Nghiên cứu quá trình lên men lactic từ mật rỉ đường

1

PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1.

Đặt vấn đề

Ngày nay, nước ta có nhiều nhà máy đường tạo ra một sản lượng lớn về đường kết tinh.
Bên cạnh đó một lượng khơng nhỏ mật rỉ đường mà các nhà máy này thải ra làm ô nhiễm môi
trường. Với những ứng dụng Công nghệ Sinh học đã sử dụng những phế liệu mật rỉ để lên men
tạo ra nhiều sản phẩm có giá trị như L-lysine, acid citric, acid glutamic.v.v. và đặc biệt là acid
lactic được quan tâm nhiều trong những năm gần đây.
Nhu cầu cung cấp acid lactic ngày càng nhiều, bởi vì chúng được ứng dụng rộng rãi trên
nhiều lĩnh vực như bảo quản và chế biến thực phẩm, trong y học, môi trường (acid polylactic
thay thế các loại sản phẩm nhựa PE, pp, đĩa CD, bịch nilon), mỹ phẩm.v.v.
Tổng thị trường thế giới về acid lactic 86.000 tấn vào năm 2001, 500.000 tấn vào năm
2010. Ở Việt Nam: vào năm 2006, đại diện công ti dược Ildong (Hàn Quốc) xuất khẩu một số
lượng lớn chế phẩm acid lactic sang hãng MERAP phân phối dược ở Việt Nam với giá trị hợp
đồng 3,7 triệu USD [38], [39], [40].
Xuất phát từ tình hình thực tế trên, được sự đồng ý của Bộ môn Công nghệ Sinh học
trường Đại học Nông Lâm TP.HCM. Dưới sự hướng dẫn của Thầy Nguyễn Đức Lượng trường
Đại học Bách Khoa và Thầy Phan Vĩnh Hưng Trường Cao đẳng Công nghiệp Thực Phẩm
TP.HCM. Chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu quá trình lên men lactic từ mật rỉ
đuờng”.
1.2.

Mục đích của đề tài
Chọn vi khuẩn có khả năng sinh acid lactic nhiều nhất để sản xuất acid lactic.

1.3.

Yêu cầu

- Phân lập vi khuẩn lactic
- Tuyển chọn các khuẩn lạc có khả năng lên men lactic
- Khảo sát các điều kiện tối ưu cho quá trình lên men
- So sánh sự tạo acid tổng của các khuẩn lạc
- Sản xuất acid lactic từ mật rỉ

PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1.

Giói thiệu về acid lactic

Acid lactic, 2-hydroxypropionic acid

(CH3CHOHCOOH)

là acid tồn tại rộng rãi trong tự nhiên,

được tìm thấy ở người, động vật, thực vật và vi sinh vật. Được phát hiện vào năm 1780 do nhà


2
hóa học Thụy Điển Sheele ở trong sữa chua. Acid lactic được chấp nhận là sản phẩm của một
quá trình lên men vào năm 1847 [2], [25], [32].
Trong cấu tạo phân tử của acid lactic có một carbon bất đối xứng nên chúng có hai đồng
phân quang học: D - acid lactic và L - acid lactic. Hai đồng phân quang học này có tính chất
hóa lý giống nhau, chỉ khác nhau khả năng làm quay mặt phẳng phân cực ánh sáng, một sang
phải và một sang trái. Do đó tính chất sinh học của chúng hồn tồn khác nhau.
I -axi: L:. •: 71-::

D -a:d L: :;:K

Loại L - acid lactic ở dạng tinh thể. Chúng có khả năng tan trong nước, tan trong cồn,
tan trong eter, không tan trong

CHCI3,

nhiệt độ nóng chảy 28° c [9]. L - acid lactic được ứng dụng

trong công nghiệp thực phẩm và dược phẩm. Hầu hết các sinh vật lên men lactic đồng hình
đều tạo ra được các dạng đồng phân quang học [32].
Loại D - acid lactic là dạng tinh thể, tan trong nước tan trong cồn. Nhiệt độ nóng chảy
28° c.
Neu D - acid lactic và L - acid lactic có trong một hỗn hợp theo tỉ lệ 50/50 người ta gọi
là hỗn hợp Raxemic. Trong q trình lên men khơng khi nào có một hỗn hợp có tỉ lệ lý tưởng
này mà chỉ có được hỗn hợp này khi tiến hành tổng hợp hữu co. DL - acid lactic có khả năng
tan trong nước, trong cồn, không tan trong CHCI3 [9].
2.2.

Vi sinh vật trong lên men lactic

Vi khuẩn lactic có thể được phân lập từ các cây trồng trên thế giới bao gồm hạt trái cây
và rau [24]. Các loài Lactobacillus cịn tìm thấy ở dạ dày, ruột non, ruột già và âm đạo [21].
Vi khuẩn lactic là vi khuẩn gram dương, không sinh bào tử, tỉ lệ G+C thấp, cầu khuẩn
hay hình que. Chúng sản xuất ra acid lactic như là sản phẩm lên men chính. Chúng khơng có
enzyme catalase mặc dù catalase giả có thể được tìm thấy trong những trường hợp rất hiếm vì
vậy khơng phân giải oxi già. Các thành viên của nhóm này thiếu cytochrome. Tất cả các vi
khuẩn lactic phát triển trong điều kiện kị khí. Tuy nhiên, khơng giống như những vi khuẩn kị
khí, hầu hết các vi khuẩn acid lactic không nhạy cảm với oxi và cũng có thể phát triển tốt trong

điều kiện có mặt oxi cũng như khơng có mặt oxi. Vì thế chúng là vi khuẩn kị khí tùy ý
(Madigan et al. 2000) [30].
Sự phân chia vi khuẩn lactic dựa vào các sản phẩm của quá trình trao đổi chất của
carbohydrate, các lồi Lactobacillus có thể phân chia thành 3 nhóm [23], [19].
- Nhóm I: Lên men đồng hình bắt buộc có fructose-l,6-diphosphate aldolase (FDP
aldolase) nhưng khơng có phosphoketolase. Chúng lên men được hexose để tạo acid lactic
nhưng không lên men được pentose.)


3
- Nhóm II: Lên men dị hình tùy ý (có FDP aldolase và cảm ứng phosphoketolase. Tuy
nhiên, hexose là lên men đồng hình và pentose được chuyển thành acid lactic và ethanol hoặc
acid acetic).
Nhóm III: Lên men dị hình bắt buộc (Có phosphoketolase nhưng khơng có
FDP aldolase, q trình trao đổi chất cả hexose và pentose lên men dị
hình).


Bảng 2.1. Phân loại Lactobacillus (Sharpe, 1981; Kandler và Weiss, 1986)
Đặc đểm

Nhóm I

Nhóm II

Nhóm III

Lên men pentose

-

+

+

Tạo C02 từ glucose

-

-

+

Tạo C02 từ gluconate

-

+a

+a

Sự hiện diện FDP aldolase

+

+

-

Sự hiện diện phosphoketolase

-

+b

+

L. acidophilus

L. casei L.

L. brevis L.

L. delbrueckii

curvatus L.

buchneri L.

L. helveticus L.

plantarum L.

