Nghiên cứu và chế tạo cảm biến sinh học trên cơ sở công nghệ polyme in phân tử ứng dụng phát hiện một số phân tử nhỏ (protein, kháng nguyên, kháng sinh)

ĐẶT VẤN ĐỀ

Các phân tử nhỏ có thể được định nghĩa là các phân tử hữu cơ có trọng lượng
phân tử thấp có kích thước thường nhỏ hơn 1000 Da. Danh mục này bao gồm nhiều
loại hợp chất hóa học khác nhau, có nguồn gốc tự nhiên hoặc dược phẩm, nhiều hợp
chất trong số đó có liên quan đến sinh học, dược lý hoặc môi trường, điều này làm
cho việc phát hiện và định lượng các phân tử này trở nên quan trọng trong nhiều
lĩnh vực. Đương nhiên, gần như mọi tế bào đều chứa tập hợp từ 100 đến 200 phân
tử hữu cơ có trọng lượng phân tử thấp khác nhau, bao gồm các axit amin phổ biến,
nucleotide, đường và các dẫn xuất phosphoryl hóa của chúng. Mặt khác, các phân
tử tổng hợp nhỏ, do con người tạo ra hoặc được sản xuất bằng sinh học tổng hợp, đã
được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực bao gồm phân tích dược phẩm, lâm
sàng, mơi trường hoặc thực phẩm. Nhiều phân tử nhỏ là chất gây ô nhiễm nổi tiếng
trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và các sản phẩm nông nghiệp khác.
Thông thường, nhiều phân tử nhỏ được phát hiện bằng phương pháp sắc ký cung
cấp độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Tuy nhiên, do chi phí cao, thiết bị đo đạc cồng kềnh
và yêu cầu chuyên môn cao, các phương pháp này không phù hợp cho mọi mục
đích. Ngược lại, cảm biến sinh học có thể cung cấp một giải pháp thay thế rẻ hơn và
nhanh hơn. Vô số cảm biến sinh học và xét nghiệm phân tích sinh học khác nhau đã
được cơng bố cho nhiều nhóm chất phân tích phân tử nhỏ khác nhau, từ xét nghiệm
hấp thụ miễn dịch liên kết với enzym (ELISA) truyền thống và xét nghiệm dòng
chảy bên đến vi mạch và huỳnh quang hoặc cảm biến điện hóa. Một số ưu điểm của
cảm biến sinh học so với các phương pháp cổ điển để phát hiện phân tử nhỏ bao
gồm theo dõi thời gian thực, độ đặc hiệu cao, thời gian phản hồi nhanh, giảm tiêu
thụ dung môi hữu cơ và thao tác lấy mẫu, tính di động, nhỏ gọn và dễ vận hành mà
khơng cần nhân viên có tay nghề.
Việc phát triển các cảm biến sinh học để phát hiện phân tử nhỏ thể hiện những
thách thức cụ thể mà có thể khơng phải là vấn đề với các chất phân tích lớn hơn.
Thứ nhất, các phân tử nhỏ là mục tiêu thách thức đối với nhiều yếu tố nhận dạng,
đặc biệt là đối với các kháng thể vì chỉ riêng các phân tử nhỏ khơng thể kích thích
hệ thống miễn dịch chịu trách nhiệm sản xuất kháng thể. Do đó, các kháng thể đặc

hiệu với phân tử nhỏ thường được chọn bằng cách sử dụng phân tử nhỏ này được
liên hợp với phân tử mang lớn hơn, điều này đôi khi tạo ra các kháng thể đặc hiệu
cho liên hợp hơn là cho các phân tử nhỏ tự do. Do kích thước nhỏ của chúng, các
đoạn kháng thể tái tổ hợp có thể góp phần làm giảm liên kết không đặc hiệu và cản
trở Steric thấp hơn so với kháng thể nguyên vẹn. Tuy nhiên, kháng thể tái tổ hợp
hiếm khi thể hiện ái lực tốt hơn hoặc thậm chí tương tự so với kháng thể thơng
thường, điều này hạn chế việc sử dụng chúng để phát hiện các phân tử nhỏ có nồng
độ thấp và do đó yêu cầu các yếu tố nhận biết phải có ái lực cao.
1


Công nghệ polyme in phân tử (MIP) cho phép thiết kế và chế tạo các đầu thu sinh
học nhân tạo có tính chọn lọc và độ đặc hiệu được xác định trước, ứng dụng trong các
lĩnh vực phân tách, phân tích, xúc tác hay cảm biến sinh hóa. MIP thường sử dụng ma
trận polyme kết hợp giữa chất cần phân tích và các gốc monome (monomer). Sau khi
loại bỏ các chất phân tích (được gọi là khn mẫu) màng polyme sẽ xuất hiện các
khuôn nhận dạng phân tử rất mạnh. Tại một số vị trí của khn có đính các liên kết có
tính chọn lọc tương tự như đầu thu sinh học tự nhiên như kháng nguyên, kháng thể
hoặc enzyme. Độ chọn lọc của MIP khá cao do dựa vào các yếu tố hình dạng, kích
thước và các nhóm chức hóa học của chất phân tích. Chính vì vậy, MIP khơng chỉ nhận
diện các chất sinh học mà cịn đặc biệt hữu ích với các chất hóa học. Ưu điểm của đầu
thu sinh học nhân tạo MIP có độ bền và ổn định cao hơn so với các đầu thu sinh học tự
nhiên trong các môi trường khắc nghiệt như độ pH quá cao hoặc quá thấp, áp suất cao
hay nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp. MIP có thể sử dụng được trong nhiều tháng mà
khơng có tổn thất về hiệu quả sử dụng cũng như yêu cầu bảo quản đơn giản hơn so với
chất sinh học tự nhiên. Do những đặc tính này, MIP đã thu hút sự chú ý ngày càng tăng
của các nhà nghiên cứu thông qua số lượng các bài báo tăng hàng năm. MIP được xem
như lựa chọn thay thế đầy hứa hẹn cho các đối tác sinh học của chúng để phát triển các
hướng mới trong các lĩnh vực nghiên cứu đa ngành như sắc ký, công nghệ sinh học,
khoa học môi trường, an toàn thực phẩm và đặc biệt trong cảm biến sinh học. Tuy

nhiên, việc ứng dụng MIP trong cảm biến sinh học vẫn còn tồn tại một số hạn chế cần
khắc phục trước khi đưa ra sản phẩm thương mại. Trước hết, tính khơng đồng nhất của
các vị trí liên kết có thể gây ra tương tác khơng đặc hiệu và do đó làm giảm chất lượng
của tín hiệu. Để khắc phục vấn đề này, một số nghiên cứu đã sử dụng phương pháp tổ
hợp và tính tốn để lựa chọn tỷ lệ monome và phân tử chất phân tích. Thứ hai, tính chất
ngẫu nhiên của q trình polyme hóa cũng có thể ảnh hưởng đến tính đồng nhất trong
việc phân bố các khuôn in trong mạng polyme, gây ra sự biến thiên không mong muốn
trong khuếch tán. Để khắc phục nhược điểm này, một số phương pháp đã được áp dụng
để cải thiện MIP như chuyển đổi chuỗi phân mảnh bổ sung đảo ngược (Reversible
addition-fragmentation chain transfer), phản ứng trùng hợp chuyển hóa gốc nguyên tử
(atom transfer radical polymeisation), khởi tạo lắng đọng hơi hóa học (Initiated
chemical vapour deposition) và gắn hóa học (click-chemistry). Ngồi ra, một số
phương pháp mới cũng đã được phát triển như cấu trúc lõi-vỏ, vật liệu composit lai
giữa hữu cơ và vô cơ, kỹ thuật màng mỏng và quang khắc “mềm” (softphotolithography) để tạo khn. Để tăng cường tín hiệu của cảm biến và mở rộng
phạm vi ứng dụng, một số hình mẫu của cảm biến ứng dụng MIP đã được phát triển
bao gồm đơn chất phân tích trên nhiều đế, đa chất phân tích trên mảng đế đơn, chíp vi
dịng và các hệ thống lab - on - valve. Tuy nhiên, cảm biến MIP vẫn cần các giải pháp
thỏa đáng về cách thức chúng có thể được sản xuất và tích hợp một cách kinh tế vào
các thiết bị hiện tại. Do đó, nghiên cứu trong luận án tập trung vào việc khắc phục hạn
chế của công nghệ MIP ứng dụng trong cảm biến sinh học điện hóa phổ tổng trở EIS
phát hiện các phân tử nhỏ với chiến lược sử dụng điện cực phủ hạt nano vàng.

