Sàng lọc in silico các hợp chất coumarin ức chế enzyme carbonic anhydrase II hướng điều trị tăng huyết áp

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC

NGUYỄN KHÁNH HỒNG

SÀNG LỌC IN SILICO CÁC HỢP CHẤT
COUMARIN CÓ TÁC DỤNG
ỨC CHẾ ENZYME CARBONIC ANHYDRASE II
HƯỚNG ĐIỀU TRỊ TĂNG HUYẾT ÁP

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC SĨ

Hà Nội - 2021


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC

NGUYỄN KHÁNH HỒNG

SÀNG LỌC IN SILICO CÁC HỢP CHẤT
COUMARIN CÓ TÁC DỤNG
ỨC CHẾ ENZYME CARBONIC ANHYDRASE II
HƯỚNG ĐIỀU TRỊ TĂNG HUYẾT ÁP

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC SĨ
Khóa: QH2016.Y

Người hướng dẫn: 1. PGS.TS Bùi Thanh Tùng
2. PGS.TS Vũ Mạnh Hùng

Hà Nội - 2021


LỜI CẢM ƠN
Trước hết, em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành cảm ơn tới PGS. TS
Bùi Thanh Tùng, công tác tại bộ môn Dược lý – Dược Lâm sàng – Trường Đại học Y
dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, là người thầy vô cùng tâm huyết đã động viên và
chỉ dẫn tận tâm cho em từ những ngày đầu tiên thực hiện đề tài.
Em cũng bày tỏ sự biết ơn tới PGS. TS Vũ Mạnh Hùng công tác tại Học
viện Quân y đã hỗ trợ cho em trong suốt q trình hồn thành đề tài khóa luận tốt
nghiệp này.
Bên cạnh đó, em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới lãnh đạo, các thầy cô
công tác tại Trường Đại học Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội đã giúp đỡ, tạo
điều kiện để em được học tập, nghiên cứu, rèn luyện tại Trường suốt 5 năm học vừa
qua.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, anh chị em và bạn bè
luôn sát cánh, ủng hộ động viên em trong q trình nghiên cứu hồn thành luận văn
nói riêng và q trình học tập 5 năm nói chung.
Dù đã rất cố gắng nhưng vì kiến thức và kinh nghiệm thực tiễn cịn giới hạn,
em khó tránh khỏi những thiếu sót. Em kính mong nhận được sự chỉ dẫn và đóng
góp của các thầy, cơ để khóa luận của em được hồn thiện hơn.
Em xin kính chúc thầy cô nhiều sức khỏe, thành công và hạnh phúc.
Em xin chân thành cảm ơn.

Hà Nội, ngày 28

tháng 05

năm 2021

Sinh viên

Nguyễn Khánh Hồng


DANH MỤC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

THA

Tăng huyết áp

CAII

Enzyme carbonic anhydrase II

AT1

Thụ thể angiotensin II tuýp 1

WHO

Tổ chức Y tế Thế giới

ISH

Hiệp hội tăng huyết áp quốc tế

ESC/ ESH

Hội Tim mạch và Huyết áp châu Âu

HATT

Huyết áp tâm thu

HATTr

Huyết áp tâm trương

BMI

Chỉ số khối cơ thể (kg/ m2)

FKE

4-(4-phenylpiperidin-1-yl) carbonylbenzenesulfonamide

hCAII

Enzyme carbonic anhydrase II ở người

R&D

Quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc mới

FDA

Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ

Ro5

Quy tắc Lipinski 5

ADMET

Hấp thu, phân phối, chuyển hóa, thanh thải và độc tính

SMILES

Simplified Molecular Input Line Entry Specification

RMSD

Giá trị độ lệch bình phương trung bình gốc

PDB

Ngân hàng dữ liệu Protein

CSDL

Cơ sở dữ liệu

pkCSM

Predicting Small-Molecule Pharmacokinetic and Toxicity

Properties Using Graph-Based Signatures
CYP

Các isozyme cytochromes P450

BBB

Hàng rào máu não


Caco2

Khả năng kết bám với tế bào ung thư ruột kết

OCT2

Chất vận chuyển cation hữu cơ ở thận

CNS

Hệ thần kinh trung ương

AMES

Xét nghiệm đột biến ngược Salmonella typhimurium

IMP

Imperatorin

MPO

Myeloperoxidase

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU....................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN........................................................................................3
1.1. Tổng quan về bệnh Tăng huyết áp: 3
1.1.1. Khái niệm và phân loại:

3

1.1.2. Nguyên nhân gây bệnh:

4

1.1.3. Triệu chứng của THA:

5

1.1.4. Hậu quả:

5

1.1.5. Điều trị:

6

1.2. Tổng quan về enzym CAII:

8

1.2.1. Giới thiệu chung về enzyme CA: 8
1.2.2. Sơ lược enzyme carbonic anhydrase II:

8

1.2.3. Trung tâm hoạt động của enzyme CAII: 9
1.3. Nghiên cứu về hợp chất thiên nhiên nhóm coumarin:
1.3.1. Tiềm năng của hợp chất thiên nhiên Việt Nam:
1.3.2. Đơi nét về nhóm hợp chất coumarin:
1.4. Mơ hình in silico trong q trình nghiên cứu và phát triển thuốc mới:
1.4.1. Tổng quan về quá trình nghiên cứu phát triển thuốc:

