Đồ án nghiên cứu sản xuất protease từ chủng nấm mốc aspergillus

Đô án chuyên môn

GVHD:

5.1............................................................................................................................................

Trang 1


Đô án chuyên môn

GVHD:

5.2............................................................................................................................................Cá
c hệ enzyme trong sản xuất nước mắm........................................................................
5.3.7.........................................................................................................................................Hệ
enzyme Metalo-protease...............................................................................................
5.3.2.....................................................................................................................................Hệ
enzyme serin-protease..................................................................................................
5.3.3.....................................................................................................................................Hệ
enzyme acid-protease....................................................................................................
5.3............................................................................................................................................Vỉ
sinh vật trong sản xuất nước mắm...............................................................................
5.4............................................................................................................................................Qu
ỉ trình sản nước mắm.....................................................................................................
5.5............................................................................................................................................Ng
uyên liệu và xử lý nguyên liệu.......................................................................................
5.6.1.....................................................................................................................................Hả
i sản...............................................................................................................................
5.6.2.....................................................................................................................................Nư
ớc...................................................................................................................................

5.6.3.....................................................................................................................................Mu
ối....................................................................................................................................
5.6.4.....................................................................................................................................Nấ
m mốc Asp.oryzae.........................................................................................................
5.7 Một sổ nguyên nhân dẫn đến nước mắm kém chất lường và cách phòng chữa... 5.7.1
Chượp chua..................................................................................................................................
5.7.2.........................................................................................................................................Ch
ượp đen.........................................................................................................................
5.7.3.........................................................................................................................................Ch
ượp thối.........................................................................................................................
5.7.4.........................................................................................................................................Nư
ớc mắm thối..................................................................................................................
Trang 2


Đô án chuyên môn

GVHD:

5.8............................................................................................................................................Bả
o quản...............................................................................................................................
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NHỊ.......................................................................................................
TÀI LIỆU THAM KHẢO

36
36
36
36
37
38

39
39
39
39
39
40
40
41
41
42
42
43
44

Trang 3


MỞ ĐẦU
Một trong những thành tựu to lớn của khoa học công nghệ trong thơi gian gần đây là
nghiên cứu về enzyme, nó đặt trung cho sự phát triển của khoa học tự nhiên trong mấy chục
năm qua, đó là những khám phá về cấu trúc hóa học và các cơ chế tác dụng kỳ diệu của enzymexúc tác sinh học. Enzyme đóng vai trị cực kỳ quan trọng trong nghành công nghiệp hiện đại.
Truớc đây enzyme enzyme đuợc dùng trong nghiên cứu và áp dụng trong sản xuất thuờng
đuợc thu nhận từ động vật, thực vật. Trong những năm gần đây nguời ta bắt đầu chú ý đến một
nguồn enzyme vơ cùng phong phú và rẻ tiền. Đó là nguồn enzyme đuợc tách chiết từ vi sinh vật.
Các vi sinh vật có tốc độ phát triển nhanh do đó có thể tạo ra một luợng enzyme vơ cùng lớn
trong một thời gian ngắn, đồng thời enzyme này có hoạt lực xúc tác rất cao. Do đó, chúng đuợc
ứng dụng cho nền sản xuất enzyme.
Qua nhiều năm việc gia tăng sử dụng vi sinh vật nhu là một nguồn cung cấp protease đã
cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm đuợc tạo ra nhiều hơn. Tuy nhiên giá thành chế
phẩm protease cịn khá cao (giá trị bn bán 187.2 triệu USD). Do đó, cũng hạn chế việc sử

dụng rộng rãi enzyme trong sản xuất. Các chế phẩm thu đuợc sau q trình ni cấy sản xuất
enzyme chua phải là chế phẩm có độ tinh khiết cao vì protein chỉ chiếm 20 - 30%. Với để tài:
“Nghiên cứu sản xuất protease từ chủng nấm mổc Aspergillus, oryzae ủng dụng trong sản xuất
nước mắm ” nhằm thu đuợc chế phẩm có độ tinh khiết cao và ứng dụng trong các lĩnh vực khác
nhau của đời sống xã hội là rất cần thiết.


CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN VÈ ENZYME
Enzyme là những protein có khả năng xúc tác cho các phản ứng hoá học với mức độ đặc
hiệu khác nhau ở nhiệt độ tuơng đối thấp. Enzyme có trong tất cả các tế bào sống và là chất xúc
tác sinh học. Enzyme có đầy đủ các tính chất của chất xúc tác, nhung enzyme có hiệu suất xúc
tác lớn hơn tất cả các chất xúc tác hữu cơ và vô cơ khác. Enzyme không những có thể xúc tác
cho phản ứng trong cơ thể sống mà sau khi tách khỏi hệ thống sống, ở những điều kiện nhất
định chúng vẫn giữ đuợc hoạt tính xúc tác.Các chất tham gia trong phản ứng do enzyme xúc tác
gọi là cơ chất của enzyme, ký hiệu là S.E có tính đặt hiệu cao nghĩa là một emzyme chỉ tác dụng
trên một hoặc một số cơ chất nhất định.
Từ thập kỉ truớc enzyme đã đuợc sử dụng trong công nghiệp chế biến nhung mới chỉ có
tính chất kinh nghiệm thuần tuý. Công nghệ enzyme ra đời là một buớc buớc phát triển ứng
dụng của enzyme. Ngày nay việc nghiên cứu enzyme đã buớc vào một giai đoạn mới, một giai
đoạn của sự tích hợp của nhiều ngành khác nhau nhu hố học protein, sinh học phân tử....Do đó,
có đuợc những hiểu biết đầy đủ hơn về tính chất hóc học, cấu trúc, động học....Tạo điều kiện để
sản xuất enzyme ở qui mô lớn, giảm giá thành sản sản phẩm, hiệu quả ứng dụng ngày càng cao.
Sử dụng enzyme trong sản xuất sẽ nâng cao chất lượng, hạ giá thành sản phẩm, cải thiện
lao động, giảm ô nhiễm môi trường. Cùng với sự phát triển của khoa học cũng như enzyme học,
việc ứng dụng enzyme ngày càng mở rộng, phát triển ở tầm cao hơn, không chỉ trong lĩnh vực
truyền thống mà còn cả trong những vực mới tạo ra sản phẩm mới.
1.1.