2


Các phân tử nhỏ được lựa chọn nghiên cứu bao gồm protein (sarcosine, 17βestradiol), kháng nguyên Enrofloxacin và kháng sinh (Chloramphenicol,
Ciproflocaxin, Norfloxacin). Đây là các chỉ dấu phân tử nhỏ đánh giá mức độ chẩn
đoán bệnh, chẩn đoán việc sử dụng hc mơn tăng trưởng và kháng sinh trong thực
phẩm.
Sarcosine hay còn gọi là N-methyl glysine là chất được sinh ra trong q trình

chuyển hóa và phân giải Glysine. Năm 2009, Sreekumar và nhóm đã cơng bố kết
quả nghiên cứu được cơng nhận rộng rãi về vai trị tiềm năng của sarcosine để phát
hiện và chẩn đoán ung thư tiền liệt tuyến [129]. Nhóm nghiên cứu đã thực hiện các
thực nghiệm kiểm tra so sánh khả năng chẩn đốn chính xác giữa Sarcosine và PSA
với các bệnh nhân có chỉ số PSA trong dải xám (4 -10 ng/mL). Kết quả thu được
cho thấy Sarcosine có chỉ số AUC cao hơn so với PSA. Cho nên đây là một chỉ dấu
sinh học tiềm năng cho việc chẩn đoán ung thư tiền liệt tuyến.
17β-estradiol, khi được tiêu thụ sẽ trải qua quá trình trao đổi chất, một số tích tụ
trong các mơ có ái lực và một số khác sẽ bị đào thải ra khỏi cơ thể theo đường nước
tiểu. Các hợp chất bài tiết đó được phát hiện trong nước thải ở nồng độ thấp, từ vài
ng/ L đến μg/ L. Điều đáng chú ý là một số nghiên cứu đã được thực hiện cho thấy
các tác dụng phụ liên quan đến các chất gây rối loạn nội tiết trong nước thải, bao
gồm q trình nữ hóa cá đực, giảm số lượng tinh trùng, chậm rối loạn chức năng
sinh sản, vitellogenin và giảm sự nở trứng ở cá [137], [141], [142]. Ở người,
estradiol có thể gây ung thư vú và tinh hoàn, thay đổi nội tiết tố, giảm khả năng sinh
sản của nam giới và các vấn đề sức khỏe khác [136].
Tại Việt Nam thì một lượng lớn dược phẩm được sử dụng trên động vật bao gồm kháng
sinh, vitamin và các thuốc diệt ký sinh trùng. Trong đó, kháng sinh chiếm tới 70%.
Chăn nuôi lợn và gia cầm thường được bổ sung kháng sinh như Tetracycline và Tylosin
cịn trong ni trồng thủy sản là các kháng sinh nhóm Quinolones và Sulfonamides.Có
khoảng 700g kháng sinh được sử dụng trên mỗi tấn cá trong nuôi trồng thủy sản ở Việt
Nam, cao gấp 7 lần so với các quốc gia khác (Báo cáo từ Cục Quản lý Thực phẩm, Hà
Lan, 2009, mã VWA/BuR/2009/13186). Theo báo cáo của Bộ Nơng nghiệp, tình hình
sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi chưa hợp lý. Việc lựa chọn kháng sinh cũng như
liều dùng dựa chủ yếu trên kinh nghiệm (chiếm 44%), 33% theo hướng dẫn của bác sĩ
thú y và 17% theo nhà sản xuất. Nhiều chủ hộ chăn nuôi không tuân thủ quy chế về
việc ngừng sử dụng kháng sinh trước khi thu hoạch sản phẩm từ động vật. Trong 4
tháng năm 2014, có tổng cộng 11 lô tôm Việt Nam bị 2 thị trường lớn là EU và Nhật
Bản phát hiện dư lượng Oxytetraxycline. Trong đó, số lơ tơm bị cảnh báo ở Nhật là 6
cịn ở EU là 5 (số lơ tơm bị phát hiện dư lượng kháng sinh Oxytetraxycline ở EU chỉ là

2 trong cả năm 2013). Các lô tôm bị cảnh báo có dư lượng thấp nhất là 0,3 ppm và cao
nhất là 2,1 ppm (mức giới hạn cho phép đói với kháng sinh này ở EU là 0,1 ppm, ở
Nhật là 0,2 ppm). Nhật Bản là thị trường xuất khẩu thủy sản lớn của Việt Nam, luôn
chiếm tỷ trọng 17 - 23% tổng giá trị kim ngạch xuất khẩu cả nước trong 10 năm qua.
Năm 2015, xuất khẩu thủy sản sang Nhật đạt 1,043 tỷ USD, đứng thứ ba sau Hoa Kỳ
và EU. Tuy nhiên, mặt hàng tôm (loại thủy
3


sản hay dùng kháng sinh Enrofloxacin) đã giảm 22,8% so với năm 2014 với giá trị
kinh ngạch đạt 574 triệu USD. Nhật quy định mức MRL cho tổng dư lượng
Enrofloxacin và Ciprofloxacin - dẫn xuất của Enrofloxacin - trong sản phẩm thủy
sản là 0,01 mg/kg. Trong khi đó, EU - thị trường nổi tiếng về các tiêu chuẩn an toàn
thực phẩm cũng chỉ quy định ở mức 0,1 mg/kg, thấp hơn 10 lần quy định của Nhật
Bản. Do vậy, nhu cầu về loại thiết bị cho phép phát hiện định lượng và nhanh tồn dư
kháng sinh trong thực phẩm là vơ cùng cần thiết.
Mục đích nghiên cứu:
1. Nghiên cứu phát triển công nghệ polyme in phân tử (MIP) chế tạo đầu
thu sinh học nhân tạo trên điện cực mực in các bon phủ hạt nano vàng ứng
dụng trong cảm biến sinh học phát hiện định lượng phân tử nhỏ.
2. Nghiên cứu chế tạo cảm biến sinh học phổ tổng trở điện hóa (EIS) sử
dụng đầu thu sinh học nhân tạo MIP phát hiện protein (sarcosine và 17βestradiol), kháng nguyên Enrofloxacin và kháng sinh trong nước hồ nuôi
thủy sản và trong dược phẩm.
3. Phát triển công nghệ vi lưu ly tâm, chế tạo chíp CMF gắn vi mẫu linh
kiện vi cân tinh thể thạch anh QCM hướng tới tự động hóa quy trình chế tạo
cũng như quá trình đo đạc của cảm biến sử dụng đầu thu MIP.
Phương pháp nghiên cứu:
Phương pháp nghiên cứu của luận án là nghiên cứu thực nghiệm. Cách tiếp cận
trong quá trình nghiên cứu là từ các kết quả thực nghiệm, kết hợp với lý thuyết và
các tài liệu tham khảo, giải thích, so sánh, đánh giá và tối ưu qui trình thực nghiệm.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài:
Về ý nghĩa khoa học, các kết quả của luận án đã góp phần phát triển công nghệ
polyme in phân tử (MIP) trong chế tạo các đầu thu sinh học nhân tạo ứng dụng
trong cảm biến sinh học phát hiện định lượng và tại chỗ các phân tử nhỏ bao gồm
protein, kháng nguyên và kháng sinh sử dụng điện cực mực in các bon thương mại.
Hơn nữa, luận án cũng đã thiết kế và chế tạo được chíp vi lưu ly tâm ứng dụng gắn
vi mẫu lên điện cực của linh kiện vi cân tinh thể thạch anh (QCM), vừa tiết kiệm
được hoát chất tiêu hao, vừa đảm bảo khả năng gắn kết nhanh, đồng đều từ đó giúp
tăng độ chính xác cũng như độ nhạy của cảm biến sinh học. Bằng cách sử dụng vi
kênh lắp ghép được tạo ra ngay trên bề mặt cảm biến và sử dụng lực ly tâm để gắn
mẫu cho phép loại bỏ được vấn đề bọt khí. Ngoài ra, với thiết kế này, việc tháo, lắp
và vệ sinh vi kênh được dễ dàng, có khả năng tái sử dụng cao. Chíp vi lưu này có
thể dễ dàng áp dụng ngay trên các máy ly tâm sẵn có trong các phịng xét nghiệm
mà khơng cần các thiết bị gắn phức tạp với nhiều đường bơm, kiểm soát được thời
gian và lượng mẫu sử dụng, giúp tiết kiệm nhân cơng và chi phí.
Về ý nghĩa thực tiễn, luận án nghiên cứu phát triển một kỹ thuật chế tạo cảm biến
sinh học sử dụng đầu thu sinh học nhân tạo trên cơ sở điện cực mực in các bon
thương mại cho phép phát hiện các phân tử nhỏ có giá thành thấp, thời gian
4


phân tích ngắn, độ nhạy và độ chọn lọc cao. Cảm biến hoạt động tốt trong môi
trường mẫu thực, cho kết quả tương thích với kết quả đo sử dụng sắc ký lỏng hiệu
năng cao (HPLC) và phổ UV-vis.
Các đóng góp mới của luận án:
Luận án đã đề xuất quy trình cơng nghệ chế tạo đầu thu sinh học nhân
tạo MIP trên nền điện cực mực in các bon được phủ một lớp hạt nano vàng
(AuNPs) phân tán trên bề mặt nhằm khắc phục tính khơng đồng nhất của các vị
trí liên kết có thể gây ra tương tác khơng đặc hiệu và do đó làm giảm chất lượng
của tín hiệu cảm biến. Lớp AuNPs này sẽ làm tăng diện tích hiệu dụng bề mặt

