Nghiên cứu thành phần hóa học và đánh giá tác dụng xua đuổi muỗi aedes aegypti của phong lữ thảo (pelargonium hortorum bailey)

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Việt Nam là quốc gia nằm ở vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, có nhiều điều
kiện thuận lợi cho các sinh vật phát triển, tạo ra hệ thực vật rất phong phú và đa
dạng.Trong số đó có rất nhiều các loài dược liệu đã và đang được sử dụng làm
thuốc.
Xã hội ngày càng phát triển hiện đại, việc sử dụng các dược liệu để làm
thuốc đang là xu hướng toàn cầu. Vấn đề kết hợp y học cổ truyền với y học hiện
đại và hiện đại hóa y học cổ truyền là xu hướng chung của thời đại.
Vì vậy việc nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây
thuốc một cách đầy đủ và toàn diện là điều cần thiết giúp lý giải cơ chế, tác dụng
chữa bệnh của thảo dược để sử dụng chúng hiệu quả hơn, góp phần nâng cao
tính an tồn và hiện đại hóa nền y học cổ truyền. Tuy vậy, trong thực tế, nhiều
cây thuốc có tác dụng chữa bệnh vẫn chưa được nghiên cứu một cách đầy đủ.
Phong lữ thảo có tên khoa học là Pelargonium hortorum Bailey thuộc họ
Mỏ hạc (Geraniaceae) là cây được di thực vào Việt Nam chủ yếu được sử dụng
làm cây cảnh.Tuy nhiên, ở nước ta Phong lữ thảo chưa được nghiên cứu sâu về
tác dụng dược lý và thành phần hóa học cũng như chưa có ghi nhận nào chú ý
một số tính chất rất độc đáo của Phong lữ thảo khơng những là cây hoa đẹp lại
có thể làm sạch mơi trường, đất có kim loại nặng và có tác dụng xua đuổi muỗi.
Kiểm soát muỗi là một vấn đề quan trọng trong thời đại ngày nay với số
lượng ngày càng tăng của các bệnh truyền qua muỗi. Trong lịch sử thế giới,
nhiều người đã chết vì các bệnh lây truyền qua muỗi hơn tất cả các cuộc chiến
tranh. Theo một chương trình sức khỏe BBC World Service ‘Vật nguy hiểm nhất
thế giới là muỗi . Sốt rét hiện nay lây nhiễm khoảng 110 triệu người mỗi năm,
gây ra 2-3 triệu trường hợp tử vong. Bệnh sốt xuất huyết Dengua ở Việt Nam
ngày càng gia tăng trong những năm gần đây, vai trò truyền bệnh chủ yếu là


2

muỗiAedes aegypti.Trong khi đó, nỗ lực để kiểm sốt và phòng chống muỗi đã
chứng minh là hiệu quả cao trong phòng chống các bệnh truyền qua muỗi.[30]
Việc sử dụng các dược chất được chiết xuất từ thực vật đã thực sự có tác
dụng trong phịng chống muỗi, hơn nữa chúng lại không độc cho người, động vật
và môi trường. Để góp phần phịng chống muỗi và các bệnh do muỗi truyền,
chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và đánh giá tác
dụng xua đuổi muỗi Aedes aegypti của Phong lữ thảo (Pelargonium
hortorum Bailey)” với các mục tiêu sau:
1)

Thẩm định tên khoa học của Phong lữ thảo, nghiên cứu thành phần hóa

2)

học của cây Phong lữ thảo.
Đánh giá tác dụng xua muỗi Aedes aegypti truyền bệnh sốt xuất huyết
của chất chiết xuất từ thân,lá cây Phong lữ thảo.


3

CHƯƠNG I . TỔNG QUAN
1.1.ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ PHÂN BỐ.
1.1.3. Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật của chi PelargoniumL.
1.1.1. Vị trí phân loại củachiPelargoniumL.
Theo hệ thống phân loại của Taktajan ( 1987) xây dựng trên cơ sở tổng
hợp nhiều hệ thống của Ehrendorfer(1981) và của Cronquist (1981) xác định vị
trí phân loại của chi PelargoniumL. là:[4],[7]
Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)

Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)
Phân lớp Hoa hồng ( Rosidae)
Bộ Mỏ hạc ( Geraniales)
Họ Mỏ hạc ( Geraniaceae)
Chi PelargoniumL.[4],[7]
1.1.2. Đặc điểm chung của họ Mỏ hạc (Geraniaceae)
Họ Mỏ hạc (Phong lữ).Cây cỏ. Gần với Oxalidaceae nhưng khác bởi ở đây
thường có lá kèm, thường có lơng tuyến ở thân và lá, hoa có khi khơng đều (lá
đài sau kéo dài thành cựu) có tuyến mật xen kẽ với cánh hoa, vịng nhị ngồi
(nhị đối cánh) thường thành nhị lép, vịi nhị dính liền, quả nang cắt vách, phơi
thường cong và thường khơng có nội nhũ.
8/800, cây sống nhiều ở ơn đới, ít gặp ở nhiệt đới. Ở Việt Nam có 2 chi:
Geranium, pelargonium; 2 loài.[7]
1.1.3. Đặc điểm thực vật và phân bố của chi PelargoniumL.
1.1.3.1. Đặc điểm thực vật.


