Tiểu luận bệnh học thủy sảnPcr là gì?Nguyên lý chuẩn đoán bệnh bằng Pcr trên động vật thủy sản

ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

Số phách

TIỂU LUẬN KẾT THÚC HỌC PHẦN

TÊN ĐỀ TÀI: PCR LÀ GÌ ? TRÌNH BÀY ỨNG DỤNG CỦA PCR TRONG CHUẨN
CHUẨN ĐOÁN BỆNH TRÊN ĐỘNG VẬT THỦY SẢN

Ngành học: Nôi trồng thủy sản
Tên học phần: Bệnh học thủy sản
Giảng viên giảng dạy: Trần Nam Hà

HỌ VÀ TÊN SV: TRƯƠNG THỊ BỒNG
MÃ SINH VIÊN: 18L3081009
NHÓM HỌC PHẦN: NHÓM 1

THỪA THIÊN HUẾ, NĂM 2021

Số phách


I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngành Nuôi trồng thủy sản Việt Nam ngày càng
phát
triển, trở thành ngành kinh tế mũi nhọn của
quốc gia, không chỉ mang lại nhiều ngoại tệ cho đất
nước mà cịn góp phần đáng kể vào sự thành cơng
trong cơng tác xóa đói giảm nghèo, bảo đảm an ninh
lương thực, làm thay đổi đời sống dân cư các vùng

miền núi và ven biển. Tuy nhiên, trong những năm gần
đây, dịch bệnh và ô nhiễm môi trường đang trở thành
những thách thức lớn đối với ngành Nuôi trồng thủy
sản. Thiệt hại do dịch bệnh gây ra là rất lớn.Những tác
nhân gây bệnh trên động vật thủy sản như bệnh do vi
khuẩn,virus,nấm,ký sinh gây ra chiếm tỷ lệ khá lớn.
Điều này đã cản trở việc phát triển công nghiệp sản
xuất giống thủy sản cũng như nuôi thương phẩm. Một
khi nuôi trồng thủy sản đã phát triển ở mức cơng
nghiệp, thì kỹ thuật quản lý chuẩn đoán dịch bệnh đã
trở thành các bí quyết quan trọng để đảm bảo sự thành
cơng của một vụ ni. Cho đến nay, các phương thức
phịng bệnh hiện đang được ứng dụng vẫn chưa mang
lại hiệu quả cao.
Việc chuẩn đoán bệnh cũng đang được cho là một
trong những hình thức quan trọng nhất trong ni trồng
thủy sản. Nhằm phát hiện bệnh sớm để phịng và điều
trị.Có rất nhiều phương pháp chuẩn đoán bệnh khác
nhau,tuy nhiên PCR vẫn luôn là phương pháp tối ưu và
hiệu quả nhất.Việc ứng dụng PCR trong chuẩn đoán
bệnh trên động vật thủy sản ngày càng phát triển và
được ưa chuộng.Nó góp một phần hạn chế được dịch
bệnh trong nuôi trồng thủy sản và trong phát triển nền
kinh tế,thúc đẩy ngành thủy sản phát triển bền vững
Vì vậy, đề tài tiểu luận sau đây sẽ giúp chúng ta tìm
hiểu,mơ tả thêm về kỹ thuật PCR và ứng dụng của nó
trong chuẩn đốn bện trên động vật thủy sản