điện cực dẫn đến làm tăng số lượng các phân tử chất phân tích in được vào
màng polyme. Hơn nữa với lớp AuNPs phân bố đều trên bề mặt trên điện cực
sẽ giúp tạo được một đơn lớp monome định hướng trên điện cực, giúp quá trình
hình thành màng polyme có độ đồng nhất bề mặt cao, mỏng nên dễ dàng tách
các phân tử chất phân tích đã in vào màng trong q trình polyme hóa để hình
thành các khn nhận dạng sinh học đặc hiệu, làm tăng hiệu suất chế tạo đầu
thu sinh học nhân tạo MIP. Trái với công nghệ hiện tại, đầu thu sinh học MIP
thường được tiến hành trên các điện cực kim loại, cấu trúc MIP được tạo ra
thường có dạng đa lớp của đa phân tử phức hợp, gây cản trở q trình tách phân
tử chất phân tích ra khỏi mạng polyme, do đó làm giảm hiệu suất tạo đầu thu
sinh học nhân tạo MIP.
Luận án cũng đã đề xuất một kỹ thuật mới nhằm tổng hợp màng polyme
MIP trên các chuỗi mầm poly(aminothiophenol) ngắn được tổng hợp sẵn trên
điện cực AuNPs-SPCE. Kỹ thuật này sẽ giúp cảm biến sẽ làm cho các đầu thu
MIP ở vị trí thuận lợi cho các phân tử chất in dễ dàng tái liên kết với chúng. Từ
đó giúp cải thiện độ nhạy của cảm biến.
Do màng polyme MIP có độ dẫn thấp nên thơng thường tín hiệu điện
của cảm biến sẽ khơng cao dẫn tới độ nhạy của cảm biến thấp (tín hiệu cảm
biến trên nồng độ chất phân tích). Luận án đã đề xuất các kỹ thuật nhúng hạt
AuNPs vào
mạng polyme MIP ngay trong quá trình polyme tạo MIP bằng cách:
(i)
Sử dụng hạt keo vàng kích thước 10 nm, được gắn các monome
p-ATP. Lượng thích hợp tổ hợp hạt AuNP-gắn monome sẽ được trộn vào
dung dịch polyme. Do đó, trong q trình polyme, hạt nano vàng sẽ được
nhúng vào mạng của polyme MIP.
(ii)
Trộn một lượng hợp chất hóa học HAuCl4 vào dung dịch polyme
và quét
thế tạo màng polyme MIP đi qua điện áp khử Au ra khỏi hợp chất của nó

và được nhúng ngay vào mạng polyme MIP.
Hạt nano Au được đưa vào trong màng polyme có tác dụng cải thiện độ dẫn của
màng polyme cũng như làm tăng cường quá trình vận chuyển điện tử trong mạng
polyme do hình thành sự phân bố ba chiều của AuNPs trong ma trận MIP.
- Luận án cũng đã đề xuất được phương pháp gắn vi mẫu lên điện cực cảm biến
bằng cách sử dụng chíp vi lưu kết hợp quay ly tâm cho phép thao tác dễ dàng, kiểm
soát được thời gian và lượng mẫu sử dụng, giúp tiết kiệm nhân công và chi phí.
5


Bố cục của luận án:
Luận án được trình bày gồm 05 chương không kể phần mục lục, danh mục các
tài liệu tham khảo và phụ lục.
Chương 1: Tổng quan tài liệu
Chương 2: Thực nghiệm và các phương pháp nghiên cứu
Chương 3: Cảm biến MIP/EIS phát hiện protein phân tử nhỏ Sarcosine và
17b-estradiol
Chương 4: Cảm biến MIP/EIS phát hiện kháng nguyên Enrofloxacin
Chương 5: Cảm biến MIP/EIS phát hiện kháng sinh trong nước hồ nuôi thủy
sản và dược phẩm

6


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Cảm biến sinh học điện hóa
Cảm biến sinh học điện hóa là cảm biến hoạt động dựa trên nguyên tắc chuyển
đổi tín hiệu do tương tác sinh học thành tín hiệu điện của hệ điện hóa (tín hiệu dịng,
tín hiệu điện áp, tín hiệu độ dẫn vàtín hiệu tổng trở) [1]-[9]. Đầu thu sinh học sử

dụng trong cảm biến sinh học điện hóa rất đa dạng bao gồm kháng thể, enzyme,
DNA, tế bào hoặc các vi sinh vật. Cảm biến loại này có ưu điểm như thời gian đáp
ứng nhanh, độ nhạy và độ chọn lọc cao và được ứng dụng trong các phép phân tích
y sinh trong y tế, trong cơng nghệ sinh học thực phẩm hoặc kiểm sốt các thơng số
mơi trường [10]-[12].
1.1.1. Điện cực điện hóa

Cảm biến sinh học điện hóa thông thường dựa trên hệ gồm 3 điện cực (điện cực
làm việc, điện cực so sánh và điện cực đối), vật liệu và yêu cầu đối với mỗi loại
điện cực được trình bày trong bảng 1.1. Điện cực so sánh (RE - reference electrode)
đóng vai trị giữ thế cố định đối với điện cực làm việc. Điện cực đối (CE - counter
electrode) hay còn gọi là điện cực phụ trợ (AE - auxiliary electrode). Điện cực làm
việc (WE - working electrode) đóng vai trị quan trọng nhất trong cảm biến sinh học
điện hóa do mọi q trình tương tác giữa đầu thu sinh học và đối tượng cần phân
tích đều diễn ra trên điện cực này. Vật liệu làm điện cực làm việc rất đa dạng như
vật liệu kim loại (vàng, bạc hoặc platin) hoặc các bon [2], [12]. Điện cực kim loại
được chế tạo bằng công nghệ màng mỏng kết hợp với kỹ thuật quang khắc để tạo
cấu trúc và hình dạng khác nhau. Điện cực kim loại độ dẫn tốt, bền vững trong mơi
trường hóa, cho phép cố định đầu thu sinh học một cách trực tiếp thông qua lực tĩnh
điện. Tuy nhiên, do tính ơxy hóa mạnh của kim loại nên có thể phản ứng với chất
tạp nhiễu và làm giảm độ chọn lọc của cảm biến. Điện cực làm việc sử dùng vật liệu
các bon với ưu điểm như giá thành rẻ, dịng phơng nền thấp, tính tương thích sinh
học cao, vùng thế điện hóa mở rộng nên được lựa chọn trong chế tạo cảm biến sinh
học [13], [14].
Bảng 1.1. Điện cực điện hóa trong cảm biến sinh học điện hóa.
Điện cực
Điện cực làm việc
Điện cực đối
Điện cực so sánh

7


Điện cực các bon được sử dụng phổ biến trong các phịng thí nghiệm hiện nay là
GCE (Glassy carbon electrode) (hình 1.1) với ưu điểm là có thể tái sử dụng bằng
cách đánh bóng bề mặt điện cực, tuy nhiên nhược điểm là tiêu hao hóa chất lớn và
yêu cầu xử lý bề mặt điện cực trước khi sử dụng.

Hình 1.1. Điện cực các bon thủy tinh (Glassy carbon electrode - GCE)
và hệ điện hóa ba điện cực sử dụng điện cực làm việc GCE.

Trong những năm gần đây, xu hướng sử dụng điện cực tích hợp các điện cực trên
cùng một đế và được chế tạo trên cơ sở công nghệ in lưới màng dày (screenprinting thick film). Trong công nghệ in lưới, mực in được nén qua một khn mẫu
hay mặt nạ và xử lý nhiệt thích hợp để đảm bảo mực in bám dính tốt với đế. Loại đế
thường được sử dụng trong công nghệ in lưới là đế gốm và đế nhựa. Đế gốm cho
phép áp dụng nhiệt độ xử lý cao và thường được sử dụng cho các loại mực in vàng
hoặc platin. Đế nhựa được sử dụng đối với các loại mực in chứa bạc hoặc các bon
và nhiệt độ xử lý thấp. Ngoài ra cịn có một số loại đế khác như nitroxenlulơ, sợi
thủy tinh. Các loại mực in các bon haykim loại (vàng hoặc platin) thường được sử
dụng để chế tạo điện cực làm việc và điện cực đối, mực in Ag/AgCl được dùng tạo
điện cực so sánh. Công nghệ in lưới có rất nhiều ưu điểm như: giá thành thâp, cho
phép sản xuất hàng loạt, thiết kế linh hoạt, độ lặp lại cao và nguồn nguyên liệu
phong phú.