Tình hình nghiên cứu

Trước thế kỉ XVII việc sử dụng enzyme có tính chất kinh nghiệm thuần t người xưa đã
biết dùng vi sinh vật như là nguồn enzyme trong các quá trình lên men như sản xuất bánh mì,
sản xuất giấm, rượu vang....
Thế kỉ XVII đến nửa đầu thế kỉ XVIII đã đề ra được khái niệm lên men Vanhemom người
Hà Lan lần đầu tiên quan sát được hiện tượng tạo thành chất khí khác khơng khí trong quá trình
lên men.
Năm 1659, Silvius lần đầu tiên nêu lên rằng, về cơ bản, tất cả các quá trình sống đều là
những q trình hóc học.


Nửa cuối thế kỉ XVIII đã có thí nghiệm đầu tiên về enzyme chẳng hạn nhu cơng trình
nghiên cứu khả năng tiêu hố thịt trong dạ dày. Cơng trình này do Reaumur (nguời Pháp) bắt
đầu và sau đó đuợc Sapallanzani (nguời Ý) mở rộng. Các tác giả đã cho thịt vào ống kim loại và
đua vào trong nhiều động vật khác nhau và thấy rằng thịt bị tiêu hoá. Năm 1836, Schwann đã
gọi chất tiêu hoá thịt này là pepsin (pepxin).
Từ năm 1800 nguời ta còn thấy rằng trong ruột cịn có một enzyme phân giải protein khác.
Sau đó Kuhne đặt tên enzyme đó là trypsin.
Nửa đầu thế kỉ XIX nguời ta đá tách đuợc một số chế phẩm từ nhiều nguồn nguyên liệu
khác nhau có tách dụng thuỷ phân các chất tuơng ứng và bắt đầu tách đuợc các chất tạo nên quá
trình lên men.
Nửa cuối thế kỷ XIX đã tinh sạch đuợc một số enzyme và nghiên cứu một số tính chất cơ
bản của enzyme.
Nửa đầu thế kỉ XX đã phát hiện đuợc CoE (Harden và Young, 1906) xác định ảnh huởng
của pH đến hoạt độ của enzyme (Sorensen, 1909) nghiên cứu động học phản ứng enzyme
(Bayliss, 1919) kết tinh đuợc enzyme và xác định đuợc bản chất hố học của enzyme là
protein....Đã áp dụng thành cơng các phuơng pháp hiện đại để nghiên cứu enzyme hoàn thiện
phuơng pháp xác định cấu trúc bậc 1 phân tử enzyme.
1.2.

Cấu tạo hoá học

Các enzyme là những protein đuợc cấu tạo từ 20L - amino acid (Các amino acid kết hợp
với nhau qua liên kết peptid (-CO-NH-) đuợc tạo thành do phản ứng kết hợp giữa nhóm a carboxyl của amino acid đứng truớc, với nhóm amoha-amin của amino acid tiếp theo, loại đi
một phân tử nuớc. Theo cách kết hợp này các liên kết peptid nằm trên một mạch thẳng khơng
phân nhánh, có hai đầu tận cùng gọi là “đầu N” (có nhóm a - amin tự do và amino acid thứ
nhất), kí hiệu bằng dấu “+”và “đầu C” (có nhóm a - carboxyl tự do của amino acid cuối cùng, kí
hiệu bằng dấu Đánh dấu thứ tự các gốc amino acid trong phân tử bắt đầu từ “đầu N” Trong một
số truờng hợp đầu N và đầu c có thể kết hợp với nhau, phân tử có cấu trúc vịng.
Giống như các protein khác, các enzyme có thể là protein đơn giản, gọi là enzyme một
thành phần hoặc protein phức tạp, gọi là protein hai thành phần hay holoenzyme. Phân tử
holoenzyme bao gồm 2 thành phần: phần protein gọi là apoenzyme, phần khơng phải prorein gọi
là Coenzyme. Coenzyme có vai trò quan trọng để thực hiện chức năng xúc tác, loại bỏ


coenzyme sẽ làm mất khả năng xúc tác. Trong một số trường hợp, chỉ riêng coenzyme cũng là
chất xúc tác nhưng không hiệu quả bằng khi kết hợp với apoenzyme. Cùng một coenzyme khi
kết hợp với apoenzyme khác nhau tạo thành các holoenzyme khác nhau, xúc tác cho các phản
ứng chuyển hoá khác nhau nhưng giống nhau về kiểu phản ứng. Coenzyme cịn có vai trị làm
ben enzyme.
Apoenzyme có vai trị quan trọng với tính đặc hiệu của enzyme và tăng hiệu quả xúc tác
của Coenzyme.Coenzyme thường là các chất dẫn xuất của các vitamin hồ tan trong nước. Vì
vậy khi thiếu một vitamin nào đó sẽ ảnh hưởng đến hoạt độ của enzyme tương ứng trong tế bào,
vi phạm quá trình trao đổi chất trong cơ thể, gây nên các bệnh đặt trưng.
1.2.1.

Phân loại

Dựa vào tính đặc hiệu phản ứng của enzyme, năm 1961 tiểu ban enzyme học quốc tế đã
trình bày một báo cáo, trong đó có đề nghị những nguyên tắc định tên và phân loại enzyme.

Người ta chia enzyme ra làm 6 lóp.
1. Oxydoreductase'. các enzyme xúc tác cho các phản ứng oxi hoá-khử.
2. Transferase', các enzyme xúc tác cho các phản ứng chuyển vị.
3. Hydrolase', các enzyme xúc tác cho các phản ứng thủy phân.
4. Lyase', các enzyme xúc tác cho các phản ưng phân cắt không càn nước.
5. Isomerase'. các enzyme xúc tác cho các phản ứng đồng phân hoá.
6. Ligase (synthetase)', các enzyme xúc tác cho các phản ứng tổng hợp có sử dụng liên
kết giàu năng lượng của ATP...
Mỗi lớp chia thành nhiều tổ (dưới lớp), mỗi tổ chia thành nhiều nhóm (siêu lớp).
Tên enzyme thường được gọi'. Tên cơ chất đặc hiệu - loại phản ứng xúc tác cộng thêm
tiếp vĩ ngữ ase.


Đơ án chun mơn
1.3.