II. NỘI DUNG

2.1 Thế nào là PCR ?
2.1.1 Các khái niệm về PCR.
PCR đã được sử dụng rất phổ biến và là công cụ không
thể thiếu trong nghiên cứu ADN thuộc lĩnh vực sinh
học, y học, tội phạm học, xác định huyết thống, ... phục
vụ nhiều mục đích khác nhau, như phát hiện các bệnh
di truyền, nhận dạng tội phạm, nghiên cứu bệnh nhiễm
trùng.
PCR là phương pháp khuếch đại nhanh và nhạy có
chọn lọc mơt trình tự DNA/RNA nhất định từ một
mạch khuôn axit nucleic
PCR là viết tắt tiếng anh của từ Polymerase chain
reaction có nghĩa là phản ứng tổng hợp DNA nhân tạo
dựa vào tính đặc hiệu của cặp mồi chuyên biệt cho
đoạn DNA đích và các chu kỳ nhiệt.
PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử
do Kary Mullis phát minh ra vào năm 1983, đến nay đã
được hoàn thiện qua nhiều cải tiến và được tự động hố
hồn tồn nhằm khuyếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một
đoạn DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống
Định nghĩa kỹ thuật PCR là gì thì từ lâu đã được người
ni tơm biết đến, có thể hiểu đơn giản về kĩ thuật PCR
(polymerase chain reaction) là một phương pháp tổng
hợp DNA dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích
DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của
khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của
enzyme polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu
cho đoạn DNA này. Primer là những đoạn DNA ngắn,
có khả năng bắt cặp theo nguyên tắc bổ sung với một
mạch của đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của

DNA polymerase đoạn primer này được kéo dài để
hình thành mạch mới.
Kỹ thuật PCR được hình thành dựa trên đặc tính này
của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai primer


sẽ được khuếch đại thành số lượng lớn bản sao đến
mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium
bromide và có thể thu nhận đoạn DNA này cho các
mục đích khác nhau bằng các thao tác trên gel. Như
vậy, để khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần
phải có những thơng tin tối thiểu về trình tự của DNA,
đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo
các primer bổ sung chuyên biệt.
2.1.2 Nguyên tắc PCR
Tất cả các ADN polymerase khi hoạt động tổng hợp
một mạch ADN mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện
diện của những mồi chuyên biệt (một mồi xuôi và một
mồi ngược so với chiều phiên mã của gen). Mồi là
những đoạn ADN ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung
với một đầu của mạch khuôn, và ADN polymerase sẽ
nối dài mồi để hình thành mạch mới. Nếu hai mồi
chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình
tự ADN thì chỉ đoạn ADN nằm giữa hai mồi được tồng
hợp. Hai mồi này gồm mồi xuôi và mồi ngược theo
chiều phiên mã gen.
2.1.3 Thành phần của PCR
• Mạch khn (template)
• Mồi (Primers)
• dNTPs: dATP, dCTP, dGTP and dTTP

• Thermostable DNA polymerase (enzym chịu
nhiệt xúc tác quá trình tổng hợp DNA)
• PCR buffer (dung dịch PCR): có chứa Mg 2+ cần cho
hoạt động của men DNA polymerase
2.2. Ứng dụng của PCR trong chuẩn đoán bệnh trên động vật thủy sản
2.2.1 Quy trình chuẩn đốn bệnh chung
Gồm 20 đến 30 chu kỳ, lặp lại và nối tiếp nhau
- Mỗi chu kỳ gồm 3 bước
+ Bước 1: Biến tính (denaturation) Giai đoạn này được thực hiện ở nhiệt độ cao
hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử (94 – 95oC) trong vòng 30 – 60 giây, làm
cho phân tử DNA mạch kép tách thành hai mạch đơn. Hai mạch đơn này đóng


vai trị là mạch khn cho sự tổng hợp hai mạch bổ sung mới.. Bước này gọi là
biến tính, nó phá vỡ cầu nối hydrogen nối 2 sợi DNA. Trước chu kỳ 1, DNA
thường được biến tính đến thời gian mở chuỗi để đảm bảo mẫu DNA và mồi
được phân tách hồn tồn và chỉ cịn dạng sợi đơn. Thời gian: 1-2 phút
+ Bước 2: Bắt cặp mồi (hybridization) Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được
hạ thấp xuống để mồi có thể gắn vào sợi DNA đơn. Bước này gọi là gắn mồi.
Nhiệt độ giai đoạn này phụ thuộc vào đoạn mồi và thường thấp hơn nhiệt độ
biến tính 50 °C (45-60 °C). Sử dụng sai nhiệt độ trong giai đoạn này dẫn đến
việc đoạn mồi không gắn hoàn toàn vào DNA mẫu, hay gắn một cách tùy tiện.
Thời gian: 1-2 phút. Đây là giai đoạn quyết định nên tính đặc hiệu của sản
phẩm PCR.
+ Bước 3: Kéo dài (extension) Nhiệt độ được tăng lên đến 72oC, để DNA
polymerase hoạt động kéo dài mạch. Cuối cùng, DNA polymerase gắn tiếp vào
sợi trống. Nó bắt đầu bám vào và hoạt động dọc theo sợi DNA. Bước này gọi là
kéo dài. Nhiệt độ kéo dài phụ thuộc DNA-polymerase. Thời gian của bước này
phụ thuộc vào cả DNA-polymerase và chiều dài DNA cần khuếch đại. Như một
quy tắc …, 1000bp/ 1 phút.