ỷermentum L.

salivarìus

sake

reuteri

Một vài đại diện

a: Khi lên men
b: Cảm ứng khi có pentose
Một đặc điểm quan trọng dùng để phân biệt các giống vi khuẩn acid lactic là sự lên men glucose duới các điều kiện
chuẩn nhu: nồng độ glucose và các yếu tố tăng truởng (các tiền chất acid amin, vitamin và acid nucleic) thì khơng giới hạn
và giới hạn sử dụng oxi. Duới những điều kiện này, vi khuẩn acid lactic có thể phân thành hai nhóm: lên men lactic đồng
hình thì chuyển hầu hết luợng glucose để tạo thành acid lactic và lên men lactic dị hình thì glucose lên men tạo thành acid
lactic, ethanol, acid acetic và C02. Thật ra việc kiểm tra sản phẩm khí từ glucose sẽ phân biệt đuợc giữa hai nhóm này
(Sharpe, 1979).

.2.1.

Vi khuẩn lactic dị hình
Khi tiến hành lên men các dung dịch đuờng, các vi khuẩn lactic dị hình thuờng tạo ra luợng acid lactic khơng lớn

lắm. Ngồi acid lactic chúng còn tạo ra hàng loạt các sản phẩm khác nhu acid acetic, ethanol, C02 [3], [9].
Một số loài vi khuẩn lactic dị hình đuợc nghiên cứu nhu sau:
- Lactobacillus pasteurianus
Trực khuẩn, gram duong, kích thuớc rộng 0,5 - 1 pm; dài 7,0-35 pm. Trong thiên nhiên chúng tồn tại riêng lẽ,
khơng di động. Có khả năng lên men đuợc, glucose, ữuctose, galactose, maltose, saccharose, mannitol, dextrin. Trong quá
trình lên men tạo một số sản phẩm như C02, alcohol, acid lactic, acid acetic. Nhiệt độ thích họp 29 - 33°

c, pH thích họp 8

[9].
- Lactobacillus brevis

Thuộc trực khuẩn, gram dương, khơng có khả năng di động, kích thước rộng 0,7 -1,0 pm, dài 2,0 - 4,0 pm. Trong

thiên nhiên chúng liên kết với nhau thành chuỗi. Trong quá trình phát triển, chúng có thể sử dụng lactat canxi như nguồn
cung cấp cacbon. Chúng có khả năng lên men các loại đường như glucose, ữuctose, galactose, maltose. Chúng hiếm khi lên
men mannitol, glycerol, dextrin, và tinh bột. Chúng khơng hóa lỏng gelatin [18].


- Lactobacillus lycopessici
Trực khuẩn, gram dương, trong thiên nhiên chúng tồn tại từng đơi một, có khả năng tạo bào tử. Trong quá trình lên
men đường, chúng tạo ra cồn, acid lactic, acid acetic và C0 2 .
- Streptococcus cumoris
Thuộc loài cầu khuẩn, trong thiên nhiên chúng tồn tại thành từng chuỗi rất dài. Thuộc gram dương, nhiệt độ thích hợp
phát triển là 30°

c, không phát triển ở nồng độ NaCl 4 %. Khi lên men đường tạo ra acid acetic, diacetyl, C0 . Chúng có
2

khả năng tạo ra những chất kháng khuẩn .
- Streptolacticus lactic
Thuộc chồi cầu khuẩn, gram dương, nhiệt độ phát triển từ 10 - 45°

c, có khả năng chịu được nồng độ NaCl 4 %. Khi

lên men đường glucose, maltose, lactose, xylose, saccharose, mannitol, tạo ra acid lactic, acid acetic, diacetyl, C0 2. Chúng
khơng có khả năng lên men được glycerol, sorbitol.
- Streptococcus ỷaecalis
Chúng tạo thành chuỗi tế bào hình cầu, gram dương. Nhiệt độ tối ưu 37°

c, nhiệt độ sinh trưởng 10 - 45° c, có thể

phát triển duới hoặc 5° c, hiếm khi phát triển ở 50° c. Có khả năng sống sót ở 62,8° c trong 30 phút. Phát triển ở pH 9,6.
Chịu được nồng độ NaCl 2 %, 4 % và 6,5 %. Có khả năng lên men đường glucose, maltose, lactose và ln ln lên men

mannitol; có hoặc khơng thể lên men sucrose, glycerol, sorbitol [18].

.2.2.

Vỉ khuẩn lactỉc đồng hình
Khi tiến hành lên men các dung dịch đường thì vi khuẩn lactic đồng hình thường tạo ra acid lactic là chủ yếu [3], [9].
Một số lồi vi khuẩn lactic điển hình được nghiên cứu kỹ như sau:
- Lactobacillus acidophilus
Lần đầu tiên được phân lập bởi Moro (1900) được phân lập từ phân của trẻ so sinh đã qua phẩu thuật và bê mới đẻ .

Có dạng hình que, chịu nhiệt, q trình lên men tạo ra 2,2 % acid lactic [4], [17]. Chúng có kích thước rộng 0,6 - 0,9 pm,
dài 1,5 - 6,0 pm. Trong thiên nhiên chúng tồn tại riêng lẽ. Đôi khi chúng tạo thành những chuỗi ngắn. Trên mơi trường
gelatin: chúng khơng phát triển ở 20°

c,

khơng có khả năng hóa lỏng. Trên mơi trường khoai tây thì khơng phát triển.

Chúng thuộc nhóm vi khuẩn gram dưong và khơng di động. Chúng có khả năng lên men đường như glucose, íructose,
galactose, maltose, lactose, để tạo acid lactic. Chúng khơng có khả năng lên men glycerol, mannitol, sorbitol. Khơng thể

phát triển được trong mơi trường khơng có carbohydrate. Nhiệt độ tối ưu 37° c. Nó phát triển từ 20 - 22° c. Nhiệt độ phát
triển tối đa 43 - 48°c [18].
- Lactobacillus bulgaricus
Chúng được tìm ra do Mesnhicov ở sữa chua Bungari [14]. Thuộc loại trực khuẩn có kích thước rất dài, liên kết với
nhau tạo thành chuỗi, gram dưong. Chúng khơng có khả năng di động, có khả năng lên men các loại đường như glucose,
lactose, galactose. Có thể hoặc không thể lên men ữuctose, maltose và sucrose. không lên men được xylose, mannitol,


dextrin. Chúng khơng có khả năng tạo ra nitrit từ nitrate [9]. Quá trình lên men tạo 3,7 % acid lactic [14]. Trên mơi trường

khoai tây, có khuẩn lạc trắng vàng [18]. pH thích hợp cho sự phát triển là pH = 5,2 - 5,6 [7]. Nhiệt độ tối ưu 45 - 50°

c.

Tối thiểu 22° c [20]. Trong sản xuất qui mô lớn, chúng thường được chọn để lên men Whey để tạo acid lactic, sau đó dùng
Ca(OH)2 để trung hòa lượng acid lactic tạo thành. Nhiệt độ lên men 43°

c, với nhiệt độ này đủ để ức chế các vi sinh vật

gây nhiễm mà không ức chế L. bulgaricus [22].
- Lactobacillus biỷidus
Trực khuẩn rất nhỏ, kích thước trung bình khoảng 4 pm, khơng có khả năng di động, thuộc gram dưong. Chúng có
thể đứng riêng lẽ, cặp và chuỗi ngắn. Có khả năng lên men được các loại đường như glucose, ữuctose, galactose,
saccharose, dextrin, tinh bột và maltose [18].
- Lactobacillus casei
Vi khuẩn được phân lập từ sữa, sản phẩm của sữa, ủ xylo- thức ăn xanh dùng trong chăn ni, vi khuẩn dạng hình
que, kích thước 0,7 - 1,1 pm; 2,0 - 4,0 pm, trực khuẩn nhỏ thường gặp ở dạng chuỗi dài hay chuỗi ngắn [4]. Chúng thuộc
gram dưong, khơng có khả năng lên men được các loại đường như glucose, ữuctose, galactose, maltose, lactose và
mannitol; có hoặc không thể lên men sucrose. Nhiệt độ phát triển tối ưu là 30°