10
10
10
12
12

1.4.2. In silico trong quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc: 13
1.4.3. Giới thiệu về Docking:

13

1.4.4. Giới thiệu về Quy tắc Lipinski 5 (RO5): 14
1.4.5. Dự đoán ADMET:

15

CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..........17
2.1. Nguyên liệu và thiết bị nghiên cứu: 17

2.2. Nội dung nghiên cứu: 18


2.3. Phương pháp nghiên cứu:
2.3.1. Sàng lọc bằng Docking phân tử:

18
18

2.3.2. Chọn ra hợp chất “giống thuốc” từ Quy tắc Lipinski 5: 19
2.3.3. Dự đốn ADMET bằng cơng cụ trực tuyến:

20

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ............................................................................................ 22
3.1. Sàng lọc docking:

22

3.2. Đặc điểm hóa lý của các hợp chất được chọn:

32

3.3. Dự đốn về hấp thu, phân bố, chuyển hóa, thanh thải và độc tính
(ADMET):................................................................................................................ 34
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN.......................................................................................... 39
4.1. Về phương pháp sàng lọc ảo: 39
4.2. Về kết quả sàng lọc ảo:

39

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................................................... 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1:

Phân độ tăng huyết áp theo Hội tim mạch và huyết áp Châu Âu
(ESC/ESH) năm 2018……………………………………………

Bảng 1.2:

Các thể THA dựa theo trị số HA phòng khám và HA tại nhà hoặc
HA liên tục………………………………………………………...

Bảng 3.1:

Kết quả docking của 50 hợp chất coumarin tự nhiên……………..

Bảng 3.2:

Kết quả lipinski của 8 hợp chất được lựa chọn từ kết quả Docking

Bảng 3.3: Tương tác giữa 5 hợp chất với đích CAII…………………………
Bảng 3.4:

Kết quả ADMET của 5 hợp chất được chọn từ RO5……………..

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1 :

Các

Hình 1.2:

Hìn
tron

Hình 1.3:

Hìn

Hình 1.4:

Các
mới

Hình 2.1:

Hìn

Hình 2.2

Thự
pkC
sau

Hình 3.1:

Tóm

Hình 3.2:

Kết

Hình 3.3:

Min
carb

Hình 4.1:

Min
hoạ

Hình 4.2:

Min
hoạ

Hình 4.3:

Min
hoạ

Hình 4.4:

Min

hoạ

Hình 4.5:

Min
hoạ


MỞ ĐẦU
Tăng huyết áp (THA) được coi là một trong 8 nguyên nhân hàng đầu gây tàn tật
và tử vong tồn cầu. Theo ước tính của Tổ chức y tế Thế giới (WHO), hàng năm có 9.4
triệu người tử vong do THA [58]. Tại Việt Nam, THA là một vấn đề y tế công cộng, tỷ
lệ mắc là 25.1%, là yếu tố nguy cơ quan trọng hàng đầu dẫn đến bệnh lý về tim mạch
[46]. THA với khoảng 10 triệu người tử vong vào năm 2015; trong đó có 4,9 triệu người

tử vong do bệnh mạch vành và 3,5 triệu người do đột quỵ [8]. Người ta ước tính rằng số
người bị tăng huyết áp sẽ tăng 15-20% vào năm 2025, đạt khoảng 1,5 tỷ người [44, 47].

Trong suốt những thập kỷ qua, nhiều nghiên cứu lâm sàng đã cho thấy điều trị
THA hiệu quả đã làm giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch và tử vong, nhưng đến nay
gánh nặng kinh tế của THA và các hậu quả về tim mạch do THA vẫn ngày càng tăng
trên toàn thế giới [40]. THA là bệnh mãn tính, q trình điều trị lâu dài, thậm chí là cả
đời, ước tính trên thế giới, THA sẽ tiêu tốn gần 1 nghìn tỷ đô la Mỹ và nếu THA không
được điều trị, chi phí có thể lên tới 3,6 nghìn tỷ đơ la Mỹ hàng năm [62].
Mặc dù hiện nay đã có nhiều loại thuốc hạ huyết áp nhắm vào các con đường
khác nhau liên quan đến sinh lý bệnh của nó, nhưng bệnh tăng huyết áp vẫn được kiểm
sốt kém trên tồn thế giới và tỷ lệ mắc bệnh vẫn tăng [2]. Do đó, việc phát triển các
loại thuốc hạ huyết áp mới tác động lên các mục tiêu mới, với các phương thức tác
dụng khác nhau, vẫn là điều cần thiết, để cải thiện việc kiểm soát huyết áp và giảm
gánh nặng cho các nguy cơ tim mạch. Tuy nhiên, những khó khăn gặp phải trong q

trình hình thành, phát triển, chi phí và việc đưa ra thị trường các loại thuốc hạ huyết áp,
vẫn còn là trở ngại rất lớn [38].
Hiện nay, đã có nhiều loại thuốc chữa THA ví dụ như thuốc ức chế men chuyển,
chẹn beta giao cảm, lợi tiểu, chẹn kênh canxi, ức chế thụ thể AT1 của angiotensin II, thuốc
lợi tiểu [63]. Trong các thuốc mới phát triển, nhiều hoạt chất được tìm thấy thơng qua quá
trình thiết kế và sàng lọc ảo với sự hỗ trợ của các mơ hình máy tính (in silico), cụ thể là
Docking. Các mơ hình in silico có lợi thế so với các mơ hình thực nghiệm truyền thống cả
về thời gian và chi phí vận hành. Hiện nay, in silico đã trở thành một phần không thể tách
rời trong các dự án nghiên cứu và phát triển thuốc mới, chúng được sử

