Bai giang Sinh hoc phan tu

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (8.52 MB, 83 trang )

(1)2/22/2016. Chương 1. Sự tổ chức cơ thể động vật. Sự tổ chức cơ thể động vật. SỰ TỔ CHỨC CƠ THỂ 2 tiết I. CÁC LOẠI MÔ ĐỘNG VẬT • 1. Biểu mô • 2. Mô liên kết • 3. Mô cơ • 4. Mô thần kinh II. CÁC CƠ QUAN VÀ HỆ CƠ QUAN Ở ĐỘNG VẬT. 22/02/2016 11:56 CH. 1. Nguyễn Hữu Trí. 22/02/2016 11:56 CH. Dẫn nhập. 2. Nguyễn Hữu Trí. Học thuyết tế bào Tế bào là đơn vị trung tâm của các tổ chức sinh học: Tế bào là đơn vị cơ bản của sự sống. Tất cả các sinh vật sống đều được cấu tạo bởi tế bào. Chỉ tế bào sống mới có thể sinh sản và tạo ra tế bào mới.. Matthias Schleiden 1838: Thực vật được cấu tạo bởi tế bào Theodor Schwann 1839: Động vật được cấu tạo bởi tế bào Rudolf Virchow 1858: Mỗi tế bào đều bắt nguồn từ một tế bào khác. 22/02/2016 11:56 CH. 3. Nguyễn Hữu Trí. 22/02/2016 11:56 CH. 4. Nguyễn Hữu Trí. Sự đa dạng của tế bào Tế bào trong các cơ quan khác nhau của cơ thể có sự khác nhau về hình dạng, kích thước và chức năng: hồng cầu hình cầu; tế bào thần kinh có nhiều nhánh; tế bào biểu bì hình khối, dẹt…. Tế bào Thể tích của tế bào thường cố định và không phụ thuộc vào kích thước của cơ thể. Tuy hình dạng, kích thước và chức năng của các tế bào ở các cơ quan khác nhau cũng khác nhau, song các tế bào đều có những thành phần cơ bản: màng tế bào, tế bào chất, nhân tế bào. 22/02/2016 11:56 CH. 5. Nguyễn Hữu Trí. 22/02/2016 11:56 CH. 6. Nguyễn Hữu Trí. 1.

(2) 2/22/2016. Mô động vật. Mô động vật (Tissues) • Mô là nguyên liệu để xây dựng nên các cơ quan của cơ thể đa bào. • Có 4 loại mô • • • •. Biểu mô (Epithelial) Mô liên kết (Connective) Mô cơ (Muscle) Mô thần kinh (Nerve). Mô là một tập hợp yếu tố có cấu trúc tế bào đã được chuyển hoá và các yếu tố không có cấu trúc tế bào để thực hiện các chức năng nhất định. 22/02/2016 11:56 CH. 7. Nguyễn Hữu Trí. 22/02/2016 11:56 CH. Khối u (tumor) gồm một cụm tế bào không có chức năng. Khối u có thể là lành tính (benign), hoặc xâm lấn sang các mô bao quanh và trở thành ác tính (malignant). Các tế bào khối u có thể di cư, hoặc di căn (metastatic), đến các vị trí khác trong cơ thể. Khối u ác tính và di căn chính là ung thư (cancerous).. 9. 2. 3.. 4. 5. 6.. Tế bào thường phân cực, có cực ngọn và cực gốc, liên kết chặt chẽ với nhau, khe gian bào hẹp. Mặt dưới của biểu mô thường dựa vào màng nền là màng được biệt hóa từ mô liên kết kế cận. Không có mạch máu đi vào (trừ mệ lộ ở màng tai trong), không có dây thần kinh đi vào (trừ niêm mạc khứu giác). Chất dinh dưỡng được thấm qua màng nền để nuôi biểu mô. Có khả năng tái sinh mạnh nhờ phân bào nhanh để hàn gắn vết thương (biểu bì da, biểu mô dạ con) Bề mặt biểu mô bài xuất hoặc hấp thụ thường được biệt hóa cao (lông rung- vi nhung) Tế bào biểu mô phủ được chuyển hóa để trở thành tế bào que, tế bào nón, thủy tinh thể ở mắt – tế bào có lông rung ở tai trong – sừng – móng – tóc – răng – sắc bào. 22/02/2016 11:56 CH. 11. Biểu mô là loại mô xếp thành lớp dày bao phủ mặt ngoài hay mặt trong của các cơ quan, ngoài ra biểu mô còn tạo thành các tuyến nội tiết hay ngoại tiết. Về mặt cấu tạo, biểu mô do một hay nhiều lớp tế bào xếp khít nhau tạo thành, tế bào là thành phần cấu tạo chủ yếu, còn chất gian bào thì không đáng kể.. Nguyễn Hữu Trí. Biểu Mô (Epithelial Tissue) Đặc điểm cấu tạo 1.. Nguyễn Hữu Trí. I. Biểu mô. Ung thư là gì?. 22/02/2016 11:56 CH. 8. Nguyễn Hữu Trí. Phân loại biểu mô theo cấu tạo Dựa vào hình dạng của lớp tế bào trên cùng • Biểu mô dẹt (Squamous). • Biểu mô khối (Cuboidal). • Biểu mô trụ (Columnar). 22/02/2016 11:56 CH. 12. Nguyễn Hữu Trí. 2.

(3) 2/22/2016. Phân loại biểu mô theo cấu tạo. Phân loại biểu mô theo cấu tạo. Dựa vào số lượng lớp tế bào Hai loại biểu mô khác. Biểu mô đơn (Simple): một lớp tế bào Biểu mô biến dạng (Transitional). Biểu mô tầng (Stratified): Có hơn một lớp tế bào Biểu mô giả tầng (Pseudostratified) 22/02/2016 11:56 CH. 13. Nguyễn Hữu Trí. Chức năng của biểu mô 1. 2. 3.. 4.. Bảo vệ: Biểu mô có chức năng bảo vệ, chống các tác nhân vật lý, hóa học và chống nhiễm khuẩn. Hấp thụ: Biểu mô phủ lót mặt trong ruột và các ống thận có khả năng hấp thụ. Chế tiết: Biểu mô của các tuyến nội tiết và ngoại tiết có khả năng chế tiết một số chất giúp cho quá trình trao đổi chất – tăng trưởng, sinh sản. Ở một số nơi, biểu mô được biệt hóa cao độ để thu nhận các kích thích (các tế bào biểu mô cảm giác của chồi vị giác trên mặt lưỡi; tế bào thính giác của cơ quan Corti ở tai trong). 22/02/2016 11:56 CH. 15. Nguyễn Hữu Trí. Biểu mô dẹt đơn (Simple Squamous Epithelium) Chỉ gồm một lớp tế bào dẹt ( như gạch men hoa lát nhà). Biểu bì phủ trên da ếch, biểu mô tạo thành nang Bowman của thận. Phế nang Nhân tế bào. 22/02/2016 11:56 CH. 14. Nguyễn Hữu Trí. Phân loại biểu mô theo chức năng • Dựa vào chức năng biểu mô được chia thành hai loại là biểu mô phủ và biểu mô tuyến • Biểu mô phủ: là những tế bào phủ mặt ngoài hay lót mặt trong của cơ quan rỗng, lót mặt thành, mặt tạng của cơ thể. • Biểu mô tuyến là những nhóm tế bào được chuyển hóa cao để thích nghi với chức năng chế tiết và bài xuất. 22/02/2016 11:56 CH. 16. Nguyễn Hữu Trí. Biểu mô dẹt đơn (Simple Squamous Epithelium) • Chứa năng 1.Khuếch tán • Các phế bào ở trong phổi cho phép sự khuếch tán trao đổi O2 và CO2. 2.Lọc • Các mao mạch cho phép các dịch lỏng và các chất dinh dưỡng thấm qua nhưng các tế bào máu và protein bị giữ lại trong nó.. Thành của phế nang được tạo bởi biểu mô dẹt đơn (x400) 22/02/2016 11:56 CH. 17. Nguyễn Hữu Trí. 22/02/2016 11:56 CH. 18. Nguyễn Hữu Trí. 3.

(4) 2/22/2016. Biểu mô vuông đơn (Simple Cuboidal Epithelium). Biểu mô vuông đơn (Simple Cuboidal Epithelium). • Một lớp tế bào hình khối, các cạnh có kích thước đồng đều, nhân hình cầu nằm ở trung tâm tế bào. • Biểu mô tạo thành ống góp của thận. •. Tế bào biểu mô khối đơn. • Các tuyến nội tiết như tuyến giáp trạng (thyroid) là tuyến nội tiết dạng nang được tạo thành bởi tế bào biểu mô đơn khối và chế tiết ra hormon.. 2. Hấp thu. Màng nền. • Trong thận, ống góp của thận được tạo thành từ biểu mô khối đơn và tái hấp thu nước và các chất dinh dưỡng khác từ dịch lọc.. Mô liên kết Biểu mô khối đơn ở trong ống thận (x 400) 22/02/2016 11:56 CH. 19. Chức năng: 1. Chế tiết. 22/02/2016 11:56 CH. Nguyễn Hữu Trí. Biểu mô trụ đơn (Simple Columnar Epithelium). 20. Nguyễn Hữu Trí. Biểu mô trụ đơn (Simple Columnar Epithelium). • Gồm một lớp tế bào hình trụ có nhân hình bầu dục và nằm hướng về phía màng đáy. • Tế bào dạng chén thường được tìm thấy trong lớp này. •. Tế bào biểu mô trụ đơn. • Ví dụ: Trong dạ dày, các tế bào biểu mô trụ đơn chế tiết ra các enzyme tiêu hóa. 2. Hấp thụ. Màng nền. • Ví dụ: Trong ruột non, các tế bào biểu mô trụ đơn hấp thụ các chất dinh dưỡng. Biểu mô trụ đơn ở trong niêm mạc dạ dày (x 1300) 22/02/2016 11:56 CH. 21. 22/02/2016 11:56 CH. Nguyễn Hữu Trí. Biểu mô trụ giả tầng (Pseudostratified Columnar Epithelium) • Gồm một lớp tế bào khác nhau về chiều cao. Nhân của tế bào nằm ở những hàng khác nhau • Mọi tế bào đều có mặt đáy bám vào một màng nền chung. Có thể có hoặc không có lông. Lông Dịch nhầy của tế bào dạng chén Lớp biểu mô giả trụ tầng Màng nền Mô liên kết. Biểu mô trụ giả tầng lót trong khí quản ở người (x 400) 22/02/2016 11:56 CH. 23. Nguyễn Hữu Trí. Chức năng 1. Chế tiết. 22. Nguyễn Hữu Trí. Biểu mô trụ giả tầng có lông Pseudostratified Columnar Ciliated Epithelium (PCCE). •. Chức năng 1. Bảo vệ • Ví dụ: biểu mô lót mặt trong khí quản, có lông để quét các bụi bẩn rơi vào trong đường hô hấp.. 2. Chế tiết • Ví dụ: Có thể chứa các tế bào hình chén tiết ra chất nhầy. 22/02/2016 11:56 CH. 24. Nguyễn Hữu Trí. 4.

(5) 2/22/2016. Biểu mô dẹt tầng (Stratified Squamous Epithelium). Biểu mô dẹt tầng (Stratified Squamous Epithelium) • Chứa nhiều lớp tế bào chồng lên nhau • Lớp trên cùng là tế bào dẹt • Các lớp dưới có thể có nhiều hình dạng khác nhau. • Chức năng: • Bảo vệ những phần mô ở vùng phía dưới khỏi bị tổn thương. • Có thể không hóa sừng ở bề mặt như biểu mô lót thực quản hoặc hóa sừng như ở biểu bì da, biểu bì lót âm đạo phụ nữ lớn tuổi.. Biểu mô dẹt tầng. Nhân Màng nền Mô liên kết. Biểu mô dẹt tầng lót trong thực quản (x 425) 22/02/2016 11:56 CH. 25. 22/02/2016 11:56 CH. Nguyễn Hữu Trí. Chức năng Bảo vệ cơ thể chống lại sự trầy xước và xâm nhập của tác nhân gây bệnh Vùng biểu mô không hóa sừng thường nằm ở những vùng ẩm ướt • • • • • 22/02/2016 11:56 CH. Miệng Hầu Thực quản Hậu môn Âm đạo. Nguyễn Hữu Trí. Biểu mô dẹt tầng hóa sừng. Biểu mô dẹt tầng không hóa sừng •. 26. •. Chức năng Bảo vệ cơ thể • Chỉ tìm thấy ở lớp biểu bì của da • Keratin là một protein tăng cường cho tế bào khỏi bị trầy xước • Các lớp vảy sừng ở trên bị bong ra. 27. Nguyễn Hữu Trí. Biểu mô biến dạng (Transitional Epithelium) Gồm nhiều lớp tế bào có kích thước khác nhau. Các tế bào ở ngọn có dạng vòm khi không bị căng ra. Các tế bào ở ngọn có dạng dẹt khi bị căng ra.. 22/02/2016 11:56 CH. 28. Nguyễn Hữu Trí. Biểu mô biến dạng (Transitional Epithelium) Chức năng: cho phép bàng quang phồng ra và chùn lại khi bị căng ra Chỉ tìm thấy trong hệ bài tiết. Biểu mô tầng biến dạng Màng nền Mô liên kết Biểu mô tầng biến dạng ở bàng quang khi không có nước tiểu (x 500) 22/02/2016 11:56 CH. 29. Nguyễn Hữu Trí. Bàng quang chứa đầy nước tiểu 22/02/2016 11:56 CH. Bàng quang trống 30. Nguyễn Hữu Trí. 5.

(6) 2/22/2016. Biểu mô vuông tầng (Stratified Cuboidal Epithelium) • Có hai hay nhiều lớp tế bào hình khối xếp chồng lên nhau. • Hiếm gặp. Tìm thấy trong thành ống dẫn tuyến mồ hôi. 22/02/2016 11:56 CH. 31. Nguyễn Hữu Trí. Biểu mô trụ tầng (Stratified Columnar Epithelium) Phân bố hạn chế trong cơ thể. Để phân biệt sự khác nhau với biểu mô phủ, trụ, giả tầng bằng cách quan sát nhân tế bào. Nhân tế bào của biểu mô phủ, trụ, tầng xếp thành một hàng.. 22/02/2016 11:56 CH. Biểu mô trụ tầng (Stratified Columnar Epithelium). •. Chức năng Bảo vệ • Tìm thấy trong hầu, niệu đạo ở nam, lót mặt trong một số tuyến, ống, như tuyến sữa, hậu môn. 22/02/2016 11:56 CH. 33. Nguyễn Hữu Trí. Biểu mô tuyến. 32. Nguyễn Hữu Trí. Biểu mô tuyến • Biểu mô tuyến: là những nhóm tế bào được chuyên môn hoá cao độ để thích ứng với chức năng chế tiết và bài xuất. Các tế bào tuyến này ăn sâu vào mô liên kết ở phía dưới để tạo thành tuyến. Căn cứ vào chức năng bài xuất các chất tiết người ta phân tuyến ra làm hai loại: tuyến ngoại tiết và tuyến nội tiết. 22/02/2016 11:56 CH. 34. Nguyễn Hữu Trí. II. Mô liên kết. • Tuyến ngoại tiết là những tuyến mà chất chế tiết của chúng được bài xuất ra ngoài hay vào khoang của cơ thể thông với ngoài (như lòng ống tiêu hoá, khoang tử cung) hoặc thông qua hệ thống ống trung gian. • Tuyến nội tiết: chất chế tiết ngấm trực tiếp vào máu (không có ống dẫn). Xung quanh tế bào tuyến thường có mao mạch dày đặc. Các tuyến nội tiết như tuyến yên, tuyến giáp trạng, tuyến trên thận, tuyến tuỵ nội tiết, v.v…. 22/02/2016 11:56 CH. 35. Nguyễn Hữu Trí. 6.

(7) 2/22/2016. Mô liên kết (Connective Tissue). Mô liên kết • Mô liên kết là loại mô trong đó tế bào sắp xếp không sát nhau, xen kẽ giữa các tế bào là chất gian bào. Cấu tạo của mô liên kết rất phức tạp. Có loại ở trạng thái thể dịch như máu, có loại ở trạng thái hình thể bất định như các loại sợi, có loại hình thể ổn định như sụn, xương … • Mỗi loại có đặc điểm là: có nhiều tế bào, chất gian bào chiếm tỷ lệ đáng kể.. 22/02/2016 11:56 CH. 37. Mô liên kết là mô tạo ra và giữ cho cơ thể có hình dạng nhất định, bao bọc các cơ quan để bảo vệ và trao đổi chất. Mô liên kết phân bố hầu khắp cơ thể và luôn nằm phía trong biểu mô. Dựa vào thành phần sợi và chất cơ bản vô định hình người ta chia làm 4 loại: 1. 2. 3. 4.. Mô liên kết mềm Mô liên kết sợi Mô liên kết lỏng Mô liên kết cứng. 22/02/2016 11:56 CH. Nguyễn Hữu Trí. 38. Nguyễn Hữu Trí. Các loại tế bào của mô liên kết mềm. Mô liên kết mềm 1.. Nguyên bào sợi: có vai trò quan trong trong việc tổng hợp các loại sợi của mô liên kết, sản sinh ra một số protein tham gia hình thành chất cơ bản vô định hình. 2.. Đại thực bào: Thực bào các tác nhân xâm nhiễm và các mảnh vụn tế bào. 3.. Tế bào tạo mỡ: Tế bào mỡ. 4.. Tế bào trung mô: Tế bào mầm. 5.. Tế bào bón: Kích thích phản ứng viêm địa phương: có chứa histamine và heparin. 6.. Tế bào lympho/tiểu thực bào: Bạch cầu tham gia vào quá trình miễn dịch Hồng cầu…. Chất căn bản ở dạng lỏng hay bán lỏng, có 5 loại: 1. Mô liên kết thưa 2. Mô liên kết dạng lưới 3. Mô mỡ 4. Mô nhầy 5. Mô hạt. 7.. 22/02/2016 11:56 CH. Mô liên kết thưa Areolar Connective Tissue (Loose) Chất căn bản dạng gel. Có chứa cả 3 loại sợi. Sợi đàn hồi. Nguyễn Hữu Trí. Mô liên kết thưa Areolar Connective Tissue (Loose) •. Chức năng: 1. Bao bọc và đệm các cơ quan 2. Duy trì và vận chuyển các mô lỏng. Nguyên bào sợi Sợi tạo keo Đại thực bào. 40. •. Vị trí: 1. Nằm ngay dưới biểu mô 2. Bọc các cơ quan 3. Bao quanh mao mạch. Mô liên kết thưa , một loại mô liên kết mềm của cơ thể (x 400) 22/02/2016 11:56 CH. 41. Nguyễn Hữu Trí. 22/02/2016 11:56 CH. 42. Nguyễn Hữu Trí. 7.