- Như vậy, qua một chu kỳ nhiệt, một DNA đích sẽ được nhân lên thành
2 bản sao và nếu chu kỳ lặp đi lặp lại liên tục từ 30 đến 40 chu kỳ thì từ
một DNA đích đã nhân bản thành 230 đến 240 bản sao, tức là hàng tỷ bản
sao.

2.2.2 Các dạng của PCR thường được ứng dụng
• PCR một bước (one steo PCR): thao tác cơ bản


• PCR 2 bước (PCR tổ-Nested PCR): sử dụng hai cặp mồi
• PCR phức (Multiplex PCR): khuếch đại đồng thời hai hay nhiều đoạn
DNA mục tiêu trong một mẫu
• PCR phiên mã ngược (RT-PCR): định tính biểu hiệngen hoặc phát hiện
virút RNA
• PCR thời gian thật (RealTime PCR)
2.2.3 Ứng dụng của PCR trong chuẩn đoán bệnh trên động vật thủy sản
2.2.3.1

Ứng dụng PCR trong chẩn đốn bệnh trên tơm:

Thời gian gần đây, tình hình dịch bệnh trên tơm diễn biến ngày càng phức tạp
gây thiệt hại về mặt kinh tế cho người ni. Ứng dụng kĩ thuật PCR trong chẩn
đốn bệnh tôm là phương pháp hữu hiệu cho kết quả và độ chính xác cao.
Tơm là lồi thủy sản hiện đang được ni nhiều trên diện tích rộng và mang lại
giá trị kim ngạch xuất khẩu tương đối lớn cho ngành Thủy sản Việt Nam. Tuy
nhiên, loài này dễ cảm nhiễm với bệnh do nhiều loại virus,vi trùng ,vi khuẩn gây
ra với cường độ cao. Tình hình dịch bệnh diễn biến ngày càng phức tạp. Cho đến
nay, các phương pháp phịng và điều trị bệnh thơng thường hiện đang được ứng
dụng vẫn chưa mang lại hiệu quả cao. Vì vậy, việc áp dụng kỹ thuật PCR trong
chẩn đoán bệnh trên tôm là phương thức quản lý bệnh hiệu quả hơn

Quy trình chung chuẩn đốn PCR tác nhân virus gây bệnh trên tơm
Mẫu tơm

Chuẩn bị mẫu

Tách triết DNA
Tách triết ARN
PCR

•Ứng dụng PCR chuẩn
trên tơm (Trần Thị Tuyết

RT-PCR

Đọc kết quả

đốn bệnh đốm trắng
Hoa)

Phương pháp PCR được ứng dụng là nested-PCR.Qui trình được thiết kế bao
gồm hai bước với thành phần phản ứngĐiện
của dicác bước


như sau:
(i) thành phần phản ứng bước 1 (20μl): 1X PCR buffer; 1,5mM MgCl2;
200μM dNTPs mix, 10pmol mồi deca-20s9, 10pmol mồi deca-20a2, 20pmol
mồi
P1; 20pmol mồi P2; 1,5U Taq ADN Polymerase và mẫu ADN chiết tách (1μl);
(ii) thành phần phản ứng bước 2 (20μl): 1X PCR buffer; 1,0mM MgCl2;

