Số hiệu sinh viên:

Khóa:

Ngành: Cơng nghệ thực phẩm

49

0852040456

Cán bộ hướng dẫn: ThS. Đào Thị Thanh Xuân
Cán bộ duyệt:
1.

Nội dung nghiên cứu, thiết kế:
……………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………

2.

Nhận xét của cán bộ duyệt:
……………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………
………………………………........................……………………………………
Ngày

tháng

năm 2012

Cán bộ duyệt
(Ký, ghi rõ họ, tên)


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: ThS. Đào Thị Thanh Xuân

LỜI CẢM ƠN
Đồ án được thực hiện tại phịng thí nghiệm của Bộ mơn Cơng nghệ Hóa thực
phẩm, Trường Đại học Vinh. Để hoàn thành được đồ án này ngoài sự cố gắng của bản
thân tôi đã nhận được rất nhiều sự động viên, giúp đỡ của nhiều cá nhân và tập thể.
Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến ThS. Đào Thị Thanh Xuân,
giảng viên Khoa Hóa học, trường Đại học Vinh đã tận tình hướng dẫn tơi trong suốt
q trình nghiên cứu và hồn thành đồ án tốt nghiệp.
Xin cùng bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các thầy cô giáo, người đã đem lại cho
tơi những kiến thức bổ trợ, vơ cùng có ích trong những năm học vừa qua.
Cũng xin gửi lời cám ơn chân thành tới các thầy cô giáo, cán bộ kỹ thuật viên
phịng thí nghiệm Hóa thực phẩm, Phịng Hóa vô cơ đã tạo điều kiện và giúp đỡ em
trong thời gian nghiên cứu và hoàn thành đồ án tốt nghiệp.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cám ơn đến gia đình, bạn bè, những người đã ln
bên tơi, động viên và khuyến khích tơi trong q trình thực hiện đề tài nghiên cứu
của mình.
Vinh, tháng 12 năm 2012
Sinh viên
Lê Thị Phƣơng

SVTH: Lê Thị Phương

i

Lớp 49K - CN thực phẩm


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: ThS. Đào Thị Thanh Xuân

TÓM TẮT ĐỒ ÁN
Nghiên cứu thu nhận enzyme chitinase từ chủng nấm Trichoderma hazianum
trên môi trường rắn và khảo sát khả năng chuyển hóa chitin trong q trình lên men.
Nội dung nghiên cứu:
 Nuôi cấy nấm Trichoderma hazianum sinh tổng hợp enzyme chitinase trên
môi trường rắn.
 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian, độ ẩm, nhiệt độ,tỷ lệ cơ chất, pH tới
quá trình sinh tổng hợp enzym chitinase từ chủng nấm Trichoderma hazianum.
 Nghiên cứu q trình đồng thời chuyển hóa chitin và lên men để tạo
Glucosamin dưới xúc tác enzym chitinase.
Đề tài đã đạt được một số kết quả như sau:
1. Thu nhận được enzyme chitinase từ q trình ni cấy nấm Trichoderma
harzianum trên môi trường rắn.
2. Nghiên cứu được một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp
chitinase trên mơi trường rắn thu được enzym có hoạt tính cao tại:
- Thời gian ni cấy:

5 ngày

- Độ ẩm:

55 %

- Nhiệt độ:

300C

- Tỷ lệ cơ chất:

1,6 % trên tổng khối lượng môi trường.

- pH:

5

3. Nghiên cứu được một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình đồng thời lên men
và chuyển hóa chitin bằng enzyme chitinase tạo ra hàm lượng đường amin nhiều nhất
tại các điều kiện:
- Thời gian chiết: 24 giờ.
- Hàm lượng cơ chất bổ sung vào q trình trích ly: 3g/ml.
- Bổ sung cơ chất trong 4 lần, mỗi lần ¼ tổng lượng cơ chất tối ưu.

SVTH: Lê Thị Phương

ii

Lớp 49K - CN thực phẩm


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: ThS. Đào Thị Thanh Xuân

MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................. i
TÓM TẮT ĐỒ ÁN......................................................................................................... ii
DANH MỤC CÁC HÌNH, BẢNG ................................................................................ v
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1
1.

Lí do chọn đề tài ................................................................................................ 1

2.

Mục tiêu, yêu cầu và ý nghĩa của đề tài ............................................................. 2

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ......................................................................................... 3
1.1.

Chủng nấm sợi Trichoderma hazianum ............................................................ 3

1.1.1.

Giới thiệu chủng................................................................................................. 3

1.1.2.

Nguồn dinh dưỡng cơ bản của chủng Trichoderma hazianum ......................... 5

1.2.

Enzyme Chitinase .............................................................................................. 6

1.2.1.

Định nghĩa .......................................................................................................... 6

1.2.2.

Phân loại............................................................................................................. 7

1.2.3.

Cấu trúc của hệ enzyme Chitinase ..................................................................... 9

1.2.4.

Các đặc tính cơ bản của enzym chitinase .......................................................... 9

1.2.5.

Các loại cơ chất của enzym Chitinase ............................................................. 11

1.2.6.

Cơ chế tác dụng................................................................................................ 13

1.2.7.

Cơ chế cảm ứng ............................................................................................... 15

1.2.8.

Nguồn thu nhận Chitinase ................................................................................ 16

1.2.9.

Ứng dụng của chitinase.................................................................................... 17

1.2.10. Tình hình nghiên cứu thu nhận chitinase từ Trichoderma............................... 20
1.3.

Glucosamin ...................................................................................................... 22

1.3.1.

Cấu trúc hóa học và tinh chất hóa lý của glucosamin ...................................... 22

1.3.2.

Tác dụng của glucosamin ................................................................................ 22

1.3.3.

Tình hình nghiên cứu sản xuất glucosamin trên thế giới và ở Việt Nam ........ 23

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU, PHƢƠNG PHÁP ............................................................ 26
2.1.

Vật liệu và hóa chất, mơi trường...................................................................... 26

2.1.1.

Vật liệu ............................................................................................................. 26

2.1.2.

Thiết bị và hóa chất .......................................................................................... 26

SVTH: Lê Thị Phương

iii

Lớp 49K - CN thực phẩm


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: ThS. Đào Thị Thanh Xuân

2.1.3.