(8) 2/22/2016. Mô liên kết dạng lưới Reticular Connective Tissue (Loose) • Loại mô này hiện diện ở tủy đỏ của xương, nhu mô của tỳ tạng, vách xơ của gan, lỏi lông nhung của ruột non và tử cung • Các sợi lưới phân nhánh mịn tạo thành mạng. •. Chức năng. 1. Là bộ xương mềm phía trong cố định các loại tế bào. •. Vị trí 1. Hạch bạch huyết 2. Tủy đỏ của xương xốp 3. Nhu mô của tỳ tạng (lá lách). Bạch cầu. Tỳ tạng. Mô liên kết dạng lưới Reticular Connective Tissue. Sợi lưới. Mô liên kết dạng lưới hình thành bộ xương trong của tỳ tạng (x 350) 22/02/2016 11:56 CH. 43. 22/02/2016 11:56 CH. Nguyễn Hữu Trí. Mô mỡ Adipose Tissue. 44. Nguyễn Hữu Trí. Mô mỡ Adipose Tissue (Loose). Có nguồn gốc từ mô liên kết thưa, các tế bào bón tích lũy đầy lipid, làm tế bào căng lên. Mỡ cung cấp năng lượng cho cơ thể, điều hòa thân nhiệt. Khối mỡ Sợi tạo keo Nhân tế bào Mạch máu Mô mỡ dưới da (x450) 22/02/2016 11:56 CH. 45. Nguyễn Hữu Trí. •. Chức năng: 1. Các tế bào sợi tổng hợp và tích lũy lipid ở trong làm cho tế bào phồng lên, nhân bị ép sang một bên 2. Khi bị đói ăn thì mỡ bị oxyhóa để tạo ra năng lượng và nước, các tế bào mỡ sẽ xẹp đi và trở về dạng tế bào sợi (chuyển dạng tế bào) 22/02/2016 11:56 CH. Mô nhầy (Gelatinous connective tissue) • Chất căn bản dạng keo lỏng, các sợi collagen xếp thành từng bó lượn sóng, tế bào dạng hình sao tạo mạng chứa nhiều glycogen. • Phân bố ở dây rốn, da của phôi, mào của gà. 22/02/2016 11:56 CH. 47. Nguyễn Hữu Trí. 46. Nguyễn Hữu Trí. Mô hạt • Chỉ xuất hiện khi bị nhiễm khuẩn hay bị tổn thương, có nguồn gốc từ mô liên kết thưa. • Ví dụ: mụn nhọt, khi lành bệnh thì không còn mô hạt nữa. 22/02/2016 11:56 CH. 48. Nguyễn Hữu Trí. 8.

(9) 2/22/2016. Mô liên kết sợi Fibers Connective Tissue Chất gian bào chủ yếu là các loại sợi. Tế bào chủ yếu là nguyên bào sợi Gồm các loại 1. Gân 2. Dây chằng 3. Cân 4. Lớp bì của da. Gân (Tendons) Nối các mấu xương với đầu cơ. Chịu tác dụng của các lực theo chiều dọc nên các sợi collagen và các tế bào xếp định hướng song song với chiều tác dụng của lực. Có ít chất cơ bản vô định hình dạng keo lỏng Khớp vai. Sợi collagen. Dây chằng Gân Nhân của nguyên bào sợi Gân người (x 1000). 22/02/2016 11:56 CH. 49. Nguyễn Hữu Trí. Dây chằng (Ligaments). 22/02/2016 11:56 CH. 50. Nguyễn Hữu Trí. 3. Cân (Aponeuroses) Là màng liên kết sợi, mỏng, nhiều lớp. Các sợi collagen trong cùng một lớp thì xếp song song, còn hai lớp ở kế cận thì song song hoặc chéo nhau.. Ràng buộc giữa hai đầu xương dài để tạo thành bao khớp hoặc làm nhiệm vụ treo (dây chằng ở gáy bò). Có cấu tạo giống như gân nhưng các sợi collagen ít căng. Các dây chằng đàn hồi còn có thêm sợi elastic (dây thanh âm ở thanh quản). 22/02/2016 11:56 CH. 51. Nguyễn Hữu Trí. Lớp bì của da (Dermis) Phân bố dưới biểu bì của da, gồm nhiều bó sợi collagen xếp không định hướng, chịu lực tác dụng theo nhiều chiều khác nhau, làm cho da bền vũng. Sợi collagen xếp không định hướng. 22/02/2016 11:56 CH. 52. Nguyễn Hữu Trí. Mô liên kết cứng Chất gian bào chủ yếu là chất vô định hình cứng, hòa quyện với một số sợi liên kết còn gọi là chất khuôn, thành phần tế bào thưa thớt, gồm 6 loại:  1. Sụn trong  2. Sụn đàn hồi  3. Sụn sợi  4. Xương xốp  5. Xương đặc  6. Dentine. Lớp bì của da 22/02/2016 11:56 CH. 53. Nguyễn Hữu Trí. 22/02/2016 11:56 CH. 54. Nguyễn Hữu Trí. 9.

(10) 2/22/2016. Mô sụn trong: Hyaline Cartilage • Phân bố ở các đầu xương sườn, thành khí quản và hầu, bộ xương của phôi, mặt khớp của các xương dài khi trưởng thành • Các tế bào sụn thường có hình tròn hay hình trứng và nằm trong nang sụn. • Chất căn bản thường là đồng nhất, có chứa các sợi collagen.. Mô sụn đàn hồi: Elastic Cartilage Vị trí: có ở vòm mí mắt, vành tai và ống tai, sụn vách mũi, sụn trong lưỡi gà (ở hầu). Các tế bào cũng nằm trong nan sụn. Trong chất căn bản vô định hình có chứa các sợi đàn hồi. Tế bào sụn trong ổ sụn. Tế bào sụn trong ổ sụn. Sụn sườn. Chất nền. Chất nền Mô sụn trong từ khí quản (x300) 22/02/2016 11:56 CH. 55. Nguyễn Hữu Trí. Mô sụn sợi: Fibrocartilage Vị trí: gồm các đĩa sụn gian đốt sống, chổ giao nhau của hai xương mu, mấu các xương có gân bám vào. Gồm các bó sợi collagen xếp sít nhau, xen kẽ có các nang sụn chứa tế bào sụn.. Tế bào sụn trong ổ sụn Sợi collagen. Mô sụn đàn hồi ở tai người (x 640) 22/02/2016 11:56 CH. 56. Nguyễn Hữu Trí. Mô xương: BoneTissue • Mô liên kết rất cứng để thích nghi với chức năng chống đỡ của cơ thể. • Cấu tạo gồm tế bào xương và chất căn bản của xương. • Xương là nơi dự trữ khoáng quan trọng – hỗ trợ quá trình tạo huyết • Có hai loại xương là: • xương xốp • xương đặc. Sụn sợi tạo nên các đĩa sụn gian đốt sống (x 200) 22/02/2016 11:56 CH. 57. Nguyễn Hữu Trí. Xương xốp: Spongy Bone. 22/02/2016 11:56 CH. 58. Nguyễn Hữu Trí. Xương xốp: Spongy Bone. Xương do tủy tạo cốt sinh ra, gồm những hốc tủy lớn, khúc khuỷu, thông với nhau và ngăn cách nhau bằng những vách ngăn không đầy đủ do một số ít lá xương tạo nên gọi là phiến xương. Phân bố: ở các Phiến xương đầu xương dài (xương ống) và ở lõi các xương Tủy xương dẹt (xương vòm sọ, xương chậu). Các dải xương xếp xen kẽ với các hốc chứa đầy tủy xương, đó là nơi tạo xương dài ở tuổi đang lớn. 22/02/2016 11:56 CH. 59. Nguyễn Hữu Trí. 22/02/2016 11:56 CH. 60. Nguyễn Hữu Trí. 10.

(11) 2/22/2016. Xương đặc: Compact Bone • Xương do tủy tạo cốt sinh ra, tạo bởi những khối xương hình trụ gọi là ống Havers (Haversian systems hoặc osteons ). Vị trí: là thành phần cứng của các xương dài, có cấu tạo dày đặc không có xoang, hốc như ở xương xốp. Ống Havers Ổ xương. Các hệ thống xương ống có mạch máu đi vào và đi ra qua ống Volkman, làm nhiệm vụ trao đổi chất giữa tủy xương và bên ngoài. Chức năng • Là chổ bám cho cơ • Dự trữ chất khoáng • Nâng đỡ và bảo vệ. Phiến xương. Cấu tạo của xương đặc (x 70) 22/02/2016 11:56 CH. 61. Nguyễn Hữu Trí. 22/02/2016 11:56 CH. 62. Nguyễn Hữu Trí. Dentine • Dentine là chất căn bản vô định hình của răng, có cấu trúc giống như ở xương đặc nhưng cứng hơn nhiều, do các nguyên bào răng (odonblasts) tạo thành, chứa 70% chất khoáng. 22/02/2016 11:56 CH. 63. Nguyễn Hữu Trí. 22/02/2016 11:56 CH. Mô máu: Blood Tissue. 64. Nguyễn Hữu Trí. Các loại bạch cầu. • Mô máu: gồm các tế bào máu và chất căn bản vô định hình ở dạng lỏng, đó chính là huyết tương của máu và bạch huyết. • Huyết tương = huyết thanh + tơ huyết Hồng cầu Bạch cầu Huyết tương 22/02/2016 11:56 CH. 65. Nguyễn Hữu Trí. 22/02/2016 11:56 CH. 66. Nguyễn Hữu Trí. 11.

(12) 2/22/2016. MÔ CƠ (Muscular Tissue). • Có nguồn gốc từ lá phôi giữa, riêng cơ bì có nguồn gốc từ lá phôi ngoài. • Đơn vị cấu tạo có thể là tế bào cơ (cơ trơn, cơ tim), hay hợp bào (cơ vân). • Là loại mô được biệt hóa cao để thực hiện chức năng vận động trong tế bào hoặc hợp bào không có trung thể và không có khả năng phân chia từ khi cơ sơ sinh cho đến khi chết (trừ cơ trơn).. Chia làm ba loại 1. Cơ trơn 2. Cơ vân 3. Cơ tim. 22/02/2016 11:56 CH. Mô cơ. 67. Nguyễn Hữu Trí. Cơ vân: Skeletal Muscle Gắn liền với bộ xương (trừ cơ thành bụng và cơ hoành), co mạnh và theo ý muốn. Sợi cơ có dạng hình ống, là thể hợp bào. Mỗi hợp bào có một màng chung bao bọc, bên trong màng có nhân hình gậy nằm sát màng. Chiều dài của hợp bào từ 1-40 mm, rộng từ 10-40 mm. Trên mỗi sợi cơ có một tấm thần kinh –cơ điều khiển sự co giãn của cơ theo ý muốn.. 22/02/2016 11:56 CH. 68. Cơ trơn: Smooth Muscle • Phân bố ở các nội quan, co yếu, lâu mỏi và không theo ý muốn. • Cơ bì: cơ dụng lông, cơ co giãn đồng tử mắt, cơ co tuyến lệ, tuyến sữa, tuyến nước bọt và tuyến mồ hôi.Cơ trơn chính thức: tế bào dạng hình thoi, nhân nằm chính giữa tế bào, trong cơ chất có các tơ cơ và sơ cơ là các protein co rút. Chiều dài mỗi sợi cơ trơn từ 20-500 mm, đường kính từ 8-10 mm.. Nhân. Tế bào cơ trơn Nhân. Sợi cơ. 22/02/2016 11:56 CH. Cơ vân (x 300) 69. Nguyễn Hữu Trí. Cơ tim: Cardiac Muscle. Nguyễn Hữu Trí. 22/02/2016 11:56 CH. Tấm cơ trơn (x 600) 70. Nguyễn Hữu Trí. Mô thần kinh: Nervous Tissue. • Chỉ có ở tim, co nhịp nhàng, tự động suốt cuộc sống của cá thể. • Được cấu tạo từ những tế bào riêng biệt, tế bào thường có nhánh để tạo cầu nối giữa chúng với nhau. • Nhân nằm giữa tế bào. Những đĩa xen vào giữa Nhân. 22/02/2016 11:56 CH. 71. Nguyễn Hữu Trí. 22/02/2016 11:56 CH. 72. Nguyễn Hữu Trí. 12.

(13) 2/22/2016. Mô thần kinh: Nervous Tissue •. Có nguồn gốc từ lá phôi ngoài. Các tế bào thần kinh đệm là các tế bào ngoại lai, chúng là dẫn xuất của tế bào trung mô (từ lá phôi giữa) xâm nhập vào mô thần kinh trong quá trình phát triển. Các tế bào thần kinh có tên gọi là neuron (Waldeyer – 1891). Các neuron là tế bào có “kích thước” lớn nhất, nhánh của chúng có thể dài hàng mét. Ngoài neuron ra còn có các tế bào thần kinh đệm (neuroglia).. •. •. 22/02/2016 11:56 CH. 73. Nguyễn Hữu Trí. Cấu trúc của neuron • • • •. Thân tế bào (Cell body hay Perikaryon) Sợi nhánh (Dendrite) Sợi trục (Axon ) Đầu tận cùng synap (Synaptic terminal). 22/02/2016 11:56 CH. 75. Mô thần kinh: Nervous Tissue • Ở hệ thần kinh trung ương dựa vào màu sắc và cấu tạo tự nhiên người ta chia làm hai loại chất là chất xám và chất trắng. • Ở neuron có sự phân cực chức năng: sợi nhánh là cực thu tín hiệu, sợi trục là cực phát tín hiệu.. 22/02/2016 11:56 CH. • Mặc dù đa dạng, hầu như tất cả neuron đều có 4 cấu trúc cơ bản là sợi nhánh, thân tế bào, sợi trục, và đầu tận cùng synap. • Sợi nhánh: tương đối ngắn, phân nhánh nhiều, thường là phần kéo dài của bề mặt tế bào chúng tập hợp lại một diện tích rất lớn để nhận thông tin. • Thân tế bào: chứa nhân và các bào quan thực hiện nhiệm vụ tổng hợp protein và nhiều hoạt động trao đổi chất. • Sợi trục: là dây cáp thần kinh truyền các tín hiệu dưới dạng điện thế hoạt động (xung thần kinh) từ một đểm tới các điểm khác trong hệ thần kinh. Dây thần kinh thực tế là một bó nhiều sợi trục, các sợi có thể chaỵ song song hoặc quấn lấy nhau. • Đầu tận cùng synap: ở đầu mút của sợi trục. Đầu tận cùng synap có các túi nhỏ chứa chất truyền thần kinh hóa học Nguyễn Hữu Trí. 22/02/2016 11:56 CH. 76. Nguyễn Hữu Trí. Eo thắt Ranvier. • Hỗn hợp gồm: những photphoamin – lipid (như lecithil, một số photpholipid, sphingomyelin), xerebrozit và ít cholesterol. Myelin là chất tạo thành một bao không liên tiếp bọc quanh trụ trục của những sợi thần kinh có myelin. • Các tế bào Schwann bao quanh màng axon, một phần màng của chúng kéo dài quấn quanh sợi trục là bao myelin. Các tế bào Schwann không phủ kín liên tục màng axon mà từng tế bào Schwann bao một đoạn của axon, khoảng cách giữa các tế bào Schwann đó tạo thành một eo thắt gọi là eo Ranvier. 77. Nguyễn Hữu Trí. Cấu trúc của neuron. Myelin. 22/02/2016 11:56 CH. 74. Nguyễn Hữu Trí. • Khoảng cách giữa các tế bào Schwann đó tạo thành một eo thắt gọi là eo Ranvier ở đó không có bao myelin • Màng axon tại eo ranvier có khả năng dẫn điện, liên quan đến hiện tượng lan truyền nhảy bậc.. 22/02/2016 11:56 CH. 78. Nguyễn Hữu Trí. 13.

(14) 2/22/2016. Sợi nhánh. Thân neuron • Thân neuron là thành phần chính của neuron bao gồm nhân và bào tương (không kể các nhánh bào tương). • Thân neuron là trung tâm dinh dưỡng, tuy vậy thân neuron cũng có khả năng tiếp nhận xung. • Nhiễm sắc chất mịn và lan tỏa, phản ánh hoạt động tổng hợp mạnh của các neuron. • Thân neuron có lưới nội bào hạt rất phát triển sắp xếp lại thành các khoang dài nằm song song với nhau. Khi nhuộm lưới nội bào hạt và các ribosom tự do có thể nhìn thấy được gọi là thể Nissl. Bộ Golgi chỉ có ở thân neuron, bao gồm rất nhiều khoang dài sắp xếp song song, có xuất nguồn từ lưới nội bào không hạt. Các ti thể có rất nhiều ở gò sợi trục và rải rác trong bào tương của thân neuron.. 22/02/2016 11:56 CH. 79. Nguyễn Hữu Trí. • Sợi nhánh (dendrite) thường ngắn và phân chia ra nhiều nhánh nhỏ hơn giống cành cây. Sợi nhánh có rất nhiều synap, nơi tiếp nhận và xử lý tín hiệu của neuron. Hầu hết các neuron đều có nhiều sợi nhánh giúp gia tăng diện tích tiếp nhận thông tin của neuron. Cấu trúc cây tận cùng (tương đương rễ tận cùng ở sợi trục) cho phép một neuron tiếp nhận và liên hệ với rất nhiều đầu tận cùng của sợi trục của neuron khác. • Đa số các synap gắn vào neuron đều hiện diện ở các gai sợi nhánh (dendrite pine) (tương đương cúc tận cùng ở sợi trục) 22/02/2016 11:56 CH. Nguyễn Hữu Trí. 80. Sợi trục • Hầu hết các neuron chỉ có một sợi trục. Một số neuron có sợi trục ngắn, đa số neuron có sợi trục dài. Tất cả sợi trục đều có đoạn gốc xuất phát từ thân neuron, có hình tháp, gọi là gò sợi trục (axon hillock). Màng bào tương sợi trục bao quanh bào tương sợi trục (axoplasm). • Khác với sợi nhánh, sợi trục có đường kính ổn định và thường không chia nhiều nhánh. Tất cả nhánh của sợi trục được gọi là nhánh bên (collateral branch). Sợi trục không có lưới nội chất hạt nên phải phụ thuộc vào thân neuron để tồn tại. • Sợi trục dẫn luồng thần kinh từ thân tế bào để truyền sang tế bào khác 22/02/2016 11:56 CH. 81. Nguyễn Hữu Trí. Tế bào Schwann. Axon. Khe Ranvier. Bao Myelin Đầu tận cùng synapse 22/02/2016 11:56 CH. Nguyễn Hữu Trí. 82. Neuron đơn cực Unipolar Neuron. Phân loại theo kích thước và hình dạng. Thân tế bào. • Dựa vào hình dạng và kích thước neuron được chia làm 3 loại:. • Neuron chỉ có một điểm xuất phát của sợi thần kinh mọc ra từ thân tế bào, tế bào này có một đoạn chung giữa sợi trục và sợi nhánh nên ta có cảm giác là một cực. Là neuron cảm giác • Một nhánh bào tương (sợi nhánh) cho đầu tận cùng đi đến thần kinh ngoại biên. Một nhánh (sợi trục) đi vào thần kinh trung ương. • Các neu ron loại này có ở các hạch tủy (hạch cảm giác ở rễ sau các dây thần kinh tủy) ; loại neuron này cũng có ở hầu hết các hạch não..  1. Neuron đơn cực  2. Neuron lưỡng cực  3. Neuron đa cực. 22/02/2016 11:56 CH. Axon. Dendrite. 83. Nguyễn Hữu Trí. 22/02/2016 11:56 CH. 84. Nguyễn Hữu Trí. 14.