4

Các cây thuộc chi PelargoniumL. là một nhóm cây sống hằng năm hoặc
lâu năm, loại cây thảo hoặc cây bụi phân nhiều nhánh. Tất cả các lồi đều có lá
kèm, Lá chia thùy và gần như tất cả các hình dạng thùy đều có thể được tìm thấy,
mép lá có răng cưa hoặc răng thơ, một số lồi có lơng mượt, thỉnh thoảng lá có
nếp và đơi khi có bớt đen trên lá,thường cuống lá dài,.Hoa có năm cánh sắc thái
từ trắng, màu hồng, màu hồng nhạt sang màu tím hoặc màu vàng. Mọc thẳng
đứng, chùm hoa hình tán như cụm hoa.Các hoa khơng cùng xuất hiện một lúc.Có
hoa có một mặt phẳng đối xứng (zygomorphic), trong đó có hoa đối xứng xuyên
tâm (actinomorphic).Hậu đài hoa được hợp nhất với cuống nhỏ để tạo thành
một hypanthium (ống tuyến mật của hoa). Các ống tuyến mật của hoa thay đổi từ
chỉ một vài mm, lên đến vài cm, và là một đặc điểm hoa quan trọng trong việc

phân loại hình thái. Nhị hoa khác nhau 2-7 và cong được sử dụng để xác định
các lồi. Một vài lồi hoa có hương thơm phát ra.[34]
1.1.3.2. Phân bố.
PelargoniumL. có khoảng 280 lồi và là chi có số lượng lồi lớn thứ 2
trong họ Geraniaceae phân bố tồn thế giới. Tuy nhiên có tới 90% số loài phân
bố ở Nam Phi, chỉ với khoảng 30 lồi được tìm thấy ở những nơi khác, chủ yếu
làcác thung lũng Đơng Phi, khoảng 20 lồi miền nam nước Úc, bao
gồm Tasmania.[37] Một

vài

lồi

cịn

lại

được

tìm

thấy

ở

miền

namMadagascar, Yemen, Iraq, Tiểu Á, phía bắc của New Zealand và các đảo bị
cô lập ở phía nam Đại Tây Dương, Socotra ở Ấn Độ Dương. Sự tập chung các
loài thuộc chi PelargoniumL.ở tây nam Nam Phi vì là nơi lượng mưa có vào mùa

đơng, khơng giống như phần cịn lại của đất nước nơi có lượng mưa chủ yếu là
trong những tháng mùa hè. Hầu hết các loài thuộc chiPelargoniumL. trồng
ở châu Âu và Bắc Mỹ có nguồn gốc ở Nam Phi.[37]


5

Hình 1.1: Sự phân bố tồn cầu của các lồi PelargoniumL.
(van der Walt và Vorster, 1988)
1.1.4. Đặc điểm thực vậtvà phân bố của loài Pelargonium hortorum Bailey.
1.1.4.1. Đặc điểm thực vật.
Tên khoa học: Pelargonium hortorum Bailey.
Tên khác : Thiên trúc quỳ.
Cây thường trồng với tên trên là loài lai củaPelargonium zonale L’
Hérit.Ex Soland và Pelargonium inquinans Ait.
Loài thứ nhất thuộc dạng cây thảo, hay cây bụi thấp, nạc, có lơng. Lá có
cuống dài, trịn , dạng tim, nhẵn hay có lông với một bớt đen đen, đồng tâm ở
phần trên của phiến; Phiến lá chia nhiều thùy, mép khía răng lượn, gần như nhăn
nheo. Gốc ở các triền phía tây của Nam châu phi.
Loài thứ hai dạng cây bụi thấp, cao 15-30 cm, thân nâu có lơng nhung. Lá
có hay khơng có bớt đen. Hoa đối diệnvới lá, màu hồng nhạt, đỏ hay màu son,
cánh hoa hình trái xoan, ngắn hơn cành hoa của loài trên.