GVHD:

Tính chất

Enzym có bản chất là protein nên có tất cả thuộc tính lý hóa của protein. Đa số enzym có
dạng hình cầu và khơng đi qua màng bán thấm do có kích thuớc lớn.
Tan trong nuớc và các dung môi hữu cơ phân cực khác, không tan trong ete và các dung
môi không phân cực.
Không bền duới tác dụng của nhiệt độ, nhiệt độ cao thì enzym bị biến tính. Mơi truờng
axít hay bazơ cũng làm enzym mất khả năng hoạt động.
Enzym có tính luỡng tính: tùy pH của môi truờng mà tồn tại ở các dạng: cation, anion hay
trung hịa điện.
Enzym chia làm hai nhóm: enzym một cấu tử (chỉ chứa protein) nhu pepsin, amylase... và
các enzym hai cấu tử (trong phân tử cịn có nhóm khơng phải protein)

1.4.

Cơ chế tác dụng ([5])

Trong phản ứng có sự xúc tác của enzyme, nhờ sự tạo thành phức hợp trung gian enzyme
cơ chất mà cơ chất đuợc hoạt hóa, biến đổi tạo thành sản phẩm.
Nhiều dẫn liệu thực nghiệm đã cho thấy quá trình tạo thành phức hợp enzyme cơ chất và
sự biến đổi phức hợp này thành sản phẩm, giải phóng enzyme tự do thuờng trải qua ba giai đoạn
theo sơ đồ sau.
E + S->ES->P + E

ị+Ề
substrate

the Reaction

Enzỹme

Hình 1.1. Cơ chế tác dụngcủa enzyme

SVTH:

Trang 8


Đồ ản chun mơn
Trong đó: E là Enzyme,

GVHD:

s

là cơ chất (Substrate), ES là phức hơp enzyme - cơ chất, p là sản

phẩm (Product)
Giai đoạn thứ nhất: enzyme kết hợp với cơ chát bằng liên kết yếu tạo thành phức hợp
enzyme - cơ chất (ES) không bền, phàn ứng này xảy ra rất nhanh và địi hỏi năng lượng hoạt hóa
thấp.
Giai đoạn thứ hai: xảy ra sự biến đổi cơ chất dẫn tới sự kéo căng và phá vỡ các liên kết
đồng hóa trị trong phân tử cơ chất.
Giai đoạn thứ ba: tạo thầnh sản phẩm, cịn enzyme được giải phóng trở lại trạng thái tự do
ban đầu để quay vòng xúc tác.

Hình 1.2. Một vỉ dụ minh họa sự tạo thành phức hợp enzyme-cơ chất
1.5. Các yếu tố ảnh hưởng tấc độ đến phản ứng ([5])
Phản ứng do enzyme xúc tác phụ thuộc vào nhỉều yếu tố như: nồng độ enzyme, đặc tính
và nồng độ của cơ chất, nhiệt độ, pH môi trường phản ứng, các ion kim loại, các chất vơ cơ và
hữu cơ khác (có tác dụng kiềm hãm hay hoạt hoá enzyme). Các yếu tố hoá lý không chỉ ảnh
hưởng đến phản ứng enzyme theo kiểu như đối vớỉ các phản ứng hố học bình thường mà cịn
ảnh hưởng đến cấu trúc khơng gian, độ bền của cấu trúc khơng gian, độ tích điện của phân tử
enzym, làm thay đổi hoạt độ xúc tác của nó.
1.5.1.

Ảnh hưởng của nồng độ ([E])

Nói chung, trong điều kiện thừa cở chất, tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào E]:v =
k[E]

SVTH:

Trang 9


[E]2[E]
3

V

Đơ án chun mơn
20

40

60

GVHD:

80

Hình 1.3. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến vận toc của phản
ứng

V : vận tốc phản ứng, [E] : nồng độ enzyme
[E]i

Nồng độ E quá lớn, chỉ sau khoảng thời gian ngắn, vận tốc của phản ứng đã thay đổi theo
thời gian. Theo sơ đồ này nên chọn nồng độ [E] 3 sẽ có đuợc sự phụ thuộc tuyến tính giữa V vào
thời gian trong khoảng thời gian dài hơn, dễ dàng xác định v 0. Do đó nên tiến hành lựa chọn
nồng độ enzyme truớc khi xác định hoạt độ enzyme hoặc nghiên cứu động học phản ứng
enzyme

1.5.2.

Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất

Tốc độ của các phản ứng đơn giản trong ở phuơng trình hóa học biểu diễn theo phuơng
trình động học Michaelis - Menten.

:

K„
+ [51

Ở trạng thái đầu, tốc độ phản ứng phụ thuộc vào nồng độ cơ chất. Nếu tại điểm đó, tất cả
các phân tử enzyme đã thực hiện chức năng xúc tác của mình thì nó đuợc gọi là tốc độ phản ứng
tối đa với một luợng enzyme xác định, nếu tăng dần luợng cơ chất trong dung dịch thì thoạt đầu
hoạt tính của enzyme tăng dần nhung đến một lúc nào đó thì sự gia tăng về nồng độ cơ chất
cũng khơng làm tăng hoạt tính của Enzyme. Đó là vì tất cả các trung tâm hoạt động của enzyme
đã đuợc bão hoà bởi cơ chất.

SVTH:

Trang 10


Đồ ản chuyên môn
1.5.3,

GVHD:

Ảnh hưởng của các chất kiềm hãm

Các chất kiềm hãm (I), cũng gọi là chất ức chế, là những chát làm giảm tốc độ phản ứng
do enzyme xúc tác.
Cách 1: Kìm hãm cạnh tranh
Trong trường hợp kìm hãm cạnh tranh lầ cơ chất vầ chất kìm hãm đều tác dụng lên trung
tâm hoạt động của enzyme, chất kìm hãm chốn chỗ của cơ chất ở enzyme.
Khỉ cơ chất dư thừa, nồng độ chất kìm hãm thấp thì có thể loại bỏ tác dụng của chất kìm
E + s ^

ES - - - -* E + p

Hình 1.4. Kiểu kìm hãm cạnh tranh
hãm, cịn nồng độ cơ chất thấp và nồng độ chất kìm hãm cao thì lại có tác dụng kìm hãm hồn
tồn.
1/v = (aKm/Vmax) l/s +1/Vmax a = 1+P]/Kr
Hĩnh ỉ. 5. Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ cơ chất cỏ kiềm
1/V

hãm cạnh tranh

SVTH:

Trang 11


Đơ án chun mơn

GVHD:

Người ta thấy kìm hãm như vậy phần lớn xảy ra giữa chất kìm hãm và cơ chất có sự tương

đồng về mặt hố học chẳng hạn như malic acid có cấu trúc gần giống với succinic acid nên kìm
hãm cạnh tranh enzyme succinatedehydrogenase, là enzyme xúc tác cho sự biến đổi succinic
acid thành acid fumaric acid.
Đường thẳng có chất kìm hãm thì có độ xiên lớn hơn và cắt trục tung ở một điểm là
1/Vmax
Cách 2: Kìm hãm phi cạnh tranh
Đặc trưng của kiểu kìm hãm này là chất kìm hãm chỉ liên kết với phức hợp ES, mà không
liên kết với enzyme tự do.

E + s SP

ES -------w E t 1 >
-»-

X
il

ESI

oo
Hình 1.6. Kiểu kìm hãm phi cạnh tranh
Cách 3: Kìm hãm hỗn tạp
ES

E -*- s I

E+p

A

*1
r

EI + s

Hình 1.7. Kiểu kìm hãm hỗn tạp

SVTH:

Trang 12


Đơ án chun mơn

GVHD:

Trong đó, chất kìm hãm khơng những liên kết với enzmye tự do mà còn liên kết với cả
phức hợp ES tạo thành phức hợp EIS không tạo được sản phẩm p.
1.5.4.

Ảnh hưởng của chất hoạt hóa

Là chất làm tăng khả năng xúc tác nhằm chuyển hóa cơ chất thành sản phẩm. Thông
thường là những cation kim loại hay những hợp chát hữu cơ như các vitamin tan trong nước như
Mg2+ hoạt hóa các enzyme mà cơ chất đã được phosphoryl hóa như pyrophosphatase (cơ chất là
pyrophosphate), adenosinetriphosphatase (cơ chất là ATP). Các cation kim loại có thể có tính
đặc hiệu, tính đối kháng và tác dụng cịn tuỳ thuộc vào nồng độ.
1.5.5.

Ảnh hưởng cuả nhiệt độ

Có thể tăng vận tốc của một phản ứng hóa học bằng cách tăng nhiệt độ môi trương, hiện
tượng này tuân theo quy luật Vant’- Hoff. Điều này có nghĩa khi tăng nhiệt độ lên 10 oc thì tốc độ
phản ứng tăng lên khoảng 2 lần.
Đối với phản ứng do enzyme xúc tác cũng có thể áp dụng được quy luật này nhưng chỉ
trong một phạm vi nhất định, vì bản chất enzyme là protein. Khi ta tăng nhiệt độ lên trên 40-50oc
xảy ra quá trình phá huỷ chất xúc tác. Sau nhiệt độ tối ưu tốc độ phản ứng do enzyme xúc tác sẽ
giảm. Nhờ tồn tại nhiệt độ tối ưu người ta phân biệt phản ứng hoá sinh với các phản ứng vơ cơ
thơng thường.
Mỗi enzyme có một nhiệt độ tối ưu khác nhau, phần lớn phụ thuộc nguồn cung cấp
enzyme, thông thường ở trong khoảng từ 40-60oc , cũng có enzyme có nhiệt độ tối ưu rất cao
như các enzyme của những chủng ưa nhiệt. Các chủng vi sinh vật ưa nhiệt, đặc biệt các vi khuẩn
chịu nhiệt có chứa enzyme chịu nhiệt cao.
1.5.6.

Ảnh hưởng của pH

Sự phân li khác nhau của một phân tử protein ở các giá trị pH khác nhau làm thay đổi tính
chất của trung tâm liên kết với cơ chất và tính chất hoạt động của phân tử enzyme. Điều này dẩn
đến giá trị xúc tác khác nhau phụ thuộc vào giá trị pH. Như đã biết mỗi enzyme có một pH tối
ưu, mỗi enzyme có đường biểu diễn ảnh hưởng pH lên vận tốc phản ứng do chúng xúc tác.
1.5.7.
Các yếu tổ khác

SVTH:

Trang 13


Đơ án chun mơn

GVHD:

Ánh sáng: có ảnh hưởng khác nhau đến từng loại enzyme, các bước sóng khác nhau có ảnh
hưởng khác nhau, thường ánh sáng trắng có tác động mạnh nhất, ánh sáng đỏ có tác động yếu
nhất
Ánh sáng vùng tử ngoại', có thể gây nên những bất lợi, enzyme ở trạng thái dung dịch bền
hon khi được kết tinh ở dạng tinh thể, nồng độ enzyme trong dung dịch càng thấp thì càng kém
bền, tác động của tia tử ngoại sẽ tăng lên khi nhiệt độ.
Sự chiếu điện'. Điện chiếu với cường độ càng cao thì tác động phá huỷ càng mạnh. Tác
động sẽ mạnh hơn đối với dịch enzyme có nồng độ thấp. Có thể do tạo thành những gốc tự do,
từ đó tấn cơng vào phản ứng enzyme.
Sóng siêu âm\ Tác động rất khác nhau đối với từng loai enzyme, có enzyme bị mất hoạt
tính, có enzyme lại không chịu ảnh hưởng.
1.6.

Nguồn thu nhận ([4])

Các loại enzyme hiên nay rất phong phú và đa dạng có thể thu từ nhiều nguồn khác nhau
như thực vật, động vật và vi sinh vật.
+ Động vật', có mặt trong tuyến tụy và nước bọt của động vật + Thực vật', có
nhiều trong cây dứa, đu đủ xanh, trong dịch ép thân cây sung + Vi sinh vật:
Bacillus, Penỉcỉllỉum, Pseudomonas, Rhizopus....
1.7.

ứng dụng

1.7.1.

Trong thực phẩm

Từ năm 1970, tách enzyme ra khỏi tế bàovà sử dụng trong sản xuất cơng nghiệp,hiện tại
có it nhất 60 enzyme đã được thương mại hoá, đa số là các enzyme ngoại bào như sản xuất sữa,
bánh mì, bia, cơng nghệ dệt, sản xuất bột giặt và các chất tẩy rửa..................................
1.7.2.