(15) 2/22/2016. Neuron lưỡng cực Bipolar Neuron Dendrite. Thân tế bào. Neuron đa cực (Multipolar Neuron) Thân tế bào. Axon Axon. • Neuron có hai điểm xuất phát của những sợi thần kinh mọc ra từ thân tế bào, một của sợi trục và nhánh còn lại là của sợi nhánh. Không được myelin hóa, đóng vai trò quan trọng ở các giác quan. • Neuron hai cực có ở các hạch ốc tai và hạch tiền đình, võng mạc thị giác và niêm mạc khứu giác.. 22/02/2016 11:56 CH. 85. Nguyễn Hữu Trí. Phân loại theo chức năng. Dendrites. • Neuron có nhiều điểm xuất phát của những sợi thần kinh mọc ra từ thân tế bào, trong đó chỉ có một sợi trục, còn các nhánh bào tương khác là sợi nhánh (dendrite). 22/02/2016 11:56 CH. 86. Nguyễn Hữu Trí. Phân loại dựa vào chức năng. • Các sai khác về vị trí và tỉ lệ các sợi nhánh và sợi trục giúp ta phân biệt được các loại neuron. Dựa vào chức năng người ta chia neuron ra làm ba loại:  1. Neuron vận động  2. Neuron cảm giác  3. Neuron trung gian.. 22/02/2016 11:56 CH. 87. Nguyễn Hữu Trí. Neuron vận động Motor (Efferent) Neuron • Còn gọi là các neuron đáp ứng • Là những neuron dẫn xung thần kinh đi ra khỏi hệ thần kinh trung ương (CNS) đến cơ gây co cơ và tới tuyến làm tuyến tiết ra. Điều khiển hoạt động của các cơ quan đích • Phản ứng hoặc kích thích chuyên hóa với mệnh lệnh ở mức cao hơn từ não bộ. • Ở người có khoảng 3 triệu neuron vận động.. 22/02/2016 11:56 CH. 89. Nguyễn Hữu Trí. 22/02/2016 11:56 CH. 88. Nguyễn Hữu Trí. Neuron cảm giác Sensory (Afferent) Neurons. • Còn gọi là các neuron thụ cảm. • Là các neuron dẫn luồng xung thần kinh về hệ thần kinh trung ương (CNS) được gọi là neuron hướng tâm. • Mỗi neuron cảm giác nhận một loại kích thích đặc biệt như ánh sáng, áp lực, nhiệt độ, hoặc một loại kích thích hóa học do các sợi nhánh nhận được làm biến đổi thành hoạt động điện, rồi di chuyển theo sợi trục dưới dạng xung thần kinh. • Các tế bào thụ cảm ở các cơ quan cảm giác không có sợi trục và chuyển thông tin tới các neuron cảm giác thật sự, các neuron nà mang thông tin đến các neuron trung gian hoặc đôi khi là neuron vận động. 22/02/2016 11:56 CH. 90. Nguyễn Hữu Trí. 15.

(16) 2/22/2016. Neuron trung gian Association or Interneuron • Nhận thông tin từ các neuron thụ cảm hoặc các neuron trung gian khác, xử lý thông tin và chuyển đến các neuron vận động. • Neuron trung gian còn là nơi xảy ra các quá trình ở mức độ cao như học tập và trí nhớ. • Các neuron trung gian là nơi hợp nhất của hệ thần kinh. • Khoảng 98% của 100 tỷ tế bào trong hệ thần kinh của người là các neuron trung gian 22/02/2016 11:56 CH. 91. Nguyễn Hữu Trí. Các tế bào thần kinh đệm Glial Cell • Là các tế bào thần kinh khác với neuron, chúng nằm trong hệ thần kinh trung ương (CNS), bao quanh các thân neuron, sợi trục và sợi nhánh có nhiệm vụ nâng đỡ, dinh dưỡng và bảo vệ các neuron. • Ở động vật có vú, các tế bào thần kinh đệm có số lượng gấp 10 lần neuron • Người ta cho rằng chúng còn tham gia vào quá trình tích lũy và xử lý thông tin (trí nhớ) • Chúng gồm hai loại lớn: Các tế bào đệm lớn (Macroglia) và các tế bào đệm nhỏ (Microglia) 22/02/2016 11:56 CH. Các tế bào đệm lớn (Macroglia). 92. Nguyễn Hữu Trí. Astrocyte. Các tế bào đệm hình sao: Astrocyte • Có dạng hình sao có nhiều nhánh bào tương • Có nhiều chức năng • Điều chỉnh môi trường hóa học xung quanh các neuron bằng hệ đệm. • Trao đổi chất giữa các mao mạch và các neuron. • Vận chuyển các chất dinh dưỡng 22/02/2016 11:56 CH. 93. Kích thước lớn và có số lượng nhiều nhất. Nguyễn Hữu Trí. Các tế bào đệm lớn (Macroglia) Tế bào đệm ít nhánh: Oligodendroglia. 22/02/2016 11:56 CH. 94. Nguyễn Hữu Trí. Oligodendrocyte • Nhỏ hơn astrocyte. • Oligodendrocytes tổng hợp bao myelin có tác dụng cách điện đối với một số neuron trong CNS. • Các tế bào ít nhánh cho các nhánh bào tương của mình bao quanh lấy sợi trục, tạo nên bao myelin.. 22/02/2016 11:56 CH. 95. Nguyễn Hữu Trí. 22/02/2016 11:56 CH. 96. Nguyễn Hữu Trí. 16.

(17) 2/22/2016. Các tế bào đệm nhỏ (Microglia). • Có nguồn gốc từ lá phôi giữa. • Các tế bào có hình trứng, các sợi nhánh rất mảnh và phức tạp. Nhỏ nhất, có khả năng đại thực bào, số lượng tăng khi có tổn thương và viêm. • Kiểm tra tình trạng của các neuron là một loại đại thực bào ở mô thần kinh, trực thuộc hệ thực bào đơn nhân, có tiền thân là mono bào của tủy xương. • Đặc biệt là có khả năng thực bào các vi sinh vật và các mảnh vỡ của mô. • Hệ thống tế bào miễn dịch không chịu sự điều khiển của CNS, liên quan đến hoạt động viêm và sữa chữa hệ thần kinh ở người trưởng thành. 22/02/2016 11:56 CH. 97. Các tế bào đệm nhỏ (Microglia). Nguyễn Hữu Trí. 22/02/2016 11:56 CH. 98. Nguyễn Hữu Trí. Tế bào hỗ trợ trong PNS Tế bào Schwann. Tế bào Ependymal • Lót ống nội tủy và thành các não thất • Một số vùng có lông • Một số được biệt hóa để tiết ra dịch não tủy. • Hình thành nên bao myelin bao quanh sợi trục (axon) trong PNS. • Có chức năng giống tế bào ít nhánh là tạo bao myelin song chỉ có ở thần kinh ngoại biên. Một tế bào Schwann tạo bao myelin cho một đoạn của sợi trục, khác với tế bào ít nhánh có vài nhánh bao lấy nhiều hơn một sợi trục. 22/02/2016 11:56 CH. 99. Nguyễn Hữu Trí. 22/02/2016 11:56 CH. 100. Nguyễn Hữu Trí. 17.

(18) Chương 2. Đại phân tử (Polymer). Cấu trúc và chức năng các Đại phân tử Sinh học. 21/02/2016 3:24:33 CH. 1. Monomer: Mono = một; mer = đơn vị  Đại phân tử là gì? Poly = nhiều; mer = đơn vị. Một polymer là một phân tử lớn chứa nhiều đơn vị (monomer) nhỏ liên kết với nhau.. Nguyễn Hữu Trí. Monosaccharide. Các đại phân tử sinh học quan trọng. - Dạng đơn phân chứa 4 – 7 C là phổ biến nhất trong tế bào - Đơn phân thường có sườn cấu trúc chung, khác nhau ở các nhóm thế và vị trí khoâng gian cuûa nhoùm OH- trong maïch carbon. - Protein (55%) - Nucleic acid (23,6%) DNA 3,1%; RNA 20,5%) - Lipid (9,1%) - Polysaccharide (5%). 21/02/2016 3:24:33 CH. 3. Nguyễn Hữu Trí. 21/02/2016 3:24:33 CH. Polysaccharide. 4. Nguyễn Hữu Trí. Polysaccharide. - Liên kết giữa các đơn phân là liên kết glycoside - Các polysaccharide khác nhau do khác hướng liên kết glycoside (, ), khác đơn phân, khác tổ hợp các loại đơn phân - Caùc polysaccharide quan troïng cellulose, glycogen, tinh boät, chitin.. Lạp thể. Tinh bột. Ti thể. Hạt glycogen. 0.5 m. 1 m Glycogen. Amylose. 21/02/2016 3:24:33 CH. 5. Nguyễn Hữu Trí. 21/02/2016 3:24:33 CH. Amylopectin. 6. Nguyễn Hữu Trí. 1.

(19) Polysaccharide Sợi cellulose trong vách tế bào Vi sợi Vách tế bào]. Khoảng 80 phân tử cellulose liên kết để hình thành vi sợi, cấu trúc chính của vách tế bào. Polysaccharide  Chitin, một polysaccharide quan trọng khác – Được tìm thấy ở bộ xương ngoài của động vật chân đốt. – Có thể được sử dụng như chỉ khâu trong phẫu thuật. 0.5 m CH2O H O OH H OH H OH H. Tế bào thực vật. H. OH CH2OH OH CH2OH O O O O OH OH OH OH O O O O O O CH OH OH CH2OH 2 H CH2OH OH CH2OH OH O O O OH O OH OH OH O O O O O O CH OH OH CH2OH 2 H CH2OH OH OH CH2OH O O O OH O OH OH O O OH O O O O CH OH OH CH2OH 2 H. Liên kết giữa hai phân tử cellulose song song là cầu nối hydrogen giữa nguyên tử carbon 3 và 6.. Phân tử Cellulose. O. CH3. monomer. 7. NH C. Một phân tử cellulose là một polymer -glucose không phân nhánh..  Glucose. 21/02/2016 3:24:33 CH. H. 21/02/2016 3:24:33 CH. Nguyễn Hữu Trí. 8. Lipid. Chức năng của Polysaccharide  Polysaccharide có 2 chức năng chính: 1. Dự trữ năng lượng: tinh bột là chất dự trữ năng lượng chính ở thực vật trong khi ở động vật là glycogen 2. Cấu trúc: cellulose, thành phần chính của vách tế bào thực vật, là polymer dồi dào nhất trên trái đất. Chitin, là polymer dồi dào thứ hai trên trái đất, là thành phần cấu tạo nên lớp vỏ ngoài của động vật chân đốt, giáp xác, nhện, cũng như là vách tế bào của một số loại nấm 21/02/2016 3:24:33 CH. 9. Thaønh phaàn quan troïng cuûa maøng Lipid ñôn giaûn: triglyceride Lipid phức tạp: có chứa P, N, S, các nhóm đường, ethanol amine, serine, choline Phospholipid quan troïng trong caáu truùc maøng. Steroid, saùp…. Chất béo chưa bão hòa. CH2. 3 3. 10. O. Nguyễn Hữu Trí. Lipid  Steroid, cholesterol – Được tìm thấy trên màng tế bào HC – Là tiền chất của một vài loại hormones. CH3. 3. Choline. CH2 O–. Chất béo bão hòa. Cầu nối đôi. Lipid. O P. Stearic acid. Oleic acid. 21/02/2016 3:24:33 CH. Nguyễn Hữu Trí. Cấu trúc Phospholipid Gồm một đầu ưa nước và đuôi kị nước + N(CH ). Nguyễn Hữu Trí. CH3. CH3. Phosphate. O CH2. CH. O. O. C. O C. CH2. Glycerol. CH3. O.  Sáp Acid béo Hydrophilic head Hydrophobic tails. (a) Structural formula. 21/02/2016 3:24:33 CH. (b) Space-filling model. 11. HO. – Là loại lipid tìm thấy trong vỏ bao bên ngoài ở thực vật hoặc bao bọc ở động vật.. (c) Phospholipid symbol. Nguyễn Hữu Trí. 21/02/2016 3:24:33 CH. 12. Nguyễn Hữu Trí. 2.

(20) Protein. Amino acid. - Cấu tạo bởi chuỗi các amino acid nối với nhau bằng liên kết peptide - Hai möôi amino acid khaùc nhau veà tính chaát hoùa hoïc cuûa caùc nhaùnh bên trong phân tử - Đặc tính rất đa dạng của các protein do trình tự amino acid H H3N+. CH3. O H3. C. C. H Glycine (Gly). O–. N+. C. H3N+. C. H Alanine (Ala). O–. CH. CH3 CH3. O. C. CH2. CH2. O H3N+. C. H Valine (Val). CH3. CH3. CH3 CH3. O–. C. O C. H Leucine (Leu). H3C. CH. N+. C. H3 O–. O C O–. H Isoleucine (Ile). Không phân cực. CH3 CH2. S +H N 3. NH. CH2. Amino end. CH2. Amino acid subunits. H3N+. C. pleated sheet. CH2. O H3N+. C O–. H. 13. OH. C. +. H3N. C. C. +. O–. H. Serine (Ser). O. C. CH2 H3N +. O–. H. C. CH2. O. H3N. C. H. O–. CH2. O. H3N. C. C. +. O–. H. CH2 CH2. O. H3N. C. +. O–. H. Tyrosine (Tyr). Cysteine (Cys). Threonine (Thr). C. +. C. O– H. C O–. Tryptophan (Trp). 14. O C. Proline (Pro). Nguyễn Hữu Trí. C. O C O–. H. Glutamine (Gln). Asparagine (Asn). - Phân tử protein có bốn cấp độ cấu trúc: + Cấu trúc bậc một là trình tự các amino acid + Cấu trúc bậc hai do sự hình thành các vòng xoắn hoặc các phiến bên trong sợi polypeptide do liên kết hydrogen + Cấu trúc bậc ba là cấu trúc uốn khúc nhiều hơn do các liên kết không cộng hóa trị hoặc cộng hóa trị (liên kết –SH) + Cấu trúc bậc bốn là sự kết hợp của nhiều phân tử polypeptide. Basic |. | S. Acidic. S |. O. 2. H3N. NH2 O C. NH2 O C. SH. CH3 CH. CH2. H2N O. Protein. OH. OH CH. H. 21/02/2016 3:24:33 CH. Nguyễn Hữu Trí. C. O–. H. Amino acid Phân cực. H3N+. C. Phenylalanine (Phe). Methionine (Met). 21/02/2016 3:24:33 CH. C. CH2. O. H2C. O–. 2 CH. 2 CH. C. H. H3N +. O. 2. C H. O–. H3N +. C. 21/02/2016 3:24:33 CH. Glutamic acid (Glu). Lysine (Lys). 15. +. H3N +. H. C O–. O. 2. C. O. 2. C H. 2 CH. C O–. H3N. 2 CH. O. 2. H. Aspartic acid (Asp). 2 CH. 2 CH. C. |. O. 2. C. S |. +. NH CH | S. H3N. NH+. NH2 C NH2+ CH. 2 CH. C O–. Arginine (Arg). Nguyễn Hữu Trí. | S. | S. S |. S |. |. Histidine (His). |. |. C CH. C CH. Tích điện. NH3+ CH. O. S |. O–. O. | S. –O. Xoăn tự nhiên. Tóc thẳng. 21/02/2016 3:24:33 CH. 16. Nguyễn Hữu Trí. Cấu trúc bậc 1. Chức năng của Protein GlyPro Thr Gly. 1. Cấu trúc: Bao gồm keratin (protein trong tóc và móng) và collagen (protein trong mô liên kết). Duy trì các cấu trúc cơ quan. 2. Xúc tác: Các enzyme xúc tác các phản ứng hoá học chuyên biệt với tốc độ nhanh gấp nhiều lần bình thường.. +H N 3 Amino end. Thr. Amino acid subunits. Gly Glu CysLysSeu LeuPro Met Val Lys Val Leu Asp AlaValArgGly Ser Pro Ala. 3. Bảo vệ: Các kháng thể (antibody) có khả năng phát hiện và loại bỏ các yếu tố ngoại lai xâm nhập, báo động hệ miễn nhiểm. 4. Vận chuyển: các protein màng vận chuyển các chất xuyên màng, protein máu như hemoglobin, vận chuyển oxygen, sắt, và các chất khác.. GluLle. Asp Thr Lys Ser. Lys Trp Tyr LeuAla Gly lle Ser ProPheHisGlu. His Ala. Glu Val Ala ThrPheVal Asn lle Thr Ala Tyr Arg. Asp. 5. Co bóp: các sợi actin và myosin tìm thấy trong cơ vân.. Ser Arg GlyPro. Thr. 6. Tính hiệu: là các hormone như insulin điều hòa lượng đường trong máu.. SerTyr. Pro SerTyr. Ala. Leu Leu Ser. Thr Ala Val Val LysGlu Thr AsnPro. o c. o–. Carboxyl end. 21/02/2016 3:24:33 CH. 18. Nguyễn Hữu Trí. 3.