Các môi trường ................................................................................................ 28

2.2.

Phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 28

2.2.1.

Phương pháp xác định hoạt độ enzyme chitinase ............................................ 28

2.2.2.

Phương pháp xác định đường amin theo Elson-Morgan ................................. 29

2.2.3.

Phương pháp điều chế chitin từ vỏ tơm bằng phương pháp hóa học............... 30

2.2.4.

Phương pháp thu nhận enzym chitinase trên môi trường rắn .......................... 32

2.2.5.

Phương pháp nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đên sự sinh tổng
hợp enzyme chitinase ....................................................................................... 33

2.2.6.

Phương pháp nghiên cứu nâng cao hiệu suất thủy phân tạo đường
amin của chitinase ........................................................................................... 36

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.............................................................. 38
3.1.

Nghiên cứu q trình sinh tổng hợp enzym từ chủng Trichodermar
trên mơi trường rắn .......................................................................................... 38

3.1.1.

Nghiên cứu Ảnh hưởng của thời gian ni cấy đến q trình sinh tổng
hợp enzyme chitinase trên môi trường rắn ...................................................... 39

3.1.2.

Nghiên cứu Ảnh hưởng của độ ẩm đến q trình sinh tổng hợp enzyme
chitinase trên mơi trường rắn ........................................................................... 40

3.1.4.

Nghiên cứu ảnh hưởng của cơ chất đến q trình sinh tổng hợp
enzyme chitinase trên mơi trường rắn ............................................................. 42

3.1.5.

Nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến quá trình sinh tổng hợp enzyme
chitinase trên mơi trường rắn ........................................................................... 43

3.2.

Q trình lên men và chuyển hóa đồng thời chitin .......................................... 45

3.2.1.

Nghiên cứu thời gian quá trình đồng thời lên men và chuyển hóa chitin ........ 45

3.2.2.

Nghiên cứu hàm lượng cơ chất tối ưu cho quá trình đồng thời chiết
enzym và thủy phân chitin ............................................................................... 46

3.2.3.

Nghiên cứu cách bổ sung cơ chất cho quá trình đồng thời chiết enzym
và thủy phân chitin ........................................................................................... 47

KẾT LUẬN .................................................................................................................. 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................... 50

SVTH: Lê Thị Phương

iv

Lớp 49K - CN thực phẩm


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: ThS. Đào Thị Thanh Xuân

DANH MỤC CÁC HÌNH, BẢNG
Trang
Hình:
Hình 1.1.

Bào tử và q thể nấm Trichoderma hazianum .......................................... 3

Hình 1.2.

Bào tử nấm Trichoderma hazianum ............................................................ 4

Hình 1.3.

Vị trí thủy giải phân tử chitin bởi enzyme chitinase ................................... 7

Hình 1.4.

Sơ đồ phân cắt chitin bởi enzyme thuộc nhóm chitinase ............................ 7

Hình 1.5.

Mơ hình cấu trúc Khơng gian của enzyme chitinase Serratia marcescens........ 9

Hình 1.6.

Mơ hình cấu trúc khơng gian của chitinase Hodeum Vulgale .................... 9

Hình 1.7.

Cấu trúc hóa học của Allosamidin và dẫn xuất Allosamidin .................... 11

Hình 1.8.

Cấu trúc hóa học của chitin ....................................................................... 12

Hình 1.9.

Các dạng lập thể của chitin ....................................................................... 13

Hình 1.10. Cơ chế thủy giải tại trung tâm hoạt hóa của enzyme chitinase ................. 14
Hình 1.11. Các vị trí kết nối giữa cơ chất chitin và enzyme chitinase tại trung
tâm hoạt hóa .............................................................................................. 14
Hình 1.12. Cơng thúc cấu tạo của glucosamin ............................................................ 22
Hình 2.1.

Trichoderma phát triển trên mơi trường PGA ........................................... 26

Hình 2.2.

Chitin ......................................................................................................... 31

Hình 2.3.

Chitin huyền phù 1% ................................................................................. 32

Hình 3.1.

Đường chuẩn Glucosamin nng 300 ữ500 (àg/ml) ............................. 38

Hỡnh 3.2.

So sỏnh gia lên men trên môi trường rắn và môi trường lỏng ................ 38

Hình 3.3.

Ảnh hưởng của thời gian ni cấy tới quá trình sinh tổng hợp enzym
chitinase ..................................................................................................... 39

Hình 3.5.

Ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ tới quá trình sinh tổng hợp enzym
chitinase ..................................................................................................... 41

Hình 3.6.

Ảnh hưởng của nguồn cơ chất tới quá trình sinh tổng hợp enzym
chitinase ..................................................................................................... 43

Hình 3.7.

Ảnh hưởng của yếu tố pH tới quá trình sinh tổng hợp enzym
chitinase ..................................................................................................... 44

Hình 3.8.

Ảnh hưởng của thời gian tới q trình lên men và chuyển hóa đồng
thời chitin .................................................................................................. 46

SVTH: Lê Thị Phương

v

Lớp 49K - CN thực phẩm


Đồ án tốt nghiệp
Hình 3.9.

GVHD: ThS. Đào Thị Thanh Xuân

Ảnh hưởng của hàm lượng cơ chất tới quá trình lên men và chuyển
hóa đồng thời chitin ................................................................................... 47

Hình 3.10. Ảnh hưởng của cách bổ sung cơ chất tới quá trình lên men và
chuyển hóa đồng thời chitin ...................................................................... 48

Bảng:
Bảng 2.1.

Cách pha nồng độ glucosamin 300 - 500µg/ml ........................................ 30

Bảng 3.1.

Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tới hoạt độ enzym chitinase ............... 39

Bảng 3.2.

Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường tới hoạt độ enzym chitinase ............... 40

Bảng 3.3.

Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy tới hoạt độ ........................................... 41

Bảng 3.4.

Ảnh hưởng tỷ lệ cơ chất tới hoạt độ enzym chitinase ............................... 42

Bảng 3.5.

Ảnh hưởng của pH nuôi cấy tới hoạt độ enzym chitinase ........................ 44

Bảng 3.6.

Ảnh hưởng của thời gian tới q trình lên men và chuyển hóa đồng
thời chitin .................................................................................................. 45

Bảng 3.7.