6

Cũng là cây của vùng Nam phi.
Từ hai loài được trồng này, người ta đã tạo ra lồi lai có dạng màu của lồi
thứ nhất, có hoa gần với loại thứ hai, ra hoa gần như liên tục trong mùa khơ. Bây
giờ thì sự lai giống đã đến khó phân biệt sự gần gũi với tổ tiên nào hơn. Do vậy,

hiện nay có nhiều nịi khác nhau do lai tạo.[13]
1.1.4.2. Phân bố.
Phong lữ thảo có nguồn gốc tại Nam Phi, cũng như Reunion, Madagascar,
Ai Cập và Maroc, sau đó mới được phát triển ra các nước Châu Âu như Ý, Tây
Ban Nha và Pháp vào thế kỷ 17. Hiện nay hoa Phong lữ thảo phân bố rộng rãi
trên khắp thế giới, đặc biệt là vùng ôn đới và khu vực miền núi của vùng nhiệt
đới địa Trung Hải rất thích hợp cho loại hoa này phát triển.
Hiện nay, ở Việt Nam người ta chủ yếu trồng Phong Lữ Thảo làm cây
cảnh. Cây được trồng nhiều ở Hà Nội, Đà Lạt - Lâm Đồng, Sapa – Lào Cai.[13]
Sinh thái : Cây trồng, ra hoa gần như quanh năm.[13]
Để hoa Phong lữ thảo đạt năng suất, chất lượng cao thì ánh sáng là một
trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới quá trình ra hoa của cây. Tuy
nhiên, nếu để cây chịu ánh sáng trực tiếp liên tục và nhiệt độ cao có thể làm ảnh
hưởng tới khả năng quang hợp của lá, làm cho lá bị héo, ngay cả khi làm ẩm ướt,
ngồi ra có thể gây đỏ cuống lá và thân cây.
1.2. THÀNH PHẦN HĨA HỌC
1.2.1. Thành phần hóa học một số loài của chi PelargoniumL.


Những nghiên cứu trong nước.


7

Cho đến nay, ở Việt nam chưa có tài liệu nào đi sâu vào nghiên cứu về
thành phần hóa học, tác dụng sinh học của cây Phong lữ thảo, cũng như của chi
PelargoniumL.


Những nghiên cứu trên thế giới.

Về thành phần hóa học của chiPelargoniumL.cho thấy các hợp chất được
phân lập chủ yếu thuộc các nhóm sau.
1.2.1.1. Tinh dầu.
Trên thế giới đã nghiên cứu thành phần tinh dầu một số loài thuộc chi
PelargoniumL.với các chất được thống kê trong bảng sau:
Bảng 1.1: Thành phần hóa học trong tinh dầu một số lồi thuộc chi
Pelargonium L.
STT

Tên chất

Các thành phần chính gồm:
1
2

Citronellol

3

Geraniol

4

10-epi-γ-eudesmol

5
6

Geranyl acetat

7

(l) -linalool

8

6-Octen-1-ol

9
10
11

3,7-dimethyl
isomenthon
Citronellyl format

Bộ
phận

Lồi

Tác dụng
dược lý

TL
TK

phần
trên

mặt
đất

Pelargonium

- Chống oxy
hóa
bằng
phương pháp
nhặt rác gốc tự
do.

[16]
[17]

graveolens

Kháng
khuẩn,
Bacillus
subtilis…
Kháng
nấmCandida
albicans,
Rhizoctonia
solani.
- Diệt côn
trùng
Rhysopertha
dominica.

[31]
[35]


8

Selinen
α-Terpineol

37thành phần đã được xác
định trong đó:
1

Citronellol (32,71%)

2

Geraniol (19,58%)

26 thành phần đã được xác
định trong đó:
1

α -pinen (25,28%)

2

α-fenchyl acetat (20,63%)

3

Limonen (9,94%)

4

β-caryophyllen (8,20%)

5

Camphen (4,31%)

6

δ-cadinen (3,32%)

7

β-pinen (3,21%)

8

α-amorphen(2,80%)

9

Valencen (2,73%)

10

Leden (2,25%)

11

p-xymen (1,63%).

phần
trên
mặt
đất

Pelargonium
capitatum L.

- Hoạt động [33]
kháng khuẩn
khơng
đáng
kể.
Kháng
nấm
các
chủng
Candida
albicans,
Dermatophyte
và
Phytopathoge
n

Phần
trên
mặt
đất

Pelargonium
quercetorum
Agnew.

-Kháng khuẩn [19]
và chống oxy
hóa.


9

34 thành phần đã được xác
định trong đó:

Lá,
thân

Pelargonium
citrosum

-Xua đuổi thể [29]
muỗi Aedes

Phần
trên

mặt
đất

Pelargonium
spp.

-Xua đuổi
[14]
Pyrioides
stephanitis và
Aedes aegypti.