8


Hình 1.2. Điện cực điện hóa in lưới màng dầy (a) hệ 2 điện cực, (b) hệ 3 điện cực

Điện cực in lưới mực in co câu truc đa dang bao gôm hệ hai điện cực (điện cực

làm việc và điện cực so sánh) hay ba điện cực (điện cực làm việc, điện cực so sánh,
điện cực đối) được tích hợp trên cùng một đế (hình 1.2). Hơn thế nữa, cơng nghệ in
lưới tạo ra điện cực có cấu trúc linh hoạt (cấu trúc đơn kênh hoặc đa kênh) cho phép
xác định đồng thời một hay nhiều đối tượng khác nhau, kích thước nhỏ gọn, cấu
hình phẳng, u cầu một lượng nhỏ mẫu cần phân tích, ghép nối với hệ đo dễ dàng
(hình 1.3). Các điện cực này được dùng trong cảm biến sinh học điện hóa thơng qua
việc xác định các tín hiệu điện hóa như cường độ dịng, điện áp, phổ trở kháng. Trên
hình 1.4, trình bày cấu trúc của điện cực in lưới màng dày của hãng BioDevice
Technology (Nhật Bản) được sử dụng trong nội dung nghiên cứu của luận án.
(d)
(c)
(a)

(b)

Hình 1.3. Điện cực in lưới mực in cácbon của hãng Dropsen (Tây Ban
Nha) (a) 1 điện cực làm việc; (b) 2 điện cực làm việc; (c) 4 điện cực làm
việc; (d) 8 điện cực làm việc.
4 mm

(a)

Tiếp xúc

thiết bị
12,5 mm

Điện so sánh
Ag/AgCl

Hình 1.4. Điện cực in lưới màng dày của hãng BioDevice Technology
(Nhật Bản) (a) điện cực làm việc mực in các bon; (b) điện cực làm việc
mực in vàng.
1.1.2. Cảm biến phổ tổng trở điện hóa

Cảm biến sinh học phổ tổng trở điện hóa dựa trên nguyên tắc nhận biết tương tác
sinh học xảy ra trên bề mặt điện cực làm việc thông qua sự thay đổi trở kháng của
hệ điện hóa. Khi đặt điện áp kích thích dao động biên độ nhỏ xoay chiều hình sin
lên một hệ điện hóa thì trong hệ điện hóa sẽ xuất hiện một dịng điện đáp ứng hình
sin cùng tần số góc ω nhưng lệch pha một góc θ so với điện áp đặt vào [15], [16].
UU 0 ei t


9


II 0 ei (

t )

Tổng trở của hệ lúc này được biểu diễn như sau:
ZU/ IU 0 / I 0 e i | Z | e i

Z(ω) cũng có thể được biểu diễn dưới dạng hàm phức trong đó Z’ là thành phần
thực và Z” là phần ảo:
Z

Z ' jZ "

|Z|2

Trong đó: Z'

| Z | cos

, Z"

Z' 2

| Z | sin

(1.4)

Z" 2

,

(1.5)

arctang(

Kết quả khảo sát phổ tổng trở theo tần số thu được sẽ được biểu diễn trên mặt
phẳng Nyquist

Z '( ) vs. Z "( )

hoặc mặt phẳng

log Z ( ) vs. log( f )

Bode

Z
()

vs. f

hay

. Bằng cách quét tần số liên tục từ cao đến thấp với thế một
chiều đặt trên điện cực làm việc cố định ta thu được phổ tổng trở của cảm biến. Phổ
tổng trở thực nghiệm sẽ được xử lý và mô phỏng bằng một mạch điện tương đương
mà trong đó mỗi phần tử của mạch điện sẽ đại diện cho một tính chất điện của hệ
điện hóa.
Phép đo phổ tổng trở được khảo sát trong dung dịch điện ly có cặp chất ơxy hóakhử được gọi là phổ tổng trở Faradaic (EIS faradaic); trong dung dịch điện ly khơng
có cặp chất ơxy hóa-khử được gọi là phổ tổng trở không Faradaic (EIS nonfaradaic)
[15]. Trong trường hợp khơng sử dụng cặp oxi hóa khử (nonfaradaic), sự thay đổi
giá trị trở kháng của cảm biến được đo trực tiếp ngay trong quá trình tương tác của
chất cần phân tích với vật chất trên bề mặt điện cực. Với phương pháp này, trở
kháng phụ thuộc nhiều vào sự thay đổi hàm lượng, sự bám dính và đặc trưng hình
thái bề mặt của điện cực cảm biến. Trong trường hợp sử dụng cặp chất oxy hóa khử (faradaic), sự thay đổi trở kháng được đo sau khi kết thúc q trình tương tác
của chất cần phân tích với vật chất trên bề mặt điện cực cảm biến. Vì vậy, phương
pháp đo phổ tổng trở faradaic là phương pháp hiệu quả cho phép khảo sát sự thay
đổi trên bề mặt điện cực. Ứng dụng trong cảm biến sinh học, phương pháp này cho
phép phát hiện được sự hình thành tương tác liên kết giữa kháng thể và kháng
nguyên, DNA dị và DNA đích, phản ứng giữa enzyme và cơ chất hoặcq trình tái
liên kết giữa chất phân tích với đầu thu nhân tạo dạng MIP của chúng. Ưu điểm của
phương pháp EIS là không gây phá hủy mẫu, độ chính xác cao và hồn tồn có thể
thực hiện được với mơi trường có độ dẫn kém.
Mơ hình mạch tương đương Randles như trình bày trong hình 1.5 [15], [17], [18]

được áp dụng đối với hệ điện hóa khảo sát trong dung dịch điện ly, mạch điện gồm
3 thành phần: Rs là điện trở của dung dịch điện ly, Rp điện trở phân cực và Cdl là
10


điện dung lớp kép. Trong đó, điện trở dung dịch điện ly (R s) phụ thuộc vào nồng độ
ion, loại ion. Điện dung lớp kép (Cdl) là do các ion trong dung dịch điện ly tích tụ
trên bề mặt điện cực và sinh ra lớp điện tíchphân cực gần sát bề mặt điện cực.
Thành phần của mạch Randles sẽ thay đổi, R p được thay thế bởi Rct và trở kháng
Warburg ZW trong trường hợp dung dịch điện ly có cặp chất ơxy hóa-khử, cặp ion
này phản ứng sẽ sinh ra (hoặc mất đi) điện tử trong dung dịch điện ly. Điện trở
truyền điện tích (Rct) đặc trưng cho quá trình truyền điện tích giữa dung dịch điện ly
và điện cực làm việc, giá trị R ct phụ thuộc vào độ dẫn và hình thái bề mặt điện cực.
Trở kháng Warburg (ZW) đặc trưng cho quá trình khuếch tán của ion đến bề mặt
điện cực, trở kháng này có giá trị rất nhỏ tại vùng tần số cao và giá trị lớn tại vùng
tần số thấp [15], [19]. Hai đại lượng Rs và Z W đặc trưng cho các tính chất của dung
dịch điện phân và sự khuếch tán của cặp chất dò. Trong khi C dl và R CT phụ thuộc
vào tính chất cách điện và dẫn điện tại bề mặt tiếp xúc giữa điện cực và chất điện
phân. Vì vậy, chúng thường được lựa chọn làm tín hiệu phát hiện của cảm biến để
xác định nồng độ các chất cần phân tích. Sự thay đổi về giá trị của C dl khơng nhiều
so với RCT khi có sự thay đổi nhỏ về hình thái bề mặt của điện cực. Do đó, trong
nghiên cứu này chúng tơi sử dụng RCT làm tín hiệu đầu ra của cảm biến.

Hình 1.5. Mơ hình mạch điện tương đương Randles mơ phỏng tính chất điện
của hệ điện hóa trong dung dịch điện ly (a) khơng có cặp chất ơxy hóa - khử,
(b) có cặp chất ơxy hóa - khử.