200μM3
dNTPs mix, 10pmol mồi deca-20s9, 10pmol mồi deca-20a2, 20pmol mồi P3;
20pmol mồi P4; 1,5U Taq ADN Polymerase và sản phẩm PCR bước 1 (1μl).
Điều
kiện phản ứng PCR của hai bước được thực hiện ở cùng điều kiện như sau: nhiệt
độ 94oC trong 5 phút, tiếp theo 94oC trong 30 giây, 56oC trong 30 giây, 72oC
trong 1 phút, chu kỳ này được lặp lại 30 lần, cuối cùng là 72oC trong 5 phút.
Bảng 1: Trình tự mồi sử dụng trong phản ứng PCR bước 1 và bước 2

Tên mồi

Trình tự mồi sử dụng

P1 5’

-ATC-ATG-GCT-GCT-TCA-CAG-AC-3’

P2 5’

-CGC-TGG-AGA-GGA-CAA-GAC-AT-3’

P3 5’

-TCT-TCA-TCA-GAT-GCT-ACT-GC-3’

P4 5’

-TAA-CGC-TAT-CCA-GTA-TCA-CG-3’

Deca-20a2 5’

-ACT-TCC-CCC-GGA-ACC-CAA-AGA-CT- 3’

Deca-20s9 5’

-GGG-GGC-ATT-CGT-ATT-GCG-A- 3’

Sản phẩm PCR được điện di bằng gel agarose 1,5% có chứa 0,5 µg/ml ethidium
bromide, trong dung dịch 0,5X TAE (Tris-acetate-EDTA) ở 90V và ghi nhận với
thiết bị chụp, xử lí ảnh gel (Vilber Lourmat).
Căn cứ vào thang ADN 100 bp plus (Fermentas) hay thang ADN 1kb plus
(Invitrogen) để xác định trọng lượng phân tử của mẫu phân tích. Kết quả được
ghi
nhận: (i) vạch ở vị trí 240bp là ADN chiết tách tốt và (ii) vạch ở vị trí 982 bp là
mẫu nhiễm WSSV (sản phẩm PCR bước 1) hay vạch ở vị trí 570 bp là mẫu
nhiễm


WSSV (sản phẩm PCR bước 2)
Kết quả :
Kết quả cho thấy, sản phẩm PCR bước 1 cho kết quả tốt ở tất cả các khoảng
nhiệt độ thử nghiệm, ngược lại sản phẩm PCR bước 2 chỉ cho kết quả tốt ở
khoảng
57,1o C;55,8oC (Hình 1). Dựa vào kết quả ghi nhận, nhiệt độ gắn mồi được chọn
là 56oC.

Kết quả từ hình 2 cho thấy, ở tất cả các mẫu pha loãng đều cho vạch khuếch đại
rất
rõ. Độ sáng của các vạch ADN giảm dần theo độ pha loãng của hàm lượng ADN
khn. Qua kết quả cịn cho thấy, với nồng độ ADN khn và nồng độ ADN pha

lỗng ở các mức độ khác nhau của mẫu nhiễm vừa (++) đều cho kết quả tốt.
Vạch


ở giếng thứ 6, mẫu có nồng độ pha lỗng tương ứng với hàm lượng ADN 10
pg/μl
nhưng vẫn cho kết quả PCR rất tốt, điều này chứng tỏ khả năng phát hiện mẫu
của
qui trình cao, có thể phát hiện được cả những mẫu có hàm lượng ADN thấp
(10 pg/μl) thậm chí thấp hơn nữ
Qui trình nested-PCR được phát triển phù hợp với điều kiện thực tế với các thay
đổi về thành phần hóa chất tham gia phản ứng và chu kỳ nhiệt của phản ứng.
Kết
quả ghi nhận khả năng sử dụng tốt của qui trình PCR trong việc phát hiện
WSSV từ
nhiều đối tượng cảm nhiễm khác nhau (tôm giống, tôm thịt, cua, giun nhiều tơ,
ốc
mượn hồn và mực), với độ nhaỵ khoảng 10pg/phản ứng và thời gian khuếch đại
ngắn
Ngoài ra cịn một số bệnh phổ biến trên Tơm ứng dụng PCR để chuẩn
đốn
• Bệnh hoại tử cơ trên tơm (IMNV) sử dụng phương pháp Realtime RTPCR
• Bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tơm (AHPND/EMS) sử dụng phương pháp
PCR
• Bệnh vi bào tử trùng trên tơm (EHP)
• Hội chứng Taura trên tơm (TSV) sử dụng phương pháp Realtime RT-PCR
• Bệnh đầu vàng trên tôm (YHV) sử dụng phương pháp Realtime RT-PCR
• Bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu (IHHNV) sử dụng phương pháp
Realtime PCR
• Bệnh Phát sáng trên tơm (Vibrio harveyi)