Ảnh hưởng của hàm lượng cơ chất tới q trình lên men và chuyển
hóa đồng thời chitin ................................................................................... 47

Bảng 3.8.

Ảnh hưởng của cách bổ sung cơ chất tới q trình lên men và
chuyển hóa đồng thời chitin ...................................................................... 48

SVTH: Lê Thị Phương

vi

Lớp 49K - CN thực phẩm


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: ThS. Đào Thị Thanh Xuân

MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Với vai trị là chất xúc tác sinh học, enzym có bản chất là protein, có cấu trúc
phân tử phức tạp và tinh vi. Đặc biệt hoạt lực xúc tác cao hơn nhiều so với chất xúc
tác thơng thường, và có tính đặc hiệu cao. Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ
của công nghệ sinh học, các chế phẩm enzyme được sản xuất và ứng dụng trong nhiều
lĩnh vực khác nhau như thực phẩm, nơng nghiệp, thức ăn chăn ni, y học....
Enzym có thể được khai thác từ nhiều nguồn khác nhau. Mặc dù vậy, hiện nay
người ta khai thác nhiều nhất enzyme từ vi sinh vật. Do vi sinh vật có số lượng nhiều
nhất và có khả năng chuyển hóa vật chất trong tự nhiên mạnh nhất. Hơn thế so với
nguồn khai thác enzyme từ động vật và thực vật, nguồn enzyme từ vi sinh vật có nhiều
ưu điểm như hoạt tính enzyme cao, thời gian tổng hợp enzyme từ vi sinh vật rất ngắn
(chỉ vài ngày), nguyên liệu sản xuất rẻ tiền, có thể sản xuất hồn tồn theo quy mơ
cơng nghiệp. Nhiều enzyme được khai thác từ vi sinh vật được tập trung nghiên cứu
và có nhiều ứng dụng trong thời gian qua như protease, amylase, cellulase,
pectinase,.... Những năm sau này người ta đang chú ý nhiều hơn về một loại enzyme
khác nữa là chitinase, đây là enzyme thủy phân chitin.
Những năm gần đây có nhiều cơng trình nghiên cứu tập trung vào enzyme
chitinase do tiềm năng ứng dụng to lớn của enzyme này trong nhiều lĩnh vực khác nhau
như trong thu nhận tế bào trần (thể nguyên sinh), sản xuất chitooligosaccharides,
glucosamin và N-acetyl glucosamin, sản xuất thuốc trừ sâu sinh học, ứng dụng trong y
học, trong việc kiểm soát nấm ký sinh trên cây trồng...
Chitinase được nghiên cứu nhiều trên đối tượng nấm sợi Trichoderma
Harzianum. Cả về sự điều hòa hay tối ưu hóa q trình sinh tổng hợp chitinase trên
mơi trường ni cấy chìm hay lên men bề mặt. Các nghiên cứu phần lớn tiến hành
trong môi trường lỏng. Cho tới năm 2003, Ashok Pandy và cộng sự nghiên cứu tối
ưu hóa q trình tổng hợp chitinase có tính kháng nấm từ Trichoderma Harzianum
nuôi cấy trên môi trường rắn. Dường như Trichoderma là chi nấm đến nay được
phát hiện có hoạt tính chitinase khá cao. Đó chính là tiền đề để chúng tôi thực hiện
đề tài: “Nghiên cứu thu nhận enzyme chitinase từ chủng nấm Trichoderma

hazianum trên môi trường rắn và khảo sát khả năng chuyển hóa chitin trong quá
trình lên men”.

SVTH: Lê Thị Phương

1

Lớp 49K - CN thực phẩm


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: ThS. Đào Thị Thanh Xuân

2. Mục tiêu, yêu cầu và ý nghĩa của đề tài
2.1. Mục tiêu
Nghiên cứu thu nhận enzyme chitinase từ chủng nấm Trichoderma hazianum
trên môi trường rắn và khảo sát khả năng chuyển hóa chitin trong q trình lên men.
2.2. u cầu
 Ni cấy nấm Trichoderma hazianum sinh tổng hợp enzyme chitinase trên
môi trường rắn.
 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh tổng hợp enzym chitinase
từ chủng nấm Trichoderma hazianum.
 Nghiên cứu quá trình đồng thời lên men và chuyển hóa chitin để tạo Nacetyl-glucosamin dưới xúc tác enzym chitinase.
2.3. Ý nghĩa
Tại Việt Nam cũng đã có các nghiên cứu thu nhận chitinase từ Trichoderma
hazianum. Tuy nhiên hoạt lực enzym từ các chủng phân lập ở Việt Nam có hoạt
tính chưa cao. Đề tài mang lại một số ý nghĩa khoa học và thực tiễn cho những
nghiên cứu sâu hơn về enzyme chitinase từ vi nấm Trichoderma hazianum.
Kết quả của đề tài sẽ bổ sung cho những nghiên cứu trước đó về vi nấm

Trichoderma hazianum, đồng thời làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo về vi
nấm Trichoderma hazianum. Kết quả nghiên cứu còn là nguồn tham khảo tốt cho
những nghiên cứu về những ứng dụng cụ thể của enzyme chitinase, nhất là
glucosamin để đưa vào sản xuất và đời sống nhằm giảm giá thành chế phẩm và
nâng cao hiệu quả sử dụng.

SVTH: Lê Thị Phương

2

Lớp 49K - CN thực phẩm


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: ThS. Đào Thị Thanh Xuân

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Chủng nấm sợi Trichoderma hazianum
1.1.1. Giới thiệu chủng

1.1.1.1. Nguồn gốc
Trichoderma hazianum được tìm thấy khắp mọi nơi trừ những vĩ độ Cực Nam
và Cực Bắc. Hầu hết các dòng Trichoderma hazianum đều hoại sinh, chúng phổ biến
trong những khu rừng nhiệt đới ẩm hay cận nhiệt đới, ở rễ cây, trong đất hay trên xác
sinh vật đã chết hoặc thực phẩm bị chua, ngũ cốc, lá cây hay kĩ sinh trên những loại
nấm khác [22]. Trichoderma hazianum rất ít tìm thấy trên thực vật sống và khơng
sống nội kí sinh với thực vật. Mỗi dịng nấm Trichoderma hazianum khác nhau có
nhu cầu nhiệt độ và độ ẩm khác nhau. [21]

1.1.1.2. Đặc điểm hình thái
Trichodema hazianum là một nấm đất, phát triển tốt trên các loại đất giàu dinh
dưỡng hoặc trên tàn dư thực vật. Đặc điểm hình thái của nấm này là cành bào tử không
màu, sợi nấm khơng màu, có vách ngăn, có khả năng phân nhánh nhiều và cho lượng
bào tử rất lớn. Bào tử thường có màu xanh, đơn bào, hình trứng, trịn, elip hoặc hình
oval tùy theo từng lồi. Bào tử đính ở đỉnh của cành [22].