(21) Tấm  Amino acid. O H H C C N. C N H. R. O H H R C C N O H H. O H H O H H R C C N C C N R C C N N C C N C C R R C C R OH H OH H O R. R O C. H. O. C. H. H. O H. C N HC N C N HC N C H H C O C O R R. R R H H C C O C O C N H N H N H O C O C H C R H C R H C R H C R N H O C N H O C O C O C N H N H C C R R N. C. R O C H H NH C N C H C O R. Cấu trúc bậc 2. Cấu trúc bậc 3. R C. H. N HC N H O C. Liên kết hydrogen. H. Xoắn . CH. CH22 CH O H. H3C H3C. O. Tương tác kỵ nước và van der Waals. CH3 CH3 CH. Polypeptide backbone. HO C CH2. CH2 S S CH2. Cầu disulfide O CH2 NH3+ -O C CH2 Liên kết Ion. Liên kết yếu: Liên kết hydrogen giữa 2 cực của chuỗi. Liên kết ionic giữa 2 chuỗi tích điện Liên kết kỵ nước và trương tác van der Waals Liên kết mạnh: Cầu nối disulfide hình thành từ liên kết cộng hóa trị. 21/02/2016 3:24:33 CH. 19. 21/02/2016 3:24:33 CH. Nguyễn Hữu Trí. 20. Nguyễn Hữu Trí. Nucleic acid. Cấu trúc bậc 4. - DNA vaø RNA - Được tạo thành từ các đơn phân nucleotide. - Một phân tử nucleotide gồm đường, phosphate vaø base nitric - DNA và RNA khác nhau ở thành phần đường trong nucleotide Nucleoside Nitrogenous base O . O P O. 5’C CH2. O. . O Phosphate group. Kết quả của sự tương tác bởi 2 hay nhiều hơn các chuỗi polypeptide. 3’CPentose sugar. Nucleotide. 21/02/2016 3:24:33 CH. 21. 21/02/2016 3:24:33 CH. Nguyễn Hữu Trí. Nucleic acid. Nguyễn Hữu Trí. 22. Cấu trúc DNA  DNA là chuỗi xoắn kép cấu tạo gồm. - Liên kết cộng hóa trị giữa các nhóm đường và phosphate của hai nucleotide keà nhau taïo thaønh khung đường phosphate - Trình tự các base (A, T, G, C, U) trong boä khung quyeát ñònh ñaëc trưng của phân tử nucleic acid - DNA có cấu trúc mạch đôi gắn với nhau bằng liên kết hydrogen giữa A - T vaø G - C. Hai maïch coù trình tự bổ sung cho nhau. - RNA chæ coù maïch ñôn. 21/02/2016 3:24:33 CH. Nguyễn Hữu Trí. – phân tử đường – Nhóm phosphat – Một base (A,C,G,T).  DNA luôn luôn được tổng hợp theo chiều 5’ P - 3’ OH trong quá trình sao chép 5’ ATTTAGGCC 3’ 3’ TAAATCCGG 5’. 23. 21/02/2016 3:24:33 CH. Nguyễn Hữu Trí. 24. 4.

(22) Chức năng của các Nucleotide  Monomer cho các Nucleic Acid  Vận chuyển năng lượng hóa học từ một phân tử đến phân tử khác (ví dụ ATP).. Nhiễm Sắc Thể: Nơi chứa phân tử DNA 21/02/2016 3:24:33 CH. Tính chọn lọc đồng phân quang học trong heä thoáng soáng. 27. Nguyễn Hữu Trí. Liên kết cộng hóa trị Liên kết hydrogen Tương tác kỵ nước Lực Van der Waals. 21/02/2016 3:24:33 CH. Liên kết cộng hóa trị Được tạo ra do góp chung điện tử giữa các nguyên tử Hydrogen atoms (2 H). 26. Caùc lieân keát hoùa hoïc trong heä thoáng sinh hoïc. - Đồng phân quang học (đồng phân lập thể, stereoisomer): hiện diện ở phân tử có nguyên tử C chứa bốn nhóm thế khác nhau; là ảnh qua göông cuûa nhau - Đồng phân D của đường, đồng phân L của amino acid chiếm ưu thế trong heä thoáng soáng. 21/02/2016 3:24:33 CH. Nguyễn Hữu Trí. 28. Nguyễn Hữu Trí. Liên kết hydrogen Liên kết hydrogen có xu hướng hình thành giữa các nguyên tử có điện âm với nguyên tử Hydro gắn với Oxygen hay Nitrogen. +. +. d–. O H. +. +. d+. H. Water (H2O). d+ d– Ammonia (NH3). +. 21/02/2016 3:24:33 CH. Hydrogen molecule (H2) 29. N H d+. +. Nguyễn Hữu Trí. 21/02/2016 3:24:33 CH. H H d+. d+ 30. Nguyễn Hữu Trí. 5.

(23) Liên kết Van der Waals Xảy ra khi các phân tử gần kề nhau do tương tác giữa các đám mây điện tử.. 21/02/2016 3:24:33 CH. 31. Nguyễn Hữu Trí. Tương tác kỵ nước Xảy ra giữa các nhóm của những phân tử không phân cực. Chúng có xu hướng xếp kề nhau và không tan trong nước.. 21/02/2016 3:24:33 CH. 32. Nguyễn Hữu Trí. 6.

(24) 21/02/2016. DNA là vật liệu di truyền. Chương 3. Quá trình sao chép DNA. 21/02/2016 3:25:51 CH. 1. Nguyễn Hữu Trí. Thí nghiệm về biến nạp của Griffith Tế bào S sống (control). Tế bào R sống (control). Tế bào S chết (control). Trộn tế bào S chết và tế bào R sống.  Bằng chứng 1: Thí nghiệm chứng minh có sự biến nạp ở vi khuẩn, 1928.  Bằng chứng 2: Thí nghiệm chứng minh DNA là nhân tố biến nạp, 1944.  Bằng chứng 3: Thí nghiệm chứng minh vật liệu di truyền của phage T2 là DNA, 1952.. 21/02/2016 3:25:51 CH. 2. Nguyễn Hữu Trí. Năm 1944 nhóm Avery, McCarty, McLeod xác định rõ nguyên nhân gây biến nạp là gì?. → DNA là nhân tố biến nạp KẾT QUẢ Chuột bị chết. Chuột vẫn sống. Chuột vẫn sống. Chuột bị chết. Avery kết luận rằng DNA là vật liệu di truyền Tế bào S sống được tìm thấy trong mẫu máu. 21/02/2016 3:25:51 CH. 3. Nguyễn Hữu Trí. 1952 – Alfred Hershey và Martha Chase kết luận vật liệu di truyền của phage T2 là DNA. 21/02/2016 3:25:51 CH. 4. Oswald T. Avery Nguyễn Hữu Trí. 1953 James D. Watson và Francis H. C. Crick công bố cấu trúc chuỗi xoắn kép của DNA. James Watson và Francis Crick. Hershey và Chase khẳng định rằng DNA là vật liệu di truyền 21/02/2016 3:25:51 CH. 5. Nguyễn Hữu Trí. 21/02/2016 3:25:51 CH. 6. Nguyễn Hữu Trí. 1.

(25) 21/02/2016. DNA là vật liệu di truyền. Cấu trúc xoắn kép của DNA (Double helix structure of DNA). Vật chất di truyền trong cơ thể sinh vật có nhiệm vụ truyền lại tính trạng từ đời trước xong đời sau, trên 3 nguyên tắc:  Vật chất này phải có tính bền vững về thông tin đối với cấu trúc, chức năng, sự phát triển và sự sinh sản của tế bào.  Có khả năng tự tái bản một cách chính xác sao cho tế bào con có thông tin di truyền giống như tế bào mẹ.  Có khả năng thay đổi, giúp sinh vật biến dị, thích ứng, và tiến hóa.. 21/02/2016 3:25:51 CH. 7. Nguyễn Hữu Trí. Đặc điểm của cấu trúc xoắn kép DNA  Phân tử DNA có hai chuỗi dây polynucleotide quấn nhau theo chiều tay phải. Hai dây này đối xứng nhau, cùng song hành theo từng cặp base tương ứng, theo qui ước đầu 5’ là gốc, đầu 3’ là đuôi. Dây cơ bản còn gọi là dây xương sống được hình thành bởi đường và photphase với những base đính hai bên trong dây.. 9. Nguyễn Hữu Trí. Tính ổn định và biến động của DNA.  Tính ổn định của DNA là kết quả của hai quá trình: sao chép và sửa sai  Các biến đổi của DNA: đột biến, tái tổ hợp, các gen nhảy. 21/02/2016 3:25:51 CH. 11. 8. Nguyễn Hữu Trí. Đặc điểm của cấu trúc xoắn kép DNA • Những base này ở trên hai dây đối xứng nhau được nối liền bởi cầu nối hydrogen: A-T và G-C. Cầu nối hydrogen rất dễ bị tách ra (ví dụ như nhiệt độ cao) để tạo thành hai dây đơn. Cặp base tương ứng A-T và C-G được gọi bằng thuật ngữ chuyên môn là “complement base pair”. Nối C-G (3 cầu nối) bền hơn nối A-T (2 cầu nối) • Các cặp base cách nhau 0,34 nm trên dây xoắn DNA. Mỗi một góc quay hoàn toàn (360o) của dây xoắn (helix) có độ dài 3,4 nm. Do đó, mỗi đoạn xoắn như vậy có tất cả 10 cặp base. Đường kính của một góc quay là 2nm. • Kết quả của cấu trúc dây xoắn kép tạo ra những rãnh chính (major groove) và những rãnh phụ (minor groove). Cả hai rãnh này có kích thước đủ rộng cho phép những phân tử protein tiếp xúc với những base.. - Chuỗi xoắn kép cho phép các base purine và pirimidine có cấu trúc phẳng xếp chồng khít lên nhau ở bên trong phân tử DNA, hạn chế sự tiếp xúc của chúng với nước. Chúng đính thẳng góc với dây xoắn. - Các nguyên tử đường và các nhóm phosphate xoay ra ngoài hình thành liên kết với nước đảm bảo tính ổn định cho phân tử. 21/02/2016 3:25:51 CH. 21/02/2016 3:25:51 CH. Nguyễn Hữu Trí. 21/02/2016 3:25:51 CH. 10. Nguyễn Hữu Trí. Tính ổn định của DNA  Cơ chế sao chép bán bảo tồn  Các cơ chế sửa sai DNA. 21/02/2016 3:25:51 CH. 12. Nguyễn Hữu Trí. 2.

(26) 21/02/2016. Thí nghiệm của Meselson và Stahl Sự sao chép của DNA có tính chất bán bảo tồn. Tổng quan về sự sao chép DNA  Chuỗi xoắn kép DNA bao gồm 2 mạch bắt cặp bổ sung  Mỗi mạch có thể làm nền để tổng hợp nên mạch mới – Cách thức tái bản như vậy được gọi là mô hình bảo thủ một nửa (semiconservative). – Một mạch được tổng hợp liên tục, một mạch được tổng hợp không liên tục (các đoạn ngắn sau đó được nối lại) được gọi là sao chép bán liên tục – Cần mồi DNA primer. Đồng vị nặng của Nitơ (không phải đồng vị phóng xạ) được dùng trong thí nghiệm này 21/02/2016 3:25:51 CH. 13. Nguyễn Hữu Trí. Sự sao chép DNA  Một mạch được sao chép liên tục hướng vào ngã ba sao chép (replicating fork).  Một mạch được sao chép không liên tục tạo ra các đoạn 1-2 kb Okazaki theo hướng ngược lại (hướng ra khỏi ngã ba sao chép).  Điều này đảm bảo cả hai mạch được sao chép theo đúng chiều 5’3’.. 21/02/2016 3:25:51 CH. 14. Nguyễn Hữu Trí. Ngã ba sao chép • Sự sao chép DNA diễn ra tại vị trí ngã ba sao chép (replication fork) • Đây là quá trình: – Theo một hướng duy nhất – chĩa ba sao chép di chuyển theo một hướng trong khi cái còn lại thì cố định ở origin – Theo hai hướng – hai chĩa ba di chuyển theo hai hướng ngược nhau từ origin. • Hầu hết sự sao chép ở vi khuẩn và ở tế bào eukaryote là theo hai hướng 21/02/2016 3:25:51 CH. 15. Nguyễn Hữu Trí. Cấu trúc sao chép có dạng theta “q” • DNA bắt đầu sao chép với sự tạo thành “bubble” – một vùng nhỏ nơi chuổi gốc (template) được tách ra và DNA con đã được tổng hợp • DNA được tách mạch tại điểm khởi đầu sao chép (ORI). Mỗi mạch đóng vai trò làm khuôn để tổng hợp mạch bổ sung. • Ngã ba sao chép (Replication fork) di chuyển theo hai hướng ngược nhau tạo cấu trúc giống kí tự theta (q). • Sau khi quá trình sao chép hoàn tất hai mạch được tách ra. 21/02/2016 3:25:51 CH. 17. 21/02/2016 3:25:51 CH. 16. Nguyễn Hữu Trí. Sự sao chép DNA ở prokaryote và eukaryote. Origin (ORI) là điểm cố định nơi bắt đầu của quá trình sao chép. Replicon là một đơn vị sao chép Nguyễn Hữu Trí. 21/02/2016 3:25:51 CH. 18. Nguyễn Hữu Trí. 3.

(27) 21/02/2016. Sự sao chép DNA ở prokaryote và eukaryote. E. coli DNA Polymerases. Sự sao chép DNA ở vi khuẩn: mỗi nhiễm sắc thể là một replicon. 1. 2. 3. • Có ba loại 3 DNA polymerase ở E. coli: – pol I – pol II – pol III • E. coli DNA polymerase I xác định đầu tiên. Nó được khám phá năm 1958 bởi Arthur Kornberg.. 4. Sự sao chép được tiến hành đồng thời tại nhiều điểm trên phân tử DNA của eukaryote 21/02/2016 3:25:51 CH. 19. Nguyễn Hữu Trí. 21/02/2016 3:25:51 CH. • DNA polymerase • 3’5’ exonuclease • 5’3’ exonuclease. Nguyễn Hữu Trí. Phần Klenow (Klenow Fragment). DNA Polymerase I • DNA polymerase I (pol I) là một enzyme linh hoạt với 3 hoạt tính:. 20. Có 2 chức năng: Polymerase và hoạt tính 3’5’ exonuclease giúp nó có khả năng đọc ngược (proofreading) – – – –. Nếu pol I thêm nt sai, sự bắt cặp giữa các base không đúng Pol I dừng lại, exonuclease loại bỏ nt không bắt cặp Cho phép quá trình sao chép tiếp tục Làm tăng tính trung thực của quá trình sao chép. – Xử lý thủy phân nhẹ cho ra 2 polypeptide • Phần Klenow • Phần nhỏ hơn. 21/02/2016 3:25:51 CH. 21. Nguyễn Hữu Trí. 5’3’ exonuclease • Hoạt tính này cho phép pol I cắt tại một đầu của chuỗi DNA đang hình thành • Loại bỏ và thay thế một chuỗi khi nó đi qua • Là chức năng cơ bản khi:. 21/02/2016 3:25:51 CH. 22. Nguyễn Hữu Trí. Polymerases II và III  Hoạt tính của Pol II không liên quan đến sự sao chép của DNA  Pol I có vai trò chủ yếu trong sửa sai  Chỉ có pol III là cần đến cho quá trình sao chép DNA  Pol III là enzyme sao chép ở vi khuẩn. – Loại bỏ primer – Sửa chữa cho đứt (nick) 21/02/2016 3:25:51 CH. 23. Nguyễn Hữu Trí. 21/02/2016 3:25:51 CH. 24. Nguyễn Hữu Trí. 4.

(28) 21/02/2016. Enzyme Pol III hoàn chỉnh. Sự trung thực trong sao chép cần thiết cho sự sống Bộ máy sao chép DNA đã thiết lập một hệ thống sửa sai (proofreading system).  Pol III core được tạo thành bởi 3 tiểu đơn vị : – Hoạt tính DNA polymerase nằm trên tiểu đơn vị a – Hoạt tính 3’5’exonuclease tìm thấy trên tiểu đơn vị  – Vai trò của tiểu đơn vị q vẫn chưa rõ – Hoạt tính DNA-dependent ATPase nằm trên phức hợp g chứa 5 tiểu đơn vị. – Hệ thống này cần mồi – Chỉ nucleotide bắt cặp bổ sung làm mồi cho pol III hoàn chỉnh – Nếu một nucleotide sai thì quá trình sao chép ngừng lại cho đến khi hoạt tính 3’5’ exonuclease của enzyme pol III hoàn chỉnh loại bỏ nó.  Cuối cùng, tiểu đơn vị b thêm vào tạo thành enzyme hoàn chỉnh (holoenzyme). 21/02/2016 3:25:51 CH. Tính trung thực của quá trình sao chép. 25. Nguyễn Hữu Trí. 21/02/2016 3:25:51 CH.  Quá trình DNA sao chép cho thấy 2 mạch DNA tại ngã ba sao chép bị tách mạch Không xảy ra tự động khi DNA polymerase làm công việc của nó. – Polymerase d và a có vai trò tham gia sao chép trên cả hai mạch DNA – Pol a đóng vai trò trong việc khởi đầu trổng hợp DNA – Kéo dài cả hai mạch được thực hiện bởi pol d. 21/02/2016 3:25:51 CH. – 2 mạch nền liên kết rất chặt với nhau – Cần tốn năng lượng và hoạt động của enzyme để tách chúng – Helicase làm tách mạch dsDNA tại ngã ba sao chép được mã hóa bởi gene E. coli dnaB.. 27. Nguyễn Hữu Trí. 21/02/2016 3:25:51 CH.  Ở prokaryote ssDNA-binding proteins gắn chặt với ssDNA hơn với dsDNA – Nhờ sự hoạt động của helicase giúp hình thành ssDNA – Giữ cho hai mạch không bắt cặp trở lại.  Bằng cách bọc ngoài ssDNA, SSBs giữ cho nó khỏi bị phân hủy  SSBs cần thiết cho quá trình sao chép DNA ở prokaryote 29. Nguyễn Hữu Trí. 28. Nguyễn Hữu Trí. Topoisomerases. Single-Strand DNA-Binding Proteins. 21/02/2016 3:25:51 CH. Nguyễn Hữu Trí. Sự tách mạch. Các DNA Polymerase của eukaryote Tế bào động vật có vú chứa 5 DNA polymerase khác nhau. 26. Chuỗi DNA được tách được gọi là “unzipping” o DNA không thật sự giống một dây kéo thẳng mà là một chuỗi xoắn đối song song. o Khi 2 mạch DNA được tách ra, mạch này quay vòng quanh mạch kia. Helicase có thể tự mình tách và giữ nếu hai mạch của DNA là thẳng và ngắn, ở DNA dạng vòng nảy sinh một vấn đề o Khi DNA được tháo xoắn ở một vị trí thì sẽ làm xoắn hơn ở vị trí khác.. 21/02/2016 3:25:51 CH. 30. Nguyễn Hữu Trí. 5.