Citronellol
1
2

Isomenthon
Geraniol
Citronellol

3
4
1

Geraniol

2

Citronellol

3

Geranyl formate

1.2.1.2. Flavonoid.
Bảng 1.2: Thành phần hóa học Flavonoidmột số lồi thuộcchiPelargoniumL.
STT

1

Tên chất

Kaempferol 3-Orhamnosyranosy-glucosid
Aglycone isorhamnetin

2

Quercetin 3-O-glucosid

3

Kaempferol 3,7-di-O-

Bộ
phận

Lồi

Tác dụng
dược lý

TL
TK

phần
Pelargonium - Chống oxy [31]
trên
graveolens hóa.
mặt đất


10

4

glucosid
Quercetin 3-O-pentose
Kaempferol 3-O-glucoside

5
6
7

Quercetin 3-Orhamnospyranosyl –glucosid
Quercetin 3-O-pentosylglucosid
Myrisetin flavonoids 3-Oglucosepyranosy-rhamnosid

8

9

1.2.1.3. Những nghiên cứu về thành phần hóa học khác trong các bộ phận
của cây.
Trên thế giới đã nghiên cứu một số loài thuộc chi PelargoniumL.với các
chất được thống kê trong bảng sau:
Bảng 1.3: Thành phần hóa học của một số lồi thuộc chi PelargoniumL. đã
được nghiên cứu.
STT

1

Tên chất

1,2,3,4,6-penta-Oalloyl-β-D-glucose

Bộ
phận

Loài

phần
Pelargoniumi
trên
nquinans Ait.
mặt đất

Tác dụng dược
lý

TL

TK

- Hoạt động [32]
chống oxy hóa
với khả năng
nhặt rác và bảo
vệ khỏi bị hư hại
oxy hóa gốc tự
do.


11

2

1,2,3,4,6-pentagalloylβ-D-glucopyranose

phần
Pelargoniumi
trên
nquinans Ait.
mặt đất

- Chống đơng [20]
máu.

1

Scopoletin

2

Umckalin, 5,6,7trimethoxycoumarin

phần
Pelargonium
trên
sidoides
và
mặt đất Pelargonium
reniforme

-Hoạt tính kháng [26]
khuẩn được đánh
giá với 8 loại vi
sinh vật trong đó
trong đó có 3
gram
dương
(Staphylococcus
aureus,
Streptococcus
pneumoniae, và
beta-hemolytic
Streptococcus
1451) và 5 loại
vi khuẩn Gram
âm (Escherichia
coli, Klebsiella
pneumoniae,

Proteus
mirabilis,
Pseudomonas
aeruginosa,
Haemophilusinfl
uenzae)

phần
Pelargonium
trên
reniforme
mặt đất

-Kích

3
4

6,8-dihydroxy-5,7dimethoxycoumarin
(+) – catechin
Acid gallic
Methyl gallat

5
6

1

Acid gallic

2

Methyl gallat

3

Myricetin

4

Quercitin-3-O-beta-dglucosid

5

1-O- (2- (4Metoxyphenyl) ethyl6-O-galloyl- .
glucopyranosid

thích việc [27]
tiêu diệt các tác
nhân gây bệnh
nội bào
loàiMycobacteri
um tuberculosis.


12

1.2.2. Thành phần hóa học của Pelargoniumhortorum Bailey.
Một số triterpenoids, sterol, flavonoids và các axit anacardic được phân
lập từ thực vậtnày.Thành phầnhóa học của tinh dầu có nguồn gốc từ P. hortorum

đã được cũng xác định.[38]
Thành phầnhóa học của tinh dầu:
Bảng 1.4: Thành phần hóa học của tinh dầu Pelargonium hortorum
Bailey.đã nghiên cứu.
STT

Tên chất

1

α-pinen

2

Camphen

3

β-pinen

4

β-myrcen

5

Yomogi alcohol

6

δ-4-Caren

7

o-xymen

8

D-limonen

9

β- phellandren

10

1,8-cineol

11

γ- terpinen

12

Artemisia keton

13

Artemesia alcohol

14

Myrcenol

15

trans-Pinocarveol

16

Camphor

17

β-Terpineol

18

(-) - Borneol

19

4-Terpineol

BPD

Lồi

Hoa,
phần

trên
mặt
đất

Pelargoniu
m
hortorum
Bailey

Tác dụng dược lý

TLT
K

- Diệt cơn trùng [38],
đối
với
lồi [21]
(Liposcelis
bostrychophila
Badonnel) và mọt
ngơ (Sitophilus
zeamais
Motschulsky)độc
tính xơng khói/
(thuốc trừ sâu)
diệt cơn trùng tồn
trữ lúa gạo. Độc
tính đáng kể đối
với Spodoptera

littoralis.
Diệt
lồi
Spodoptera
littoralis (Boisd)
.