Hình 1.1. Bào tử và quá thể nấm Trichoderma hazianum

1.1.1.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa, sinh học
Đa số các dòng nấm Trichoderma hazianum phát triển ở trong đất có PH từ 2,5
đến 9,5 và phát triển tốt ở PH = 4,5 - 6,5. Nhiệt độ để Trichoderma hazianum phát
triển tối ưu thường là 25 - 300C, ở một vài dòng phát triển tốt ở 350C, một số ít phát
triển được ở 400C [20], [22] hình thái khuẩn lạc và bào tử của Trichoderma hazianum
SVTH: Lê Thị Phương

3

Lớp 49K - CN thực phẩm


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: ThS. Đào Thị Thanh Xuân

khác nhau khi ở những nhiệt độ khác nhau. Ở 350C chúng tạo ra những rắn dị thường
với sự hình thành bào tử nhỏ và mép bất thường, Ở 370C không tạo ra bào tử sau 7
ngày nuôi cấy.
Trichoderma hazianum là loại nấm mốc, sợi nấm có vách ngăn, tế bào hữu tính
ít khi thấy rõ. Đính bào tử (conidi) là một tế bào hình cầu, hình trứng hoặc hình trụ

ngắn. Conidi khơng có chất nhầy bao bọc. Cuống conidi và các nhánh bên của cuống
dài và mảnh, khơng có đoạn sợi vơ sinh kéo dài, thể hình chai khơng cụm lại, có phần
mỏng manh [22].
Trichoderma hazianum là loại sản xuất nhiều kháng sinh và enzyme như
chitinolytic (enzyme phân giải chitin). Đây là enzyme chính phân giải thành và màng
tế bào, phá hủy khuẩn ty của nấm đối kháng với Trichoderma. Một vài lồi
Trichoderma có tác động làm tăng tỉ lệ nảy mầm, tuy nhiên cơ chế của tác động này
chưa được biết [21].
Trong q trình sinh sản vơ tính của Trichoderma hazianum có thể xẩy ra hiện
tượng đột biến nên di truyền lại cho thế hệ sau hoặc sai sót từ quá trình phân chia tế
bào và tác động của điều kiện môi trường sống khác nhau nên sẽ dẫn đến sự sai khác
và đa dạng trong kiểu gen cũng như kiểu hình của cùng một loại Trichoderma
hazianum. Vì thế sẽ tạo ra những dịng thích nghi tốt trong điều kiện sinh thái, địa lý
khác nhau và đây là những dòng rất có ý nghĩa trơng nghiên cũng như trong việc tạo
chế phẩm sinh học kiểm soát mầm bệnh thực vật cứu [22].

Hình 1.2. Bào tử nấm Trichoderma hazianum

SVTH: Lê Thị Phương

4

Lớp 49K - CN thực phẩm


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: ThS. Đào Thị Thanh Xuân

1.1.2. Nguồn dinh dƣỡng cơ bản của chủng Trichoderma hazianum

1.1.2.1. Nguồn cacbon
Manczinger và Pollner (1985) đã sử dụng nguồn cacbon là phương thức để
phân loại các giống Trichoderma hazianum thành từng nhóm. Theo phân tích, những
nguồn cacbon sau được sử dụng bởi tất cả các chủng đã nghiên cứu: D-glucose, Dgalactose, D-fructose, D-mannose, cellobiose, trehalose, D-xylose, L-arabinose, Dmannitol, D-arabitol, glycerol, salicin, esculin, arbutin, glycerol-1-monoacetat, bmethyl-D-glucosid và N-acetyl-b-D-glucosamin. Nói chung nguồn cacbon tốt nhất là
glucose, fructose, mannose, galactose, xylose, trehalose và cellobiose [20].
Việc sử dụng một vài nguồn cacbon (như inulin, tinh bột, xylan, pectin, lactose,
sucrose, maltose, một vài polyol, sugar acid, hầu hết các amino acid và một vài pentoses)
thì tùy thuộc vào từng lồi, và có thể sử dụng cho mục đích phân loại hóa học[22].
Trichoderma hazianum nổi bật về khả năng tiết ra enzyme phân hủy nhiều loại
polymer liên quan như chitinase. Những enzyme này được cơng nhận có giá trị thương
mại [21].

1.1.2.2. Nguồn nitơ
Nguồn nitơ hữu cơ như pepton thường được sử dụng trong môi trường để hạn
chế sự tăng trưởng chậm trên cơ chất polymeric như cellulose. Tuy nhiên cần chú ý
rằng pepton được sử dụng như là cả nguồn nitơ lẫn cacbon, và được ưu tiên sử dụng
khi được cung cấp đồng thời với polysaccharid. Trong số những amino acid, nguồn
nitơ tốt nhất cho Trichoderma hazianum là alanin, acid aspartic và acid glutamic [22].
Trichoderma hazianum có khả năng sử dụng cả những nguồn nitơ phức tạp hay
đơn giản để tăng trưởng. Khi Trichoderma hazianum đang tăng trưởng trên nguồn
cacbon là carbohydrat, nguồn nitơ thường được sử dụng là amonium hơn là nitrat, Một
vài chủng như là T.reesei hay T.koningii T-1 cũng khơng thể sử dụng nitrat. Đó là do
sự thiếu enzyme nitrate permease [20]. [22].