c, thấp nhất 10° c. Tối đa 37 - 40° c và

vài chủng có thể 45° c. Quá trình lên men tạo khoảng 1,5 % acid lactic [18].
- Lactobacillus causaciccus
Trực khuẩn ngắn, khơng có khả năng di động, gram dưong. Chúng có khả năng lên men các loại đường như glucose,
ữuctose, galactose, maltose, lactose, mannitol. Nhiệt độ phát triển tối ưu là 48 - 55° c [9].
- Lactobacillus delbrueckii
Thường gặp chúng trên hạt đại mạch [14]. Vi khuẩn chịu nhiệt, được tìm thấy ở các lồi hạt ngũ cốc và tinh bột, đây
là một giống vi khuẩn có khả năng đồng hóa được tinh bột. Trực khuẩn dài, kích thước 0,5 - 0,8 pm; 2,0 - 9,0 pm, khơng di
động, gram dưong. Q trình lên men tạo 2,5 % acid lactic. Chúng có khả năng lên men được glucose, ữuctose, maltose,

sucrose, galactose và dextrin. Chúng khơng có khả năng lên men xylose, lactose, tinh bột, mannitol. Nhiệt độ tối ưu 45°c
[9], [18].
-Lactobacillus leichmannii
Trực khuẩn gram dưong. Kích thước tế bào 0,6 - 2 pm. Vi khuẩn này có khả năng tạo thành chuỗi ngắn, không di
động, gram dưong. Nhiệt độ tối ưu 36°

c. Tối đa 40 - 46° c. Chúng khơng có khả năng tạo nitrit từ nitrate. Có khả năng

lên men glucose, ữuctose, maltose, saccharose. Trong mơi trường khoai tây chúng tạo 1,3 % acid lactic [18].
- Lactobacillus helveticcus


Thuộc trực khuẩn có kích thước 0,7 - 0,9 pm; 2,0 - 6,0 pm. Trong thiên nhiên chúng có thể tồn tại riêng từng tế bào,
cũng có thể tồn tại thành từng chuỗi tế bào. Nhiệt độ phát triển

40 - 42° c. Chúng có khả năng lên men được glucose,

ữuctose, galactose, maltose và lactose [9].
-

Lactobacỉllus thermophỉllus
Trực khuẩn, gram dương, kích thước tế bào 0,5 - 3,0 pm, khơng có khả năng di động. Lên men được glucose,

lactose, sucrose, tinh bột và dạng glycerol. Không tạo acid từ mannitol. Lên men được ữuctose, galactose, maltose và

dextrin. Không tạo nitrit từ nitrate. Nhiệt độ tối ưu 50 - 62,8° c. Nhiệt độ tối thiểu 30° c, nhiệt độ tối đa 65° c. Điểm nhiệt
độ chết khoảng 71° c trong 30 phút [18].
-

Lactobacillus plantanrum

Trực khuẩn, gram dương, kích thước tế bào 0,7 - 1,0 pm; 3,0 - 8,0 pm. Nhiệt độ tối ưu 30° c. Tối thiểu 10° c, tối đa

40° c. Điểm nhiệt độ chết từ 65 - 75° c trong 15 phút. Có khả năng chịu nồng độ NaCl 5,5 %. Chúng có khả năng lên men
glucose, ữuctose, galactose, sucrose, maltose và lactose. Tinh bột thì khơng lên men. Khơng tạo được nitrit từ nitrate [18].
-

Lactobacillus sporogenes

Thuộc giống Lactobacillus dựa trên các đặc tính bởi Nakayama và Yanoshi (1967). Chúng thuộc Gram dương, có
khả năng sinh bào tử, có dạng hình que, kích thước 3-5 pm, thuộc vi khuẩn hiếu khí, là vi khuẩn lactic đồng hình sản xuất

ra axít lactic L(+) - (dextrorotraytory), phát triển ở nhiệt độ dao động từ 35 - 50° c, pH tối ưu dao động từ 5,5 - 6,5, phản
ứng với catalase dương tính. Tạo acid từ glucose, galactose, ữuctose, maltose và sucrose. Khơng có thủy phân tinh bột hoặc
casein, khơng hóa lỏng gelatin. phản ứng indol âm tính và khơng tạo khí [31].
2.3.

Cơ chế tạo ra acid lactic [20]

Kluyver chia vi khuẩn lactic thành 2 nhóm dựa vào sản phẩm cuối của q trình chuyển hóa glucose. Q trình này
tạo acid lactic là sản phẩm chính từ lên men glucose được gọi là lên men đồng hình, số lượng acid lactic đồng hình thu

được nhiều hơn lactic dị hình khoảng 2 lần. Vi khuẩn lactic dị hình lên men từ hexose tạo số lượng mole lactat, CƠ2 và
ethanol bằng nhau.
Bảng 2.2 Vi khuẩn lên men lactic đồng hình và dị hình [20]


Lên men đồng hình
Sinh vật

Dạng

Lên men dị hình
% G+C

Sinh vật

lactat

Dạng

% G+C

lactat

Lactobacillus

Lactobacillus

L. acidophilus

DL

36,7

L. brevis

DL

42,7 - 46,4

L. bulgaricus

D(-)
L(+)

50,3
46,4

L. buchneri

L. casei

L. cellobiosus

DL
DL

44,8
53

L. coryniýormis

DL

45

L. coprophilus

DL

41,0

L. curvatus

DL

43,9

L. ỷermentum

DL

53,4

L. delbrueckii

D(-)
DL

50
39,3

L. hilgardii

L. helveticus

L. sanýrancisco

DL

DL

40,3
38,1 - 39,7

L. jugurti

DL

36,5-39,0

L. trichoides

DL

42,7

L. jensenii

D(-)

36,1

L. ỷructivorans

DL

38-41

L. lactis

D(-)

50,3

L. pontis

DL

53-56

L. leichmannii

D(-)

50,8

Leuconostoc

L. plantarum

DL

45

L.cremoris

D(-)

39-42

L. salivarius

L(+)

34,7

L.dextranicum

D(-)

38-39

L. lactis

D(-)

43-44

L.mesenteroides

D(-)

39-42

Pediococcus
p.acidilactici

DL

p.cerevisiae

DL

L.gelidum

D(-)

37

DL

38

L.camosum

D(-)

39

S.bovis

D(-)

38-42

c.divergens

33,0 - 36,4

S.thermophilus

D(-)

40

c.mobile

35,5 - 37,2

c.gallinarum

34,3 - 36,4
33,7 - 36,4

p.pentosaceus

44,0

Streptococcus

Camobaterium

Lactococcus
L.lactis subsp. lactis

D(-)

38,4 - 38,6

C.piscicola

L.lactissúbsp.cremoris
L. lactissubsp. hordniae

D(-)

38,0 - 40,0
35,2

Weisseũa
W.confusa

DL

44,5 - 45,0

L.garvieae

38,3 - 38,7

w.hellenica

D(-)

37-47

L.plantarum

36,9 - 38,1

W.halotolerans

DL

45

L.raffinolactis

40,0 - 43

w.kandler

DL

39

W.minor

DL

44

V.ýluvialis

33,6

w. paramesenteroides

D(-)

38-39

v.salmoninarum

36,0 - 36,5

w.viridescens

DL

43

DL

38-42

Vagococcus

Oenococcus
O.oeni


2.3.1.