13

20

α-Terpineol

21

2,6-Dimethyl-3(E),5
(E),7-octatrien-2-ol

22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32

33
34
35
36

Carvon
Bornyl acetat
Carvacrol
Triacetin
Eugenol
Copaen
β-caryophyllen
(Z) -β-farnesen
allo-Aromadendren
Germacren D
δ - Selinen
δ -Cadinen
Spathulenol
α-Cedrol
β-Eudesmol
Sản lượngdầu màu vàng của P. hortorum hoa, phần trênmặt đất là 0,11%

(V/W) và hàm lượng tinh dầu đậm đặc đã được xác định là 0,87 g / ml. Có tổng
cộng 36 thành phần của tinh dầu đã được xác định, chiếm 97,68% tổng số dầu.
Các hợp chất chính trong tinh dầu của P. hortorum hoa, bộ phận trên mặt đất là:
1,8-cineol (23,01%), α-tecpineol (13,22%), α-pinen (8,13%) và camphor
(8.12%) tiếp theo là 4-tecpineol (4,63%), β-myrcen (4,56%) và β-caryophyllen
(4,08%)[38] (Bảng 1.4).
Monoterpenoids đại diện 24 của 36 hợp chất,tương ứng với 83,54% của
toàn bộ dầu trong khi 10 của 36 thành phần là sesquiterpenoids (11.93% của dầu

thô).[38]


14

Acid amin: Nghiên cứu được tiến hành bởi Tiến sĩ Christopher Rangervà
các cộng sự đã tìm ra các acid amin gây kích thích được gọi là acid quisqualic.
[38]

Hình 1.2: acid quisqualic
1.3. CÔNG DỤNG, TÁC DỤNG DƯỢC LÝ.
1.3.1. Tác dụngdược lý được nghiên cứu.
Theo tài liệu thống kê 15 tinh dầu có khả năng xua muỗi trong đó có tinh
dầu phong lữ thảo. Theo Handbook of herbs and spices, tập 2, tinh dầu phong lữ
thảo gồm : Citronellol 28%-58%, geraniol 7%-19%, linalool 3%-10% ...đều là
những chất có thể xua muỗi. Theo tài liệu Trung Quốc tinh dầu chiết xuất từ
Phong lữ thảo có chứa thêm α- terpiol 13,2%, camphor 8,12% cũng là những
tinh dầu xua muỗi rất tốt. Năm 2011 Marta Ferreira Maia and Sarah J. Moore đã
đề cập đến tinh dầu geraniol xua muỗi.[28]
Trên một công bố của tác giả Curtis năm 1991 cho thấy hai tinh dầu
citronellol, geraniol có tác dụng xua muỗi trong 1 giờ.Theo Donald R. Barnard
and Rui-de xue 2004, tinh dầu phong lữ thảo có tác dung xua muỗi Aedes
albopictus, Culex nigripalpusvà Orchlerotatus triseratus trong vòng 3,2-4,8 giờ
[19]. Theo nghiên cứu của một nhóm tác giảGünter C và cộng sự năm 2009 sử
dụng nến có dầu citronella thể hiện tác dụng xua muỗi dạt 14%, geraniol 50%,
song nếu sử dụng tinh dầu thì Geraniol đẩy lùi muỗi đạt 97%, Citronenlla đạt
60%, Linallol đạt 93%.[24]


15

Nhiều nghiên cứu về tinh dầu geraniol xua muỗi đươc cơng bố trên các tạp chí
những năm gần đây như hành vi tìm kiếm và hút máu Aedes aegypti,Aedes
albopictus (Diptera:Culicidae) sau khi bôi tinh dầu geraniol, citral, citronellol,
năm 2008 của tác giả Hao H và cộng sự.[25]; tác dụng chống muỗi và côn trùng
đốt của các tinh dầu như geraniol, citronellol, linalool…năm 2008 tác giả Muller
và cộng sự.[15],[23]
Nghiên cứu được tiến hành bởi Tiến sĩ Christopher Rangervà các cộng sự
đã chứng minh các acid amin gây kích thích được gọi là acid quisqualic. Trong
các cánh hoa có tác dụng gây tê liệt của bọ cánh cứng Nhật Bản.Acid quisqualic
được cho là giống như L-glutamic acidlà một chất đồngvận của AMPA, kainate,
và nhóm I Metabotropic thụ thể glutamate, và một trong những chất chủ vận thụ
thể AMPA mạnh nhất được biết. Nó gây ra các tế bào thần kinh bị hư hoặc bị
kích thích quá mức bởi dodẫn truyền thần kinh như glutamate và được sử dụng
để chọn lọc tiêu diệt tế bào thần kinh trong não hoặc tủy sống.[18]
1.3.2.Công dụng truyền thống của Pelargonium hortorum Bailey.
Là loại thuốc bổ, chống suy nhược và có khả năng khử trùng. Mùi hương
của cây phong lữ giúp tăng cường sự tỉnh táo nhạy bén của trí não vì thế giảm
việc sử dụng nhiều cà phê.
Loại thảo mộc này cũng có thể là gia vị cho món gà hay cá giúp kích thích
tiêu hố và cải thiện hệ thống miễn dịch.
Toàn bộ cây từ thân, lá, hoa, rễ… đều được dùng làm thuốc. Nhờ các đặc
tính chữa bệnh của nó, phong lữ được sử dụng thành công như là một loại thảo
dược cho sức khỏe. “Cây sức khỏe” được dùng chữa bệnh huyết áp cao, mất ngủ,
an thần, làm dịu thần kinh, các bệnh viêm loét và chảy máu.
Hoa được dùng ở Trung quốc trị viêm tai giữa.[13]