1.1.2.3. Nguồn dinh dƣỡng khác
Hầu hết các chủng phân lập hoang dại của Trichoderma hazianum không yêu
cầu cao những nhân tố tăng trưởng phức tạp hay vitamin.
Thành phần ion kim loại của sợi nấm T. hazianum đã được phân tích bởi Gaunt
và cộng sự (1984) và được sử dụng để tính tốn nhu cầu về ion kim loại. Những ion

SVTH: Lê Thị Phương

5

Lớp 49K - CN thực phẩm


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: ThS. Đào Thị Thanh Xuân

kim loại như sắt thì cần thiết cho sự tăng trưởng và có thể được tìm thấy ở một nồng
độ rất thấp trong môi trường [22].
Một số lượng lớn những ion kim loại khác cũng rất quan trọng cho sự tăng
trưởng ở những nồng độ thấp, ngược lại nồng độ cao lại ức chế tăng trưởng. Sự thêm
vào của Cd2+ và Hg2+ ở nồng độ 1-10mM dẫn đến ức chế tăng trưởng T. hazianum và
đẫn đến kiểu hình bất thường của nấm. Tuy nhiên tương tự nhiều loại nấm khác,
Trichoderma hazianum cũng bắt các ion kim loại trong màng tế bào của chúng, phát
hiện này đã được sử dụng trong việc loại bỏ những ion kim loại nặng ra khỏi nước thải
công nghiệp bằng hệ sợi nấm Trichoderma hazianum [21].

1.2.2.4. Nguồn O2 và CO2
Trichoderma hazianum là vi sinh vật, mặc dù những chủng đã phân lập được
đều thu nhận trên những môi trường sống có áp suất từng phần oxi rất thấp. Cung cấp
oxi và hoạt động của ti thể cũng là những nhân tố điều hịa sự hình thành chitinase của
T. hazianum và nồng độ O2 ở mức dưới cực thuận là thích hợp cho sự tổng hợp
enzyme [22].
CO2 là sản phẩm cuối cùng của sự oxi hóa cacbon, sẽ được tích lũy ở một mức
độ nào đó trong mơi trường tăng trưởng rắn, phụ thuộc PH và nhiệt độ. Vì vậy, một số
loại T. hazianum bị ức chế bởi CO2 theo phương thức phụ thuộc vào PH, sự ức chế

mạnh nhất trong mơi trường kiềm nhẹ và trung tính. [23] nghiên cứu và cho rằng
T.harzianum tạo ra hiệu ứng ức chế CO2 và ethanol trên sự tăng trưởng và tạo bào tử
của nhiều nấm khác (Aspergillus niger, pestalotia rhododendri), trên cây con của
Lactuca sativa. Điều này cho thấy một vài chủng Trichoderma hazianum có thể chấp
nhận sự tích tụ CO2 nhiều hơn một số nấm khác.
1.2. Enzyme Chitinase
1.2.1. Định nghĩa
Chitinase hay poly  -1,4-(2-acetamido-2-deoxy) D-glucosid glucanohydrolase,
thuộc nhóm enzyme thủy phân (hydrolase) là enzyme thủy phân chitin thành
chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác sự thủy phân liên kết 1,4-  - glucosid giữa
C1 và C4 của 2 phân tử N- acetyl glucosamine liên kết nhau trong chitin.

SVTH: Lê Thị Phương

6

Lớp 49K - CN thực phẩm


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: ThS. Đào Thị Thanh Xuân

Hình 1.3. Vị trí thủy giải phân tử chitin bởi enzyme chitinase

1.2.2. Phân loại
a. Dựa vào phản ứng phân cắt [22]
Enzyme phân giải chitin bao gồm: Endochitinase, Chitin-1,4-β- chitobiosidase, Nacetyl-β- D-glucosaminidase (exochitinase)
Endochitinase là nhóm enzyme phân cắt nội mạch chitin một cách ngấu nhiên
tạo các đoạn oligosaccharid. Các enzyme này đã được nghiên cứu từ dịch chiết môi

trường nuôi cấy nấm mốc Trichoderma harzianum (2 loại endochitinase M1 = 36kDa,
pI1 = 5,3+/- 0,2 và M2 = 40kDa, pI2 = 3,9), Gliocladium virens (M = 41kDa, pI = 7,8).
Chitin 1,4 -  - chitobiosidase là enzyme phân cắt chitin tạo thành các sản
phẩm chính là các dimer chitobiose.
N - acetyl -  - glucosaminidase (exochitinase) là enzyme tiếp tục phân cắt
chitin từ một đầu cho sản phẩm chính là các monomer N - acetyl - D - glucosamin.
Chitobiase là enzyme phân cắt chitobiose thành 2 đơn phân N - acetyl - D glucosamin.

Hình 1.4. Sơ đồ phân cắt chitin bởi enzyme thuộc nhóm chitinase

b. Dựa vào cấu trúc phân tử [24]
Enzyme chitinase được sắp xếp vào 2 họ Glycohydrolase
SVTH: Lê Thị Phương

7

Lớp 49K - CN thực phẩm


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: ThS. Đào Thị Thanh Xuân

Họ Glycohydrolase 18 là họ chitinase lớn nhất với khoảng 180 chi, có cấu trúc
xác định gồm 8 xoẵn α/β cuộn trịn, được tìm thấy ở hầu hết các lồi thuộc Eukaryote,
Prokaryote và virus. Họ này bao gồm chủ yếu là enzyme chitinase, ngồi ra cịn có các
enzyme khác như Chitodextrinase, Chitobiase và N-acetyl glucosaminidase. Các
enzyme này hoạt động thông qua một cơ chế kiểm sốt mà trong đó các đoạn βpolimer bị phân cắt tạo ra sản phẩm là β- anomer.
Các Chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 được tổng hợp từ Aeromonas
hydrophila, Bacillus circularis, Trichoderma harzianum, Aphanocladium album,