Trong nông nghiệp

Tăng hiệu suất sử dụng thức ăn, sản xuất thức ăn dễ tiêu hoá cho động vật, đặc biệt là
động vật còn non để tăng hiệu quả sử dụng thức ăn, sản xuất các loại chế phẩm để chuyển hóa
phế thải nơng nghiệp cải tạo đất.
1.7.3.
Trongy học
Dùng trong chuẩn đoán bệnh, điều trị bệnh

SVTH:

Trang 14


CHƯƠNG 2

2.1.

TỔNG QUAN VÈ PROTEASE

Tình hình nghiên cứu

Sử dụng enzyme trong sản xuất và đời sống là một vấn đề được các nhà khoa học và kỹ thuật chú ý từ lâu. Ngày nay,

việc sử dụng này đã trở thành phổ biến ở nhiều nước và đã mang lại lợi ích kinh tế khá lớn. Enzyme là chất xúc tác sinh
học khơng chỉ có ý nghĩa cho q trình sinh trưởng, sinh sản của thực vật mà nó cịn đóng vai trò rất quan trọng trong chế
biến thực phẩm, trong y học, trong kỹ thuật phân tích, trong cơng nghệ gen và bảo vệ môi trường. Trong những năm gần

đây giá trị của enzyme cơng nghiệp trên tồn thế giới đạt khoảng 1 tỷ USD trong đó chủ yếu là các enzyme thuỷ phân
(75%) và protease là một trong ba nhóm enzyme lớn nhất sử dụng trong cơng nghiệp (59%)
2.2.

Cấu tạo

Nhóm enzyme protease (peptitd - hidrolase) xúc tác q trình thuỷ phân liên kết peptitd (-CO-NH-) trong phân tử
protein, từ poly peptitd đến sản phẩm cuối cùng là acid amind. Ngồi ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên
kết este và vận chuyển acid amin.

Hình 2.1. Cẩu trúc không gian của protease
Protease được phân thành 2 loại: endopeptitlase và exopeptidase. ([7])
Dựa vào vị trí tác động trên mạch poly peptid, exopeptidase được phân thành 2 loại: Amino peptidase', xúc tác thuỷ
phân liên kết peptid ở đầu N tự do của chuỗi poly peptid để giải phóng ra một amino acid, một dipeptid hoặc một tripeptid.


Carboxy peptidase', xúc tác thuỷ phân liên kết peptid

ở đầu c của chuỗi poly peptid và giải phóng ra một amino

acid hoặc một đipepti.

Dựa vào động lực hcọ của cơ chế xúc tác, endo peptidase được chia thành 4 nhóm: Serin proteinase', là những
proteinase chứa nhóm -OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trị đặc biệt quan trọng đối với hoạt động

xúc tác của enzyme. Nhóm này bao gồm 2 nhóm nhỏ chymotripsin và subtilisin. Nhóm chymotripsin bao gồm các enzyme

động vật như chymotripsin, tripsin, elastase. Nhóm subtilisin bao gồm 2 loại enzyme vi khuẩn như subtilisin carlsberg,
subtilisin BPN. Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện đặc hiệu cơ chất tương đối
rộng.

Cyteim proteinase', các proteinase chứa nhóm -SH trong trung tâm hoạt động. Cystein protease bao gồm các

proteinase thực vật như papayin, bromelin, một vài proteinase động vật và proteinase ký sinh trùng. Các Cystein proteinase
thường hoạt động ở vùng PH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng.

Aspatic proteinase', hầu hết các asportic proteinase thuộc nhóm pepsin. Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hố
như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin.... Các asportic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và
thường hoạt động mạnh ở PH trung tính.
Metallo proteinase metallo proteinase: là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi
sinh vật bậc cao hơn. Các metallo proteinase thường hoạt động ở vùng PH trung tính và giảm hoạt động mạnh dưới tác
dụng của EDTA.
Ngoài ra, proteinase được phân loại đơn giản hơn thành 3 nhóm Proteinase acid: pH từ 2 - 4, Proteinase trung tính:
pH từ 7 - 8, Proteinase kiềm: pH từ 9 - 10
2.3.
Cff chế tác dụng

Protease là enzyme xúc tác thủy phân protein, về cơ bản cơ chế xúc tác sinh học của enzym người ta đề ra nhiều giả

thuyết để giải thích, nhưng đều thống nhất ở chỗ quá trình xúc tác bắt đầu bằng sự kết hợp giữa enzym và cơ chất thành
hợp chất trung gian.
E (enzym) + s (cơ chất)—>■ ES(hợp chất trung gian)


2.4.

Nguồn thu nhận

Hiện chúng ta sử dụng 3 nguồn sinh học cơ bản để thu nhận protease chẳng hạn như các mô và cơ động vật, mô và cơ
quan thực vật, tế bào vi sinh vật...
Động vật: Thông thường protease động vật có ở tuyến tiêu hóa (niêm mạc dạ dày niêm mạc ruột non, tuyến tụy)....
Pepsin từ niêm mạc dạ dày và dịch vị của động vật bậc cao, Chymosin “ rennin” có trong ngăn thứ tư dạ cỏ bê non dưới 5
tháng tuổi.
Thực vật'. Papain từ mủ thu đủ xanh, Brome lin từ thân cây dứa, Ficin tách từ dịch ép thân cây sung
Vi sinh vật', phân bố chủ yếu ở nấm mốc vi khuẩn và xạ khuẩn.. .gồm các loại thuộc Aspergiỉỉus, Bacỉllus,
Pénicillium, Clostridium.............................................


CHƯƠNG 3
3.1.