Vỉ khuẩn lactỉc dị hình [9]
Tất cả các vi khuẩn lactỉc dị hình thường thiếu hai loại enzỵtn quan trọng đó là aldolase và hexose isomerase. Do đó

trong giai đoạn đầu của quá trình lên men, chúng thường được tiến hành theo con đường hexose monophosphate hay gọi là
con đường pentose phosphate (PP ) . Q trình chuyển hóa đường được trình bày như sau:

ơluc ose

\[/
Glu cos e -ố - ph ospha te

M/
6 - ph osph oglu c on a t e

\/
Ribulose-5 -ph-osphate
'V

Xylulose-5-phospbate
--------------p hosphoketola se
Glyceraldehyde-3-phosphate Acetyl-phosphate 1 ;3"dipbosphoglycerat.e

ị

Acetyl-CũA

A c e taldehvđe

3 -ph o s ph ogíyc e r at e

M
2 -phosph oglyc
/ er ate
I

V

Ethanol

phosph oenolpyiTi va te

I
pyiaívate

ĩ
A c i d lactic

.3.2.

VỈ khuẩn lactíc đằng hình
Q trình lên men lactic đồng hình nhờ có enzyme aldolase và hexose ỉsomerase nhưng thỉếu phosphoketolase.

Chúng sử dụng con đường Embden-Meyerhoí-Pamas (EMP) để tạo 2 phân tử lactat từ 1 phân tử glucose [9], [19], [20].
Q trình chuyển hóa được trình bày như sau:


Glucose

V
Gluc ỬS e-6-ph ửsphate
iructose-6 -ph 0 s phat e

ị
Fructose-l,6-diphosphate Aldolase

Glyc e ralde hy de - 3 -ph o

s ph. a t
> D ihydroxy-ac etone
-phosphate
2

/

1,3-ầphosp ìoglyc erate

M/

2 3~phosphoglycerate

ị
2-phos plì oglycerate

v|/

2 phosphoenlpyruvate T
2 pyruvate

ị

2 Âcid lactic

>


2.4.

.4.1.

Nhu cầu dinh dưỡng của vỉ khuẩn lactỉc và các yếu tổ ảnh hưởng đến quá trình lên men

Nhu cầu dinh dưỡng của vỉ khuẩn lactỉc
Vi khuẩn lactic có nhu cầu về dinh dưỡng rất phức tạp, không một đại diện nào thuộc nhóm này có thể phát triển

được chỉ có chứa glucose và NH4+. Đa số trong chúng cần hàng loạt vitamin (lactoílavin, tiamin, acid pantotenic, acid
nicotinic, acid folic, biotin) và các acid amin. Vì thế người ta thường nuôi cấy chúng trên các môi trường phức tạp chứa
một số lượng tưong đối lớn cao nấm men, dịch cà chua hoặc thậm chí máu. Một số lồi vi khuẩn lactic có những nhu cầu
về yếu tố tăng trưởng chính xác hon động vật hữu nhũ [25].
2.4.1.1.

Nhu cầu dinh dưỡng carbon

Vi khuẩn lactic có thể sử dụng được nhiều carbohydrate như glucose, ữuctose, maltose, saccharose.. .các nguồn
carbon này dùng để cung cấp năng lượng và tham gia vào hầu hết các cấu trúc của tế bào. Vì vậy đây là nguồn thức ăn có ý
nghĩa hàng đầu đối với sự sống của tế bào vi sinh vật [13]. Nguồn carbon tốt nhất là các loại đường và ở mức độ nhỏ các
đường chứa nhóm rượu, cịn polysaccharide thì thực chất không thể lên men. Tốc độ lên men các loại mono-, di- và
oligosaccharide khác nhau đến mức có thể dùng tiêu chuẩn này để có thể phân biệt giữa các loài [2].
2.4.1.2.

Nhu cầu dinh dưỡng nitơ

Đa số vi khuẩn lactic khơng có khả năng sinh tổng hợp được các hợp chất hữu co phức tạp có chứa nito, chỉ có một
số lồi có khả năng sinh tổng hợp các hợp chất nito hữu co từ nguồn vơ co. Vì vậy, để đảm bảo sự phát triển của mình, vi
khuẩn lactic phải sử dụng nguồn nito có sẵn trong mơi trường. Tuy nhiên, để sinh trưởng và phát hiển bình thường thì ngồi
nito dưới dạng hỗn hợp các acid amin, vi khuẩn lactic còn cần những co chất hữu co phức tạp có chứa nito như: cao thịt,
cao nấm men, pepton, casein.. .[13].
Bảng 2.3 Các acid amin cần thiết cho vi khuẩn lactic [34]

2.4.I.3.

L-Alanine

Glycine

L-Proline

D-Alanine

L-Histidine

L-Serine

L-Arginine

L-Isoleucine

L-Threonine

L-Acid aspartic

L-Leucine

L-Tryptophan

L-Cysteine

L-Lysine

L-Tyrosine

L-Acid glutamic

L-Phenylalanine

L-Valine

Nhu cầu về vỉtamỉn

Vi khuẩn lactic rất cần vitamin cho sự phát triển và các vitamin này đóng vai trị là coenzym trong q trình trao đổi
chất của chúng. Rất ít vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp đuợc vitamin, phần lớn chúng cần nhiều loại vitamin nhu:
riboílavin, tiamin, biotin.
Bảng 2.4 Các vitamin và các yếu tố có liên quan đến sự phát triển của vi khuẩn lactic [34]



Y ếu tố phát triển

Các sinh vật đại diện mà đòi các họp chất cho sự phát tri
cn

/>-Acid aminobenzoic

Lactobacillus plantarum Lactobacillus
arabinosus

Biotin
Lactobacillus plantarum Leuconostoc

mesenteroides Streptococcus ỷaecalis

Acid folic (Acid pteroylglutamic)
Lactobacillus casei Streptococcus ỷaecalis

Acid tolinic (acid leucovorin, 5-Formyl- 5,6,7,8

Leuconostoc citrovorum

-tetrahydrop teroylglutamic)
Acid lipoic (Acid thioctic, yếu tố thay thế

Lactobacillus casei

acetat, protogen)

Streptococcus lactis

Acid nicotinic

Lactobacillus arabinosus Leuconostoc
mesenteroides Streptococcus ỷaecalis

Acid pantothenic
Lactobacillus casei Leuconostoc
mesenteroides Streptococcus ỷaecalis

Pantetheine hoặc pantethine
Lactobacillus acidophilus Lactobacillus
bulgaricus

Ribotlavin
Lactobacillus casei Streptococcus lactis

Thiamine
Lactobacillus ỷermenti Streptococcus lactis

Pyridoxal

Lactobacillus casei

Pyridoxamin
Pyridoxamin phosphat

Streptococcus ỷaecalis
Lactobacillus acidophilus Lactobacillus
delbrueckii Lactobacillus lactis

Vitamin B12
Lactobacillus lactis Lactobacillus leichmannii

2.4.1.4.

Nhu cầu về các chất hữu cơ

Ngoài các nguồn dinh dưỡng trên, vi khuẩn lactic cịn có nhu cầu rất lớn về các hợp chất hữu cơ khác cần cho sự phát
triển của chúng như purine, pyrimidine. Acid hữu cơ như acid acetic và nhiều acid hữu cơ không bay hơi khác. Tween 80 là
một dẫn xuất của acid oleic, là một loại acid hữu cơ quan trọng có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của hầu hết các loại vi
khuẩn lactic. Ngoài ra các acid béo cũng ảnh hưởng lên sinh trưởng của các vi khuẩn lactic nhưng cơ chế còn chưa được
biết rõ [2].