Serratia marcescens...
Họ Glycohydrolase 19 họ này gồm hơn 130 chi, thường thấy chủ yếu ở thực vật
như cà chua (Solanum tuberosum), cải (Arabidopsis thaliana), đậu Hà Lan (Pisum
sativum)...Ngồi ra, cịn có ở xạ khuẩn Streptomyces griceus, vi khuẩn Haemophilus
influenzae... Chúng có cấu trúc hình cầu với một vịng xoắn và hoạt động thơng qua cơ
chế nghịch chuyển.
c. Dựa vào trình tự amino acid [25]
Dựa vào trình tự đầu amin (N), sự định vị của enzyme, điểm đẳng điện, peptid
nhận biết và vùng cảm ứng, người ta phân loại enzyme chitinase thành 5 nhóm:
- Nhóm I là những đồng phân enzyme trong phân tử có đầu N giàu cystein nối
với tâm xúc tác thông qua một đoạn giàu glycin hoặc prolin ở đầu carboxyl (C) (peptid
nhận biết). Vùng giàu cystein có vai trị quan trọng đối với sự gắn kết enzyme và cơ
chất chitin nhưng không cần cho hoạt động xúc tác.
- Nhóm II là những đồng phân enzyme trong phân tử chỉ có tâm xúc tác, thiếu
đạm giàu cystein ở đầu N và peptid nhận biết ở đầu C, có trình tự amino acid tương tự
chitinase ở nhóm I. Chitinase nhóm II có ở thực vật, nấm và vi khuẩn; chúng được
cảm ứng bởi các tác nhân bên ngồi.
- Nhóm III trình tự amino acid hồn tồn khác nhau với chitinase nóm I và II.
- Nhóm IV là những đồng phân enzyme chủ yếu có ở lá cây hai lá mầm, 41 - 47
% trình tự amino acid ở tâm xúc tác của chúng tương tự như chitinase nhóm I, phân tử
cũng có đoạn giàu cystein nhưng kích thước phân tử nhỏ hơn đáng kể so với chitinase
nhóm I.

SVTH: Lê Thị Phương

8

Lớp 49K - CN thực phẩm

Đồ án tốt nghiệp

GVHD: ThS. Đào Thị Thanh Xuân

- Nhóm V dựa trên những dữ liệu về trình tự, người ta nhận thấy vùng gắn
chitin (vùng giàu cystein) có thể đã giảm đi nhiều lần trong q trình tiến hóa ở thực
vật bậc cao.
1.2.3. Cấu trúc của hệ enzyme Chitinase

1.2.3.1. Cấu trúc enzym chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18
Cấu trúc không gian (cấu trúc bậc 3) của một số enzyme chitinase thuộc họ
Glycohydrolase 18 đã được nghiên cứu, cụ thể là chitinase vi khuẩn (serratia
marcascens) và chitinase thực vật. Tâm hoạt động của các enzyme này tạo thành từ 8
sợi xoắn  /  cuộn tròn. Sợi số 8 của phiến cuộn vào bên trong cấu trúc hình nhộng
với vịng xoắn thể hiện như một chiếc nhẫn hướng ra ngồi.

Hình 1.5. Mơ hình cấu trúc Khơng gian của enzyme chitinase Serratia marcescens

1.2.3.2. Cấu trúc enzym chitinase thuộc họ Glycohydrolase 19
Chitinase tách chiết từ lúa mạch (Hodeum vulgare) đã được tinh thể hóa và phân
tích cấu trúc bằng tia X. Đầu tiên người ta tiến hành quan sát ở độ phân giải 2,8Ao và
sau đó quan sát ở đọ phân giải 1,8Ao.

Hình 1.6. Mơ hình cấu trúc khơng gian của chitinase Hodeum Vulgale

1.2.4. Các đặc tính cơ bản của enzym chitinase

1.2.4.1. Trọng lƣợng phân tử
Enzyme chitinase tìm thấy ở thực vật bậc cao và tảo biển có trọng lượng phân tử
khoảng 30kDa. Enzyme chitinase của các loại thân mềm, chân đốt, động vật có xương

SVTH: Lê Thị Phương

9

Lớp 49K - CN thực phẩm


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: ThS. Đào Thị Thanh Xuân

(cá, lưỡng cư, thú) có trọng lượng phân tử cao hơn, khoảng 120 kDa. Trọng lượng
phân tử của enzyme chitinase thu nhận từ nấm và vi khuẩn có khoảng biến đổi rộng, từ
30 đến 120 kDa [22]
Một số enzyme chitinase có trọng lượng phân tử thấp có thể được tạo ra từ một
enzyme lớn hơn bằng cách phân cắt một phần Protein.

1.2.4.2. Điểm đẳng điện - phổ hấp thụ - số Michaelis
Enzyme chitinase có giá trị pI thay đổi rộng 3,0 - 10,0 ở thực vật bậc cao và tảo.
pH thay đổi 4,7 - 9,3 ở côn trùng, giáp xác, thân mềm và cá, pI bằng 3,5 -8,8 ở vi sinh
vật. [24] Hệ số hấp thụ E280mg/ml = 1,24; phổ hấp thụ chỉ là bước sóng đơn 280  m.
Hằng số michaelis: 0,01-0,011 (g/100ml) [22]

1.2.4.3. Nhiệt độ
Nhìn chung, nhiệt độ tối ưu cho enzyme chitinase ở vi sinh vật hoạt động là
400C, ngoại trừ enzyme chitinase của Aspergillus niger hoạt động trên cơ chất là
glycol chitin có nhiệt độ tối thích là 500C. [22]
Tùy thuộc nguồn gốc thu nhận mà enzyme chitinase có thể có những nhiệt độ
tối ưu khác nhau.
Các enzyme chitinase thực vật thuộc nhóm III và các chitinase từ Bacillus

licheniformis phân lập từ suối nước nóng có khả năng chịu nhiệt độ đến 800C. Mặt
khác, chitinase từ côn trùng (tằm...) khơng ổn định ở nhiệt độ 400C, có thể do côn
trùng phát triển ở nhiệt độ 250C nên nhiệt độ tối ưu của enzyme chitinase côn trùng
không cao.