Điện trở truyền điện tích R CT: Xem xét một hệ điện cực được nhúng vào dung
dịch điện ly. Khi phản ứng xảy ra trên điện cực, các phân tử trên bề mặt điện cực bị
oxi hóa theo phản ứng tổng quát:

Chất khử ↔ Chất oxy hóa + neĐiện trở truyền điện tích đặc trưng cho q trình oxy hóa khử trên có thể được
mơ tả bởi công thức:
RCT RT n 2 nF 2 ARk ct S

1

Trong đó, T: nhiệt độ tuyệt đối
F:
n:

hằng số Faraday

số điện tử liên quan trong các phản ứng điện cực
kct: hằng số tốc độ truyền điện tích (phụ thuộc điện thế)
A: diện tích bề mặt điện cực

11

(1.6)


[S]: nồng độ chất tham gia phản ứng oxy hóa khử
Khi trạng thái cân bằng ổn định xảy ra ở một tín hiệu nhỏ, điện trở này có thể
viết dưới dạng đơn giản hơn:
R

RT
CT

nFI0

Với Io là mật độ dòng truyền điện tích và các thơng số như trên.
Như vậy, điện trở R CT là một thành phần quan trọng của hệ điện cực. Nó thể hiện
độ dẫn của màng sinh học được cố định trên bề mặt điện cực và tốc độ chuyển đổi
tín hiệu của một cảm biến sinh học.
Cảm biến dựa trên phép đo phổ tổng trở được chia làm hai loại là cảm biến kiểu
tụ và cảm biến phổ tổng trở. Cảm biến sinh học kiểu tụ (capacitive biosensor) dựa
trên sự thay đổi điện dung để xác định chất cần phân tích. Các cảm biến kiểu tụ có
cấu trúc điện cực kim loại (vàng, platin) trên đế vật liệu bán dẫn (Si/SiO 2 ) hoặc ơxít
kim loại (Ti/TiO2, Ta/Ta2O5) [15]. Bề mặt điện cực được biến tính bởi màng đơn lớp
tự lắp ghép SAM hoặc vật liệu polyme đóng vai trị như một lớp điện mơi trên bề
mặt và cố định đầu thu sinh học. Điện dung của cảm biến được mô tả gồm 3 tụ điện
mắc nối tiếp nhau bao gồm: tụ điện ở gần sát bề mặt điện cực được tạo bởi lớp điện
môi và điện dung lớp kép, tụ điện do đầu thu sinh học cố định trên bề mặt điện cực
và tụ điện do sự có mặt của đối tượng cần phân tích như trình bày trên hình 1.6
[18]. Giá trị điện dung tổng được biểu diễn qua cơng thức:
1

=

C

Hình 1.6. Mơ hình cấu trúc cảm biến miễn dịch kiểu tụ và mạch điện tương đương

Khi có tương tác giữa đầu thu sinh học và chất cần phân tích trên bề mặt điện
cực, giá trị điện dung của cảm biến sẽ thay đổi [17]. Để tăng độ nhạy của cảm biến
kiểu tụ thì điện dung của lớp điện môi phải đủ lớn để sự thay đổi giá trị điện dung
của cảm biến chỉ phụ thuộc vào điện dung của chất cần phân tích [20]. Bên cạnh
cấu trúc điện cực đơn, cảm biến kiểu tụ còn được phát triển dựa trên điện cực răng
12

lược với đầu thu sinh học được cố định trên bề mặt điện cực và vùng khe hẹp giữa
hai điện cực. Điện dung của cảm biến tụ cấu trúc điện cực răng lược bao gồm giá trị
điện dung tại vùng bề mặt điện cực và điện dung do sự thay đổi hằng số điện môi
tại khe hẹp giữa các điện cực răng lược [22]-[25].
Cảm biến sinh học phổ tổng trở (impedimetric biosensor) dựa trên sự thay đổi trở
kháng phức của cảm biến khi cảm biến được khảo sát trong dung dịch điện ly có
cặp chất ơxy hóa-khử [15]. Hai loại cặp chất ơxy hóa-khử thường được sử dụng là
cặp anion [Fe(CN)6]3-/4- và cặp cation [Ru(NH3)6]2+/3+; các cặp chất này được lựa
chọn dựa trên các thơng số như điện tích, kích thước của các ion [25], [26]. Điện tử
sinh ra từ phản ứng ơxy hóa khử của cặp chất dị di chuyển từ dung dịch điện ly đến
điện cực làm việc (hoặc ngược lại) phụ thuộc vào điện áp phân cực trên điện cực
làm việc. Phổ tổng trở của cảm biến được mơ phỏng bởi mơ hình mạch điện
Randles trong đó giá trị điện trở truyền điện tích R ct được chọn làm tín hiệu của
cảm biến (hình 1.7b). Ngun lý cơ bản của cảm biến phổ tổng trở dựa trên sự cản
trở (hoặc tăng cường) chuyển động của cặp chất ôxy hóa-khử trong dung dịch điện
ly đến và bề mặt điện cực. Khi có sự bắt cặp giữa đầu thu sinh học và đối tượng cần
phân tích sẽ hình thành lớp điện mơi cản trở cặp chất dị đến bề mặt điện cực làm
giá trị điện trở truyền điện tích R ct tăng (hình 1.7a,c). Bên cạnh đó, do các thành
phần sinh học mang điện tích nên sẽ hình thành lớp điện tích trên bề mặt điện cực;
lực tương tác tĩnh điện (lực hút hoặc lực đẩy) sẽ làm tăng cường hoặc suy giảm
dòng các ion trong dung dịch điện ly đến bề mặt điện cực [25]. Cảm biến phổ tổng
trở có độ nhạy cao hơn và khơng u cầu lớp vật liệu điện môi trong cấu trúc điện
cực như cảm biến kiểu tụ. Cảm biến loại này có độ ổn định cao, cảm biến khơng
những cho phép phân tích nồng độ của đối tượng cần phát hiện mà còn cho phép
khảo sát qua từng bước công nghệ chế tạo cảm biến. Cảm biến loại này được ứng
dụng để phát hiện DNA [27], kháng nguyên-kháng thể [28], [29], phát hiện các
phân tử nhỏ [30], [31], phát hiện vi khuẩn [32]…

13


Hình 1.7. Cảm biến miễn dịch phổ tổng trở điện hóa sử dụng chất dị
[Fe(CN)6]3-/4-; (a) đầu thu kháng thể cố định trên điện cực vàng, (b) đầu
thu kháng thể liên kết đặc hiệu với kháng nguyên cản trở quá trình
truyền điện tích đến điện cực, (c) mạch tương đương Randles và (d) phổ
tổng trở biểu diễn trên mặt phẳng Nyquist của cảm biến trước và sau
phản ứng miễn dịch [18].

Ưu điểm của cảm biến phổ tổng trở là có thể phân tích một cách trực tiếp thơng
qua phản ứng đặc hiệu giữa đầu thu sinh học và chất cần phân tích, điều này giúp
cho cảm biến có thể phát hiện các loại đối tượng sinh học đa dạng. Cảm biến phổ
tổng trở có độ nhạy và độ ổn định cao, điện áp đặt trên điện cực nhỏ nên không làm
ảnh hưởng đến hoạt tính của thành phần sinh học như trong cảm biến đo dịng và đo
thế [25].
1.2. Cơng nghệ polyme in phân tử (MIP)
Công nghệ polyme in phân tử (MIP) là một kỹ thuật cho phép chế tạo đầu thu
sinh học nhân tạo. Công nghệ này được nghiên cứu và phát triển với mục đích ban
đầu nhằm thay thế các đầu thu sinh học dựa trên các cơ chế tương tác của enzyme
với cơ chất hay các cơ chế tương tác kháng nguyên-kháng thể trong một số trường
hợp đặc thù. Để phát triển và hồn thiện cơng nghệ MIP, nhiều bí mật về hệ thống
miễn dịch cũng như các phản ứng miễn dịch và các cơ chế tương tác sinh học đã
được các nhà nghiên cứu làm sáng tỏ.
Trong các tương tác sinh học như tương tác giữa các cặp kháng nguyên-kháng
thể hay tương tác giữa enzyme và cơ chất của nó, tính đặc hiệu, độ chọn lọc của các
tương tác này phụ thuộc mạnh không những vào số lượng và độ mạnh yếu của các
liên kết mà còn liên quan chặt chẽ đến cấu trúc ba chiều của các protein. Về bản
chất, kháng thể hay các enzyme là các phân tử protein có kích thước lớn, được tạo
thành từ các chuỗi amino axit mạch dài mà trình tự sắp xếp của chúng được quy

định bởi mã gen. Một số chuỗi protein phức còn chứa thêm các gốc đường, lipid
hoặc các nhóm photphat để đảm nhiệm các chức năng khác nhau trong cơ thể.
Chính vì đặc tính phức tạp về cấu trúc hình dạng này của kháng nguyên kháng thể
và enzyme nên các tương tác của chúng rất đa dạng, khơng trùng lặp, có độ đặc hiệu
và tính chọn lọc cao đối với nhóm chức sinh học cũng như các chất hố học [33].
Chính vì vậy, các tương tác sinh học giữa kháng - nguyên kháng thể hay các
tương tác tương tự đã giúp các nhà khoa học sáng tạo ra nhiều kỹ thuật mới trong
sinh học, hóa học (phân tích) và y học. Các nhà khoa học đã ứng dụng những hiểu
biết trong lĩnh vực này để phát triển các công thức tiêm chủng, các công cụ phân
tích mới (ví dụ, xét nghiệm miễn dịch, sắc ký kháng nguyên-kháng thể
(immunoaffinity chromatography), cả hai đều dựa trên kháng thể cố định) hoặc các
cách tiếp cận mới trong việc tổng hợp và xúc tác (ví dụ dựa trên kháng thể xúc tác).
Tuy rằng các kết quả đạt được rất khả quan nhưng họ cũng đã sớm nhận thấy những
hạn chế của các phương pháp mới. Hầu như tất cả các vật liệu sinh học được sử
dụng cho thấy các vấn đề về khả năngổn định trong các môi trường có điều kiện
14