1


dụng trong giai đoạn sàng lọc các thư viện hoá học lớn nhằm tìm kiếm hợp chất tiềm
năng cho các nghiên cứu thực nghiệm.
Từ những phân tích nêu trên, nhằm góp phần tìm kiếm các chất có hoạt tính tốt phù
hợp phát triển thành thuốc điều trị THA, em tiến hành đề tài “Sàng lọc in silico các

hợp chất coumarin có tác dụng ức chế enzyme carbonic anhydrase II hướng điều trị
tăng huyết áp” với mục tiêu chính như sau:
Sàng lọc một số hợp chất coumarin có tác dụng ức chế enzyme
carbonic anhydrase II (CAII) bằng phương pháp Docking phân tử.
-

Nghiên cứu đặc tính giống thuốc và tính tốn dược động học - độc
tính của chúng; từ đó tìm ra các hợp chất tiềm năng.
-

2

CHƯƠNG 1: TỔNG
QUAN 1.1. Tổng quan về bệnh Tăng huyết áp:
1.1.1. Khái niệm và phân loại:
•

Huyết áp là gì [5, 19]:

Huyết áp là lực tác động bởi tuần hoàn máu chống lại thành mạch khi được tim
bơm máu. Huyết áp bình thường tăng và giảm trong suốt cả ngày.
Huyết áp được đo bằng hai con số. Cả hai đều được đo bằng milimét thủy ngân
(mmHg):
Con số đầu tiên, được gọi là huyết áp tâm thu, còn gọi là huyết áp
tối đa, là trị số huyết áp cao nhất trong chu kỳ tim, đo được ở thời kỳ tâm
thu, phụ thuộc vào lực tâm thu và thể tích tâm thu của tim.
-

Con số thứ hai, được gọi là huyết áp tâm trương, là trị số huyết áp
thấp nhất trong chu kỳ tim, ứng với thời kỳ tâm trương, phụ thuộc vào
trương lực của mạch máu.
-

•

Định nghĩa tăng huyết áp, theo [9]:

Tăng huyết áp là tình trạng tăng huyết áp tâm thu và/hoặc huyết áp tâm trương
có hoặc khơng có ngun nhân.
Theo WHO-ISH 1999 thì tăng huyết áp (THA) được xác định khi huyết áp tâm
thu ≥ 140mmHg và hoặc huyết áp tâm trương ≥ 90mmHg, hoặc đang sử dụng thuốc

chống THA.
•

Phân loại tăng huyết áp:

Bảng 1.1: Phân độ tăng huyết áp theo Hội tim mạch và huyết áp Châu
âu (ESC/ESH) năm 2018 [9, 17]:

Tối ưu
Bình thường

3


Bình thường cao
THA độ 1
THA độ 2
THA độ 3
THA Tâm thu đơn độc
*Nếu huyết áp không cùng mức để phân loại thì chọn mức HATT hay HATTr
cao nhất. THA tâm thu đơn độc xếp loại theo mức HATT.
**Tiền Tăng huyết áp: khi HATT > 120-139mmHg và HATTr > 80-89 mmHg.
Các thể THA và Huyết áp bình thường [8]:
Bảng 1.2: Các thể THA dựa theo trị số huyết áp phòng khám và huyết áp tại nhà hoặc
huyết áp liên tục

Huyết áp tại nhà
hoặc liên tục ban
ngày (mmHg)

1.1.2. Nguyên nhân gây bệnh:
90-95% trường hợp là THA khơng có ngun nhân, 5% có nguyên nhân. Các yếu
tố thuận lợi thường thấy trong THA nguyên phát như sau: ăn nhiều muối natri (> 14
gam/ngày) có nhiều nguy cơ THA; nịi giống: người da đen có tỷ lệ THA cao hơn
người da trắng (trong cùng hoàn cảnh, điều kiện làm việc như nhau); thừa cân và béo
phì; di truyền; nghiện rượu; hút thuốc lá [6]. Các nguyên nhân THA thứ phát có thể là:
hẹp động mạch thận, hẹp eo động mạch chủ, hẹp động mạch chủ (trên chỗ xuất phát
động mạch thận), viêm thận các loại, teo thận bẩm sinh, u thượng thận, ăn mặn, sinh
hoạt bị nhiều stress, di truyền [9].