2.4.1.5.

Nhu cầu các muối vô cơ

Để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển, vi khuẩn lactic cần rất nhiều các hợp chất vô cơ. Phosphat là loại muối
quan trọng nhất mà các vi khuẩn lactic yêu cầu. Các muối amôn không thể được dùng làm nguồn nitơ duy nhất song hình

như chúng gây một ảnh hưởng nhất định lên sự chuyển hóa một số acid amin. Đối với Lactobacillus thì Mn2+, Fe2+, Mg2+ có

tác dụng tích cực lên sự phát triển và sinh ra acid lactic [13]. Sự vắng mặt glucose thì Mg 2+ khơng ảnh hưởng đến sự ổn
định của Lactobacillus delbrueckii nhưng khi có glucose thì nó làm ổn định q trình thủy phân (Rees và Pirt, 1979). Cơ

chế của sự ổn định này chưa được xác định, nhưng tất cả các các trình tự thủy phân của kinase xem Mg 2+như là đồng nhân
tố. Sự địi hỏi Mg2+ bởi Lactobacillus delbrueckii khơng thể thay thế bằng Mn2+ [23].

.4.2.

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men
Trong nghiên cứu vi khuẩn lactic thì thường sử dụng môi trường: MRS (de Man, Rogosa and Sharpe), môi trường cà

chua, môi trường cao nấm men, môi trường rau cải, môi trường cà chua - Tween 80, môi trường nấm men - glucose, môi
trường nhũ thanh, môi trường sữa. Tùy theo từng loại và thành phần môi trường mà áp dụng phương pháp xử lý cho thích
hợp. Thiết bị lên men dùng để lên men trong phịng thí nghiệm là bình erlen hoặc fermentor cỡ nhỏ có gắn các thiết bị kiểm
sốt các thơng số có liên quan. Dù ta sử dụng môi trường, thiết bị lên men nào cũng phải đảm bảo điều kiện vô trùng, công
đoạn này quyết định hiệu quả của quá trình lên men.
2.4.2.1. Thành phần môi trường nuôi cấy Vi khuẩn lactic thuộc loại vi sinh vật dị dưỡng. Nguồn năng lượng cần
thiết cho hoạt động sống và phát triển của chúng là nguồn năng lượng do trao đổi chất với môi trường bên ngồi. Để duy trì
sự sống, điều hịa các q trình chuyển hóa trong tế bào, chúng cần sử dụng nguồn glucid có trong mơi trường dinh dưỡng

làm nguồn carbon
(chủ yếu là đường lactose), nguồn nitơ (pepton, acid amin), vitamin, muối khống và các ngun tố vi lượng. Vì vậy, ta cần
bổ sung các nguồn dinh dưỡng trên với liều lượng thích hợp nhất giúp vi khuẩn lactic phát triển tốt, nâng cao hiệu suất lên
men.
2A.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ là một trong những nhân tố quan trọng nhất ảnh hưởng tới sinh trưởng. Nhiệt độ càng cao thì sự lên men
càng manh.
2A.2.3. Ảnh hưởng của pH môi trường
Mỗi lồi vi sinh vật thích hợp với một giới hạn pH nhất định của môi trường nuôi cấy. Với vi khuẩn lên men lactic
đồng hình, pH mơi trường thường khơng ảnh hưởng đến các sản phẩm đặc trưng của quá trình lên men, cịn đối với vi
khuẩn lactic dị hình, pH mơi trường có ảnh hưởng đến việc tạo thành các sản phẩm lên men. Khi pH môi trường cao thì sản
phẩm tạo ra chủ yếu là acid lactic, cịn khi pH mơi trường thấp thì ngồi acid lactic cịn có thêm acid acetic và nhiều sản
phẩm phụ khác.
Acid mới tạo thành phải được trung hòa liên tục. Đe lên men nhanh và trọn vẹn, phạm vi pH tối ưu phải nằm giữa 5,5
và 6,0. Lên men bị ức chế mạnh ở pH = 5 và sẽ dừng lại ở các pH dưới 5 [2]. Khi acid lactic được hình thành và nồng độ
tăng dần trong quá trình lên men thì pH sẽ giảm và nồng độ acid lactic đạt khoảng 2,2% sẽ ức chế vi khuẩn lactic [15].


2.4.2.4.

Ảnh hưởng của nồng độ acid

Acid là sản phẩm chính của quá trình lên men lactic do hoạt động sống của vi khuẩn lactic tạo nên. Các vi khuẩn này
chịu được acid, tuy nhiên với lượng acid tích lũy trong môi trường ngày càng một nhiều sẽ ức chế chúng. Để giúp vi khuẩn
lactic phát triển bình thường khơng bị chính sản phẩm do hoạt động của chúng tạo ra ức chế, người ta cho vào môi trường
các chất đệm thích hợp với một lượng đủ để trung hịa lượng acid sinh ra thông thường chất đệm này là CaC03.
2.4.2.5.

Vi sinh vật tạp nhiễm trong quá trình lên men

Trong quá trình lên men tạo sinh khối thường dựa trên co sở ni cấy một chủng thuần khiết, vì vậy việc đảm bảo
cho tất cả các q trình ni cấy từ giữ giống trong ống nghiệm, nhân giống trong bình erlen.. .đều phải đảm bảo vô trùng
tuyệt đối.
Hệ vi sinh vật tạp mhiễm, thường ảnh hưởng xấu đến quá trình lên men ở những mức độ khác nhau có thể phá hủy
các tế bào giống hoặc phá võ tế bào quá trình trao đổi chất cần thiết cho sự tạo thành các sản phẩm lên men.
2.5.

ứng dụng của vỉ khuẩn lactỉc và acỉd lactỉc

Vi khuẩn lactic và acid lactic ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như trong bảo quản
và chế biến thực phẩm, y học, môi trường, mỹ phẩm.v.v. Nhưng nhiều nhất là trong chế biến bảo quản thực phẩm...

.5.1.

Trong bảo quản và chế biến thực phẩm [17] [19]
Vi khuẩn lactic được sử dụng để lên men thu nhận acid lactic. Acid lactic sản xuất công nghiệp được ứng dụng trong

nhiều lĩnh vực. Do vị chua dễ chịu và có đặc tính bảo quản, một lượng lớn acid lactic được sử dụng trong công nghiệp thực
phẩm. Acid lactic được sử dụng như là một chất gia vị đối với các loại đồ uống nhẹ, tinh dầu, dịch quả, mứt, sirơ. Ngồi ra,
acid lactic cịn được dùng để acid hóa rượu vang và hoa quả nghèo acid, acid hóa dịch đường hóa trong cơng nghiệp sản
xuất rượu mạnh và để sản xuất bột chua trong ngành bánh mì.
- ứng dụng để sản xuất dưa chua
Quá trình muối chua rau, quả chính là q trình hoạt động sống của vi khuẩn lactic và vi khuẩn acetic. Trong quá
trình phát triển của chúng, trong rau quả, khi lên men sẽ tạo ra acid lactic và acid acetic cùng một số loạt acid hữu co khác.
Các acid hữu co này làm giảm pH của dịch, chống lại hiện tượng gây thối rau, quả. Mặt khác nhờ có lượng acid hữu co
được tạo thành sẽ làm tăng hưong vị của khối ủ chua rau, quả là quá trình vừa mang ý nghĩa chế biến vừa mang ý nghĩa bảo
quản [9].
- ứng dụng để làm chua quả
Trước đây, người ta thường sử dụng acid acetic để ngâm chua quả. Sau này người ta sử dụng acid lactic để ngâm chua
quả. Phưong pháp thay thế này tỏ ra hiệu quả vì chúng ít làm thay đổi màu tự nhiên của quả và vẫn đảm bảo chất lượng quả

ngâm chua.
- ứng dụng trong sản xuất tưong
Sản xuất tưong theo phưong pháp của miền Bắc (Việt Nam) có giai đoạn ngả nước đậu sau khi rang. Quá trình ngả
nước đậu xảy ra nhiều phản ứng sinh hóa khác nhau, trong đó có quá trình lên men lactic tạo pH thích hợp cho sản phẩm và
làm tăng hưong vị cho sản phẩm.
-