(29) 21/02/2016. Cơ chế hoạt động của Helicase • Khi helicase hoạt động nó gắn với những “initiator” và lôi chúng vào DNA đang tái bản. • Helicase có nhiệm vụ mở xoắn và tách dây đôi thành dây đơn bằng cách sử dụng năng lượng từ quá trình phân giải ATP. • Sự phân giải ATP làm thay đổi trạng thái của helicase, tạo điều kiện để enzyme di chuyển dọc theo dây DNA để mở xoắn.. 21/02/2016 3:25:51 CH. 31. Nguyễn Hữu Trí. Sự khởi đầu (Initiation)  Khởi đầu của quá trình sao chép DNA là quá trình tổng hợp primer  Primosome được dùng để chỉ tập hợp các protein cần thiết cho sự tổng hợp primer cho quá trình sao chép DNA.  Tổng hợp primer ở E. coli đòi hỏi một primosome gồm có: o DnaB DNA helicase o DnaG Primase. 21/02/2016 3:25:51 CH. 32. Nguyễn Hữu Trí. Primosome. Primer ở E. coli  Primosome hình thành tại ORI, trong trường hợp E. coli với nhiễm sắc thể vòng tròn, điểm gốc của sự sao chép gọi là oriC (245bp)  Vùng OriC bao gồm hai nhóm trình tự lặp lại với (N là base bất kỳ) o 3 trình tự lặp lại liên tiếp gồm 13 cặp base GATCTNTTNTTTT o 4 trình tự lặp lại phân tán với 9 cặp baseTTATNCANA. 21/02/2016 3:25:51 CH. 33. Nguyễn Hữu Trí. 21/02/2016 3:25:51 CH. Khởi đầu sao chép ở E. coli. 34. Nguyễn Hữu Trí. Replisome. Primosome hình thành tại oriC xảy ra như sau: – DnaA gắn vào oriC tại vị trí được gọi là dnaA box và phối hợp với HU protein tách một đoạn DNA kế cận về phía trái của dnaA box – DnaB gắn vào phức hợp mở và tạo thuận tiện cho primase gắn vào để hoàn thành primosome – Primosome vẫn gắn replisome (là hệ thống các enzyme của bộ máy sao chép), lập lại việc tổng hợp primer cho các đoạn Okazaki tổng hợp trên mạch chậm (lagging strand) – DnaB có hoạt tính helicase giúp tháo xoắn DNA khi replisome tiến hành 21/02/2016 3:25:51 CH. 35. Nguyễn Hữu Trí. 21/02/2016 3:25:51 CH. 36. Nguyễn Hữu Trí. 6.

(30) 21/02/2016. Sự khởi đầu sao chép ở E.coli. Sự khởi đầu (Initiation). Nhóm enzyme helicase có nhiệm vụ tách mạch. Chúng bám lên một mạch đơn, cắt đứt liên kết hidro giữa 2 mạch đôi. Chúng sử dụng năng lượng từ quá trình phân giải ATP. 21/02/2016 3:25:51 CH. 37. Nguyễn Hữu Trí. Chĩa ba sao chép (Replication fork). 21/02/2016 3:25:51 CH. 38. Nguyễn Hữu Trí. Kéo dài (Elongation)  Khi một primer được tổng hợp quá trình tổng hợp DNA thực sự bắt đầu  Một cách kết hợp hài hòa trong quá trình tổng hợp mạch sau(lagging) và mạch trước (leading) giữ holoenzyme pol III bám chặt với dây nền.  Sao chép là một quá trình diễn ra rất nhanh.. 21/02/2016 3:25:51 CH. 39. Nguyễn Hữu Trí. Tốc độ sao chép • In vitro enzyme pol III tổng hợp DNA với tốc độ khoảng 730 nt/giây, in vivo tốc độ này khoảng 1000 nt/giây • Đây là enzyme có tốc độ tổng hợp cao cả trong in vitro và in vivo.. 21/02/2016 3:25:51 CH. 41. Nguyễn Hữu Trí. 21/02/2016 3:25:51 CH. 40. Nguyễn Hữu Trí. Pol III Holoenzyme và quá trình sao chép • Pol III core có khả năng polymerase rất yếu, sau khi tổng hợp khoảng 10 nt nó bị tách khỏi dây nền (template). • Như vậy core enzyme thiếu một yếu tố – Đó là tác nhân hiện diện trên holoenzyme cho phép nó vẫn liên kết chặt với template – Tác nhân đó là một “kẹp trượt”, tiểu đơn vị b-của enzyme hoàn chỉnh (holoenzyme).. 21/02/2016 3:25:51 CH. 42. Nguyễn Hữu Trí. 7.

(31) 21/02/2016. Vai trò của tiểu đơn vị b • Core được thêm tiểu đơn vị b có thể sao chép DNA tốc độ cao khoảng 1,000 nt/giây. Proliferating cell nuclear antigen (PCNA). – Dimer được hình thành bởi tiểu đơn vị b có dạng vòng (ringshaped) – Vòng này bao quanh DNA template – Tương tác với tiểu đơn vị a của core để kết hợp toàn bộ polymerase và template với nhau. • Holoenzyme giữ nó trên dây nền nhơ vào kẹp b. • Yếu tố giữ cho quá trình sao chép ở Eukaryote là PCNA hình thành một trimer, cũng có dạng vòng bao quanh DNA và giữ DNA polymerase trên template. 21/02/2016 3:25:51 CH. 43. Nguyễn Hữu Trí. Yếu tố giúp gắn “kẹp”. 21/02/2016 3:25:51 CH. 44. Nguyễn Hữu Trí. Kẹp b và Loader. • Tiểu đơn vị b cần sự trợ giúp của một phức hợp g để gắn vào DNA template – Phức hợp g này hoạt động xúc tác trong việc việc hình thành phức hợp adb – Nó không liên kết với phức hợp trong suốt quá trình sao chép. • Quá trình gắn “kẹp” là quá trình sử dụng ATP – Năng lượng từ ATP thay đổi hình dạng của tiểu đơn vị d giúp nó gắn với tiểu đơn vị b – Việc gắn này cho phép mở “kẹp” và bao quanh DNA 21/02/2016 3:25:51 CH. 45. Nguyễn Hữu Trí. Kẹp b và Loader. Source: Adapted from Ellison, V. and B. Stillman, Opening of the clamp: An intimate view of an ATP-driven biological machine. Cell 106(2001), p. 657, f. 3. 21/02/2016 3:25:51 CH. Source: Adapted from Henderson, D.R. and T.J. Kelly, DNA polymerase III: Running rings around the fork. Cell 84:6, 1996.. 46. Nguyễn Hữu Trí. Sự tổng hợp mạch sau • Pol III holoenzyme là enzyme có 2 đầu, ở đây có 2 core polymerases gắn 2 tiểu đơn vị t với một phức hợp g • Một core chịu trách nhiệm tổng hợp liên tục ở mạch trước (leading strand) • Một core khác thực hiện việc tổng hợp gián đoạn ở mạch sau (lagging strand) – Phức g duy trì như một clamp loader để gắn kẹp b vào primer trên DNA template – Sau khi được load, kẹp b không còn ái lực với g complex mà lại liên kết chặt với core polymerase. 21/02/2016 3:25:51 CH. 47. Nguyễn Hữu Trí. 21/02/2016 3:25:51 CH. 48. Nguyễn Hữu Trí. 8.

(32) 21/02/2016. Sự sao chép DNA. Sự tổng hợp đồng thời • Phức hợp g và kẹp b giúp core polymerase tổng hợp nhanh một đoạn Okazaki • Khi đoạn này tổng hợp xong, kẹp b mất ái lực với core • Hình thành liên kết giữa kẹp b với g complex với hoạt động tháo kẹp (unload clamp) • Sau đó lại bắt đầu một chu kì mới. 21/02/2016 3:25:51 CH. 49. 21/02/2016 3:25:51 CH. Nguyễn Hữu Trí. 50. Nguyễn Hữu Trí. Sự tổng hợp đồng thời. Figure 5-19a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008). Figure 5-19b,c Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008). DNA polymerase I. Sao chép ở mạch sau. – Loại bỏ mồi RNA và tổng hợp DNA thay thế. DNA polymerase I 5 3. 3. ligase. 5. 5. growing 3 replication fork RNA. 5. 3 Source: Adapted from Henderson, D.R. and T.J. Kelly, DNA polymerase III: Running rings around the fork. Cell 84:7, 1996. 21/02/2016 3:25:51 CH 53 Nguyễn Hữu Trí. 21/02/2016 3:25:51 CH. 54. Nguyễn Hữu Trí. 9.

(33) 21/02/2016. Kết thúc (Termination) DNA polymerase I 5 3. 3 5. 5. growing 3 replication fork. DNA polymerase III RNA. 5. 3. 21/02/2016 3:25:51 CH. 55. Nguyễn Hữu Trí. Kiểu sao chép vòng xoay. • Trong quá trình sao chép của vi khuẩn – 2 replication fork tiến đến vùng kết thúc – Có chứa vị trí 22-bp terminator liên kết với protein đặc hiệu (terminus utilization substance, TUS) – Replicating fork đi vào vùng kết thúc sao chép và dừng lại – Tách rời hai mạch con dính vào nhau nếu không tế bào sẽ không phân chia 21/02/2016 3:25:51 CH. 56. Nguyễn Hữu Trí. Sao chép vòng xoay • DNA dạng vòng có thể sao chép theo cơ chế vòng xoay (rolling circle replication) – Một sợi của dsDNA bị cắt (nick) và đầu 3’ được mở ra – Sử dụng mạch DNA còn nguyên như là một DNA template – Đầu 5’ bị tách ra. Sao chép vòng xoay (Rolling circle) là một kiểu sao chép của DNA trong các DNA mạch vòng (circular template) mà mạch khuôn được sao chép nhiều lần (copied many times).. 21/02/2016 3:25:51 CH. 57. Nguyễn Hữu Trí. Kiểu sao chép vòng xoay ở Phage l. • Phage X174 sao chép xoay vòng vì vậy khi sao chép đủ chiều dài, chuổi vòng đơn của DNA được tách ra • Phage l, chuỗi tách ra được sử dụng như là template cho sự sao chép gián đoạn, mạch lagging 21/02/2016 3:25:51 CH. 58. Nguyễn Hữu Trí. TÍNH BIẾN ĐỘNG CỦA DNA. • Khi vòng tròn xoay qua phải – Mạch liên tục (leading strand) tiếp tục được kéo dài – Mạch gián đoạn (lagging strand) kéo dài một cách gián đoạn • Dùng mạch liên tục không xoay làm template • RNA primer được dùng tổng hợp đoạn Okazaki • Các dsDNA con mới được tổng hợp tạo thành nhiều bộ gen trước khi DNA bị cắt.. 21/02/2016 3:25:51 CH. 59. Nguyễn Hữu Trí. • ĐỘT BIẾN VÀ SỬA SAI • GEN NHẢY • TÁI TỔ HỢP. 21/02/2016 3:25:51 CH. 60. Nguyễn Hữu Trí. 10.

(34) 21/02/2016. CÁC KHÁI NIỆM VỀ ĐỘT BIẾN • Đột biến là một tiến trình trong đó chuỗi trình tự của những cặp base của phân tử DNA bị thay đổi. • Đột biến ở mức độ nhiễm sắc thể: là biến dị từ những điều kiện bình thường làm thay đổi số lượng nhiễm sắc thể, hoặc cấu trúc nhiễm sắc thể, gây ảnh hưởng đến giới tính, hoặc nhiều tính trạng khác. • Đột biến ở mức độ phân tử là đột biến trong chuỗi trình tự của gen ở mức độ từng cặp base, còn được gọi là đột biến gen, hay đột biến điểm vì nó chỉ thay đổi ở một, hoặc một vài cặp base. • Các loại hình đột biến điểm: đột biến chuyển vị, đột biến chuyển đổi, đột biến sai nghĩa, đột biến vô nghĩa, đột biến đồng nghĩa, đột biến chuyển dịch khung.. 21/02/2016 3:25:51 CH. 61. Nguyễn Hữu Trí. Các loại đột biến điểm ATGCCCGAAGTG TACGGGCTTCAC Đột biến chuyển đổi (transversion mutation) purine  pyrimidine pyrimidine  purine. Đột biến chuyển vị (transition mutation) purine  purine pyrimidine  pyrimidine. ATGCCCAAAGTG TACGGGTTTCAC. ATGCCCTAAGTG TACGGGATTCAC. Purines: A và G. Pyrimidines: C và T. 21/02/2016 3:25:52 CH. 62. 21/02/2016 3:25:52 CH. 64. Nguyễn Hữu Trí. Các loại đột biến điểm AAT DNA UUA mRNA Leu amino acid CUA Leu. GUA Val. AUA Ile UGA Stop. 21/02/2016 3:25:52 CH. UCA UUC UUG UUU UCA Ser Phe Leu Phe Ser UAA Stop. 63. Nguyễn Hữu Trí. Đột biến và sự biểu hiện • Đột biến là sự thay đổi trong vật liệu di truyền của tế bào • Đột biến tự phát có thể xảy ra trong suốt quá trình sao chép của DNA, sự tái tổ hợp, hoặc sữa chữa • Đột biến do các tác nhân vật lý hay hóa học có thể là nguyên nhân gây đột biến • Đột biến điểm là sự thay đổi chỉ một cặp base của gene • Đột biến điểm có thể gây ảnh hưởng đến cấu trúc và chức năng của protein. 21/02/2016 3:25:52 CH. 65. Nguyễn Hữu Trí. Nguyễn Hữu Trí. Đột biến • Đột biến sai nghĩa (đột biến làm sai dây gốc, missense mutation): là đột biến gen trong đó một cặp base thay đổi làm DNA tạo nên một codon mRNA có một amino acid không tương ứng chèn vào đại phân tử polypeptide. • Đột biến đồng nghĩa (đột biến im lặng, silent mutation): sự thay đổi một cặp base của một gen nào đó làm thay đổi một codon của mRNA, tạo ra một codon mới nhưng amino acid không thay đổi. • Đột biến vô nghĩa (đột biến kết thúc dịch mã, nonsense): là đột biến gen trong đó một cặp base thay đổi làm DNA tạo nên một codon mRNA là codon stop (UAG, UAA, UGA). 21/02/2016 3:25:52 CH. 66. Nguyễn Hữu Trí. 11.

(35) 21/02/2016. Sự thay đổi chỉ một base của chuỗi làm khuôn dẫn tới việc tổng hợp một protein không bình thường Wild-type hemoglobin DNA 3. Mutant hemoglobin DNA 5. C. T. T. G. A. A. 3. mRNA. 5 C. A. T. G. U A. mRNA. 5. 3. 5. Hemoglobin bình thường. 3. Trong DNA, mạch khuôn bị đột biến chứa A trong khi mạch khuôn bình thường chứa T.. mRNA đột biến chứa U thay vì A trong một codon. Hemoglobin hình lưỡi liềm hemoglobin đột biến chứa valine (Val) thay vì glutamic acid (Glu).. Val. Glu. 21/02/2016 3:25:52 CH. 67. Nguyễn Hữu Trí. 21/02/2016 3:25:52 CH. 68. Nguyễn Hữu Trí. Thay thế base. Các loại đột biến điểm. • Là sự thay thế một base và nucleotide bắt cặp của nó bằng một cặp base khác. • Đột biến điểm xảy ra trong gene có thể chia thành hai loại chính. – Có thể gây ra đột biến sai nghĩa (missense) hoặc đột biến vô nghĩa (nonsense) Wild type mRNA Protein. – Thay thế cặp base – Chèn hoặc mất một cặp base. 5. A U. A A G U U U G G C U A A. G. Lys. Met. Phe. 3. Gly. Stop. Amino end. Carboxyl end Thay thế cặp base Không ảnh hưởng đến trình tự amino acid U thay vì C A U G. A. A G U U U G Lys. Met. Phe. Missense. G U U Gly. A A Stop. A thay vì G. A U G. A A. G U U U. Lys. Met. A A. A G U U. Phe. Ser. Stop. Nonsense U thay vì A A U G U Met. 21/02/2016 3:25:52 CH. 69. Nguyễn Hữu Trí. A G U U U. G G. C U A. A. Stop. 21/02/2016 3:25:52 CH. 70. Nguyễn Hữu Trí. Chèn base và mất base Đột biến chuyển dịch khung (frameshift mutation): nếu một hoặc nhiều cặp base được thêm vào hay mất đi trong một gen, khung đọc của mRNA có thể thay đổi vùng dưới (dowstream) của khung đọc, tạo ra những amino acid không đúng trong chuỗi polypeptide.. – Việc thêm hoặc mất một cặp nucleotide trong gene in a gene có thể gây ra đột biến lệch khung (frameshift mutation). Wild type mRNA. 5. Protein. A U G A Met. A. G U. Lys. G. U U. G. U A A. C. Gly. Phe. Amino end Chèn hoặc mất một cặp base. 3. Stop Carboxyl end. Đột biến lệch khung gây vô nghĩa. Thêm U A U. G U. Met. A. A G U U. A U. U. G. G C. U A. U A. A. Stop. Đột biến lệch khung gay6sai nghĩa. G. Met. A A. Mất U. U. G U U. Lys. G. G. C Ala. Leu. Chèn hoặc mất 3 nucleotides không gây lệch khung nhung làm thêm hoặc mật một amino acid. A A U Met. 21/02/2016 3:25:52 CH. 71. Nguyễn Hữu Trí. 21/02/2016 3:25:52 CH. A G G. U U Phe. Missing U G. G. C. U. Gly. A A Stop. 72. Nguyễn Hữu Trí. 12.

(36) 21/02/2016. II. NGUYÊN NHÂN GÂY ĐỘT BIẾN. Đột biến trong quá trình sao chép “enol”. “keto”. 1.Đột biến tự phát sinh - Đột biến trong quá trình sao chép - Đột biến do những thay đổi hóa học một cách tự phát (đột biến do chuyển hóa). 2.Đột biến do kích thích. “keto”. “enol”. - Kích thích bằng phóng xạ - Kích thích bằng hóa chất 21/02/2016 3:25:52 CH. 73. Nguyễn Hữu Trí. 21/02/2016 3:25:52 CH. 74. 21/02/2016 3:25:52 CH. 76. Nguyễn Hữu Trí. Đột biến trong quá trình sao chép Amino. Imino. Imino. C H H H. H H. C H. H. CH2. H. H. O. C. O. C OH. C. P. C. 78. O. H. O. H. C. O. H. 21/02/2016 3:25:52 CH. O. H. C. CH2 C. C. G. O. H. H. P. CH2. H. O. C. C. O. C. O. P. H. H. O. H. O. H. C. O. O. C. Aflatoxin B1. C. CH2. O. C. C. O. O. C. H. H. H. C. CH2. C. O. C. O P. O. O. H. H. P. O. H. O. CH2 C. O. A. T. O. Sự phản purin hóa (depurination) O. H. C. O. P. Nguyễn Hữu Trí. H. O. O. 77. C. O. 21/02/2016 3:25:52 CH. Nguyễn Hữu Trí. Đột biến điểm do chuyển hóa. Đột biến điểm do chuyển hóa. H. Nguyễn Hữu Trí. C. 75. OH. 21/02/2016 3:25:52 CH. H. Amino. Nguyễn Hữu Trí. 13.