cực đoan về nhiệt độ hoặc độ pH hay trong các dung mơi hữu cơ hay các q trình
tiêu hóa bằng vi sinh vật và tác nhân phân hủy nói chung. Do đặc tính sinh học vượt
trội của kháng nguyên-kháng thể nên chúng dễ bị phân hủy trong các môi trường
cực đoan dẫn đến hạn chế ngăn ứng dụng trong một số trường hợp. Thêm nữa, các
vật liệu sinh học tự nhiên này còn rất đắt đỏ, thời gian sống ngắn, cần các điều kiện
bảo quản phức tạp và khắt khe nên khả năng linh động trong ứng dụng rất hạn chế
[35]-[37]. Ngồi ra, chúng ta cũng khơng thể chế tạo ra các kháng thể để chống lại
các chất độc cũng như các chất ức chế miễn dịch do ảnh hưởng bất lợi của chúng
lên cơ chế phản ứng miễn dịch [37].
Cơng nghệ MIP ra đời chính là để giải quyết những hạn chế này của các tương
tác sinh học tự nhiên. Về cơ bản, công nghệ MIP vẫn giữ nguyên các nguyên tắc
đặc trưng sinh học nhưng phương pháp lại được thực hiện hồn tồn bằng phương

pháp hố học.
1.2.1. Lịch sử hình thành và phát triển của cơng nghệ MIP

Kĩ thuật in dấu phân tử ra đời từ năm 1949, khi Dickey nghiên cưu về sư trùng
hợp cua natri silicat với trong bốn loại hợp chất hữu cơ khác nhau là methyl, ethyl,
n-propyl và n-butyl. Hóa chất sau đó đã được loại bỏ, và trong các thí nghiệm tái
liên kết đã cho thấy rằng silica được chuẩn bị từ trước đều tái liên kết với khuôn in
các phân tử trong từng loại hóa chất khác nhau [38]. Ngay sau khi cơng trình này
được cơng bố rộng rãi, nhận thấy tiềm năng phát triển của một công nghệ mới, một
số nhóm đã nghiên cứu các chất hấp phụ dựa trên phương pháp của Dickey và bước
đầu định hình xu hướng phát triển các cơng nghệ sinh hóa mới.
Cho đến ngày nay, tùy theo loại liên kết hóa học giữa chất cần phân tích và các
monomer, người ta đã chia thành 3 kỹ thuật để tổng hợp MIP, đó là MIP dựa trên
liên kết cộng hóa trị, MIP dựa trên liên kết khơng cộng hóa trị và MIP kết hợp đồng
thời cả hai phương pháp trên. Tiếp bước những nghiên cứu của Dickey, đến năm
1972 lần đầu tiên kỹ thuật MIP dựa trên các liên kết cộng hóa trị đã được giới thiệu
và mô tả bởi Wulff và các cộng sự của ông [39], [40].Trong nghiên cứu này, một
liên kết cộng hóa trị có thể tách rời để liên kết các phân tử chất cần phân tích với
các monomer chức năng, các phân tử cần phân tích được xác định là các mẫu đường
cis-diol thông qua este boronate vinyl nối với các monomer chức năng. Sau khi
trùng hợp polyme, các liên kết cộng hóa trị sẽ bị phá vỡ giải phóng đường cis -diol
ra khỏi polyme bằng phương pháp thủy phân cung cấp các khn in, trong q trình
tái liên kết các phân tử đường liên kết lại với các vị trí trống trên khn in thơng qua
cùng một liên kết cộng hóa trị và cho thấy độ dặc hiệu cao [40], [41], [42]–[44]. Sau
8 năm kể từ ngày Wulff và các cộng sự chế tạo thành công polyme in dấu phân tử
dựa trên liên kết cộng hóa trị, vào năm 1980 Mosbach và các đồng nghiệp đã thành
công trong việc sử dụng các tương tác khơng cộng hóa trị để in dấu các phân tử
trong các polyme hữu cơ [45]. Với cách tiếp cận này, Mosbach đã sử dụng các
tương tác khơng cộng hóa trị để ổn định liên kết giữa các monomer chức năng với
phân tử mẫu thông qua liên kết chéo, về sau kĩ thuật này thường được gọi là kĩ thuật

15


tạo mẫu tự gắn kết (self-assembly). Việc tách các phân tử mẫu để tạo khuôn in và
tái liên kết của mẫu với khuôn in cũng được thực hiện giống như đối với kĩ thuật sử
dụng tương tác cộng hóa trị. Ưu điểm của cách tiếp cận khơng cộng hóa trị là sự đa
dạng và sẵn có các monomer chức năng có thể được sử dụng, q trình tổng hợp
cũng ít phức tạp hơn so với cách tiếp cận sử dụng liên kết cộng hóa trị. Chính điều
này đã đưa MIP sử dụng tương tác khơng cộng hóa trị trở thành kỹ thuật chính của
phương pháp in dấu phân tử [39], [41]. Sau thành công trong việc nghiên cứu ra
MIP sử dụng tương tác khơng cộng hóa trị của Mosbach, đến năm 1995 Whitcome
cùng các đồng nghiệp đã tìm ra một cách tiếp cận mới để chế tạo ra polyme in dấu
phân tử bán cộng hóa trị (semi-covalent) [46]. Trong nghiên cứu này, Whitcome đã
sử dụng liên cộng hóa trị để in các phân tử mẫu vào mạng polyme trong quá trình
trùng hợp, nhưng điều đặc biệt là việc tái liên kết các phân tử mẫu với khuôn in lại
thông qua tương tác khơng cộng hóa trị. Nhìn chung, cách tiếp cận thơng qua liên
kết cộng hóa trị và bán cộng hóa trị địi hỏi nhiều hơn về kĩ năng tổng hợp mặc dù
nó hứa hẹn mạng lưới khn in sẽ cho khả năng nhận biết tốt hơn so với cách tiếp
cận bằng phương pháp khơng cộng hóa trị. Trong thực tế, độ chọn lọc, ái lực liên
kết và giới hạn nhận biết của MIP bị ảnh hưởng không chỉ bởi vì sự ổn định của liên
kết giữa phân tử mẫu và màng polyme, vì vậy việc cải thiện hiệu suất của MIP thu
được bằng cách sử dụng các tương tác cộng hóa trị và bán cộng hóa trị vẫn cịn
nhiều điều phải bàn luận thêm [41], [46].
Dựa trên 3 kỹ thuật chế tạo polyme in dấu phân tử đề cập ở trên, ngày nay trên thế
giới đã định hình hai xu thế phát triển cơng nghệ MIP, đó là chế tạo MIP dạng hạt nano
dựa trên liên kết cộng hóa trị và MIP dạng màng nano dựa trên các tương tác khơng
cộng hóa trị. Trong thời gian đầu do cơng nghệ chưa phát triển, MIP dạng hạt được chế
tạo theo phương pháp cũ cho kích thước lớn và khơng đồng đều, vì vậy để có thể sử
dụng cho một số nghiên cứu các hạt MIP buộc phải trải qua quá trình sàng lọc để thu
được các hạt với kích cỡ mong muốn từ 5-10µm. Quy trình chế tạo phức tạp và khó

khăn nên việc chế tạo MIP dạng hạt rất tốn thời gian và hóa chất. Hơn nữa, các hạt MIP
được chế tạo với kích thước khơng đồng đều nên các khn in có kích thước khơng
đồng nhất, và để tạo ra được các tương tác có ái lực mạnh cần phải có rất nhiều các
phân tử mẫu. Chính vì thế, các nhà khoa học luôn tập trung nghiên cứu với mong muốn
chế tạo thành công MIP dạng hạt nano để cải thiện nhược điểm kể trên. Với cấu trúc
nano, MIP dạng hạt nano sẽ cho tỉ lệ giữa diện tích bề mặt với thể tích của hạt lớn hơn
rất nhiều so với MIP dạng hạt có kích thước lớn, chính vì vậy các phân tử mẫu có thể
dễ dàng xâm nhập vào các khuôn chọn lọc cũng như cải thiện được khả năng tái liên
kết của các phân tử mẫu với khn in. Để có thể ứng dụng vào các nghiên cứu, các hạt
MIP buộc phải phân tán trong các dung dịch, đây cũng chính là một ưu thế của MIP
dạng hạt nano. Các hạt nano MIP dễ dàng phân tán trong dung dịch hơn nên có thể sử
dụng trong rất nhiều các ứng dụng như phân tích, dẫn thuốc, thay thế một số thụ thể
sinh học như enzyme hay kháng thể trong cảm biến. Tuy nhiên việc chế tạo hạt nano
MIP rất khó khăn, phụ thuộc vào nhiều yếu tố nên MIP dạng hạt nano ít được sử dụng
hơn. Mặc dù vậy, ái lực liên kết của các hạt nano MIP
16


rất lớn dẫn đến độ đặc hiệu cao với các chất cần phân tích nên MIP dạng hạt nano
vẫn được ưu tiên trong các nghiên cứu yêu cầu độ chính xác cao.
Kỹ thuật phổ biến hơn thường được nghiên cứu đó là kỹ thuật tạo màng nano
MIP do quy trình đơn giản và nhanh chóng. Trong kỹ thuật này, cách tiếp cận tự lắp
ráp là phương pháp phổ biến nhất để chế tạo màng MIP. Màng MIP hai chiều chế
tạo theo phương pháp này có quy trình chế tạo đơn giản, linh hoạt, có thể sử dụng
đa dạng các loại monomer khác nhau và có khả năng biến tính trên nhiều loại nền
điện cực cũng như ứng dụng trong nhiều cảm biến sinh hóa.
Nhìn chung, tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu mà chúng ta lựa chọn các
phương pháp tiếp cận phù hợp để chế tạo MIP với các phép đo tương ứng. Các
nghiên cứu về công nghệ chế tạo MIP vẫn đang được tiến hành và hứa hẹn nhiều
triển vọng phát triển hơn nữa trong tương lai.