ứng dụng trong sản xuất đậu phụ


Trong sản xuất đậu phụ có giai đoạn kết tủa protein của đậu. Phương pháp truyền thống thường làm là dùng nước
chua (chứa vi khuẩn lactic) để tạo kết tủa (nhờ pH giảm đến điểm đẳng điện của protein đậu nành).
-

ứng dụng để sản xuất các sản phẩm lên men từ sữa
Trong sản xuất các loại sữa chua đều có sử dụng q trình lên men lactic. Nhờ có q trình chuyển hóa đường thành

acid lactic mà casein được kết tủa và tạo cho sản phẩm hương vị đặc trưng. Hippocrates, người được xem là cha đẻ của
ngành y đã cho rằng “Whey”, loại nước xuất hiện khi tách bơ ra khỏi sữa chính là một dạng huyết thanh của sữa. Trong
“Whey” chiếm khoảng 4,5% đường sữa. Trong ruột chất đường này biến thành acid lactic, một chất hỗ trợ cho loại vi
khuẩn lành mạnh trong ruột phát triển [28].
-

ứng dụng để ủ thức ăn gia súc

về nguyên tắc, ủ các loại cỏ và lá cây làm thực phẩm gia súc cũng giống như công nghệ sản xuất dưa chua. Quá trình
lên men lactic xảy ra làm gia tăng giá trị dinh dưỡng và khả năng bảo quản cỏ, lá cây cho gia súc.

.5.2.
-

Trong y học
ứng dụng vi khuẩn lactic để chữa bệnh đường ruột
Thực ra việc ứng dụng này đã được Việt Nam ứng dụng từ lâu. Khi người ta bị tiêu chảy, thầy thuốc khuyên hàng

ngày uống 1 - 2 chén nước dưa chua. Phương pháp này tỏ ra rất hiệu nghiệm trong điều kiện ngành dược chưa phát triển.
Dựa vào hiệu quả sử dụng vi khuẩn lactic trong việc chữa trị tiêu chảy, Pháp đã sản xuất và đưa ra thị trường từ hàng
chục năm nay một sản phẩm mang tên là Biolactyl. Sản phẩm này chuyên trị tiêu chảy bằng nhiều vi khuẩn lactic.
-

ứng dụng acid lactic theo phương pháp chữa vi lượng đồng cân (homeopathy)
Trong q trình vận động của cơ thể, mơ cơ hoạt động mạnh và trong một thời

gian dài sẽ gây hiện tượng mệt mỏi. Hiện tượng mệt mỏi này xuất hiện do các phản ứng sinh hóa xảy ra trong mơ cơ, tạo
acid lactic.
Các thầy thuốc đã tạo ra một vị thuốc bao gồm acid lactic kết hợp với cây kim sa có khả năng giúp cơ thể khơng cịn
mệt mỏi và có khả năng làm việc và hoạt động liên tục trong thời gian dài.
-

ứng dụng acid lactic trong phẫu thuật chỉnh hình
Trong phẫu thuật chỉnh hình, người ta thường sử dụng loại vật liệu có tên là purasorb. Purasorb là một hợp chất cao

phân tử được sản xuất từ acid lactic. Thành phần của purasorb bao gồm: lactides, glycolide, polylactides, polyglycolide,
lactide/glycolide copolyme. Purasorb được sử dụng như những định ghim, gắn phần xưong lại với nhau; khi xưong định
hình, purasorb sẽ tự tiêu hủy [9]. Một loại thanh dẫn có thể mang 20 lớp thuốc khác nhau vừa được các chuyên gia
Singapore sáng chế. Đây là loại thanh dẫn tự tiêu đầu tiên trên thế giới giúp người bệnh tim mau chóng bình phục đồng thời
giảm thiểu nguy co nhiễm trùng và phát bệnh trở lại. Các nhà phát minh thuộc Đại học Công nghệ Nanyang cho rằng, với
loại thanh dẫn này, bác sĩ có thể kết hợp nhiều loại thuốc phù hợp với từng loại bệnh trạng của từng người để tăng hiệu quả
điều trị. Khi được đưa vào co thể, thanh dẫn sẽ nhả thuốc vào từng thời điểm khác nhau kéo dài trong nhiều tháng. Khi hết
thuốc nó sẽ tự hủy hồn tồn. Thanh dẫn được chế tạo bằng PLA và PLGA, khi vào co thể sẽ chuyển hóa thành acid lactic

và có thể hấp thụ vào máu. Không chỉ được sử dụng trong động mạch vành tim, loại thanh dẫn tự hủy này có thể được cấy


trong não, phơi, đường niệu hoặc bất kì co quan nào bị nghẽn mạch máu. Được biết, các loại thanh dẫn hiện nay đều làm
bằng kim loại và chỉ mang được một loại thuốc duy nhất, có thể gây tụ huyết khối và làm mạch máu tắc nghẽn trở lại [26].
-

ứng dụng acid lactic trong nha khoa [9], [22]
Trong nha khoa có hai chế phẩm được sử dụng nhiều đó là Puramex và puracal. Puramex bao gồm các thành phần

sau: amulinium lactat, Fe-lactat (được sử dụng để điều trị thiếu máu), Mg-lactat, Mn-lactat, Zn-lactat cịn puracal chỉ có
lactat canxi. Các chế phẩm này thường làm răng khỏe hon.
-

ứng dụng để sản xuất vật liệu sinh học (Biomaterials)
Các nhà khoa học đang nghiên cứu tạo ra những vật liệu sinh học dùng trong y học bằng các copolyme của acid

lactic. Các copolyme này có tính năng rất giống những bộ khung xưong động vật. Hướng này đang được nghiên cứu và
người ta hy vọng trong tưong lai nó sẽ được ứng dụng nhiều.
-

ứng dụng trong sản xuất các loại sữa và bột giàu canxi
Người ta thường bổ sung lactat canxi vào thành phần sữa bột dinh dưỡng, bánh ngọt, bánh nướng để tăng lượng

canxi cho co thể [9]. Thiếu calci lại ảnh hưởng đến hoạt động của cơ tim, tới sự tạo huyết và đơng máu, là ngun nhân của
bệnh cịi xương ở trẻ em và giòn xương xốp xương ở người già [27].

.5.3.

Trong mơi trường

Các phịng thí nghiệm đang nghiên cứu loại chất dẻo mới thay thế cho chất dẻo củ khó phân hủy. Chất dẻo mới này

là một loại polyme được gọi là poly acid lactic (PLA). Đó là sản phẩm tạo ra từ phản ứng trùng hợp acid lactic. Người ta hy
vọng trong tương lai nó sẽ thay thế chất dẻo được sản xuất từ dầu mỏ vì tính chất dễ phân hủy của nó có ý nghĩa rất lớn
trong bảo vệ môi trường [9].