(37) 21/02/2016. Đột biến điểm do hóa chất 5-bromouracil: • Trong trạng thái bình thường rất giống T, sẽ bắt cặp với A. • Trong trạng thái hiếm, bắt cặp với G • Gây ra đột biến AT thành GC 2-aminopurine: Có thể bắt cặp với C Gây ra đột biến AT thành GC Những chất đồng phân gốc base (base analogs) 21/02/2016 3:25:52 CH. 79. Nguyễn Hữu Trí. A·T. Iioyo. Replication in presence of BrU. Ơu. 21/02/2016 3:25:52 CH. 80. Nguyễn Hữu Trí. Đột biến điểm do tia UV. A·BrU 8. Tautomeric shift. A·BrU* Replication. A·T + G·BrU* Replication. Tia UV cung cấp năng lượng hình thành 2 liên kết cộng hóa trị mới giữa 2 T kế cận, gây ra sự dimer hóa các thymine.. A·T + A·T + G·BrU* + GC. 21/02/2016 3:25:52 CH. 81. Nguyễn Hữu Trí. CÁC CƠ CHẾ SỬA SAI. 1. CƠ CHẾ SỬA SAI TRONG QUÁ TRÌNH SAO CHÉP. 2.CƠ CHẾ SỬA SAI NGOÀI QUÁ TRÌNH SAO CHÉP. 21/02/2016 3:25:52 CH. 83. Nguyễn Hữu Trí. 21/02/2016 3:25:52 CH. 82. Nguyễn Hữu Trí. CƠ CHẾ SỬA SAI TRONG QUÁ TRÌNH SAO CHÉP DNA polymerase sử dụng hoạt tính exonuclease để cắt các nucleotide tổng hợp sai trong quá trình sao chép.. 21/02/2016 3:25:52 CH. 84. Nguyễn Hữu Trí. 14.

(38) 21/02/2016. Sửa sai nhờ DNA polymerase (proofreading). Sửa sai nhờ DNA polymerase (proofreading). -T A T -A T G C A T G C A T G C. 21/02/2016 3:25:52 CH. 21/02/2016 3:25:52 CH. 85. 86. Nguyễn Hữu Trí. CƠ CHẾ SỬA SAI NGAY SAU KHI SAO CHÉP. Nguyễn Hữu Trí. CƠ CHẾ SỬA SAI NGOÀI QUÁ TRÌNH SAO CHÉP. Mạch bố mẹ được methyl hóa. Một thời gian ngắn sau khi sao chép mạch con mới được methyl hóa. Do đó ngay sau khi sao chép mạch con không được methyl hóa.. ĐẢO NGƯỢC SAI HỎNG (DAMAGE REVERSAL) CẮT BỎ SAI HỎNG (BER,NER). Đặc điểm này, khi hệ thống sửa sai của tế bào nhận biết được mạch nào sai và sửa sai mạch đó. 21/02/2016 3:25:52 CH. 87. Nguyễn Hữu Trí. CƠ CHẾ SỬA SAI NGOÀI QUÁ TRÌNH SAO CHÉP. 21/02/2016 3:25:52 CH. 88. Nguyễn Hữu Trí. CƠ CHẾ SỬA SAI NGOÀI QUÁ TRÌNH SAO CHÉP. ĐẢO NGƯỢC SAI HỎNG ĐẢO NGƯỢC SAI HỎNG. Hiện tượng quang hoạt hóa 21/02/2016 3:25:52 CH. 89. Nguyễn Hữu Trí. Loại bỏ nhóm methyl 21/02/2016 3:25:52 CH. 90. Nguyễn Hữu Trí. 15.

(39) 21/02/2016. CƠ CHẾ SỬA SAI NGOÀI QUÁ TRÌNH SAO CHÉP. CƠ CHẾ SỬA SAI NGOÀI QUÁ TRÌNH SAO CHÉP. BER (BASE EXCISION REPAIR). NER (NUCLEOTID EXCISION REPAIR). -Glycosylase: nhận biết và cắt base sai hỏng. Nuclease: nhận biết và cắt ở 2 vị trí chuyên biệt:. -AP endonuclease, exonuclease: Cắt phân tử đường của base sai hỏng. -Nu thứ 7 kể từ vị trí sai hỏng theo hướng 5’. 21/02/2016 3:25:52 CH. -Nu thứ 4 kể từ vị trí sai hỏng theo hướng 3’ 91. 21/02/2016 3:25:52 CH. Nguyễn Hữu Trí. Gene nhảy (Tranposon). . . 93. Nguyễn Hữu Trí. • Các trình tự gắn xen IS (Insertion Sequence) được tìm thấy đầu tiên ở E. coli do tác động ức chế của chúng trong cơ chế kiểm soát sự biến dưỡng đường galactose. • Khi nhân tố IS2 xen vào bên trong gen tương ứng, vi khuẩn mất khả năng lên men galactose. Khi nhân tố này rời khỏi gen, khả năng lên men galactose được tái lập.. 95. Các gen nhảy là các trình tự DNA có khả năng gắn xen vào một vị trí mới trên bộ gen hay rời bỏ vị trí đó, làm biến đổi các hoạt động di truyền. Các gen nhảy còn được gọi là nhân tố chuyển vị (transposon). Các nhân tố chuyển vị được tìm thấy ở prokaryote và eukaryote. Ví dụ về gen nhảy ở bắp 21/02/2016 3:25:52 CH. 94. Nguyễn Hữu Trí. Cấu trúc và cơ chế chuyển vị của IS. Các trình tự IS. 21/02/2016 3:25:52 CH. Nguyễn Hữu Trí. Gene nhảy (Tranposon) . 21/02/2016 3:25:52 CH. 92. Nguyễn Hữu Trí. Các trình tự IS có kích thước nhỏ (khoảng 1kb), cấu trúc bao gồm:  Một trình tự trung tâm đặc trưng cho từng loại IS. Vùng này mã hóa cho transposase và một vài gen khác.  Ở hai đầu hai trình tự lặp đảo IR (Inverted repeat) là hai trình tự ngắn giống nhau nhưng có chiều ngược nhau.. 21/02/2016 3:25:52 CH. 96. Nguyễn Hữu Trí. 16.

(40) 21/02/2016. Cơ chế chuyển vị của IS • •  . • •. Hai kiểu chuyển vị. Dưới tác động của transposase, đoạn DNA nơi sẽ nhận đoạn gắn xen bị cắt đứt, hình thànn nên các đầu so le, hay đầu dính (cohesive end). Sự chuyển vị gen có thể xảy ra theo hai khả năng: Transposon được nhân lên, bản cũ ở lại vị trí ban đầu, bản sao kia chuyển đến vị trí mới. Transposon được chuyển ngay đến vị trí nhận, vị trí cũ mất transposon. Ở hai đầu của nhân tố IS vẫn còn hở, DNA polymerase và ligase sẽ làm nhiệm vụ lấp đầy chỗ trống. Sau khi gắn chèn, nhân tố IS hoàn toàn được dung hợp vào genome.. 21/02/2016 3:25:52 CH. 97. Chuyển vị nhân bản: Transposon được nhân lên, bản cũ ở lại vị trí ban đầu, bản sao kia chuyển đến vị trí mới. Chuyển vị bảo tồn: Transposon được chuyển ngay đến vị trí nhận, vị trí cũ mất transposon.. 21/02/2016 3:25:52 CH. Nguyễn Hữu Trí. • • • •. 21/02/2016 3:25:52 CH. Nguyễn Hữu Trí. 100. Nguyễn Hữu Trí. DNA transposon và Retrotransposon. • Transposon đơn có chứa gen kháng kháng sinh, nhưng nó không kết thúc ở hai đầu với nhân tố IS, nhưng có những chuỗi trình tự lặp đảo IR cần thiết cho sự chuyển vị. • Enzyme đóng vai trò quan trọng trong chuyển vị được mã hóa bởi các gen định vị trong vùng trung tâm của transposon. • Tn3 là một ví dụ về transposon đơn.. 101. Nguyễn Hữu Trí. Là một phức hợp với vùng trung tâm có chứa những gen kháng thuốc kháng sinh, nằm kề bên với các nhân tố IS. Có độ dài vài ngàn bp. Nhân tố IS nằm bên trái được gọi là IS-L, và nhân tố IS nằm bên trái là IS-R. Tùy theo loại transposon mà IS-L và IS-R có thể cùng hướng, hoặc ngược hướng đối xứng nhau. Vì bản thân IS có IR (Inverted repeat), nên transposon cũng có IR ở hai đầu cần thiết cho sự chuyển vị. Tn 10 là một ví dụ về transposon phức hợp. Tn 10 có độ lớn phân tử 9.300bp, vùng trung tâm chiếm 6.500bp, chứa gen kháng tetracyline nằm giữa IS10L và IS10R. Mỗi nhân tố IS dài khoảng 1.400bp.. Transposon đơn. 21/02/2016 3:25:52 CH. 98. Transposon phức hợp •. • Các transposon (Tn) là các trình tự gen nhảy có kích thước lớn hơn các trình tự IS. Giống như nhân tố IS, transposon có chứa những gen chèn vào đoạn DNA trên nhiễm sắc thể. • Transposon tương đối phức tạp hơn nhân tố IS, nó còn có những gen bổ sung. • Có hai dạng transposon trong prokaryote: composite Tn và noncomposite Tn (transposon phức hợp và transposon đơn).. 99. . Nguyễn Hữu Trí. Transposon. 21/02/2016 3:25:52 CH. . 21/02/2016 3:25:52 CH. 102. Nguyễn Hữu Trí. 17.

(41) 21/02/2016. Retrotransposon. Retroviruses. 21/02/2016 3:25:52 CH. 103. Nguyễn Hữu Trí. 21/02/2016 3:25:52 CH. TÁI TỔ HỢP TƯƠNG ĐỒNG (HOMOLOGUOS RECOMBINATION). 104. Nguyễn Hữu Trí. Mô hình Holiday. • Tái tổ hợp (recombination): là quá trình trong đó nhiễm sắc thể hay phân tử DNA đứt ra rồi các phần đứt được nối lại theo một tổ hợp mới. Quá trình này có thể xảy ra trong tế bào sống (ví dụ như qua sự trao đổi chéo trong phân bào giảm nhiễm) hay trong ống nghiệm nhờ các enzyme cắt và nối. • Mô hình tái tổ hợp đơn giản và cổ điển nhất là mô hình Holiday. Mặc dù có những thiếu sót cần thêm thắt, sửa đổi, nhưng mô hình này đã minh họa tương đối rõ tiến trình tái tố hợp. Về cơ bản được mô tả như sau :  Điều kiện xảy ra tái tổ hợp tương đồng: hai vùng DNA tái tổ hợp phải có trình tự tương đồng và một trong hai trình tự đó phải có điểm đứt (nick) trên một mạch.  Các protein RecB và RecC làm tháo xoắn và cắt đứt một trong hai mạch DNA. Phức hợp RecBC nhận biết một trình tự chi () và cắt cách đó vài base.  Protein RecA gắn lên mạch DNA đứt tạo thuận lợi cho việc nhận biết trình tự tương đồng ở mạch kia và hình thành nên phân tử lai. 21/02/2016 3:25:52 CH. 105. Nguyễn Hữu Trí. 21/02/2016 3:25:52 CH. • Điều kiện xảy ra tái tổ hợp tương đồng: hai vùng DNA tái tổ hợp phải có trình tự tương đồng và một trong hai phân tử DNA có điểm đứt (nick) trên hai mạch. • Mô hình này phổ biến hơn mô hình Holiday và có vai trò quan trọng trong việc sửa chữa các đột biến đứt gãy mạch đôi. 107. Nguyễn Hữu Trí. Nguyễn Hữu Trí. VAI TRÒ CỦA REC A TRONG TÁI TỔ HỢP TƯƠNG ĐỒNG. Mô hình DSB (Double strand Break ). 21/02/2016 3:25:52 CH. 106. • Vị trí gắn sơ cấp: gắn với DNA mạch đơn • Vị trí gắn thứ cấp: gắn với DNA mạch đôi. • Để rà tìm vùng tương đồng trên mạch đôi, Rec A giữ mạch đơn ở vị trí sơ cấp, trượt đi, đến khi xuất hiện vùng tương đồng thì dừng lại, cắt liên kết H giữa hai mạch đôi; nối và hình thành liên kết H mới.. 21/02/2016 3:25:52 CH. 108. Nguyễn Hữu Trí. 18.

(42) 21/02/2016. Tái tổ hợp tương đồng trong giảm phân. 21/02/2016 3:25:52 CH. 109. Nguyễn Hữu Trí. 21/02/2016 3:25 CH. 110. Nguyễn Hữu Trí. 19.

(43) 21/02/2016. Chương 4. Quá trình phiên mã ở Prokaryote. Quá trình Phiên mã ở Prokaryote. • Được tiến hành bởi RNA polymerase – Không cần primer. – Không có khả năng đọc ngược (proofreading). – Đọc trên khuôn DNA (DNA template) theo chiều 3’-5’ tổng hợp RNA transcript theo chiều 5’-3’. – Chỉ có 1 trong 2 mạch đơn của phân tử DNA được dùng làm khuôn. – RNA polymerase quyết định việc chọn mạch khuôn bằng cách gắn vào 1 trình tự đặc biệt trên mạch được chọn làm khuôn, trình tự đó là promoter.. 21/02/2016 3:29:41 CH. 1. Nguyễn Hữu Trí. 21/02/2016 3:29:41 CH. 3. Nguyễn Hữu Trí. Cấu trúc của Core Polymerase • RNA polymerase core được phát hiện là một enzyme có hình giống như một càng cua. Nó có hình dạng như vậy để ôm lấy DNA. • Một kênh dọc theo enzyme đóng vai trò là trung tâm phản ứng. – Ion Mg2+ phối hợp với 3 gốc Asp – Vị trí gắn Rifampicin. 21/02/2016 3:29:41 CH. 5. Nguyễn Hữu Trí. Nguyễn Hữu Trí. RNA polymerase. Quá trình phiên mã ở Prokaryote Được xúc tác bởi RNA polymerase, nó tách mạch chuỗi DNA và gắn vào DNA nền, liên kết các RNA nucleotide lại với nhau. Tuân theo nguyên tắc bắt cặp bổ sung giống DNA, ngoại trừ trong RNA, uracil thay thế cho thymine. Dạng RNA polymerase gọi là “holoenzyme”, còn được gọi là enzyme hoàn chỉnh, phải gắn với promoter. Dạng RNA polymerase gọi là “core enzyme” là enzyme cơ bản của RNA gắn với một polypeptide khác gọi là yếu tố sigma (sigma factor).. 2. 21/02/2016 3:29:41 CH. là một phức hợp của enzyme, được gọi là holoenzyme, gồm enzyme lõi (Core enzyme) và nhân tố s.  .  ’. +.  s   ’. s. . . Core enzyme. Holoenzyme. Core enzyme: Gồm nhiều tiểu đơn vị : , , ’, , đảm bảo cho phản ứng kéo dài chuỗi RNA  : có vai trò gắn kết các tiểu đơn vị , ’ : trung tâm xúc tác của RNA polymerase,  liên kết với DNA khuôn, RNA đang tổng hợp và ribonucleotide Nhân tố s: đảm bảo tính đặc hiệu promoter: giảm ái lực giữa RNA pol và trình tự DNA bất kỳ, tăng ái lực giữa RNA pol và promoter. 21/02/2016 3:29:41 CH. 4. Nguyễn Hữu Trí. Cấu trúc của Holoenzyme • RNA polymerase holoenzyme cho thấy có một vùng tiếp xúc rộng giữa s và tiểu đơn vị - và ’-của core. • Cấu trúc cũng cho thấy vùng s giúp cho việc mở kênh chính của enzyme để nhận vào dsDNA template để hình thành phức hợp đóng promoter. • Sau khi giúp mở kênh, s sẽ bị đẩy ra khỏi kênh chính khi khi kênh này bị thu hẹp khi bao quanh DNA bị tách mạch của phức hợp mở promoter.. 21/02/2016 3:29:41 CH. 6. Nguyễn Hữu Trí. 1.

(44) 21/02/2016. Promoter. Chức năng của yếu tố s • Gene được chọn phiên mã nhờ có s làm cho RNA polymerase xác định đúng và gắn chặt lên promoter. • Sự gắn chặt phụ thuộc vào vị trí tách mạch của DNA để cho phép hình thành phức hợp mở promoter. • Sự tách s ra khỏi core sau khi đã đảm bảo cho việc gắn chặt giữa polymerasepromoter 7. 21/02/2016 3:29:41 CH. Nguyễn Hữu Trí. Promoter. 9. Nguyễn Hữu Trí. Sự gắn RNA Polymerase. 8. Nguyễn Hữu Trí. • Đầu tiên RNA polymerase holoenzyme gắn vào DNA một cách lỏng lẻo. – Dò dọc theo DNA cho tới khi tìm thấy được promoter – RNA polymerase được gắn tại promoter. • Phức hợp holoenzyme gắn một cách lỏng lẻo tại promoter là một phức hợp đóng promoter (closed promoter complex) khi mà DNA vẫn ở dạng chuỗi kép. • Holoenzyme sau đó có thể tách một vùng ngắn DNA tại promoter để hình thành phức hợp mở promoter (open promoter complex) với polymerase gắn chặt vào DNA. 21/02/2016 3:29:41 CH. 10. Nguyễn Hữu Trí. Quá trình phiên mã ở Prokaryote • Các bước của quá trình phiên mã (transcription). • Đầu tiên holoenzyme gắn vào DNA một cách lỏng lẻo. • Phức hợp lỏng lẻo liên kết tại promoter = phức hợp đóng promoter (closed promoter complex), DNA ở dạng mạch kép khép kín. • Holoenzyme tách mạch DNA tại promoter hình thành phức hợp mở promoter (open promoter complex) với polymerase gắn chặt vào DNA. 21/02/2016 3:29:41 CH. 21/02/2016 3:29:41 CH. Sự gắn RNA Polymerase. • Có một vùng trong các promoter của vi khuẩn có tính chất rất chuyên biệt cho sự khởi động phiên mã gồm 6-7 bp tập trung ở 10 bp đầu nguồn (upstream) từ vị trí +1 (vị trí bắt đầu phiên mã) = vùng -10 (-10 box, hay còn gọi là Pribnow box, TATA box) là 5’-TATAAT-3’. • Một trình tự ngắn khác tập trung ở 35 bp đầu nguồn (upstream) được gọi là vùng -35 (-35 box) là 5’-TTGACA-3’ • Các trình tự này là trình tự thỏa hiệp được đưa ra khi so sánh trên hàng ngàn promoter khác nhau.. 21/02/2016 3:29:41 CH. Promoter là một trình tự điều hòa trên phân tử DNA, nơi RNA polymerase gắn vào để khởi động phiên mã. Promoter có hai đặc điểm: + nằm ngay trước vùng gen mã hóa + hoạt động theo đúng chiều (-35, -10, +1). – Khởi đầu (Initiation) – Kéo dài (Elongation) – Kết thúc (Termination). 11. Nguyễn Hữu Trí. 21/02/2016 3:29:41 CH. 12. Nguyễn Hữu Trí. 2.