16

CHƯƠNG 2.ĐỐI TƯỢNGVÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU.
Đối tượng nghiên cứu: Mẫu cây Phong lữ thảo trồng ở Hà Nội. Thu thập
mẫu nghiên cứu được thực hiện theo phương pháp điều tra cây thuốc của
Nguyễn Tập (2006).[6],[11]Việc điều tra thu thập mẫu cây được tiến hành trực
tiếp trên thực địa:
- Cây tươi mang lá, hoa để giám định tên khoa học và làm tiêu bản mẫu
khô.
- Lấy lá, thânđủ lượng để nghiên cứu, phơi sấy nhẹ50-55 oC đến khơ, bảo
quản trong túi polyme kín, để nơi khơ ráo,thống mát làm ngun liệu nghiên
cứu thành phần hóa học và tác dụngsinh học.


17

- Muỗi thử nghiệm:Đối tượng nghiên cứu là muỗi Ae. Aegyptithế hệ F1 từ
2- 3 ngày tuổi, được thu thập từ các điểm nghiên cứu.
2.2. PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU.
2.2.1. Dung mơi và hóa chất.
-Cồn 96oC, nước cất 2 lần, dung môi hữu cơ n-hexan, ethyl acetat,
methanol, chloroform, aceton.
- Các dung mơi hóa chất dùng trong phân tích đạt tiêu chuẩn Dược điển
Việt Nam VI.
- Bột silicagel pha thường (0,040 – 0,063 mm, Merch), bột silica gel pha
đảo YMC ( 30 – 50 µm, FuJi Silisa Chemical Ltd).
- Chất hấp phụ Sephadex TM LM-20.
- SKLM được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 G F 254
(Merch)

(silica gel, 0.25mm) và bản mỏng pha đảo RP-18

F 254 (Merch,

0.25mm).
- Phát hiện chất bằng đèn tia tử ngoại ở hai bước sóng 254nm và 366 nm
hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong ethanol hơ nóng để phát hiện
vết chất.
- Các hóa chất khác đạt tiêu chuẩn tinh khiết dược điển.
2.2.2. Thiết bị.
- Các dụng cụ cần thiết dùng trong quá trình thực nghiệm.
- Máy cất quay.
- Tủ sấy Memmert, Binder – FD 115.
- Bếp điện, bếp đun cách thủy.
- Cân kĩ thuật, cân phân tích, cân xác định độ ẩm.


18

- Đèn UV- Vilber lourmat, máy chụp ảnh UV.
- Máy sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao.
- Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao.
- Máy xác định điểm chảy.
- Máy xác định phổ tử ngoại UV-VIS.
- Máy đo góc quay cực
- Máy đo phổ khối lượng phun mù điện tử.
- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân.
- Máy đo quang.
2.2.3. Vật liệu phục vụ nghiên cứu thử tác dụng xua muỗi.


Dụng cụ bắt muỗi và bọ gậy, bắt muỗi.

- Ống nghiệm 2 × 20cm, thủng hai đầu là tốt nhất hoặc kín một đầu.
- Đèn pin ( loại 2 pin là thích hợp), màn, đèn bẫy, bơng mỡ.
- Máy hút muỗi cầm tay.
- Nhãn bằng giấy trắng, bút chì đen, túi có ngăn để đựng các dụng cụ trên.
- Vợt to và vợt nhỏ, khay men, lọ nút mài, cồn 700
- Ống hút thường, ống hút có quả bóp cao su.
- Bảng định loại muỗi Ae.aegypti của viện SR – KST – CT - TW


Các dụng cụ thử nghiệm

- Lồng ni muỗi kích thước 40 x 40 x 40cm.
- Bocan và thức ăn nuôi bọ gậy.
- Chuột nhắt trắng cho muỗi hút máu.
- Đường glucose 10 %.
- Giấy thấm làm giá cho muỗi đẻ.
- Phiếu ghi chỉ số cắm đậu.
- Ống hút muỗi.
- Đồng hồ, nhiệt kế, ẩm kế.
2.3. SƠ ĐỒ THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU


19

Gồm nghiên cứu mô tả cắt ngang và nghiên cứu thử nghiệm thể hiện qua
sơ đồ thiết kế nghiên cứu sau:

Thẩm định tên khoa học Phong lữ

thảoThu hái, chế biến, bảo quản dược
liệu Phong lữ thảo

Thu thập bọ gậyvà
muỗi Ae.aegypti

Trứng muỗi
Khảo sát sơ bộ các nhóm chất hữu cơ
thân, lá phong lữ thảo
Bọ gậy
Điều chế cao cồn 96%, cao phân đoạn
(n-hexan, ethyl acetat, nước) của cao
cồn 96%, cất tinh dầu tổng hợp của thân,
lá Phong lữ thảo

Thử tác dụng xua với
muỗi Ae.aegypti

Đánh giá tác dụng xua
muỗi

Muỗi trưởng thành
F1


20

Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc một
số hợp chất từ mẫu thử có tác dụng xua muỗi
Sơ đồ 2.3: thiết kế nghiên cứu

2.4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH NGHIÊN CỨU


Nghiên cứu xác định thành phần hóa học của Phong lữ thảo:

- Thẩm định tên khoa học Phong lữ thảo.
- Thu hái, chế biến, bảo quản Phong lữ thảo
- Khảo sát sơ bộ các nhóm chất hữu cơ thân, lá cây phong lữ thảo
- Điều chế cao cồn 96%, cao phân đoạn (n-hexan, ethyl acetat, nước) của
cao cồn 96%, cất tinh dầu tổng hợp của thân, lá cây Phong lữ thảo.
- Phân lập và xác định cấu trúc các thành phần hóa học trongthân, láPhong
lữ thảo.


-

Nghiên cứu đánh giá một số tác dụng sinh học: Thử và đánh giá tác
dụng xua muỗi với các mẫu thử được điều chế từ thân, lá phong lữ thảo.
Thu thập bọ gậy.
Nuôi bọ gậy.
Nuôi muỗi trưởng thành.
Cho đẻ trứng.
Nuôi bọ gậy F1.
Nuôi muỗi trưởng thành F1 bằng glucose 10 %.
Thử tác dụng xua muỗi với các mẫu thử được điều chế từ thân, lá
phong lữ thảo.

2.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.
2.5.1. Thẩm định tên khoa học.

21

- Quan sát và mơ tả đặc điểm hình thái thực vật, điều kiện sinh trưởng và
phát triển của cây Phong lữ thảo tại thực địa.
- Thu hái, làm tiêu bản mẫu cây và lưu giữ tiêu bản.
Xác định tên khoa học của cây trên cơ sở phân tích đặc điểm hình thái
thực vật, so sánh các khóa phân loại của thực vật chí Việt Nam, Trung Quốc
dưới sự hướng dẫn của chuyên gia thực vật.
2.5.2. Nghiên cứu thành phần hóa học.
2.5.2.1. Khảo sát sơ bộ các nhóm chất hữu cơ có trong Phong lữ thảo.
- Thực hiện các phản ứng định tính nhóm chất có trong dược liệu bằng các
phản ứng định tính trong ống nghiệm và sắc ký lớp mỏng[1],theo sách Thực tập
Dược liệu (phần định tính các nhóm chất bằng phản ứng hóa học) – Bộ mơn
Dược liệu – Trường ĐH Dược Hà Nội.
+ Nhóm Alcanoid : Phản ứng với thuốc thử Mayer.
Phản ứng với thuốc thử Dragendorff.
Phản ứng với thuốc thử Bouchardat.
+ Nhóm Flavonoid: Phản ứng với Cyanidin.
Phản ứng với hơi NH3
Phản ứng với kiềm loãng.
Phản ứng với FeCl3 5%.
+ Nhóm Saponin: Hiện tượng tạo bọt.
Phản ứng Liebermann.
Phản ứng Baljet.
Phản ứng Legal.


22

Phản ứng Keller – Kiliani.
+ Nhóm Coumarin : Phản ứng mở đóng vịng lacton.
+ Nhóm Tanin : Phản ứng với FeCl3 5%.
Phản ứng chì acetat 10%.
+ Nhóm Anthranoid: Phản ứng Borntrager.
+ Nhóm Acid hữu cơ: Phản ứng với Na2CO3.
+ Nhóm đường khử: Phản ứng với thuốc thử Felling A và B.
+ Nhóm chất béo: vết mờ trên giấy lọc.
+ Nhóm Sterol: Phản ứng Salkopski
Phản ứng Liberman.
+ Nhóm Caroten: Với H2SO4 đặc.
+ Polysaccharid: với thuốc thử Lugol.
+ Acid amin: Với thuốc thử Nihydrin.
+ Định lượng tinh dầu:
Dược liệu đã xác định độ ẩm. Tinh dầu được tách ra bằng phương pháp cất kéo
hơi nước, hàm lượng tinh dầu tính theo cơng thức sau:
HLT.D(%)=
Trong đó:

a: số ml tinh dầu thu được.
A: Khối lượng dược liệu đem định lượng.
X: Hàm ẩm của dược liệu

Kết quả được xử lý theo phương pháp thống kê.[5]
2.5.2.2. Chiết xuất, phân lập các hợp chất trong cây Phong lữ thảo.