• Bệnh do vi khuẩn gây hoại tử gan tụy (NHPB).
2.2.3.2

Ứng dụng PCR trong chuẩn đoán bệnh trên cá
Ngày nay ,bệnh trên cá cũng là một trong số vấn đề được sự quan tâm
của người nuôi thủy sản.Tình trạng bệnh do virus,vi khuẩn,ký sinh
trùng,nấm….gây ra trên một số lồi cá ni ngày càng gia tăng,tuy


nhiên việc phát hiện và chuẩn đoán bệnh theo truyền thống không đme
lại hiệu quả.Hiện nay phương pháp PCR đang rất thình hành,được
nhiều người dụng cho việc chuẩn đốn bệnh cho động vật thủy
sản.Chính vì vậy ứng dụng PCR trong chuẩn đoan bệnh trên cá là một
giải pháp hữu hiệu.Phương pháp PCR có thể ứng dụng để chuẩn đốn
rất nhiều loại bệnh do nhiều tác nhân gây ra.Một trong số đó có thể kẻ
đên là ứng dụng PCR để chuẩn đốn bênh VNN trên cá.
•
Ứng dụng PCR chuẩn đốn bệnh hoại tử thần kinh (VNN) trên các
loài cá biển bằng phương pháp Realtime RT-PCR
Quy trình chung ứng dụng quy trình PCR trong chuẩn đốn bệnh VNN trên cá
biển

Trong tiến trình phản ứng RT-PCR thì Phản ứng khuếch đại được thực
hiện trong máy luân nhiệt theo phương pháp RT PCR một bước, sử dụng
cặp mồi khuếch đại đoạn gen vùng T4 mã hoá protein vỏ của chủng
SSJNNV.
R3: 5'-CGA-GTC-AAC-ACG-GGT-GAA-GA-3'
F2: 5'-CGT-GTC-AGT-CAT-GTG-TCG-CT-3'
Đọc kết quả
Sau khi điện di xong, đọc kết quả trên bàn đọc UV, đọc kết quả với tia UV

bước sóng 302 nm.
Đối chiếu các vạch sáng của mẫu với các vạch sáng từ thang ADN, mẫu
kiểm chứng dương tính và mẫu kiểm chứng âm tính để đưa ra kết luận.


Giếng

Vạch 427 bp

Kết quả

Thang
ADN

Các vạch sáng
rõ ràng

Điện di tốt

Mẫu kiểm
chứng âm
tính

Khơng

Khơng ngoại nhiễm

Mẫu kiểm
chứng
dương

tính
Mẫu thử

Có
Có
Khơng
Có
Khơng

Bi ngoại nhiễm
Hỗn hợp phản ứng RT-PCR
tốt
Mẫu kiểm chứng dương tính
hỏng hoặc enzym hỏng
Dương tính với VNN
Âm tính với VNN

Kết quả mẫu thử dương tính khi: Xuất hiện vạch sáng có kích thước bằng
kích thước giống mẫu đối chứng dương có kích thước 427 bp, thang ADN
phân vạch rõ ràng, mẫu đối chứng âm khơng có vạch sáng.
Kết quả mẫu thử âm tính khi khơng có vạch sáng kích thước 427 bp.
Khơng có vạch sáng của mẫu đối chứng âm tính, có vạch sáng mẫu đối
chứng dương tính. Thang ADN phân vạch rõ ràng
Ngồi ra cịn một số bệnh đươc ứng dụng PCR trong chuẩn đoán
bệnh như:
Bệnh xuất huyết mùa xuânở cá chép (SVCV) sử dụng phương pháp PCR
RT-PCR
Bệnh Koi Herpesvirus(KHV) gây bệnh ở cá chép sử dụng phương pháp
PCR RealtimePCR
Phát hiện vi khuẩnEdwardsiella ictaluri gâybệnh gan thận mủ ở cá bằng