(45) 21/02/2016. Khởi đầu phiên mã (Initiation) • Quá trình khởi đầu phiên mã không phải là khi RNA polymerase hình thành liên kết phosphodiester đầu tiên. • Carpousis và Gralla chỉ ra rằng có một đoạn oligonucleotide (dài 2-6 nt) được tổng hợp khi mà RNA polymerase chưa rời đi trên DNA. • Quá trình phiên mã có thể thất bại khi mà chuỗi oligonucleotide khoảng 10 nt được tổng hợp.. Khởi đầu phiên mã (Initiation) Promoter -35 -10.  s   ’ Phức hợp đóng.  s  RNA pol nhận biết và gắn vào  ’ promoter nhờ nhân tố s rNTPs PPi. 13. Nguyễn Hữu Trí.  . 21/02/2016 3:29:41 CH. Khởi đầu phiên mã (Initiation) RNA pol nhận biết và gắn vào promoter nhờ nhân tố s, theo 2 bước: - RNA pol nhận biết và gắn một cách lỏng lẻo vào trình tự -35 tạo thành phức hợp đóng. - RNA pol gắn với DNA chặt hơn để mở xoắn tại vùng trình tự -10, tạo thành phức hợp mở. Tại đây DNA được tháo xoắn và một sợi đơn phơi ra dưới dạng tự do làm khuôn cho sự phiên mã RNA.. -RNA pol gắn với DNA chặt hơn để mở xoắn tại vùng trình tự -10, tạo thành phức hợp mở.. Core enzyme. Phức hợp mở 21/02/2016 3:29:41 CH. -RNA pol nhận biết và gắn một cách lỏng lẻo vào trình tự -35 tạo thành phức hợp đóng.. Holoenzyme enzyme. mRNA. 14.  ’. s. Nguyễn Hữu Trí. Kéo dài (Elongation). Khi phân tử RNA đạt chiều dài khoảng 8 nucleotide thì nhân tố s tách khỏi phức hợp RNA pol, thay thế bằng các nhân tố kéo dài. Sự tách rời này cần thiết cho quá trình kéo dài chuỗi RNA. RNAP trượt tiếp tục trên sợi DNA, tháo xoắn liên tục phân tử DNA, vùng DNA được tháo xoắn gọi là transcription bubble dịch chuyển trên DNA cùng với RNA polymerase.. 15. 21/02/2016 3:29:41 CH. Nguyễn Hữu Trí. 21/02/2016 3:29:41 CH. Transcription bubble • Các nucleotide thêm vào tuần tự từng nucleotide đây gọi là quá trình kéo dài. • Kích thước vùng được tháo xoắn luôn duy trì không đổi khoảng 17 cặp base, và xoắn lai RNA-DNA có chiều dài khoảng 12 cặp base.. Kéo dài (Elongation) RNA nucleotide. RNA polymerase. T. C. 3. C. A. A. 3 U. 5. A. E. G. C. A. T. A. G. G. T. T. Hướng phiên mã (“downstream”). 5. Nguyễn Hữu Trí. Mạch DNA chứa thông tin. Kéo dài (Elongation). A. 16. Mạch DNA khuôn. • Sự kéo dài phiên mã bao gồm quá trình polymer hóa của các nucleotide khi RNA polymerase di chuyển dọc theo khuôn DNA (template DNA) • Polymerase duy trì một vùng ngắn của DNA khuôn bị tách mạch. • DNA bị tháo xoắn ở phía trước polymerase và đóng lại ở phía sau. • Mạch template DNA được tháo xoắn nhờ các enzyme topoisomerase.. RNA mới hình thành. 21/02/2016 3:29:41 CH. 17. Nguyễn Hữu Trí. 21/02/2016 3:29:41 CH. 18. Nguyễn Hữu Trí. 3.

(46) 21/02/2016. Kết thúc phiên mã (Termination). Kết thúc phiên mã không phụ thuộc Rho Intrinsic termination = Rho-independent termination. • Khi polymerase tiến tới một terminator tại điểm cuối của gene nó sẽ tách ra khỏi template và giải phóng RNA • Có hai cơ chế kết thúc (terminator) – Chức năng kết thúc nội tại (Intrinsic) với chính RNA polymerase không có sự giúp đỡ của các protein khác – Kết thúc phiên mã phụ thuộc vào một protein rho. 21/02/2016 3:29:41 CH. 19. Nguyễn Hữu Trí. Kiểu hoạt động của Intrinsic Termination Terminator vi khuẩn hoạt động dựa vào sự bắt cặp bổ sung không bền giữa lai RNA-DNA o 2 trình tự đối xứng bổ sung giàu GC, khi phiên mã sẽ tạo thành cấu trúc kẹp tóc (hairpin), cấu trúc này ổn định và ngăn không cho RNA pol tiếp tục tổng hợp. o Nguyên nhân chính dẫn tới ngừng quá trình phiên mã là chuỗi giàu U nằm ở downstream của hairpin, làm giảm ái lực của RNA với DNA mạch gốc. Do đó RNA tách khỏi phức hợp phiên mã.. 21/02/2016 3:29:41 CH. 21. Nguyễn Hữu Trí. Kết thúc phiên mã phụ thuộc nhân tố rho • Rho nhận diện một vùng trên RNA gọi là “rut” (gồm 50-90 bp nằm phiá trước trình tự kết thúc, giàu C và ít G) • Rho thủy phân ATP để dịch chuyển trên RNA với tốc độ cao hơn RNA pol. Khi đó Rho phân tách liên kết RNA-DNA nhờ hoạt tính helicase. Quá trình phiên mã kết thúc.. • Kết thúc nội tại hay không phụ thuộc rho phụ thuộc vào hai yếu tố kết thúc: – Một trình tự lặp đảo theo sau ngay một vùng giàu T trên chuỗi nontemplate của gene. • Trình tự lặp đảo mở đường cho phân tử transcript hình thành một cấu trúc kẹp tóc (hairpin structure).. 20. 21/02/2016 3:29:41 CH. Nguyễn Hữu Trí. Kết thúc phiên mã phụ thuộc Rho Rho-Dependent Termination Rho là một protein gồm 6 tiểu đơn vị, có 2 domain Rho là nguyên nhân làm suy giảm khả năng phiên mã của RNA polymerase trong in vitro.Sư suy giảm này là do Rho làm kết thúc phiên mã. Sau khi kết thúc phiên mã, polymerase sẽ tái khỏi đầu lại quá trình phiên mã. 21/02/2016 3:29:41 CH. 22. Nguyễn Hữu Trí. PHIÊN MÃ VÀ DỊCH MÃ Ở PROKARYOTE & EUKARYOTE. RNA Polymerase ở Eukaryote • RNA Pol I: phiên mã các RNA của ribosome (28S, 18S, 5.8S) • RNA Pol II: phiên mã mRNA • RNA Pol III: phiên mã tRNA, rRNA 5S và các RNA nhỏ khác.. 21/02/2016 3:29:41 CH. 23. Nguyễn Hữu Trí. 21/02/2016 3:29:41 CH. 24. Nguyễn Hữu Trí. 4.

(47) 21/02/2016. Sự biến đổi mRNA. Kết thúc phiên mã. • Mỗi đầu cuối của phân tử pre-mRNA được biến đổi (modified) theo các cách khác nhau. • Cơ chế của sự kết thúc – Có sự khác nhau giữa prokaryote và eukaryote. • Tế bào Eukaryote biến đổi RNA sau khi dịch mã • Enzyme trong nhân của eukaryote. – Đầu 5 được gắn chóp(cap) 7- Mehtyl- Guanylate. – Đầu 3 nhận đuôi poly-A dài khoảng 50-250 nu. – Biến đổi pre-mRNA trước khi tín hiệu di truyền rời nhân và đi vào tế bào chất. 7- Mehtyl- Guanylate. 50 đến 250 adenine nucleotide Được gắn vào đầu 3. Được gắn vào đầu 5 TRANSCRIPTION. RNA PROCESSING. DNA. Đoạn mã hóa protein. Pre-mRNA. 5. mRNA. G P P P. Tín hiệu Polyadenylation 3 AAA…AAA AAUAAA. Ribosome TRANSLATION. 5 Cap. 5 UTR. Start codon Stop codon. 3 UTR. Đuôi Poly-A. Polypeptide. 25. 21/02/2016 3:29:41 CH. Nguyễn Hữu Trí. 26. 21/02/2016 3:29:41 CH. Nguyễn Hữu Trí. RNA transcript (pre-mRNA) 5. Gene gián đoạn và RNA splicing. Intron. Exon 1. Exon 2. Protein 1. Other proteins. snRNA. • RNA splicing. snRNPs. – Loại bỏ các intron và nối exon lại 5 Exon Intron TRANSCRIPTION. DNA. Exon. 3. Pre-mRNA 5 Cap 1. RNA PROCESSING. Spliceosome. Intron. Exon. Đuôi Poly-A 30. 31. 104. 105. 2. 5. 146. Pre-mRNA. mRNA. Đoạn mã hóa. Intron bị cắt ra và các exon được nối lại với nhau. Ribosome TRANSLATION. Polypeptide. mRNA. 5 Cap. Thành phần Spliceosome. Đuôi Poly-A 1. 146 3 UTR. 3 UTR. Intron bị cắt ra 21/02/2016 3:29:41 CH. 27. Nguyễn Hữu Trí. 21/02/2016 3:29:41 CH 3. mRNA28 5. Exon 1. Nguyễn Hữu Trí. Exon 2. Chức năng và sự tiến hóa quan trọng của Intron • Hiện diện trong intron – Cho phép có khả năng biến đổi quá trình RNA splicing. 21/02/2016 3:29:41 CH. 29. Nguyễn Hữu Trí. 21/02/2016 3:29 CH. 30. Nguyễn Hữu Trí. 5.

(48) 21/02/2016. Gene. Chương 5. Mã di truyền và quá trình tổng hợp Protein • Trong suốt quá trình phiên mã. – gene được xác định dựa vào trình tự các base dọc theo chiều dài của phân tử mRNA. – Gene biểu hiện thành protein thông qua con đường phiên mã (transcription) và dịch mã (translation).. 21/02/2016 3:32:41 CH. 1. Nguyễn Hữu Trí. Gene 1 Gene 3. Chuỗi DNA 3 5 A C C A A A C C G A G T (template) TRANSCRIPTION. mRNA. 5. U G G U U U G G C U C A. 3. Codon TRANSLATION. Protein. 21/02/2016 3:32:41 CH. Sự biểu hiện của gen • DNA là vật liệu di truyền của sự sống • Quá trình chuyển thông tin di truyền từ DNA sang protein còn gọi là quá trình biểu hiện của gen • Bao gồm 2 bước, được gọi là phiên mã (transcription) và dịch mã (translation).. Gene 2. Phân tử DNA. Trp Amino acid. 2. Phe. Gly. Ser. Nguyễn Hữu Trí. Prokaryote • Phiên mã và dịch xảy ra gần như đồng thời DNA. TRANSCRIPTION. mRNA Ribosome TRANSLATION Polypeptide. (a) Tế bào Prokaryote. Tế bào không có màng nhân, mRNA được tổng hợp bởi quá trình transcription thì ngay lập tức được translation mà không thông qua quá trình chế biến.. 21/02/2016 3:32:41 CH. 3. Nguyễn Hữu Trí. 21/02/2016 3:32:41 CH. 4. Nguyễn Hữu Trí. Eukaryote. RNA thông tin (mRNA). • RNA transcript được biến đổi trước khi trở thành mRNA trưởng thành • RNA được phiên mã trong nhân, mRNA được dịch mã ở tế bào chất. mRNA là bản sao của những trình tự nhất định trên DNA, đóng vai trò trung gian chuyển thông tin mã hóa trên phân tử DNA đến bộ máy giải mã thành protein tương ứng. mRNA được tạo ra nhờ qúa trình phiên mã khi có nhu cầu; và do đó nó sẽ mã hóa cho các protein đặc hiệu cho tế bào. mRNA ở tế bào eukaryote sau khi được dịch mã sẽ được xử lý (processing) trước khi rời nhân đi ra tế bào chất là nơi xảy ra quá trình dịch mã ở Prokaryote quá trình dịch mã diễn ra gần như đồng thời cùng với quá trình phiên mã.. Màng nhân. DNA. TRANSCRIPTION. Pre-mRNA. RNA PROCESSING. mRNA. Ribosome TRANSLATION Polypeptide. 21/02/2016 3:32:41 CH. Tế bào Eukaryote. Quá trình transcription xảy ra trong (b) nhân được ngăn cách bởi màng nhân. Khi RNA mới được phiên mã, gọi là pre-mRNA, sau khi qua chế biến mRNA được gọi là trưởng thành hay mRNA thật sự 5 Nguyễn Hữu Trí và rời nhân.. mRNA 21/02/2016 3:32:41 CH. 6. Nguyễn Hữu Trí. 1.

(49) 21/02/2016. Khung đọc mở ORF. RNA ribosom (rRNA) • RNA ribosom chiếm đến 80% tổng số RNA tế bào • Các RNA kết hợp với các protein chuyên biệt tạo thành Ribosom. • Một Ribosom gồm một tiểu đơn vị nhỏ và một tiểu đơn vị lớn. Mỗi tiểu đơn vị gồm nhiều protein và rRNA có kích thước khác nhau • Tiểu đơn vị nhỏ có vị trí gắn với phân tử mRNA. Tiểu đơn vị lớn có ba vị trí gắn cho phân tử tRNA, vị trí P (Peptide site), vị trí A (Amino acid site) và vị trí E (Exit site). Trong suốt quá trình sinh tổng hợp protein hai tiểu phần này gắn với nhau.. 21/02/2016 3:32:41 CH. 7. 21/02/2016 3:32:41 CH. Nguyễn Hữu Trí. RNA vận chuyển (tRNA). 8. Nguyễn Hữu Trí. Cấu trúc RNA vận chuyển. Vị trí gắn Amino acid 3. • Hầu hết các phân tử tRNA của prokaryote và eukaryote có cấu trúc rất giống nhau. • Dây đơn RNA gấp khúc tạo thành vòng (loop), cho ra một phân tử có cấu trúc bậc hai trên thân chính. – Thân (stem) hoặc nhánh (arm) là vùng chứa các cặp base nối với nhau, tương ứng theo mã di truyền. – Ở các loop không có sự bắt cặp giữa các base. A C C A C G C U U A A U C C A C AG * G U G U G C * C * * U * G AG G U. C. • Phân tử tRNA • Là một chuỗi RNA mạch đơn có chiều dài khoảng 80 nucleotide. – Có hình L – Mỗi tRNA mang một amino acid đặc hiệu với đầu cuối. – Mỗi tRNA mang một anticodon ở đầu khác. *. A*. *. A. 5 G C G G A U U U A. * CUC C G A G. * C C A G A. A G *. *. G A G G. Liên kết Hydro C U. A G. Anticodon. 21/02/2016 3:32:41 CH. 9. 21/02/2016 3:32:41 CH. Nguyễn Hữu Trí. 21/02/2016 3:32:41 CH. U UUU Phe U UUC UUA UUG Leu. Base mRNA đầu (5 end). • Codon (bộ ba mã hóa) : Thông tin di truyền được mã hóa bằng những bộ ba base (base triplets) không chồng lắp lên nhau, hay còn gọi là codon.. C. CUU CUC CUA CUG. A. AUU AUC AUA AUG. GUU GUC G GUA GUG. Leu. lle Met or start. Val. 11. Nguyễn Hữu Trí. Sự tiến hóa của mã di truyền. Base mRNA thứ 2 C A UAU Tyr UAC Ser UAA Stop UAG Stop. G UGU Cys UGC UGA Stop UGG Trp. CCU CCC CCA CCG. Pro. CAU His CAC CAA Gln CAG. ACU ACC ACA ACG. Thr. AAU Asn AAC AAA Lys AAG. U C A G U CGU CGC C Arg CGA A CGG G U AGU Ser C AGC A AGA AGG Arg G. GCU GCC GCA GCG. Ala. GAU GAC Asp GAA GAG Glu. U GGU C GGC Gly GGA A GGG G. UCU UCC UCA UCG. Nguyễn Hữu Trí. Base mRNA thứ 3 (3 end). Mã di truyền. 10. • Các codon phải được đọc đúng khung đọc để tổng hợp nên một chuỗi polypeptide đặc hiệu • Mã di truyền gần như có tính vạn năng (universal) – Tức là toàn bộ thế giới các sinh vật từ đơn giản nhất là vi khuẩn tới các loài động vật phức tạp nhất có chung bộ mã di truyền.. 21/02/2016 3:32:41 CH. 12. Nguyễn Hữu Trí. 2.

(50) 21/02/2016. Sự dịch mã. Quá trình dịch mã (Translation). Trình tự của bốn loại nucleotide trên mRNA được dịch mã thành trình tự của các acid amin trên protein. • 1. RNA vận chuyển (tRNA) đóng vai trò vận chuyển các amino acid cần thiết đến bộ máy dịch mã để tổng hợp protein ừ mRNA tương ứng • 2. Ribosome xúc tác cho quá trình dịch mã. • 3. Protein, là polymer của các amino acid, được tổng hợp nhờ các aminoacyl‐tRNA • 4. Protein được tổng hợp theo hướng từ N‐C, trong khi mRNA (mRNA) được dịch mã theo hướng 5'‐3'. • 5. Nhóm amino của aminoacyl‐tRNA gắn vào đầu C‐terminal carbonyl của chuỗi peptide đang hình thành để tạo cầu nối peptide. • 6. Tỉ lệ sai sót khoảng ∼ 10−4. TRANSCRIPTION. DNA mRNA Ribosome. TRANSLATION Polypeptide. tRNA với amino acid Ribosome gắn vào Gly tRNA Anticodon A A A U G G U U U G G C. Codons. 5 21/02/2016 3:32:41 CH. 13. Nguyễn Hữu Trí. 21/02/2016 3:32:41 CH. Sự khởi đầu dịch mã (Intiation) • Hai sự kiện quan trọng nhất xảy ra trước khi khởi đầu dịch mã xảy ra đó là – Sự tạo thành các aminoacyl-tRNA • Amino acid phải tạo được cầu nối đồng hóa trị với tRNA • Quá trình nối tRNA với amino acid được gọi là nạp tRNA (tRNA charging).. – Sự phân ly của ribosom thành hai tiểu phần • Tế bào hình thành phức hợp khởi đầu dịch mã trên tiểu phần nhỏ của ribosome • Hai tiểu phần phải được tách nhau trước khi quá trình này có thể xảy ra 21/02/2016 3:32:41 CH. 15. Nguyễn Hữu Trí. Amino acids. Polypeptide. mRNA. 3 14. Nguyễn Hữu Trí. Nạp tRNA • Tất cả tRNA có cùng 3 base tại đầu cuối 3’(CCA) • Đầu cuối adenosine là điểm nạp của amino acid • Amino acid được gắn bởi cầu nối ester giữa – Nhóm carboxyl của amino acid – Nhóm 2’-OH hoặc 3’-OH của đầu cuối adenosine của tRNA 21/02/2016 3:32:41 CH. 16 Nguyễn Hữu Trí. Nạp tRNA 5. Vị trí gắn Amino acid. • Các Aminoacyl-tRNA synthetase gắn các amino acid vào các tRNA chuyên biệt với chúng • Quá trình này hoàn thành thông qua hai bước phản ứng:. A A G. – Khởi đầu là quá trình hoạt hóa amino acid với AMP có nguồn gốc từ ATP – Bước thứ hai, năng lượng từ aminoacyl-AMP được sử dụng để chuyển amino acid tới tRNA. 3 Liên kết hydro. Anticodon. 3 Anticodon5 (c). (b) Cấu trúc 3-D. 21/02/2016 3:32:41 CH. 17. Kí hiệu. Nguyễn Hữu Trí. 21/02/2016 3:32:41 CH. 18. Nguyễn Hữu Trí. 3.