1.2.2. Nguyên lý đánh dấu phân tử

Lấy ý tưởng từ quá trình nhận dạng phân tử trong tự nhiên, kỹ thuật in dấu phân
tử được đưa vào nghiên cứu nhằm tạo ra các khuôn mẫu bằng polyme với các liên
kết sinh học đặc hiệu được giữ nguyên hứa hẹn nhiều tiềm năng phát triển, đặc biệt
trong chế tạo các cảm biến phát hiện nhanh các tác nhân hóa sinh. Về cơ bản, MIP
được tạo thành từ năm thành phần khác nhau: mẫu (chất) cần phân tích, monomer
chức năng, thành phần liên kết chéo, thành phần làm xốp và thành phần khởi tạo
[46]. Trong đó, hai yếu tố cuối xác định hình thái học của polyme. Hình 1.8 trình
bày các bước trong quy trình cơng nghệ chế tạo MIP [48]-[50].
Q trình gồm:
i) Phân tử khuôn kết hợp với monomer chức năng thông qua liên kết cộng
hóa trị hoặc khơng cộng hóa trị. Các monome này có chứa nhóm chức có khả
năng polyme hóa (thường là liên kết đơi);
ii) Q trình polyme hóa được bắt đầu với một lượng lớn các phân tử liên
kết chéo chứa ít nhất hai nhóm chức có khả năng polyme hóa. Các phân tử
liên kết chéo này rất cần thiết để tạo ra được một mạng lưới polyme 3D
cứng, giúp duy trì được khn in của phân tử mẫu với đặc tính chọn lọc cao;
iii) Tách loại bỏ các phân tử mẫu, MIP được tạo ra có khả năng nhận biết
một cách đặc hiệu dựa trên hình dạng, kích thước và các vị trí tương tác chọn
lọc với phân tử mẫu trong các khuôn in trong mạng polyme.

17


Hình 1.8. Sơ đồ ngun lý cơng nghệ MIP

Các phân tử khuôn mẫu, monome chức năng, liên kết chéo và chất khơi mào là
cần thiết với tỷ lệ tối ưu cho q trình trùng hợp hồn tồn. Sau khi trùng hợp, các
hốc nhận biết có độ đặc hiệu cao được hình thành trong ma trận MIP cho các phân

tử khn. MIP có thể được tạo thành bằng các phương pháp khác nhau. Như được
minh họa trong hình 1.9, các liên kết cộng hóa trị thuận nghịch (A), các nhóm liên
kết polyme hóa được gắn cộng hóa trị được kích hoạt cho các tương tác khơng cộng
hóa trị (B), tương tác tĩnh điện (C), tương tác kỵ nước hoặc Van der Waals (D) hoặc
phối hợp với một tâm kim loại (E). Tất cả các tương tác được hình thành với các
nhóm chức năng bổ sung của các phân tử khuôn mẫu (a - e) [50]-[52], [52].

Hình 1.9. Nguyên tắc nhận dạng in phân tử [47], [51]

Trong polyme in dấu phân tử, các vị trí cụ thể có thể được tạo ra cho nhiều khuôn
mẫu khác nhau như axit amin [29], [47], [53], protein [54], [55], [56], [57], enzym
[58], [59], hormone [61]-[63], kháng thể [64]-[66], nucleic axit [67]- [70], vi khuẩn
[70], vi rút [72]- [75], thuốc [76]-[80], ion kim loại [81]-[85], kháng sinh [86]-[91]
và thuốc trừ sâu [91], [92]… Hơn nữa, MIP rất dễ tổng hợp, ổn định cao, tiết kiệm
chi phí và thân thiện với người dùng. Chúng có thể được sản xuất với số lượng lớn
với hiệu suất tái sử dụng cao.
Trong cơng nghệ MIP, tương tác hóa học giữa phân tử mẫu và monomer đóng vai
trị rất quan trọng trong việc xác định độ đặc hiệu và tính chọn lọc. Trong tương
18


tác này, phân tử mẫu và các nhóm chức của nó sẽ quyết định monomer chức năng
được lựa chọn. Tính đặc hiệu của khuôn in tạo thành được xác định chủ yếu bởi độ
mạnh của liên kết giữa monomer và phân tử mẫu, liên kết càng mạnh ái lực càng
tốt. Ngoài ra, số lượng các điểm liên kết giữa phân tử mẫu và khuôn in càng nhiều
càng tốt. Về mặt lý thuyết cần ít nhất ba điểm liên kết để xác định một cấu trúc ba
chiều của phân tử mẫu trong khn in. Tùy theo loại tương tác hóa học giữa phân tử
mẫu và monomer chức năng mà MIP được chia làm ba loại [51], [92], [94], [95][99]:
MIP dựa trên tương tác cộng hóa trị: Kỹ thuật MIP dựa trên các liên kết
cộng hóa trị đã được giới thiệu và mô tả lần đầu tiên bởi Wulff và các cộng sự

của ông (1972). Trong trường hợp này, các monomer phải tạo được liên kết
cộng hóa trị với các mẫu trước khi in, do vậy tùy thuộc vào tính chất hóa học
của phân tử mẫu mà các monomer sẽ khác nhau. Việc sử dụng kỹ thuật MIP
dựa trên các liên kết cộng hóa trị làm tăng tính đồng nhất của các vị trí liên kết
và làm giảm các liên kết khơng đặc hiệu. Tuy nhiên, các tương tác cộng hóa trị
tương đối bền vững, do đó địi hỏi các điều kiện loại bỏ mẫu khắc nghiệt, có
thể gây biến dạng polyme và mất tính liên kết của vị trí gắn kết [51], [99],
[100].
MIP dựa trên tương tác khơng cộng hóa trị: Kỹ thuật MIP dựa trên các
liên kết khơng cộng hóa trị được áp dụng lần đầu tiên bởi Klaus Mosbach và
các đồng nghiệp (1980). Với cách tiếp cận này, Mosbach đã sử dụng các
tương tác khơng cộng hóa trị để ổn định liên kết giữa các monomer chức năng
với phân tử mẫu thông qua liên kết chéo, về sau kỹ thuật này được gọi là kỹ
thuật tạo mẫu tự gắn kết (self-assembly). Việc in dấu phân tử bởi liên kết
không cộng hóa trị phụ thuộc vào sự hình thành của nhiều tương tác yếu hơn
như liên kết hidro, liên kết kị nước và liên kết ion giữa phân tử mẫu và các
monomer để cung cấp ái lực cho in dấu polyme, những liên kết này có thể dễ
dàng bị phá vỡ bởi các điều kiện nhẹ dẫn đến phân tử mẫu dễ dàng bị loại bỏ
sau quá trình polyme. Ưu điểm của cách tiếp cận khơng cộng hóa trị là sự đa
dạng và sẵn có cácmonomer chức năng có thể được sử dụng, q trình tổng
hợp cũng ít phức tạp hơn so với cách tiếp cận sử dụng liên kết cộng hóa trị.
Chính điều này đã đưa MIP sử dụng tương tác khơng cộng hóa trị trở thành kỹ
thuật chính của phương pháp in dấu phân tử [100], [101].
MIP dựa trên cả hai loại tương tác cộng hóa trị và khơng cộng hóa trị:
Đây là kỹ thuật lai ghép của hai kỹ thuật trên. Liên kết cộng hóa trị được thiết
lập giữa monomer và phân tử mẫu trước khi tiến hành polyme. Sau khi phân
tử mẫu đã được tách ra khỏi ma trận polyme thì việc tái liên kết giữa phân tử
mẫu và màng MIP lại thông qua tương tác khơng cộng hóa trị [50], [51],
[101]– [103].