4


1.1.3. Triệu chứng của THA:
Khi các triệu chứng xảy ra, chúng có thể bao gồm nhức đầu vào sáng sớm, chảy
máu cam, nhịp tim không đều, thay đổi thị lực và ù tai. Tăng huyết áp nghiêm trọng có
thể gây ra mệt mỏi, buồn nôn, nôn mửa, lú lẫn, lo lắng, đau ngực và run cơ.
Tăng huyết áp được mệnh danh là “kẻ giết người thầm lặng”. Hầu hết những
người bị tăng huyết áp khơng biết mình bị tăng huyết áp vì nó hầu như khơng có dấu
hiệu hoặc triệu chứng cảnh báo. Vì lý do này, việc đo huyết áp thường xuyên là điều
cần thiết [57].
1.1.4. Hậu quả:
Tăng huyết áp là một bệnh lý tiến triển âm thầm và gây ra nhiều biến chứng ảnh
hưởng tới tuổi thọ và chất lượng cuộc sống của con người.
Tăng huyết áp có thể ảnh hưởng đến cơ thể bằng nhiều cách khác nhau. Thông
thường, tăng huyết áp làm tăng gánh nặng cho tim và động mạch. Tim phải làm việc
nặng hơn trong thời gian dài nên tim có xu hướng to ra, giãn ra và dày thành tim lên,
dần dần sẽ gây ra hậu quả suy tim. Tăng huyết áp thúc đẩy và gây ra xơ vữa động
mạch. Đây là bệnh lý nguy hiểm gây ra nhiều biến chứng tim mạch (tai biến mạch não,

nhồi máu cơ tim…). Tăng huyết áp làm tăng nguy cơ đột quỵ, ngồi ra tăng huyết áp
cịn có thể làm tổn thương thận, mắt [8].
Hầu hết các trường hợp tăng huyết áp có thể kiểm sốt hiệu quả bằng thuốc và
từ đó làm giảm nguy cơ mắc bệnh và biến cố tim mạch do tăng huyết áp.
*Các biến chứng thường gặp của THA [8]:
✓ Biến chứng tim:

Cấp tính: phù phổi cấp, nhồi máu cơ tim cấp…
- Mạn tính: dày thành tim trái, suy vành mạn, suy tim…
✓ Biến chứng mạch não:
- Cấp tính: xuất huyết não, tắc mạch não, tai biến mạch máu não thoáng
qua, bệnh não do THA…
- Mạn tính: tai biến mạch não, tai biến mạch não thoáng qua…
✓ Thận: đái máu, đái ra protein, suy thận…
-

5


✓ Mắt: phù võng mạc, xuất huyết, xuất tiết võng mạc, động mạch võng mạc

co nhỏ…
✓ Biến chứng động mạch: tách thành động mạch chủ, bệnh động mạch
ngoại biên…

Hình 1.1: Các biến chứng nguy hiểm của tăng huyết áp
1.1.5. Điều trị:
Tăng huyết áp là bệnh mạn tính nên cần theo dõi đều, điều trị đúng và đủ hàng
ngày, điều trị lâu dài. Mục tiêu điều trị là đạt “huyết áp mục tiêu” là <140/90 mmHg và
giảm tối đa “nguy cơ tim mạch”. Nếu nguy cơ tim mạch từ cao đến rất cao thì huyết áp

mục tiêu cần đạt là <130/80 mmHg. Khi điều trị đã đạt huyết áp mục tiêu, cần tiếp tục
duy trì phác đồ điều trị lâu dài kèm theo việc theo dõi định kỳ [1, 11].
Cho đến nay, quá trình phát triển bệnh được phát hiện là có liên quan nhiều đến lối
sống như hút thuốc, béo phì và các yếu tố mơi trường chẳng hạn như hấp thụ quá nhiều
muối và rượu [16, 42, 64]. Nên người bệnh cần có chế độ ăn hợp lý, đảm bảo đủ kali và
các yếu tố vi lượng như giảm ăn mặn (< 6 gam muối hay 1 thìa cà phê muối mỗi ngày);
tăng cường rau xanh, hoa quả tươi; hạn chế thức ăn có nhiều cholesterol và axít béo no;
duy trì vịng bụng dưới 90 cm ở nam và dưới 80 cm ở nữ; hạn chế uống rượu, bia, hút
thuốc; hoạt động thể lực ở mức thích hợp; tránh lo âu, căng thẳng thần kinh [1].

6


Bên cạnh đó, việc sử dụng thuốc cũng vơ cùng quan trọng với bệnh nhân THA:
-

Đối với THA độ I với nguy cơ thấp: lựa chọn một thuốc trong số các nhóm: lợi
tiểu thiazide liều thấp; ức chế men chuyển; chẹn kênh canxi loại tác dụng kéo
dài; chẹn β giao cảm (nếu khơng có chống chỉ định).

-

THA từ độ 1 với nguy cơ trung bình, cao, rất cao hoặc độ II, III: nên phối hợp 2
loại thuốc (lợi tiểu, chẹn kênh canxi, ức chế men chuyển, chẹn thụ thể
angiotensin, chẹn β giao cảm).

-

Nếu chưa đạt huyết áp mục tiêu, cần điều chỉnh liều tối ưu hay từng bước phối
hợp các thuốc hạ huyết áp:

+ Phối hợp 2 thuốc: ức chế men chuyển/chẹn thụ thể angiotensin phối hợp với

chẹn kênh canxi hoặc lợi tiểu.
+ Phối hợp 3 thuốc: ức chế men chuyển/chẹn thụ thể angiotensin phối hợp với

chẹn kênh canxi và lợi tiểu.
+ Phối hợp 4 thuốc (THA kháng trị): Thêm kháng aldosteron hoặc lợi tiểu khác,

chẹn α hoặc chẹn β.
- Đối với tăng huyết áp có chỉ định điều trị bắt buộc:
+ Bệnh mạch vành: Chẹn β + ức chế men chuyển/chẹn thụ thể angiotensin, chẹn

kênh canxi.
+ Suy tim: ức chế men chuyển/chẹn thụ thể angiotensin + chẹn β + kháng

aldosteron, lợi tiểu quai khi ứ dịch.
+ Đột quỵ: ức chế men chuyển + lợi tiểu.
+ Bệnh thận mạn, đái tháo đường: ức chế men chuyển/chẹn thụ thể angiotensin

+ lợi tiểu/chẹn kênh canxi [8, 16].