TỒNG QUAN VỀ ASPERGILL US OZYZAE
Đặc điểm cấu tạo([3])

Aspergillus gồm hơn 185 loài khoảng 20 loài cho đến đã được báo cáo là tác nhân gây
bệnh nhiễm trùng cơ dụng để sản xuất thực phẩm, hóa chất và các enzyme . Trong số này,
Aspergillus fumigatus là phổ biến nhất, tiếp theo là Aspergillus flavus, Aspergillus nỉger,
Aspergillus clavatus, Aspergillus gỉaucus, Aspergillus terreus, versicolor, Aspergillus oryzae...
Nấm mốc Aspergillus oryzae sinh ra các enzym amylase, invertase, maltoase, protease và
catalase có khả năng phân giải tinh bột, protein thành đường, acid amin.
Nấm mốc Aspergillus oryzae là tác nhân chủ yếu lên men trong sản xuất nước tương theo
phương pháp vi sinh vật. Trong công nghiệp người ta nhân giống nấm mốc này để sản xuất
tương.
Nấm Aspergillus orzae có cấu tạo đa bào thuộc loại vi hồn khuẩn, các khuẩn ty có nhiều
vách ngăn, khi khuẩn ty mới mọc có màu trắng xám và khi phát triển có màu xanh lợt có ít
vàng.

Nấm Aspergillus oryzae có hình dáng là đính bào tử, màu thay đổi từ xanh vơi sang màu
xanh thẩm, dưới kính hiển vi đính bào tử có dạng hình cầu có tia.
Một số enzyme quan trọng được tổng hợp bởi nấm Aspergillus oryzae.
Protease', ứng dụng trong công nghiệp da giày, y học, công nghiệp chế biến thức an gia
súc
Amylase', ứng dụng trong công nghiệp dệt, sản xuất các chế phẩm sinh học bổ sung vào
thức ăn gia súc, sản xuất glucose, dixtrin, malt.........................
Cellulose', ứng dụng trong công nghiệp dệt,công nghệ giấy, xử lý ô nhiễm môi
trường....


3.2.

Vai trị của giống ([3])

Trong cơng nghệ enzyme từ vi sinh vật, giống đống vai trò quyết định đến: Năng suất của
nhà máy, chất luợng sản phẩm sinh học (hay là hoạt tính của enzyme), vốn đầu tu cho sản xuất,
giá thành sản phẩm, có ý nghĩa to lớn trong phát triển công nghệ vi sinh vật.
3.3.

Yêu cầu của giống ([3])

Cơng nghệ sản xuất enzyme thuộc nhóm cơng nghệ lên men hiện đại và đuợc sản xuất
theo qui mô công nghiệp. Do đó, giống vi sinh vật ứng dụng trong cơng nghệ enzyme cần có
những u cầu và mục đích nhất định. Giống vi sinh vật phải cho ra sản phẩm mà ta mong
muốn. Sản phẩm phải có số luợng và chất luợng cao. Vì trong quá trình trao đổi chất, để chuyển
hóa một luợng sinh khối khổng lồ gấp hàng ngàn lần cơ thể mình trong khoảng thời gian ngắn
thì cơ thể vi sinh vật cần tổng hợp rất nhiều chất.
+ Giống phải cho năng suất sinh học cao
+ Giống phải có khả năng thích nghi nhanh và phát triển mạnh trong điều kiện sản xuất

công nghiệp.
+ Giống vi sinh vật phải có khả năng đồng hóa các nguyên liệu rẻ tiền và dễ kiếm tại
địa phuơng.
+ Giống sử dụng trong quá trình sản xuất hiện đại phải là những vi sinh vật thuần khiết,
có tốc độ sinh sản nhanh.
+ Tốc độ trao đổi chất mạnh để tạo nhanh các sản phẩm mong muốn, dễ dàng tách
chiết, tinh sạch
+ Dễ dàng bảo quản và ổn định
Đe tạo thuận lợi lớn nhất về chủng giống vi sinh vật cung cấp cho q trình lên men cơng
nhiệp, ta cần tiến hành phân lập giống vi sinh vật thuần khiết.
3.4.
Phương pháp thu nhận protease từ chủng nấm mốc Asp.oryzae [9]
3.4.1.

Nuôi cấy bề mặt


Phương pháp này rất thích hợp để ni cấy các loại nấm mốc do khả năng phát triển
nhanh, mạnh nên ít bị tạp nhiễm. Khi nuôi nấm mốc phát triển bao phủ bề mặt hạt chất dinh
dưỡng rắn, các khuẩn ty cũng phát triển đậm, sâu vào lịng mơi trường đã được tiệt trùng, làm
ẩm. Người ta thường dùng cám mì, cám gạo, ngơ mảnh... Có chất phụ gia là trấu. Cám, trấu có
bề mặt tiếp xúc lớn, mỏng, tạo được độ xốp nhiều, khơng có những chất gây ảnh hưởng xấu
đến sự phát triển của nấm mốc. Tỷ lệ các chất phụ gia phải đảm bảo sao cho hàm lượng tinh bột
trong khối nguyên liệu không được thấp hơn 20% có thể bổ sung thêm nguồn nitơ vơ cơ (NH 4)2
S04, (NH4)2 10, phospho, nitơ hữu cơ và các chất kích thích sinh trưởng như malt, nước chiết
ngơ, nước lọc bã rượu. Với phương pháp này nồng độ enzyme cao hơn nhiều lần so với dịch
ni cấy chìm sau khi đã tách tế bào vi sinh vật. Chế phẩm dễ dàng sấy khô mà không làm
giảm đáng kể hoạt tính enzyme, chế phẩm khơ dễ bảo quản, vận chuyển, nghiền nhỏ hoặc sử
dụng trực tiếp nếu không cần khâu tách và làm sạch enzyme, tốn ít năng lượng, thiết bị, dụng
cụ ni cấy đơn giản, có thể thực hiện quy mơ gia đình. Ni cấy trong điều kiện vơ trùng tuyệt

đối và trong q trình ni cấy nếu có nhiễm trùng phần nào, khu vực nào thì chỉ cần loại bỏ
canh trường phần đó. Tuy nhiên, phương pháp bề mặt có năng suất thấp, khó cơ khí hóa, cần
diện tích ni lớn, chất lượng chế phẩm ở các mẻ khơng đồng đều.
3.4.2.