19


1.2.3. Thành phần của MIP

1.2.3.1. Khn
Mục đích chính của việc in dấu phân tử là hình thành mạng lưới polyme có ái lực
với các phân tử khn đã chọn. Các phân tử khn phải chứa các nhóm chức, trơ
trong q trình polyme hóa và các nhóm chức có thể tạo thành phức chất khuônmonome ổn định. Hơn nữa, khuôn mẫu phải được đặc trưng bởi tính ổn định hóa
học và nhiệt tuyệt vời trong q trình polyme hóa. Nói chung, các phân tử khn
mẫu có thể được chia thành bốn nhóm: các ion (ví dụ: Cd 2+, Cu2+, Pb2+, Hg2+,
CH3Hg+), các phân tử hữu cơ (ví dụ: thuốc trừ sâu, chất nổ, dược phẩm, hóa chất
gây rối loạn nội tiết, axit amin và peptit, đường - một số được trình bày trong hình
1.10), các phân tử sinh học (ví dụ adenosine, albumin huyết thanh bị), tế bào và vi
rút (ví dụ vi rút bệnh bạch cầu ở bò) [105]-[107].

20


Hình 1.10. Ví dụ về thuốc trừ sâu, chất nổ và dược phẩm sử dụng như khuôn mẫu

1.2.3.2. Các monome chức năng
Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong cơng nghệ in dấu phân tử là sự lựa
chọn thích hợp của các monome chức năng sao cho các monome này sẽ có thể
tương tác với phân tử khn mẫu, trong cách tiếp cận khơng cộng hóa trị, ví dụ, liên
kết hydro (lựa chọn chất cho liên kết H và chất nhận liên kết H). Một số monome
điển hình (bao gồm axit cacboxylic, axit sulfonic và bazơ thơm dị vòng) được trình
bày trong hình 1.11.

Hình 1.11. Monome sử dụng trong MIPs

Axit metacrylic là monome chức năng được sử dụng phổ biến nhất trong quá
trình tổng hợp MIP. Việc lựa chọn monome chức năng ảnh hưởng đến cấu trúc của
vị trí nhận dạng và nồng độ ảnh hưởng đến số lượng vị trí liên kết. Nói chung, các
monome chức năng được sử dụng với số mol phân tử dư so với khn mẫu (tỷ lệ
mol điển hình là 4:1), điều này cho phép tạo ra các phức chất khuôn mẫu - monome
21


chức năng. Điều này cho phép thu được các khoang đặc hiệu cao (được thiết kế cho
phân tử khuôn mẫu) phân bố đồng đều các vị trí liên kết trong MIP cuối cùng [51],
[52], [107].
1.2.3.3. Các liên kết chéo
Trong quá trình polyme hóa, các liên kết chéo cố định các monome chức năng
xung quanh các phân tử khuôn, dẫn đến việc hình thành mạng lưới polyme cứng
liên kết chéo cao (chống lại các q trình loại bỏ khn mẫu). Ví dụ về các liên kết
chéo được sử dụng trong quá trình tổng hợp MIP được trình bày trong hình 1.12, là
hợp chất phổ biến nhất - ethylene glycol dimethacrylate. Các chất liên kết chéo ảnh
hưởng đến hình thái và hiệu suất cơ học của chất nền polyme cũng như tính chọn
lọc và khả năng liên kết của các MIP. Yếu tố quan trọng nhất là loại và số lượng
chất liên kết ngang được sử dụng cho q trình polyme hóa. Lượng liên kết ngang
cao hơn cho phép tạo ra vật liệu xốp ổn định. Số lượng đơn vị vinyl trên mỗi phân
tử cao hơn trong cấu trúc hóa học của liên kết chéo dẫn đến độ ổn định cơ học và
hiệu suất liên kết cao hơn của MIP cuối cùng [108].

22


Hình 1.12. Một số hợp chất liên kết chéo sử dụng trong MIPs

1.2.3.4. Tác nhân Porogen (tạo xốp)
Các porogen đóng vai trị lớn trong việc hình thành các lỗ xốp trong mạng
polyme. Porogen được định nghĩa là những hạt vật chất có khối lượng, có hình dạng
và kích thước đặc trưng để tạo ra các lỗ xốp trong cấu trúc khn đúc. Trong điều
kiện của q trình trùng hợp phân tán điển hình, các polyme kết tủa khi được tạo
thành, vẫn cịn có chứa một lượng lớn các porogen trong các lỗ xốp. Đối với một
khuôn in được tạo ra thành cơng, phân tử mẫu phải được hịa tan trong porogen (đơi
khi hỗn hợp đã được đun nóng để đảm bảo điều này), nhưng porogen được lựa chọn
phải đảm bảo không cạnh tranh với các monomer chức năng tương tác với các phân
tử mẫu. Nếu các tương tác này, chủ yếu được dựa trên các liên kết hydro thì các
proton porogen sẽ gây trở ngại và hạn chế ít nhất một phần của phân tử mẫu tương
tác với các monomer chức năng. Ngoài ra, hỗn hợp phản ứng này nên được hịa tan
hồn tồn trong nước, vì nước cạnh tranh rất hiệu quả với các liên kết hydro. Oxy
hòa tan trong dung dịch nên được loại bỏ khỏi porogen bằng cách thổi khí nitơ.
Các dung mơi gây độc hoạt động như mơi trường phản ứng (trong q trình
polyme hóa) và tác nhân tạo pore. Các porogen quan trọng nhất là acetonitril,
chloroform, dichloroethane,N- dimethylformamide, methanol, 2-methoxyethanol,
tetrahydrofuran và toluen. Đối với phương pháp in dấu khơng cộng hóa trị, dung
mơi khơng phân cực và ít phân cực được sử dụng. Loại dung môi được sử dụng ảnh
hưởng đến hiệu quả in, sự tương tác giữa khn mẫu và các monome chức năng,
tính chất hấp thụ và hình thái của polyme. Lượng dung môi được sử dụng ngày
càng tăng dẫn đến việc tăng kích thước pore, vì vậy lượng dung mơi thích hợp sẽ
cải thiện sự hình thành các khoang cụ thể được thiết kế để liên kết các phân tử
khuôn mẫu. Cũng cần phải chỉ ra rằng, bản chất của dung môi được sử dụng cũng
đóng một vai trị quan trọng. Các dung mơi ít phân cực hơn cải thiện sự hình thành
phức chất khuôn mẫu- monome chức năng (ổn định liên kết hydro), trong khi các
dung môi phân cực hơn làm xáo trộn các tương tác trong các phức chất được tạo
thành, vì vậy sự hiện diện của nước là khơng thể trong nhiều trường hợp [48], [94],
[105].

23


1.2.3.5. Chất khơi mào

Hình 1.13. Các chất khơi mào thường sử dụng trong MIPs

Các hợp chất peroxy và azo thường được sử dụng làm chất khơi mào trong quá
trình tổng hợp MIP bằng phản ứng trùng hợp gốc tự do (hình 1.13). Chất khơi mào
phổ biến nhất là azobisisobutyronitrile (AIBN), có thể bị phân hủy bằng nhiệt phân
(nhiệt độ phân hủy AIBN là 50–70 °C) và quang phân. Polyme hóa các gốc tự do
nên được thực hiện trong môi trường khí trơ do có thể xảy ra các phản ứng phụ với
oxy [94].
1.2.4. Ưu điểm của công nghệ MIP

Không giống như các thành phần sinh học, MIP bền và ổn định trong các mơi
trường cực đoan có độ pH, áp suất và nhiệt độ rất cao (dưới 180 oC) hoặc rất thấp
hoặc trong các môi trường dung môi hữu cơ thường được sử dụng trong các ứng
dụng phân tích hoặc xúc tác [110]-[113]. Với những ưu điểm như vậy, MIP có thể
sử dụng trong nhiều tháng mà khơng có bất kì một tổn thất nào về hiệu năng cũng
như khơng yêu cầu điều kiện bảo quản quá khắt khe. Ngoài ra, do MIP được chế tạo
bằng cách tổng hợp theo phương pháp hoá học nên đơn giản và rẻ hơn nhiều so với
các chất sinh học như kháng nguyên kháng thể [108].
Tuy nhiên, cơng nghệ MIP chưa có một quy trình chuẩn để chế tạo do mỗi một
đối tượng phân tích có một cấu trúc và tính chất khác nhau nên yêu cầu các thành
phần hóa học cấu tạo nên MIP cũng khác nhau [113]. Tùy vào đặc điểm của mỗi đối
tượng mà MIP được chế tạo theo một quy trình riêng.
Mặt khác, MIP đã chỉ ra khả năng ứng dụng tương tự như các bản sao sinh học
của chúng cũng như ái lực pha tĩnh có tính chọn lọc cao trong hóa phân tích, thay
thế cho các kháng thể trong xét nghiệm miễn dịch, làm chất xúc tác như enzyme

hoặc là thành phần nhận dạng cho việc phát triển "sinh học".

24