phương pháp nuôi cấy phân lập sử dụng phương pháp PCR Realtime PCR
Bệnh nhiễm trùng xuấthuyết (VHS) ở cá sử dụng phương pháp PCR
RealtimeRT-PCR
Bệnh hoại tử cơ quan tạomáu (EHN) ở cá sử dụng phương pháp PCR
Ngồi ứng dụng chuẩn đốn bệnh trên tơm và cá, PCR cịn được ứng dụng trong
chuẩn đốn bệnh trên động vật thân mềm hai mảnh vỏ và các loài nhuyễn


thể.Hiện có rất nhiều nghiên cứu về ứng dụng của PCR trng chuẩn đoán bệnh
trên động vật thủy sản
2.3 Ưu nhược điểm của việc ứng dụng PCR trong chuẩn đoán bệnh
Ưu điểm
Kết quả thu được nhanh, sau khi làm xét nghiệm đến khi có kết quả chỉ khơng
q 5 giờ.
Có khả năng phát hiện nhiều bệnh mà bằng phương pháp lâm sàng không phát
hiện được.
Xác định các đột biến gen,…
Nhược điểm
Chi phí mua máy xét nghiệm PCR khơng hề thấp.
Các xét nghiệm PCR khó có thể thực hiện tại đúng chuẩn mực tại những phịng
thí nghiệm lâm sàng.
Người thực hiện kỹ thuật PCR cần phải có trình độ chun mơn cao.
Phương pháp PCR thông thường không hoạt động được với những đoạn DNA
lớn hơn 3 kb (kết quả tốt với các đoạn DNA dưới 1.5 kb)
Sự ngoại nhiễm do sản phẩm khuếch đại của những lần thao tác trước
Các sai sót gây ra do taq polymerase (khoảng 10.000 nucleotic thì enzym gắn
sai 1 nucleotic)
III. KẾT LUẬN
Thời gian gần đây, tình hình dịch bệnh trên động vật thủy sản diễn biến ngày
càng phức tạp gây thiệt hại về mặt kinh tế cho người ni. Ứng dụng kĩ thuật

PCR trong chẩn đốn bệnh trên động vật thủy sản tuy cịn gặp khó khăn nhiều
mặt nhưng là phương pháp hữu hiệu cho kết quả và độ chính xác cao.Chính vì
vậy cần được khuyến khích phát triển mở rộng,tìm hiểu học hỏi những thứ ưu
việc trong việc ứng dụng PCR trong chuẩn đoán bệnh trên động vật thủy sản của
các nước để hoàn thiện hơn,khắc phục những khó khăn hiện tai của ta trong việc
áp dụng nó
IV. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.Giáo trình bệnh học thủy sản, Nhà xuất bản đại học Huế,2018
2.Bùi Quang Tề .Giáo trình bệnh học thủy sản phần 2.Xuất bản 2006
3. Đặng Thị Hoàng Oanh và Đặng Thụy Mai Thuy, 2009. “Nghiên cứu ứng
dụng qui trình PCR chẩn đốn vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trên thận cá tra
(Pangasianodon hypophthalmus)”


4. Bênh học thủy sản –Quy trình chẩn đốn-Phần 2: Bệnh hoại tử thần kinh ở cá
biển
5. Danh mục các phép thử chẩn đốn bệnh thủy sản-Phịng thử nghiệm ngành
Nơng nghiệp và PTNN ,Chi cục thú y Vùng Vi ,trung tâm chuẩn đoán xét
nghiệm bệnh động vật
6. Trần Thị Tuyết Hoa. Tạp chí Khoa học 2011:17a 1-8Trường Đại học Cần Thơ.
“Quy trình Nested-PCR phát hiện virus gây bệnh Đốm Trắng (WSSV )và nội
chuẩn giáp xác mười chân trên nhiều đối tượng cảm nhiễm”
7. DTHOanh. “Nguyên lý và ứng dụng của phương pháp PCR trong phát hiện
và chẩn đoán bệnh ở động vật thủy sản”