Ni cấy chìm

Vi sinh vật được ni cấy trong mơi trường lỏng, với có chất chủ yếu trong đa số
trường hợp là tinh bột. Chỉ có một số ít giống vi sinh vật dùng nguồn cơ chất cacbon là đường
glucoza, saccharoza. Phương pháp ni cấy bề sâu địi hỏi phải được vô trùng tuyệt đối ở các
khâu vệ sinh tổng hợp, thanh trùng môi trường dinh dưỡng, thao tác ni cấy, khơng khí cung
cấp cho q trình ni cấy. Các giai đoạn của q trình ni cấy chìm một bước gồm: chuẩn bị
môi trường nuôi cấy, nuôi cấy nấm men giống, nuôi cấy nấm mốc sản xuất. Phương pháp ni
cấy hiện đại, dễ cơ khí hóa, tự động hóa năng suất cao, dễ tổ chức sản xuất. Có thể nuôi cấy dễ
dàng các chủng vi sinh vật đột biến có khả năng sinh tổng hợp enzyme cao và lựa chọn tối ưu
thành phần môi trường, các điều kiện nuôi cấy, enzyme thu đuợc tinh khiết hơn, đảm bảo điều
kiện vệ sinh vô trùng.Tuy nhiên do thu đuợc canh truờng và nồng độ enzyme thấp nên khi tách
thu hồi enzyme sẽ có giá thành cao. Tốn điện năng cho khuấy trộn, nếu không bảo đảm vô
trùng sẽ bị nhiễm hàng loạt, toàn bộ gây tổn thuơng lớn.


3.5.

Ngun liệu sản xuất
Cần phải chọn mơi truờng vì thành phần mơi truờng dinh duỡng có ảnh huởng trực tiếp

đến sự sinh truởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật. Trong thành phần mơi truờng phải có
đủ các chất đảm bảo đuợc sự sinh truởng bình thuờng của vi sinh vật và tổng hợp enzyme. Đặc
biệt luu ý là để tăng sự tổng hợp enzyme nguời ta thuờng dựa vào hiện tuợng cảm ứng. Vì nếu
nhu trong thành phần mơi truờng có các chất cảm ứng thì chất đó hay sản phẩm phân giải của

nó sẽ kìm hãm hoặc làm yếu tác dụng kìm hãm của chất kìm hãm nhằm đảm bảo khả năng tổng
hợp enzyme đã cho không bị cản trở. Chất cảm ứng tổng hợp enzyme cho thêm vào môi truờng
thuờng là cơ chất tuơng ứng của enzyme cần tổng hợp.
Thành phần chính của mơi truờng:

c, H, ON. Ngồi ra các chất vơ cơ: Mn, Ca, p, S,

Fe, K và các chất vi luợng khác nhu.
3.5.1.

Nguồn cacbon ([8])

Đối với Asp. oryzae\ frucfoza saccroza maltoza

glucoza manit

arabinoza glactoza.
Tinh bột là nguồn cacbon của nhiều chủng vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme protease.
Chảng hạn nhu: vi khuẩn Bac. Subtilis có khả năng sinh tổng hợp protease ở môi truờng tinh
bột lớn hơn 8%.
Nhiều xạ khuẩn ua nhiệt, trong đó Micromonos pora vulgaris 42, mọc tốt và sinh tổng
hợp protease cao ở mơi truờng có tinh bột. Tăng nồng độ tinh bột từ 0,25 - 1,5% sinh khối cũng
tăng đồng thời với hiệu suất tổng hợp enzyme.
3.5.2.

Nguồn nìíơ ([2]),([8])

Trong số các nguồn nitơ vơ cơ thì NH4 H2P04 là tốt hơn cả. Các nguyên liệu đã chuẩn bị
làm môi truờng tự nhiên bao gồm: cám và bột hạt cốc, nuớc chiết ngô, dịch ép quả, rau, khô
dầu, bã ruợu, rỉ đuờng, sản phẩm phân hủy, nấm, men bia, trấu, lõi ngô. Khi lựa chọn sử dụng

môi truờng cần chú ý đến các chất có tác dụng điều hịa sinh tổng hợp enzyme, đặc biệt các
chất cảm ứng.
3.6.

Phương pháp phân lập


Vi sinh vật phân bố rất rộng trong tự nhiên, đâu đâu cũng có vi sinh vật. Ở những nơi giàu
chất hữu cơ, trong khơng khí, trong cơ thể động vật, thực vật....Chính vì vậy mà vi sinh vật có
khả năng tồn tại và phát triển ở những điều khắc nghiệt nhất.
Thông thường chủng vi sinh vật để thu nhận enzyme thường có 3 cách phân lập:
+ Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên + Phân lập giống trong điều kiện sản xuất +
Phân lập giống trong mẫu giống đã hư hỏng Tùy thuộc vào khả năng và điều kiện thực tế mà
chọn cách phân lập phù hợp nhất. Mỗi cách có những ưu điểm riêng .
3.6.1.

Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên

Ở điều kiện tự nhiên và trong điều kiện sản xuất cơng nghiệp thì có sự khác biệt đáng kể
các giống vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme trong điều kiện tự nhiên, được gọi là
các chủng vi sinh vật hoang dại. Chúng đã quen với các điều kiện tự nhiên, khi chúng ta đưa
chúng vào điều kiện sản xuất công nghiệp với điều kiện mơi trường cố định địi hỏi các lồi vi
sinh vật cũng có thời gian thích nghi. Huấn luyện chúng thích nghi với điều kiện sản xuất cơng
nghiệp là điều kiện rất cần thiết.
3.6.2.

Phân lập giống trong điều kiện sản xuất

Các giống được phân lập trong điều kiện sản xuất thường đã thích nghi với điều kiện sản
xuất. Nhờ đó sau khi phân lập các giống này khơng qua giai đoạn huấn luyện.

Các giống này đã được chọn lọc hoặc đã qua q trình biến đổi gen và có những đặc điểm
sinh hoá hơn hẳn các giống vi sinh vật hoang dại.
Mật độ tế bào vi sinh vật thường rất cao, do đó khả năng thu nhận đã sinh tổng hợp cao
3.6.3.
Phân lập giống trong điều kiện hư hỏng
Các ống giống có thể bị nhiễm do q trình bảo quản. Do bị nhiễm nhiều tế bào vi sinh
vật đã bị thối hố nhung cũng có nhiều tế bào khơng bị thoái hoá.
3.7.