1.2.4.4. pH
Giá trị pH tối ưu của enzyme chitinas thường giao động trong khoảng từ 4 - 9
đối với các chitinase ở thực vật bậc cao và tảo. ở động vật là 4,8-7,5 và ở vi sinh vật là
3,5-8,0. pH tối thích của enzyme chitinase còn phụ thuộc vào cơ chất được sử dụng.
Đa số các enzyme chitinase đã được nghiên cứu có pH tối thích khoảng 5,0 khi
cơ chất là chitin, enzyme chitinase của Streptomyces grieus có pH tối thích khoảng
6,3. Tùy mục đích phân tích, những cơ chất hịa tan như glycol chitin và N- acetyl
chitooligosacharid được sử dụng thay thế cho chitin thì PH tối ưu nằm trong khoảng
giá trị PH kiềm yếu [24].
Hoạt tính của enzyme chitinase sẽ nhanh chóng bị ức chế ở pH < 4 ngoại trừ
chitinase trong dạ dày của động vật có xương sống, vẫn hoạt động ở pH 3,0.
SVTH: Lê Thị Phương

10

Lớp 49K - CN thực phẩm


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: ThS. Đào Thị Thanh Xuân

1.2.4.5. Chất tăng hoạt - Chất ức chế
Allosamidin: Allosamidin là chất ức chế được nghiên cứu, đặc biệt là với
chitinase côn trùng. Allosamidin ức chế cạnh tranh với enzyme chitinase, giá trị KI

khoảng 0,1  m. Chất này có cấu tạo tương tự dạng trung gian của cơ chất: một vòng
oxazoline; vòng này có thể ở giữa carbonyl oxygen của nhóm N- acetyl và C1 của N acetyl - D - glucosamin trong q trình thủy phân [24].

Hình 1.7. Cấu trúc hóa học của Allosamidin và dẫn xuất Allosamidin

Allosamidin:

R1 = R2 = CH3

Demethylallosamidin:

R1 = CH3, R2 = H

Didemethylallosamidin: R1 = R2 = H

1.2.4.6. Các ion kim loại
Các ion kim loại: Hg2+, Ag+ ;là những chất ức chế, cịn ion Cu+ thì tùy theo
dạng enzyme chitinase: dạng chitinase bị ức chế hoặc tăng cường hoạt tính (tìm
thấy ở một số loại cá và vi sinh vật). Bên cạnh đó albumin cũng có vai trò làm tăng
hoạt động của enzyme chitinase, nhưng sự ảnh hưởng này chỉ rõ ràng sau 2-3 giờ
đầu của phản ứng [22].

1.2.4.7. Ổn định hoạt tính
Enzyme chitinase thơ hoặc tinh sạch ổn định trong trạng thái đông lạnh khoảng
2 năm. Chúng bị mất hoạt tính nhanh chóng ở 370C trong trường hợp khơng có mặt cơ
chất. Chu kỳ bán hủy ở 370C là 40 ngày và ở 50C là 230 ngày.
Sự ổn định của enzyme chitinase sẽ cao hơn khi có mặt của cơ chất là chitin.
Enzyme chitinase bất hoạt bởi oxygen, hằng số bất hoạt ở 200C là k = 0,145/h [22].
1.2.5. Các loại cơ chất của enzym Chitinase

1.2.5.1. Chitin
Cơ chất chủ yếu của enzyme chitinase là chitin. Chitin được tìm thấy trong thành
tế bào của nấm sợi và là chất hữu cơ chiếm khối lượng lớn hình thành nên lớp vỏ
SVTH: Lê Thị Phương

11

Lớp 49K - CN thực phẩm


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: ThS. Đào Thị Thanh Xuân

ngoài của động vật không xương sống (côn trùng, giáp xác, thân mềm), cụ thể thành
phần chitin chiếm từ 25 - 60% trọng lượng khơ lớp vỏ ngồi của cơn trùng.
Chitin là một polymer mạch thẳng có cấu tạo dạng chuỗi, thành phần chủ yếu là
các monomer N- acetyl-D- glucosamin nối với nhau bằng liên kết 1,4-  - glucosid.
Mỗi đoạn chitin được xác định có độ dài là 10,4 Ao. Về mặt cấu trúc chitin có cấu trúc
tương tự như cellulose, điểm khác biệt hóa học duy nhất là nhóm acetamido ở vị trí số
2 trên khung các bon của chitin được thay thế bằng nhóm hydroxyl (- OH) ở cellulose.
Ngồi ra, chitin cũng có cấu trúc liên hệ với murein- cấu trúc polymer hiện diện ở vách
tế bào vi khuẩn [24].
Ở lớp vỏ côn trùng và giáp xác chitin được được gắn kết với các polysaccharid
khác (cellulose, mannan, glucan…) hàm lượng chiếm tối đa khoảng 3-5% sinh khối
nấm tươi.

Hình 1.8. Cấu trúc hóa học của chitin

Đến nay, chitin tinh sạch chỉ được phát hiện ở lớp vỏ ngoại bào của

Thalassiosira fluviatilis và Cyclotella cryptica. Do đó, chitin với cấu trúc chuỗi  -(14) - 2 - acetamido - 2 - hydroxyl - D - glucopyranose chỉ tồn tại sau khi đã trải qua một
quá trình tinh chế loại bỏ các tạp chất khoáng, các protein và các thành phần khác.
Trong tự nhiên, chitin là một chất hữu cơ chiếm vị trí thứ hai sau cellulose về số
lượng. Chitin là chất rắn vơ định hình, bền vững, khơng tan trong nước, hầu hết các
acid cũng như kiềm, alcol và các dung mơi hữu cơ khác. Tuy nhiên, chitin có thể bị
thủy giải bởi acid vô cơ mạnh (HCl đậm đặc, H2SO4 đậm đặc, HF khan) hoặc bằng
enzyme sinh vật.
Về mặt cấu trúc lập thể, Chitin có 3 dạng:  ,  ,  ; sự khác nhau này biểu hiện
ở sự sắp xếp các chuỗi. Ở  - chitin các chuỗi " xuôi" xen kẽ với 2 chuỗi " ngược".
Dạng chiếm nhiều nhất là  -chitin. [21]
SVTH: Lê Thị Phương

12

Lớp 49K - CN thực phẩm


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: ThS. Đào Thị Thanh Xuân

Hình 1.9. Các dạng lập thể của chitin

α - chitin có cấu trúc các mạch được xếp ngược chiều nhau đều đặn, nên ngoài
liên kết hydro trong một lớp và hệ chuỗi, nó cịn có liên kết hydro giữa các lớp do các
chuỗi thuộc lớp kề nhau nên rất bền vững. Do các mắt xích sắp xếp đảo chiều, xen kẽ
thuận lợi về mặt không gian và năng lượng. Đây cũng là dạng phổ biến trong tự nhiên.
β, γ - chitin do mắt xích ghép với nhau theo kiểu song song (β- chitin) và hai
song song một ngược chiều (γ - chitin), giữa các lớp khơng có loại liên kết hydro.
Dạng β-chitin cũng có thể chuyển sang dạng α-chitin nhờ q trình axetyl hóa cho cấu

trúc tinh thể bền vững hơn.
Trong tế bào, chitin được hình thành từ uridin-diphosphat-N-acetyl-D-glucosamin
nhờ enzyme chitinsynthetase (EC 2.4.1.16). Chitin-N- deacetylase (EC 3.5.1.41) xúc
tác phản ứng N - deacetyl hóa chitin thành chitosan.