7


1.2. Tổng quan về enzym CAII:
1.2.1. Giới thiệu chung về enzyme CA:
Anhydrase carbonic (CAs) là các metalloenzyme có mặt ở khắp nơi trong tự
nhiên và được tìm thấy trong nhiều loại sinh vật. Các enzym này có nguồn gốc cổ xưa
vì chúng được tìm thấy ở phần sâu nhất của các nhánh của cây tiến hóa. Về mặt di
truyền, chúng thuộc bảy phân nhóm α, β, γ, δ, ζ, η, θ khơng liên quan về mặt tiến hóa

[35]. Enzyme này có cấu trúc ba chiều khác nhau, nhưng cơ chế enzym là tương tác tập
trung mà kim loại tạo liên kết ion làm giảm pKa của phân tử nước để trở thành ion
hydroxyl có thể tấn cơng phân tử carbon dioxide liên kết trong một túi kỵ nước ở vị trí
hoạt động [15]. CAs xúc tác q trình hydrat hóa thuận nghịch của carbon dioxide
thành bicarbonate với sự giải phóng proton. Mức độ hoạt động bất thường của các
enzyme này có liên quan đến nhiều rối loại như tăng nhãn áp, động kinh, loét dạ dày,
ung thư, mất cân bằng axit- bazo. Do đó, CAs đã nổi lên như một mục tiêu có giá trị để
điều trị hoặc phịng ngừa các rối loạn này [29].
Trong số năm lớp khác nhau của anhydrase cacbonic, lớp alpha có lẽ được chú ý
nhiều nhất vì vai trị của nó trong bệnh lý ở người [29]. Hiện nay, người ta đã phát hiện
có 15 đồng dạng a-carbonic anhydrase khác nhau ở người [35]. Chúng xúc tác sự
chuyển đổi lẫn nhau giữa CO2, bicacbonat và proton, do đó tạo ra hai trong số các ion
-

+

(HCO3 và H ):
CO2 + H2O ⇔ HCO3- + H+

Các đồng dạng CA (h) của con người có hoạt tính xúc tác khác nhau, nằm cục
bộ dưới tế bào và phân bố ở một số mô [53].
1.2.2. Sơ lược enzyme carbonic anhydrase II:
Anhydrase carbonic II cụ thể là trên người là một metalloenzyme xúc tác q trình
-

hydrat hóa thuận nghịch của CO2 sang HCO3 . Protein miền đơn này bao gồm 260 axit
amin với một tấm sợi trung tâm. Kẽm được điều khiển bởi các gốc imidazole của ba
histidine nằm sâu trong một túi liên kết kỵ nước hình nón. Ở trạng thái khơng có phối tử,
-

các mol phân tử nước lấp đầy vị trí hoạt động. Một trong số chúng, được cho là OH chiếm
vị trí phối trí thứ tư của kẽm. Nó cũng được liên kết hydro với Thr199, được giả định là
tạo thành liên kết hydro với cơ chất CO2. Một loại nước bổ sung, W338 (gọi là

8


“deep water”), được tìm thấy ở trạng thái khơng có phối tử và được thay thế trong phản
ứng enzyme bằng CO2 [55].
1.2.3. Trung tâm hoạt động của enzyme CAII:
Một cái nhìn sâu hơn về các đặc điểm cấu trúc giữa 6H2Z và phối tử 4-(4phenylpiperidin-1-yl) carbonylbenzenesulfonamide (FKE) cho thấy rằng FKE liên kết
với ion Zn (II) bằng cách gốc sulfonamit bị khử có liên quan đến liên kết H (khoảng
cách 2,16 Å) với -OH của Thr199 dư. Một trong số oxy sulfonamide tạo thành liên kết
H (khoảng cách 1,85 Å) với nitơ amin của Thr199, và nhóm cacboxyl cũng tạo liên kết
H (khoảng cách 2,10 Å) với Gln92. Hơn nữa, FKE hiển thị thêm một tương tác bổ
sung, như liên kết giữa vịng benzen và nhóm imidazole của His94 [14].

Hình 1.2: Hình ảnh 2D của FKE tương tác với các axit amin quan trọng trong túi

liên kết của protein hCAII (PDB ID: 6H2Z).
Vai trị của enzyme CAII:
Nhìn chung, các đồng dạng CA của người có trong thận gồm CAII, IV, VB, IX,
XII và XIV và chúng đóng một chức năng quan trọng trong ba quá trình sinh lý:
-

Cân bằng axit - bazơ (bằng cách tiết và bài tiết proton, do sự mất nước của CO 2
phản ứng xúc tác bởi các enzym này).

-

Quá trình tái hấp thu bicacbonat.
9


-

Sản xuất NH4

+

ở thận.