.5.4.

Trong mỹ phẩm [9] [22]
Các loại lactat kim loại (chẳng hạng như lactat natri) được sử dụng trong thành phần của một số mỹ phẩm chăm sóc

da như punosal và của hãng mỹ phẩm Punac. Mỹ phẩm này có tác dụng chống lại các vi sinh vật có trên bề mặt da, làm ẩm
và làm sáng da [9].
2.6.

.6.1.

Sản xuất acid lactic

Mật rỉ đường [1], [8], [12]
Là phế liệu chứa nhiều đường không kết tinh trong sản xuất đường từ mía hoặc củ cải đường. Thơng thường tỉ lệ rỉ

đường trong sản xuất đường mía chiếm khoảng 3 - 5 % trọng lượng mía. Tùy thuộc vào giống mía, điều kiện trồng trọt,
cơng nghệ sản xuất đường.v.v.
Thành phần rỉ đường dao động như sau: Nước chiếm 15 - 20 %; chất khô chiếm 80 - 85 %. Trong chất khơ có 60 %
là đường (40 % là đường saccharose và 20 % là ữuctose và glucose) và 40 % chất khơ cịn lại là chất không phải là đường

(phi đường). Trong thành phần phi đường có khoảng 30 - 32 % hợp chất hữu cơ và 6 - 10 % hợp chất vô cơ. Trong hợp chất

vơ cơ, theo Mắc-Dinit, gồm có K20: 3,5 %; Fe203: 0,2 %; MgO: 0,1 %; sulíat: 1,6 %; CaO: 1,5 %; Si0 2: 0,5 %; p205: 0,5 %;

Clorit: 0,4 %.
Trong những hợp chất hữu cơ gồm có hợp chất có chứa nitơ và khơng chứa nitơ ở dạng amin như: acid aspactic, acid
glutamic, leuxin, isoleuxin [2].


Ngồi ra trong rỉ đường có một số vitamin (tính theo |j/g mật rỉ đường ) như sau:


Bảng 2.5 Thành phần vitamin trong rỉ đường
Các vitamin

Số lượng (pg/g)

Thiamin

8,3

Riblavin
Acid nicotinic

2,5
21,0

Acid folic

0,038

Pyridoxin
Biotin

6,5

Acid pantotenic

21,4

12,0

2.6.2. Qui trình sản xuất acid lactic [14Ị
Mật rỉ
1r
Xử lý

Vi khuẩn

CaC03

H2SO4

1r
Lên men

Trung hịa

1 can xi
Lactat
1r
Lọc

Dung dịch

acid lactic

Cơ đặc



PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.1.
3.1.1.

Thịi gian và địa điểm thực hiện đề tài
Thòi gian

Thời gian tiến hành từ ngày 14/04/2005 đến ngày 15/09/2005
3.1.2.

Địa điểm
Thí nghiệm được tiến hành tại phịng thí nghiệm vi sinh, khoa Chăn ni Thú y và Trung

tâm phân tích Hóa Sinh trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM.
3.2.
3.2.1.

Vật liệu
Đối tượng nghiên cứu

Vi khuẩn có khả năng tạo acid lactic
3.2.2.

Vật liệu nghiên cứu

-

Chế phẩm Biolactyl của Pháp

-

Chế phẩm Antibio của Hàn Quốc

-

Đại mạch của trường Cao đẳng Công nghiệp Thực Phẩm Tp. HCM

3.2.3.

Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
- Thiết bị: tủ cấy vơ trùng, tủ ấm, tủ sấy, kính hiển vi, cân điện tử, máy đo pH, máy li

tâm, máy đo OD, nồi hấp áp suất, tủ lạnh, máy cất nước và bếp điện.
- Dụng cụ: ống eppendorf, erlen, cốc, bình định mức, ống đong, đĩa petri, ống nghiệm,
buret, phễu chiết, pipet và pipetman.
3.2.4.

Môi trường nuôi cấy

-

Môi trường MRS broth (de Man, Rogosa and Sharpe broth) [36]

-

Môi trường MRS agar (de Man, Rogosa and Sharpe agar)

-

Môi trường YGC agar (Yeast extract Glucose Calcium carbonat) [37]

-

Môi trường thử khả năng lên men đường [11]

-

Môi trường thạch nitrate bán lỏng

-

Môi trường thử khả năng phân giải gelatin

-

Môi trường thạch bán lỏng di động

-

Môi trường thử khả năng sinh indol
Thành phần và tỉ lệ môi trường ni cấy được trình bày ở mục 1 phần phụ lục.

3.2.5.

Thuổc nhuộm và thuốc thử

-

Dung dịch thuốc nhuộm Bromocresol Purple 0,2% [11]

-

Thuốc nhuộm Gram [11]

-

Thuốc thử uphenmen [11]

-

Thuốc thử DNS [10]


-

Thuốc thử và hóa chất dùng chuẩn độ
Thành phần và tỉ lệ của thuốc nhuộm và thuốc thử được trình bày ở mục 2 phần phụ lục.
3.3.

3.3.1.

Phân lập và sơ chọn giống

3.3.1.1.

-

Phương pháp thí nghiệm
Quan sát đại thể

Mơi trường MRS agar và YGC agar
+ Nguyên tắc: dựa vào đặc tính sinh acid của các khuẩn lạc. Giống phân lập trên môi

trường YGC agar, CaC03 sẽ bị tan khi tác dụng với acid tạo nên vòng trong suốt quanh khuẩn
lạc.
+ Thực hiện
* Pha lỗng mẫu trong nước cất vơ trùng với các độ pha loãng khác nhau.
* Trãi đều 0,1 ml mẫu ở các nồng độ pha lỗng lên mơi trường MRS agar. Nuôi cấy ở
nhiệt độ 37° c và theo dõi sự phát triển khuẩn lạc sau 48 giờ.
* Chọn những khuẩn lạc mọc riêng lẻ, cấy ria trên môi trường YGC agar. Nuôi cấy ở
nhiệt độ 37°

c. Sau 48 giờ, chọn các khuẩn lạc sinh acid nhờ vào vòng trong suốt xuất hiện

quanh khuẩn lạc. Vòng trong suốt càng lớn chứng tỏ lượng acid sinh ra càng nhiều.
-

Môi trường MRS broth
Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trường MRS dịch thể. Nuôi cấy tĩnh ở

nhiệt độ 37° c. Ghi nhận các đặc điểm sinh trưởng trong 24 giờ.
3.3.I.2.

Quan sát vi thể

Hình thái: Nhuộm Gram để quan sát hình thái tế bào ở vật kính xioo [5] (Xem ở mục 3.2
phần phụ lục).
3.3.2.
-

Chọn giống có khả năng sinh acid lactic [6], [11], [31]
Thực hiện
+ Cấy vi khuẩn đã phân lập được vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trường MRS dịch thể.

Nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ 37° c trong 24 giờ.
+ Li tâm thu dịch trong.
+ Lấy 5 ml dịch cho vào ống nghiệm, thêm 3 ml thuốc thử uphenmen. Quan sát sự đổi
màu.
Tiến hành đồng thời 2 ống đối chứng:
+ Ống 1: 5 ml môi truờng MRS (không nuôi vi khuẩn) thêm 3 ml thuốc thử uphenmen.
+ Ống 2: 5 ml acid lactic tinh khiết, thêm 3 ml thuốc thử uphenmen.


3.3.3.