1.2.5.2. Các dẫn xuất của Chitin
Enzyme chitinase có thể tác động lên một số dẫn xuất của chitin như glycolchitin, carboxymethylchitin, chitosan, chitinsulfat, 4- methylumbellferyl-tri N-acetyl
chititrioside (MUC - phát huỳnh quang).
Enzyme chitinase không tác động trên các cơ chất: chitin nitrat, cellulose,
hyaluronic acid, alginic acid hoặc mucin [22].
1.2.6. Cơ chế tác dụng
Enzyme chitinase xúc tác cho phản ứng thủy giải liên kết 1,4-ß-glucosid trong
chitin. Nó phân cắt dọc theo mạch cacbon của chitin và sản phẩm tạo thành chủ yếu là
chitobiose và chitotriose. Những chất này sau đó tiếp tục bị phân cắt thành các
monomer là các N-acetyl-D-glucosamin.
Q trình phân giải chitin được tóm tắt như sau:
Chitin ----- Chitobiose -----N - acetyl - D - glucosamin
Sự thủy giải chitin có thể có thể xẩy ra theo 2 cơ chế: Cơ chế giữ lại các cấu tử
 - anomer trong sản phẩm và cơ chế nghịch chuyển từ dạng  sang dạng 

SVTH: Lê Thị Phương

13

Lớp 49K - CN thực phẩm


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: ThS. Đào Thị Thanh Xuân

Vị trí kết nối giữa cơ chất chitin và enzyme chitinase được giả định bao gồm tối
thiểu 6 tiểu phần đường được ký hiệu từ A đến F (bắt đầu từ đầu khơng khử). Tại vị trí
này, hexasaccharid sẽ được phân cắt thành hai trisaccharid [26] .

Hình 1.10. Cơ chế thủy giải tại trung tâm hoạt hóa của enzyme chitinase

(1) Cơ chế giữ lại các cấu tử  - anomer (Chitinase họ glycohydrolase 18)
(2) Cơ chế nghịch chuyển từ dạng  - anomer sang dạng  - anomer
(chitinase họ glycohydrolase 19)
(A: Glu 67, B: Glu 89)

Hình 1.11. Các vị trí kết nối giữa cơ chất chitin và enzyme chitinase tại trung tâm hoạt hóa

SVTH: Lê Thị Phương

14

Lớp 49K - CN thực phẩm


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: ThS. Đào Thị Thanh Xuân

1.2.7. Cơ chế cảm ứng
Hiện nay, cơ chế cảm ứng hệ enzyme chitinase của Trichoderma hazianum là
chủ đề rất được nhiều nhà khoa học quan tâm. Sự cảm ứng enzyme ngoại bào rất hiệu
quả khi nuôi cấy Trichoderma hazianum trong môi trường có nguồn cacbon duy nhất
là chitin tinh sạch, vách tế bào nấm hoặc hệ sợi nấm. Khơng có hoặc rất ít có hiện

tượng cảm ứng khi thành phần mơi trường có chữa chitosan, cellulose, chitin chưa tinh
sạch hoặc laminarin [26].
Các enzyme khác nhau thì có cơ chế cảm ứng khác nhau. Ví dụ: N - acetyl glucosamin chỉ cảm ứng đặc trưng cho việc tạo ra  - N - acetyl - hesoaminidase (Nacetylglucosaminidase) mà không cảm ứng tạo ra endochitinase hoặc chitobiosidase ở
Trichoderma hazianum.
Trong q trình kí sinh của Trichoderma hazianum trên những ký chủ khác
nhau thì mức độ cảm ứng và thành phần các sản phẩm enzyme tạo thành khác nhau,
chủ yếu là 1,4 -  - N- acetylglucosaminidase 102 kDa và 72 kDa (CHIT 102,
CHIT72) và một vài enzyme endochitinase của nhóm II. Hơn nữa vách tế bào nấm thu
nhận từ những loại nấm đảm Basidiomycetes khác nhau, được sử dụng để cảm ứng
endochitinase từ các chủng Trichoderma hazianum cũng khác nhau [24].
Sự hình thành hệ enzyme chitinase trong ống nghiệm bị ức chế bởi tỉ lệ gia
tăng của lượng đường glucose, sucrose và sản phẩm cuối, điều này cho thấy rằng quá
trình sinh tổng hợp enzyme được điều chỉnh một cách đặc hiệu bởi sự ức chế dị hóa.
Điều này đã được nghiên cứu rõ hơn ở endochitinase 42 kDa (CHIT42) và gen mã hóa
ThEn-42 của T.harzianum. Nhiều tác giả cho rằng, glucose ức chế sự hình thành
CHIT42 cũng như ở cấp độ mRNA. Sự hình thành CHIT72, CHIT42 và CHIT33 được
điều hòa ở cấp độ phiên mã [25].
Inbar và Chet đã chứng minh sự tạo thành enzyme chitinase của chủng
T.harzianum ký sinh được bắt nguồn bởi việc tiết ra chất trung gian tương tác với ký
chủ lectin. Hiện tượng này xẩy ra khi có sự cảm ứng của chitooligomer. Lectin là hệ
thống nhận biết ký chủ của vi nấm ký sinh và rất có giá trị trong nghiên cứu pha sớm
của quá trình ký sinh nấm. Sự thật là trong điều kiện ống nghiệm hệ sợi nấm đã hấp
khử trùng có tác dụng cảm ứng CHIT33 và CHIT42 mạnh hơn tác nhân cảm ứng là

SVTH: Lê Thị Phương

15

Lớp 49K - CN thực phẩm