Phương pháp phân lập nấm mốc Asp. oryzae

Qui trình lấy mẫu: khoai tây cắt lát đem chơn xuống đất. Sau 8 ngày lấy những miếng
khoai tây lên cho vào bao nilon và mang về phịng thí nghiệm.
Tiến hành thí nghiệm: Mau khoai tây đã xay nhuyễn cho vao 90ml nước cất vô trùng và
trộn đều mẫu. Lấy pipet hút lOml từ dung di ch ban đầu sang ống nghiêm khác chứa 90ml nước
cất vô trùng. Tiếp tục pha loãng tới nồng độ 10'3, 10'4.


Hút 0,1 ml mẫu ở các nồng độ pha loãng cho vào môi trường PDA
Dùng que trang trang đều mãu trên bề mặt thạch
Mốc sẽ sử dụng nguồn tinh bột làm cơ chất, nên sẽ xuất hiện những quầng sáng quanh
khuẩn lạc
Nhận biết bằng cách bổ sung Iodine vào trong môi trường trước khi cấy.
Cấy chuyền những mớc đặc trưng vào trong môi trường Pda trong ống thạch nghiêng
với 1% tinh bột cho phép mốc phát triển trong vòng 72h.
Nhân giống vi sinh vật trong bình tam giác: cholOml nước cất vo trùng vào ống thạch
nghiêng có chứa bào tử. Lắc đều cho bào tử trộn lẫn với môi trường
Hút 0,lml dung dịch cho vào bình tam giác chứa mơi trường sinh trưởng của nấm
KH2PO4

l,4g

MgSo4

0,lg

NH4NO3

10g

FeSo4

0,01g

KCL

0,5

Hồ tinh bột 20g

pH=6,5

Sau khi nhân giống thành cơng có thể sử dụng ngay hoặc mang đi bảo quản, dự trữ. Đe
có hiệu quả cao cần lựa chon các phương pháp bảo quản thích hợp.
3.8.

Phương pháp bảo quản

Khi sử dụng vi sinh vật để sản xuất enzyme cần chọn giống thuần chủng đã được kiểm tra
đầy đủ về các đặc tính hố sinh, vi sinh và cần đặc biệt lưu ý đến điều kiện bảo quản giống.

Thực tế khi bảo quản giống gốc trong một thời gian có thể tạo ra các biến dị ngẫu nhiên khơng
mong muốn do đó định kỳ phải cấy chuyền và kiểm tra lại các đặc tính ban đầu.
3.8.1 .Phươngpháp cấy chuyền
Đây là phuơng pháp phổ biến nhất dễ thực hiện bằng cách giữ giống trên môi truờng
thạch (thạch nghiêng, hợp petri...) với thành phần môi truờng nuôi cấy và điều kiện ni cấy
thích hợp cho giống vi sinh vật đó. Sau khi giống đã mọc tốt cần bảo quản ở nhiệt độ lạnh 3 - 4
và sau mỗi tuần phải cấy chuyền lại. Khi cấy chuyền chỉ lấy bào tử hoặc khuẩn lạc mà không
chuyền các sản phẩm trao đổi chất vào mơi truờng mới (có thể gây biến đổi bất lợi không thể
luờng hết đuợc).


Nếu là xạ khuẩn thì khơng nên bảo quản giống trên môi truờng thạch mà nên giữ trong
đất để khử trùng. Đe kéo thời gian bảo quản giống từ hàng tháng đến một năm, nguời ta phủ
một lớp paraphin lỏng để tiệt trùng trên bề mặt giống để hạn chế sự phát triển của nó. cần luu ý
chỉ phủ một lớp đầu sau khi cấy vi sinh vật đạt đến độ chín sinh lý. Phuơng pháp cấy chuyền rất
có hiệu quả để bảơ quản các giống nấm men, vi khuẩn và rất hữu hiệu dễ dàng triển khai giống
ra sản xuất lớn, hạn chế các tai biến có thể dẫn đến hu hỏng giống gốc.
3.8.2.

Phương pháp làm khô

Bằng cách giữ giống trên cát đất, silicagen trong điều kiện khô ráo (tất cả đều đuợc khử
trùng cẩn thận). Trong điều kiện nhu vậy sẽ hạn chế sự phát triển tiếp tục của giống khi bảo
quản. Phuơng pháp này rất hay đuợc sử dụng để bảo quản nấm mốc, xạ khuẩn, một vài loại
nấm men, vi khuẩn thời gian giữ giống có thể đuợc một năm. Phuơng pháp làm khô cũng thực
hiện đơn giản không cần dụng cụ đắt tiền. Tuy nhiên, giống nhu phuơng pháp cấy chuyền thời
gian bảo quản tuơng đối ngắn.
3.8.3.

Phương pháp đơng khơ

Đơng khơ là q trình mà nuớc đuợc lấy ra khỏi mẫu khi các mẫu đang ở trạng thái lạnh
sâu. Ở đây vi sinh vật đuợc huyền phù trong mơi truờng thích hợp và đuợc làm lạnh trong môi
truờng chân không. Thiết bị động khô sẽ hút nuớc và cuối cùng mẫu đuợc làm khô đến mức
nhất định. Mau đuợc hàn kín để cho mơi truờng chứa mẫu là chân không.
Đây là phương pháp phổ biến có hiệu quả cao cho bảo quản các nấm men, vi khuẩn và một số
virut. Tuy nhiên, phương pháp này ít được ứng dụng, đối với tảo, động vật nguyên sinh và tế
bào động vật.
3.8.4.

Phương pháp bảo quản lạnh sâu

Đối với phương pháp bảo quản lạnh sâu thì vi sinh vật được bảo quản trong môi trường
dịch thế và nước cần cho hoạt động sống của vi sinh vật bị bất hoạt ở nhiệt độ lạnh sâu (-196 0C
đến -80oc). Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu.
Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích lũy các chất điện giải trong mẫu bảo quản
và hình thành các tinh thể nước trong tế bào. Đe khắc phục nhược điểm này người ta đã bổ
sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh như glycerol, DMSO (dimethyl
sulfo xide). Việc bảo quản theo phương pháp lạnh sâu này được thực hiện ở các thang nhiệt độ


khác nhau như: -20oc, - 30oc, -40oc, -70oc, -40oc và - 1960C. Nói chung mức nhiệt cao hơn - 30°c
cho hiệu quả thấp do tế bào chịu nồng độ muối cao sinh ra từ các chất điện giải. Phương pháp
bảo quản này có hiệu quả với nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi
khuẩn, xạ khuẩn và virut.