Phương pháp xác định hàm lượng acid tổng [11]
- Nguyên tắc: Hàm lượng acid trong dịch lên men có thể định lượng được bằng dung

dịch kiềm chuẩn nhờ có sự đổi màu của dung dịch thuốc thử phenolphtalein.
- Thực hiện: ( xem ở mục 3.1 phần phụ lục)
3.3.4.

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo acid tổng và đặc điểm sinh hóa

3.3.4.I.

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo acid tổng

- Ảnh hưởng pH
Điều chỉnh pH môi trường bằng CH3COOH và NaOH sao cho pH ban đầu là : 4, 5, 6, 7
(pH sau khi khử trùng ). Lấy 10 % giống cho vào 10 ml mơi trường (gồm có 10 % mật rỉ và

0,5 % cao nấm men). Nuôi cấy ở 37° c. Sau 24 giờ, xác định lượng acid tổng tích lũy được
trong dịch nuôi cấy tương ứng với các độ pH khác nhau. Chọn pH thích hợp cho sự tích lũy
acid của các khuẩn lạc.
- Ảnh hưởng nhiệt độ
Sau khi chọn được pH thích hợp cho các khuẩn lạc, khảo sát ở nhiệt độ phòng, 37° c, 45°

c, 50° c. Lấy 10 % giống cho vào 10 ml mơi trường (gồm có 10 % mật rỉ và 0,5 % nấm men).
Sau 24 giờ, xác định lượng acid tổng tích lũy được trong dich nuôi cấy tương ứng.
- Ảnh hưởng tỉ lệ mật rỉ
Chọn được pH, nhiệt độ thích hợp cho các khuẩn lạc. Khảo sát tỉ lệ mật rỉ: 5 %, 10 %, 15
%, 20 %. Lấy 10 % giống cho vào 10 ml mơi trường (gồm có tỉ lệ mật rỉ như trên và 0,5 %
nấm men). Sau 24 giờ, xác định lượng acid tổng tích lũy được trong dịch ni cấy tương ứng.
- Ảnh hưởng tỉ lệ giống
Chọn được pH, nhiệt độ, tỉ lệ mật rỉ. Khảo sát tỉ lệ giống: 5%, 10 %, 15 %, 20 %. Lấy tỉ
lệ giống như trên cho vào 10 ml mơi trường (gồm có tỉ lệ mật ri đã chọn và 0,5 % nấm men).
Sau 24 giờ, xác định lượng acid tổng tích lũy được trong dịch nuôi cấy tương ứng.
- Ảnh hưởng thời gian
Chọn được pH, nhiệt độ, tỉ lệ mật rỉ, tỉ lệ giống. Lấy tỉ lệ giống đã chọn cho vào 10 ml
mơi trường (gồm có mật rỉ đã chọn và 0,5 % nấm men). Đem khảo sát ở các thời điểm 12 giờ,
24 giờ, 36 giờ, 48 giờ. Xác định lượng acid tổng tích lũy được trong dịch ni cấy tương ứng.
3.3.4.2.

Đặc điểm sinh hóa

-

Thử phản ứng catalase

-

Kiểm tra khả năng sinh indol

-

Xem khả năng di động

-

Khả năng khử nitrate

-

Khả năng phân giải gelatin


-

Khả năng đơng vón sữa

-

Khả năng lên men nguồn carbohydrate
Cách tiến hành các phản ứng sinh hóa (xem mục 3.5 phần phụ lục)

3.3.5.
-

So sánh về sự tạo acid tổng của các khuẩn lạc: A, B, D
Môi trường cấp 1
Với các điều kiện đã khảo sát như pH, nhiệt độ tối ưu cho từng khuẩn lạc. Cho 10 %

giống vào 10 ml môi trường MRS (môi trường cấp 1) đem ủ ở các điều kiện thích hợp của
chúng, trong 24 giờ.
-

Mơi trường cấp 2
Cho 10 % giống từ môi trường cấp 1 vào 50 ml môi trường gồm 5 ml mật ri và 45 ml

MRS (gọi là môi trường cấp 2). Đem ủ ở các điều kiện thích hợp của chúng trong 24 giờ.
-

Môi trường sản xuất
Cho 10 % giống từ môi trường cấp 2 vào 50 ml môi trường gồm 45 ml mật rỉ và 5 ml

MRS (môi trường sản xuất). Đem ủ các điều kiện thích hợp của chúng, trong 24 giờ.
3.3.6.

Sản xuất acid lactic từ mật rỉ

3.3.6.I.

Định lượng đường khử [10]

+ Nguyên tắc: Có một vài tác nhân được sử dụng để định lượng đường nhờ các đặc tính
khử của đường. 3,5 - dinitrosalicylic acid (DNS) có màu vàng trong dung dịch kiềm sẽ bị khử
thành acid 3 - amino - 5 - nitrosalicylic có màu đỏ cam.
+ Thực hiện: (xem mục 3.3 phần phụ lục)
3.3.Ó.2. Định lượng vi sinh vật [16]
-

Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc
Cách tiến hành: (xem mục 3.4 phần phụ lục)

-

Thiết lập mối tương quan giữa mật độ tế bào và OD 610 nm của dịch huyền phù tế bào.
+ Nguyên tắc của máy đo mật độ quang: vi sinh vật trong mơi trường ni cấy có thể

vừa hấp thu hoặc vừa phân tán ánh sáng làm cho ánh sáng truyền suốt bị giảm. Như vậy, số
lượng ánh sáng được hấp thu hoặc phân tán có quan hệ tỉ lệ thuận với số lượng vi sinh vật
trong dịch nuôi cấy.
+ Tưong quan giữa mật độ tế bào và OD 610 nm : Để hạn chế thao tác đếm số tế bào
mỗi khi lấy mẫu, mật độ tế bào sẽ được suy ra từ độ đục của dịch nuôi cấy bằng cách dựa vào
đồ thị tưong quan giữa mật độ tế bào và độ đục của dịch huyền phù ở các OD khác nhau khi đo
ở bước sóng 610 nm.
+ Thực hiện


* Pha lỗng dịch ni cấy vi khuẩn sau 24 giờ sao cho thu được dịch huyền phù có các
giá trị OD = 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5.
* Đếm số lượng tế bào bằng phưong pháp đếm khuẩn lạc tưong ứng với 5 giá trị OD =
0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5. Suy ra mật độ tế bào trong 1 ml dịch huyền phù.
* Dựng đồ thị tưong quan tuyến tính giữa log mật độ tế bào (trục y) và độ đục của dịch

huyền phù ở các OD khác nhau (trục x).

-

Chuẩn bị môi trường lên men
Trước tiên phải xử lý mật rỉ: Mật rỉ đem pha loãng tỉ lệ 1 : 3, cho

H2SO4

H2SO4

vào với tỉ lệ 3,5 ml

trong 1000 ml mật rỉ. Khuấy liên tục trong lgiờ, sau đó để lắng thu được phần dịch và pha

loãng dung dịch xuống phù hợp với tỉ lệ mật rỉ đã chọn, cho 0,5 % cao nấm men vào (điều
chỉnh pH sau khi khử trùng bằng pH tối ưu của khuẩn lạc đem sản xuất acid lactic).
-

Giai đoạn lên men
+ Chuẩn bị giống để lên men
*

Giống cấp 1
Với các điều kiện đã khảo sát như pH, nhiệt độ tối ưu cho từng khuẩn lạc. Cho 10 %

giống vào 10 ml môi trường MRS (môi trường cấp 1) đem ủ ở các điều kiện thích hợp của
chúng, trong 24 giờ.