Các chức năng quan trọng này được thực hiện trong các phân đoạn khác nhau
của nephron: tái hấp thu bicarbonat xảy ra ở ống lượn gần, trong khi q trình ion hóa
+

axit tiết niệu và đầu ra NH4 xảy ra ở ống lượn xa và ống góp. Sự định vị của
anhydrase carbonic trong thận đã được nghiên cứu tích cực bằng mơ học và miễn dịch.
Trong số các isozyme CA có hoạt tính xúc tác, ít nhất bốn (CAII, IV, XII và
XIV) được chứng minh là có mặt trong các tế bào biểu mô của ống thận. Trong các tế
bào của ống lượn gần, ống lượn xa và ống góp, nồng độ CAII cao đã được báo cáo.
Thật vậy, vai trò của CAII trong sinh lý thận đã được ghi nhận ở những bệnh nhân mắc
hội chứng thiếu CAII [23].
1.3. Nghiên cứu về hợp chất thiên nhiên nhóm coumarin:
1.3.1. Tiềm năng của hợp chất thiên nhiên Việt Nam:
Việt Nam hiện có 4.000 lồi cây thuốc, hơn 50 lồi tảo biển, 75 lồi khống vật
và gần 410 lồi động vật làm thuốc, trong đó có nhiều loại dược liệu quý được thế giới
công nhận như cây hồi, quế, atisô, sâm Ngọc Linh... Tổng sản lượng dược liệu trồng ở
Việt Nam ước tính đạt khoảng 100.000 tấn/năm. Nguyên liệu làm thuốc có nguồn gốc
thảo mộc được sử dụng hàng năm tại cộng đồng, các cơ sở y tế, phòng khám đông y,

sản xuất và kinh doanh với khoảng 50.000 tấn/năm thì 1/3 nguyên liệu do thu hái và
khai thác tự nhiên, 1/3 do trồng trọt và còn lại do nhập khẩu chủ yếu từ Trung Quốc,
Đài Loan, Hồng Công [3].
Theo Quyết định 1976 về Quy hoạch tổng thể phát triển dược liệu đến năm
2020 và định hướng đến năm 2030 của Thủ tướng Chính phủ, Việt Nam sẽ có 8 vùng
trồng nguyên liệu trên cả nước để trồng 54 loài dược liệu, lựa chọn và khai thác hợp lý
24 loài dược liệu tự nhiên. Đây sẽ là tiền đề để quy hoạch và phát triển nguồn dược liệu
nước ta trong thời gian tới để đáp ứng nhu cầu sản xuất trong nước [3].
1.3.2. Đơi nét về nhóm hợp chất coumarin:
Coumarins là nhóm dẫn xuất 1-benzopyran lớn nhất được tìm thấy trong thực vật.
Hợp chất ban đầu của nhóm hợp chất này, coumarin (2H-1-benzopyran-2-one), một hợp
chất khơng màu có mùi thơm, lần đầu tiên được phân lập từ đậu Tonka (Dipteryx odorata,
họ Fabaceae) vào năm 1820. Tên coumarin bắt nguồn từ một Thuật ngữ tiếng Pháp cho

10


đậu tonka, coumarou. Hơn 1300 coumarin đã được xác định là chất chuyển hóa thứ cấp
từ thực vật, vi khuẩn và nấm. Coumarins đã được tìm thấy ở khoảng 150 loài khác
nhau phân bố trên gần 30 họ khác nhau, trong đó một số họ quan trọng là Rutaceae,
Umbelliferae, Clusiaceae, Guttiferae, Caprifoliaceae, Oleaceae, Nyctaginaceae và
Apiaceae. Họ Apiaceae, Asteraceae và Rutaceae là ba nguồn thực vật chính cung cấp
coumarin [31, 51].

Hình 1.3: Hình ảnh 2D về coumarin
Coumarin là một trong hợp chất được sự quan tâm nhiều của các nhà thực vật
học, vì tính đa dạng về cấu trúc và đặc tính y học của chúng, cùng với hoạt tính sinh
học trên phạm vi rộng như giảm đau, chống đông máu, chống HIV, chống viêm, kháng
khuẩn, chống ung thư, tác dụng chống oxy hóa và điều hịa miễn dịch [51].
Ngày nay, nhiều hợp chất coumarin chiết xuất từ thiên nhiên đã được chứng

minh là có hoạt tính trên bệnh tăng huyết áp (antihypertensive). Dihydromammea
C/OB là một coumarin mới được phân lập từ hạt của cây Tây Phi Mammea africana
Sabine (Guttiferae). Hợp chất này được tìm thấy ở chiết xuất methanol và
dichloromethane của vỏ thân cây Mammea africana trong Nω-nitro-L-arginine methyl
ester và đã xác định được là gây hạ huyết áp ở những con chuột bạch tạng Wistar nặng
250-300g 12-16 tuần tuổi [43]. Scopoletin được phân lập từ quả của cây Tetrapleura
tetraptera TAUB (Mimosaceae) và nó gây hạ huyết áp ở động vật thí nghiệm in vitro và
in vivo thơng qua hoạt động giãn cơ trơn [28]. Visnadine, một hoạt chất chiết xuất từ
quả Ammi visnaga, có tác dụng giãn mạch vành, ngoại vi [27]. Dẫn xuất khellactone
được phân lập từ Phlojodicarpus sibiricus cho thấy tác dụng giãn mạch rõ rệt [18].