23

- Chiết xuất các hoạt chất trong dược liệu bằng cồn công nghiệp. Cất
thuhồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cắn cồn toàn phần.
- Chiết xuất phân đoạn từ dịch chiết cồn tồn phần bằng các dung mơi có
độ phân cực tăng dần (n-Hexan, Ethyl acetat), thu được các phân đoạn tương
ứng, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình phân lập các chất.
- Phân lập các hợp chất trong mẫu cao dược liệu bằng sắc kí cột với chất
hấp phụ là silica gel, cỡ hạt 0,04 - 0,063mm hoặc sắc ký điều chế.Theo dõi các
phân đoạn bằng sắc kí lớp mỏng.
+ SKLM được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60G
F254(Merck) (silica gel, 0.25 mm) và bản mỏng pha đảo RP-18 F 254 (Merck, 0,25
mm). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại có hai bước sóng 254 nm và 366 nm hoặc
dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong ethanol.
+ Phân tích các phân đoạn bằng SKLM để lựa chọn dung môi phù hợp cho
việc phân tách các chất bằng sắc ký cột.
+ Sắc ký cột được tiến hành với chất phụ là silica gel pha thường (0,0400,063mm, Merck) vàsilica gel pha đảo YMC (30-50µm, FuJisilisa Chemical
Ltd.). Theo dõi các phân đoạn bằng SKLM.
- Xác định cấu trúc các chất phân lập được bằng việc phân tích các đặc
điểm hóa lý (cảm quan, nhiệt độ nóng chảy) và dựa trên số liệu các phổ: phổ
hồng ngoại (IR), phổ tử ngoại (UV), phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân
(NMR).


24

Phong lữ thảo (thân, lá)

+Chiết 3 lần với EtOH 96%
+ Cất thu hồi dung môi.
Bổ Cao
sungtổng

nước

Lắc với n-hexan

Bổ sung nước

Cao n-hexan

Dịch nước

Cao nước

Lắc với EtOAc

Cao EtAc

Chạy cột tinh chế

Chất tinh khiết

Sơ đồ 3.2:thiết kế nghiên cứu chiết xuất và phân lập chất tinh khiết từ thân, lá
củaPhong lữ thảo


25

2.5.3. Nghiên cứu thử tác dụng xua muỗi Aedes aegypti.
2.5.3.1. Kỹ thuật thu thập muỗi và bọ gậỵ


Kỹ thuật thu thập muỗi:

-Tay phải cầm ống nghiệm, tay trái cầm đèn pin ( nơi sáng không cần đèn) đi nhẹ
nhàng để muỗi khỏi bay. Vừa đi vừu rọi đèn pin vào tường để soi muỗi. Đèn
thường cách tường 30cm, chiếu qua chiếu lại tránh kích thích ánh sáng trực tiếp
vào muỗi. Khi thấy muỗi, tay cầm ống nghiệm bằng ngón tay cái và ngón giữa
úp nhanh ống nghiệm lên muỗi, theo phản xạ muỗi bay vào ống. Lấy ít bơng để
lên miệng ống.Mỗi ống nghiệm chừng 4-5 con. Khi miếng bông cuối cùng cách
miệng ống 2 cm. Ghi nhãn: Địa điểm bắt, thời gian bắt ( giờ, ngày, tháng), người
bắt:
-Vị trí bắt muỗi:
+ Tùy theo đặc điểm sinh lý, sinh thái: sinh địa cảnh, vật chủ thích hợp,
nơi trú ẩn tiêu máu, nơi rình mồi để hút máu…của từng lồi muỗi mà xác định vị
trí bắt muỗi.
+ Thường tìm bắt muỗi ở nơi tối, ẩm như ngầm giường, ngầm tủ, ngầm
cầu thang, hay trong chuồng gia súc hoặc các lùm cây rậm rạp quanh nhà, bờ
rào, nơi kìn gió và có nước.
+ Có thể bắt muỗi khi muỗi mới nở từ quăng, muốn vậy phải bắt từ 5-6
giờ, tìm bắt muỗi trên mặt nước ở các vũng nước dụng cụ chứa nước.
-Dung mồi để bắt muỗi:
+ Mồi người: có thể bắt muỗi ở trong nhà hoặc ngoài nhà, thường mồi ở
những nơi kín gió. Người ngồi và vén quần lên trên đầu gối, tay cầm đèn pin soi
bắt muỗi.