11


1.4. Mơ hình in silico trong q trình nghiên cứu và phát triển thuốc mới:
1.4.1. Tổng quan về quá trình nghiên cứu phát triển thuốc:
R&D – Quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc mới là một quá trình gồm
nhiều giai đoạn, từ lựa chọn mục tiêu phân tử của thuốc mới cho đến khi thuốc được
phê duyệt và đưa ra thị trường.

Hình 1.4: Các giai đoạn chính của q trình nghiên cứu và phát triển thuốc mới
Các phân tích trên tất cả các lĩnh vực điều trị đã chỉ ra rằng, phát triển một loại
thuốc mới, từ việc xác định mục tiêu thông qua phê duyệt tiếp thị, mất hơn 12 năm và
trung bình 13.5 năm. Chi phí để phát triển một phân tử nhỏ hoặc thực thể sinh học mới
(kháng thể, protein, liệu pháp gen…) là hơn 1 tỷ đơ la và trung bình ước tính vào
khoảng 2.6 tỷ đô la [48].
Các thử nghiệm lâm sàng chiếm 63% tổng chi phí, trong khi chi phí phát hiện và
phát triển thuốc tiền lâm sàng ước tính chỉ chiếm 32% tổng chi phí. Tỷ lệ thành cơng
(xác suất thành cơng của các thuốc đi vào quy trình lâm sàng / Giai đoạn I) được ước
tính là 7% đối với các phân tử nhỏ và 11% đối với thụ thể sinh học (tỷ lệ tiêu hao

tương ứng là 93% và 89%) [32].

12


Hiện nay, R&D thường được tiến hành bởi các công ty, tập đoàn dược phẩm đa
quốc gia lớn. Khi xảy ra các bệnh hiếm gặp tại các nước nghèo (châu Phi) hay các
nước đang phát triển, thuốc đặc trị lại khơng có. Để giải quyết tình hình đó, WHO và
một số chính phủ phải đầu tư kinh phí và đặt hàng nghiên cứu với các trường đại học
hoặc công ty dược phẩm để phát triển thuốc cho các bệnh đặc thù này [4].
1.4.2. In silico trong quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc:
Sự ra đời của sàng lọc ảo dựa trên cấu trúc đã thay đổi, cải thiện rất nhiều trong
quá trình nghiên cứu và phát hiện thuốc. Phương pháp này được ứng dụng hầu như vào
mọi khâu của R&D, từ khâu tìm kiếm các hợp chất hóa học có tác dụng sinh học, đến
tối ưu hóa cấu trúc các hợp chất này nhằm tăng hoạt tính sinh học, giảm độc tính, tăng
các tính chất dược động học của thuốc, đến các khâu nghiên cứu tiền lâm sàng và lâm
sàng. Chúng được gọi chung là phương pháp “in silico” để phân biệt với các phương
pháp in vivo, in situ và in vitro [22].
So với các phương pháp thực nghiệm trước đó, các phương pháp in silico có ưu thế
giúp thiết kế những phân tử thuốc mới với những ưu thế vượt trội bằng việc giải thích bản
chất phân tử của các tương tác thuốc, điều mà khơng một thí nghiệm nào có khả năng làm
được. Ngồi ra chúng cho phép dự đốn hoạt tính sinh học nhờ sử dụng các mơ hình tốn
học, dự đốn cơ chế tác dụng, cơ chế gây độc của các hợp chất và đặc biệt giúp tiết kiệm
đáng kể cả thời gian và tiền bạc trong việc phát triển một thuốc mới [22].

1.4.3. Giới thiệu về Docking:
Việc giải trình tự bộ gen người đã dẫn đến sự gia tăng số lượng các mục tiêu điều
trị mới cho nghiên cứu dược phẩm. Ngoài ra, các phương pháp tinh thể học thông lượng
cao và cộng hưởng từ hạt nhân đã góp phần thu được cấu trúc nguyên tử của protein và
phức hợp protein-phối tử với mức độ chi tiết ngày càng cao. Và từ đó một kỹ thuật mới ra

đời đó là thiết kế thuốc dựa trên cấu trúc. Phương pháp phổ biến nhất là Docking [30].
Được thành lập vào đầu những năm 1980, docking là cơng cụ tìm kiếm mạnh mẽ
và hiện là một trong những phương pháp hữu ích nhất trong các cơng cụ thiết kế thuốc in
silico và là một thành phần không thể thiếu trong nhiều chương trình tìm kiếm thuốc [34,
56]. Docking được mô tả là một phương pháp thiết kế thuốc dựa vào cấu trúc ba chiều
(3D), nghiên cứu khả năng gắn kết một hay nhiều hợp chất (ligand) vào mơ hình

13


của protein hay enzyme, DNA v..v... [12, 24]. Trong lĩnh vực mơ hình phân tử, docking
dự đốn hướng ưu tiên của một phân tử thứ nhất vào phân tử thứ hai khi chúng liên kết
với nhau để tạo thành một phức hợp ổn định. Docking dự đoán tiềm năng liên kết giữa
hai phân tử dựa trên điểm số docking cũng như vị trí gắn kết, từ đó dự đốn khả năng
hoạt hóa hoặc ức chế một protein của hợp chất [24].
Về mặt nhiệt động lực học, mục tiêu của docking là tìm ra cấu hình mà năng
lượng tự do (∆G) của toàn hệ thống thấp nhất. Khi cơ chất gắn kết lên một phân tử
protein mục tiêu, hai điểm cần chú ý là sự phù hợp về hình dạng, kích thước và năng
lượng tương tác giữa cơ chất với protein. Ngồi u cầu phù hợp về hình dạng, kích
thước, giữa cơ chất và enzyme còn những tương tác khác như tương tác Van der Waals,
tương tác tĩnh điện... Tuy nhiên, protein thường có kích thước lớn và mềm dẻo nên rất
khó để khảo sát hết tất cả các khả năng tương tác giữa protein và cơ chất. Trong
docking, phân tử protein thường được đưa vào dưới dạng cấu trúc cứng, cơ chất có thể
chuyển động tương đối so với protein và thay đổi cấu hình [24].
Ngày nay, hơn 30 ứng dụng để Docking hồn tồn dễ tìm kiếm trên Internet.
Được sử dụng rộng rãi nhiều nhất là AutoDock Vina rồi đến Genetic Optimization for
Ligand Docking (GOLD), FlexX/FlexE, DOCK và Internal Tọa độ Cơ học
(ICM)/Thuật toán kết nối ICM-linh hoạt (IFREDA) [56].
1.4.4. Giới thiệu về Quy tắc Lipinski 5 (RO5):
Vào những năm 1990, do sự thay đổi mơ hình tìm kiếm thuốc từ sàng lọc kiểu hình

sang hóa học tổ hợp, sàng lọc thông lượng cao, RO5 đã được tạo ra để trở thành một cơng
cụ dự đốn trong thời đại mà hóa học dược liệu và tổ hợp tạo ra q nhiều hợp chất có đặc
tính hóa lý rất kém. Lipinski và các đồng nghiệp đã báo cáo một phân tích về các hợp chất
liên quan mà đến 90% đã tham gia vào các nghiên cứu lâm sàng giai đoạn II, về tương
quan các đặc tính hóa lý tính tốn của các phân tử này với khả năng hòa tan trong nước,
tính thẩm thấu và sinh khả dụng đường uống của chúng [18, 37]. "Quy tắc năm" ra đời,
như một cơng cụ ghi nhớ cho các nhà hóa dược sử dụng để đánh giá nhanh các hợp chất
trong quá trình phát hiện và tối ưu hóa thuốc liên quan đến khả năng hiển thị độ hòa tan và
độ thẩm thấu tốt của các hợp chất [37]. Nếu một hợp chất khơng đạt RO5 thì khả năng cao
khi trở thành thuốc sẽ gặp phải các vấn đề trong cơ thể

14


con người. Tuy nhiên, việc vượt qua RO5 khơng có gì đảm bảo chắc chắn rằng một
hợp chất là giống thuốc (drug-like) [18].
Theo trang web scfbio-iitd.res.in của Supercomputing Facillity for Bioinformatics
& Computational Biology, IIT Delhi, thì Quy tắc Lipinski 5 giúp phân biệt giữa các

phân tử giống thuốc và không giống thuốc [13]. Nó dự đốn xác suất thành cơng với tỷ
lệ chính xác cao, nếu các phân tử tuân thủ 2 hoặc nhiều quy tắc sau:
-

Khối lượng phân tử nhỏ hơn 500 Dalton.

-

Tính ưa mỡ cao (được biểu thị bằng Log P nhỏ hơn 5).

-

Ít hơn 5 liên kết hydro (cho) (tổng của O-Hs và N-Hs).

-

Ít hơn 10 liên kết hydro (nhận) (tổng của N và Os).

-

Độ khúc xạ mol phải nằm trong khoảng 40-130.
1.4.5. Dự đoán ADMET:

Thực nghiệm đánh giá các đặc tính dược động học và độc tính của phân tử nhỏ
vừa tốn thời gian vừa tốn chi phí và khơng phải lúc nào kết quả đáng tin cậy giữa các
mơ hình động vật và con người. Để giải quyết vấn đề này, nhiều phương pháp tính tốn
đã được phát triển để tìm kiếm và lựa chọn hợp chất trong suốt q trình phát triển
thuốc [21].
Mơ hình tính tốn dựa trên các đặc tính dược động học như hấp thu, phân bố,
chuyển hóa, thanh thải và độc tính (ADMET) trên máy tính là cần thiết cho R&D [19].
Ở một số công ty dược phẩm, phương pháp này đã được các nhà thiết kế thuốc của họ

áp dụng thường xuyên với nhiều thành công đáng kể [39].
Các đặc tính hấp thu, phân phối, chuyển hóa, thanh thải và độc tính (ADMET) là
những hiện tượng liên quan chặt chẽ đến đặc tính của một chất hóa học trong cơ thể con
người. Mục tiêu chính để tính tốn các thuộc tính ADMET là thu được dự đốn sơ bộ về
khả năng dược lý tiềm năng của một hợp chất để trở thành thuốc [19]. Mỗi đặc tính của
ADMET sẽ phản ánh kết quả của một hợp chất hóa học khi tương tác với các cơ quan khác
nhau trong cơ thể. Việc dự đốn các đặc tính ADMET quan trọng, đặc biệt là đối với các
hợp chất hóa học lạ được tiêu thụ trong thời gian dài hoặc ở nồng độ lớn [39].

15