(51) 21/02/2016. Hoạt hóa amino acid • Có hai bước để hoạt hóa amino acid nhờ enzyme aa-tRNA synthetase • Nhận ra tRNA nhờ vào việc xác định trình tự base của anticodon và các vùng khác những vùng này được gọi là vùng xác định. • Một aminoacyl tRNA synthetase có thể nạp được nhiều lần tRNA cùng họ với một loại amino acid (20 synthetase khác nhau được sử dụng). • Aminoacyl tRNA synthetase có thể sửa chữa các amino acid nạp sai.. 21/02/2016 3:32:41 CH. 19. 21/02/2016 3:32:41 CH. Nguyễn Hữu Trí. 20. Ribosome. Aminoacyl-tRNA synthetase • Một enzyme đặc hiệu gọi là aminoacyl-tRNA synthetase gắn các amino acid đúng với tRNA chuyên biệt. Amino acid. P P. P. Nguyễn Hữu Trí. • Quá trình dịch mã thực hiện trên các ribosome • Mỗi ribosome gồm hai tiểu đơn vị lớn và nhỏ • Là phức hợp gồm rRNA, các enzyme và protein cấu trúc. Aminoacyl-tRNA synthetase (enzyme) 1 Vị trí hoạt động được gắn với amino acid và ATP.. Adenosine. ATP. 2 ATP mất hai nhóm P Và nối với amino acid ở dạng AMP. P. Pyrophosphate. P Pi. Phosphates. Adenosine. Pi. Pi. tRNA 3 tRNA thích hợp hình thành cầu nối đồng hóa trị với amino acid, thay thế AMP. Amino acid được 4 hoạt hóa được phóng thích khỏi enzyme.. 21/02/2016 3:32:41 CH. P. Adenosine. AMP. Aminoacyl tRNA Một “amino acid được hoạt hóa”). 21. 21/02/2016 3:32:41 CH. Nguyễn Hữu Trí. 22. Nguyễn Hữu Trí. Ribosome Amino cuối. • Ribosome có ba vị trí gắn cho tRNA – Vị trí P – Vị trí A – Vị trí E. Chuỗi polypeptide đang hình thành Amino acid kế tiếp được gắn vào chuỗi polypeptide. Vị trí P (Peptidyl-tRNA binding site) Vị trí A (AminoacyltRNA binding site). Vị trí E (Exit site). tRNA Tiểu đơn vị lớn. 3. mRNA E. P. A 5. Vị trí gắn mRNA Tiểu đơn vị nhỏ. Mô hình cho thấy các vị trí gắn của Ribosome.. 21/02/2016 3:32:41 CH. 23. Nguyễn Hữu Trí. Codons. Mô phỏng sự kết hợp giữa Ribosome, mRNA và tRNA. Một tRNA được gắn với một amino acid kế tiếp mang anticodon tương ứng bắt cặp với codon ở vị trí A (A site) còn trống. Vị trí P (P site) giữ tRNA mang chuỗi polypeptide đang hình thành. tRNA sau đó được giải phóng nhờ vị trí E ( E site). 21/02/2016 3:32:41 CH. 24. Nguyễn Hữu Trí. 4.

(52) 21/02/2016. Sự phân tách của Ribosome. Sinh tổng hợp Protein. • Các ribosome E. coli phân tách thành các tiểu phần tại bước cuối của quá trình dịch mã • IF1 xúc tác hoạt hóa cho quá trình phân tách này • IF3 gắn vào tiểu phần 30S tự do và ngăn cản sự tái liên kết với tiểu phần 50S để hình thành ribosomehoàn chỉnh. 21/02/2016 3:32:41 CH. 1. Khởi đầu (Initiation) 2. Kéo dài (Elongation) 3. Kết thúc (Termination). 25 Nguyễn Hữu Trí. 21/02/2016 3:32:41 CH. •. • • •. – Thông thường là AUG – Có thể là GUG – Đôi khi là UUG Khi dipeptide được hình thành, α−NH2 của Met mở đầu có thể tác kích vào nhóm −C=O của gốc aa thứ hai. Quá trình này không xảy ra nếu α−NH2 của Met khởi đầu được formyl hóa thành −NH−CHO. Aminoacyl-tRNA khởi đầu là N-formyl-methionyl-tRNA N-formyl-methionine (fMet) là amino acid đầu tiên của chuỗi polypeptide được tổng hợp Amino acid này sau đó được tách khỏi phân tử protein trong suốt quá trình trưởng thành. 21/02/2016 3:32:41 CH. 27. Nguyễn Hữu Trí. Gắn mRNA vào tiểu phần 30S • Phức hợp 30S khởi đầu dịch mã được hình thành từ một tiểu phần ribosome 30S tự do cộng thêm mRNA và fMet-tRNA • Việc gắn giữa tiểu phần ribosome 30S ở prokaryote vào vị trí khởi đầu dịch mã (initiation site) của mRNA phụ thuộc vào sự bắt cặp bổ sung giữa:. Nguyễn Hữu Trí. Phức hợp 30S khởi đầu dịch mã. Codon và aminoacyl-tRNA đầu tiên • Codon khởi đầu ở Prokaryote là:. 26. Khi ribosome hoàn toàn tách thành hai tiểu phần 50S và 30S, tế bào tiến hành thiết lập một phức hợp khởi đầu dịch mã hoàn chỉnh trên tiểu phần 30S gồm: – – – –. mRNA fMet-tRNA GTP Yếu tố IF1, IF2, IF3. 21/02/2016 3:32:41 CH. 28. Nguyễn Hữu Trí. Ở vi khuẩn, tiểu đơn vị nhỏ gắn với mRNA tại trình tự ShineDalgarno (RBS = ribosome binding site) ở thượng nguồn codon AUG khởi đầu.. – Một trình tự ngắn Shine-Dalgarno của mRNA nằm ở upstream của codon khởi đầu – Trình tự bổ sung ở đầu cuối 3’ của 16S RNA 21/02/2016 3:32:41 CH. 29. Nguyễn Hữu Trí. 21/02/2016 3:32:41 CH. 30. Nguyễn Hữu Trí. 5.

(53) 21/02/2016. Initiation Factor và tiểu phần 30S. Gắn fMet-tRNA vào phức hợp 30S khởi đầu. • Liên kết giữa trình tự Shine-Dalgarno với trình tự bổ sung của 16S rRNA được hoạt hóa bởi IF3. • IF2 là nhân tố chính xúc tác cho việc gắn của fMet-tRNA vào phức hợp 30S khởi đầu dịch mã. • Hai yếu tố khởi đầu dịch mã còn lại cũng đóng vai trò trợ giúp quan trọng • GTP cần thiết cho việc gắn của IF2 • GTP không bị thủy phân ở bước này. – Trợ giúp bởi IF1 và IF2 – Lúc này cả 3 initiation factor đều liên kết với tiểu phần 30S. 21/02/2016 3:32:41 CH. 31. Nguyễn Hữu Trí. 21/02/2016 3:32:41 CH. 21/02/2016 3:32:41 CH. 33. Nguyễn Hữu Trí. Nguyễn Hữu Trí. Khởi đầu dịch mã. Phức hợp 70S khởi đầu dịch mã • GTP được thủy phân sau khi tiểu phần 50S gắn vào phức hợp 30S để hình thành phức hợp 70S khởi đầu dịch mã (70S initiation complex) • Sự thủy phân GTP được tách khỏi IF2 trong việc gắn với tiểu phần ribosome 50S. • Mục đích của sự thủy phân là tách IF2 và GTP khỏi complex nhờ đó mà quá trình kéo dài chuỗi polypeptide có thể được bắt đầu.. 32. 1. IF1 tác động làm tách ribosome 70S thành 50S và 30S. 2. Gắn IF3 vào 30S, ngăn cản sự tái hình thành ribosome hoàn chỉnh. 3. IF1, IF2, GTP gắn vào dọc bên IF3 4. Gắn mRNA vào fMet-tRNA hình thành phức hợp 30S khởi đầu dịch mã. a. IF2 xúc tác cho việc gắn fMettRNA b. IF3 xúc tác cho việc gắn mRNA 5. Việc gắn vào của 50S cùng với việc tách ra của IF1 và IF3 6. IF2 tách ra và thủy phân GTP. 7. Hoàn thành phức hợp 70S khởi đầu dịch mã. 34. 21/02/2016 3:32:41 CH. Nguyễn Hữu Trí. Cơ chế kéo dài. Sự kéo dài chuỗi Polypeptide. Quá trình kéo dài gồm 3 bước: 1.. 2.. Sự kéo dài bắt đầu khi ribosome mang fMet-tRNA ở vị trí P site và aminoacyl-tRNA ở vị trí A.. 21/02/2016 3:32:41 CH. 35. Nguyễn Hữu Trí. 3.. EF-Tu với GTP kết hợp aminoacyl-tRNA gắn vào vị trí A trên ribosoma. Peptidyl transferase tạo một liên kết peptide giữa peptide trên vị trí P và aminoacyltRNA mới đến ở vị trí A. Kéo dài chuỗi peptide thêm một amino acid và dịch chuyển nó sang vị trí A. EF-G với GTP chuyển vị trí của peptidyl-tRNA với mRNA codon tương ứng sang vị trí P.. 36. 6.

(54) 21/02/2016. Các protein factor và hình thành liên kết peptide • Factor thứ nhất T (transfer). – Vận chuyển aminoacyl-tRNAs tới ribosome – Có 2 protein khác nhau • Tu, không bền (unstable) • Ts, bền (stable). • Factor thứ hai, G, có hoạt tính GTPase. • Factor EF-Tu và EF-Ts tham gia vào bước đầu tiên của quá trình kéo dài. • Factor EF-G tham gia vào bước thứ ba.. 18-37. 21/02/2016 3:32:41 CH. – RF1 nhận stop codon UAA và UAG – RF2 nhận stop codon UAA và UGA – RF3 là một GTP-binding protein hỗ trợ RF1 và RF2 bám vào ribosome. Nguyễn Hữu Trí. Kết thúc dịch mã. Nhân tố kết thúc (Release Factor) • Sự kết thúc dịch mã ở Prokaryotic được thực hiện thông qua 3 nhân tố kết thúc RF:. 38. • Nhân tố kết thúc (RF) tương tự như một tRNA đi vào vị trí A và cung cấp một phân tử nước (H2O) để thủy phân tRNA cuối cùng khỏi chuỗi polypeptide để kết thúc dịch mã • mRNA vi khuẩn được dịch mã mà không có quá trình xử lý (processing) trước khi kết thúc phiên mã và do không có màng nhân nên quá trình phiên mã và dịch mã đi cùng với nhau • mRNA ở eukaryote hình thành một vòng cho phép ribosome sau khi dịch mã xong nhanh chóng tiếp xúc với đầu 5’. • Một phân tử mRNA được dịch mã bởi nhiều ribosom ở cả prokaryote và eukaryote tạo nên một phức hợp gọi là polyribosome hay polysome. • Eukaryote có 2 nhân tố kết thúc: – eRF1 nhận ra cả 3 stop codon – eRF3 là ribosome-dependent GTPase hỗ trợ eRF1 tách chuỗi polypeptide. 21/02/2016 3:32:41 CH. 39. 40. Sự dịch mã •Eukaryote. Sự dịch mã. • Vi khuẩn. – Bắt đầu với methionine – tRNA khởi đầu không giống như tRNA tham gia vào quá trình kéo dài – Không có trình tự ShineDalgarno – mRNA có mũ chụp tại đầu 5’. Nguyễn Hữu Trí. – N-formyl-methionine – Trình tự Shine-Dalgarno chỉ cho ribosome biết đâu là điểmkhởi đầu dịch mã. • Sự khác nhau giữa quá trình biểu hiện gen của tế bào prokaryote và tế bào eukaryote • Prokaryote thiếu màng nhân cho phép quá trình dịch mã bắt đầu trong khi quá trình phiên mã vẫn đang diễn ra. RNA polymerase DNA mRNA Polyribosome RNA polymerase. Hướng phiên mã. 0.25 m DNA. Polyribosome Polypeptide (amino cuối) Ribosome mRNA (5 end). 21/02/2016 3:32:41 CH. 41. Nguyễn Hữu Trí. 21/02/2016 3:32:41 CH. 42. Nguyễn Hữu Trí. 7.

(55) 21/02/2016. Polyribosome. Hình thành Protein có chức năng. • Nhiều ribosome có thể tham gia dịch mã một phân tử mRNA cùng một lúc hình thành nên polyribosome Polypeptide Tổng hợp xong. Polypeptide Đang tổng hợp. Tiểu đơn vị ribosome đang tiến tới Start of mRNA (5 end). • Chuỗi polypeptide tiếp tục trải qua sự biến đổi sau khi dịch mã • Sau khi dịch mã protein có thể được biến đổi theo nhiều con đường để hình thành nên hình dạng 3-D.. mRNA (3 end). (a). Ribosomes mRNA. 0.1 µm. (b). 21/02/2016 3:32:41 CH. Hình cho thấy một polyribosome lớn ở một tế bào prokaryote (TEM).. 43. Nguyễn Hữu Trí. 21/02/2016 3:32:41 CH. 44. Nguyễn Hữu Trí. Biến đổi sau dịch mã. 21/02/2016 3:32:41 CH. 45. Nguyễn Hữu Trí. 8.

(56) 21/02/2016. Chương 6. Điều hòa sự biểu hiện của eở Prokaryote. Điều hòa sự biểu hiện của gene. Quá trình kiểm soát gene Prokaryote đòi hỏi đáp ứng nhanh với những thay đổi của môi trường. Kiểm soát gene có thể là dương – có nghĩa là hoạt hóa hoạt động của gene, hoặc âm – kìm hãm sự hoạt động của gen. Điều hòa sự biểu hiện của gene ở Prokaryote chủ yếu là ở mức độ phiên mã.. DNA 2/21/2016 3:37:34 PM. 1. Nguyễn Hữu Trí. →. 2/21/2016 3:37:34 PM. •. •. Phức hợp gọi là operon được mô tả vào năm 1961 bởi Francois Jacob và Jacques Monod. Một operon có ba phần: promoter, operator và các gen cấu trúc. Thêm vào đó là một gen điều hòa liên quan đến việc cho phép gen cấu trúc được phiên mã hay không . Operon – Một cụm các gene cấu trúc đặt dưới sự kiểm soát của một vùng điều hòa. (Repressor binding site = operator ; RNAP binding site = promoter. 2/21/2016 3:37:34 PM. 3. Nguyễn Hữu Trí. •. Một operon cảm ứng (inducible) chứa một cụm gen cấu trúc thông thường ở dạng đóng (off), bị khóa bởi repressor của nó. Khi tác nhân kiểm soát gắn vào repressor, tách nó khỏi vị trí khóa gene (vì thế ngừng ức chế). Gen sau đó trở thành trạng thái mở (on) cho đến khi một repressor gắn trở lại operator. Operon cảm ứngđược hoạt hóa bởi các phân tử cảm ứng nhỏ VD: Lac operon Một operon ức chế (repressible) chứa một cụm gen cấu trúc thông thường ở dạng mở (on). Khi tác nhân kiểm soát gắn vào repressor, repressor gắn vào operator, khóa gene cấu trúc và gen trở thành trạng thái đóng (off). Operon ức chế - bị đóng bởi những chất đồng kìm hãm. VD: Trp operon. 2/21/2016 3:37:34 PM. Protein Nguyễn Hữu Trí. Phức hợp Operon 1. Promoter: được nhận diện bởi RNA polymerase là nơi bắt đầu quá trình phiên mã 2. Operator: kiểm soát việc gắn RNA polymerase vào promoter và thông thường nằm trong promoter hoặc nẳm giữa promoter và gen cần được phiên mã. 3. Gene cấu trúc: gene cấu trúc (hoặc gen thiết kế) mã hóa cho chuỗi polypeptide.. 2/21/2016 3:37:34 PM. Mô hình Operon điều hòa •. →. 2. Mô hình Operon điều hòa •. mRNA. 4. Nguyễn Hữu Trí. Cơ chế điều hòa gene • Kiểm soát dương: quá trình phiên mã chỉ xảy ra khi promoter được hoạt hóa bởi activator. • Kiểm soát âm thường là cơ chế phổ biến ở prokaryote. • Kiểm soát dương thường phổ biến ở eukaryote • Sự tự điều hòa: protein điều hòa quá trình phiên mã của chính nó.. 5. Nguyễn Hữu Trí. 2/21/2016 3:37:34 PM. 6. Nguyễn Hữu Trí.

(57) 21/02/2016. Kiểm soát dương - Kiểm soát âm Kiểm soát dương: Kiểm soát dương = activator gắn vào vị trí điều hòa để kích thích quá trình phiên mã gene, cần sự có mặt của một nhân tố activator để sự phiên mã xảy ra Kiểm soát âm: Kiểm soát âm = repressor gắn lên bị trí điều hòa để chặn lại quá trình phiên mã của gene. Sự có mặt của nhân tố repressor ức chế quá trình phiên mã, sự phiên mã chỉ xảy ra khi repressor bị bất hoạt bởi một inducer Cả hai kiểu operon cảm ứng và ức chế, gen đóng khi repressor gắn vào operator của nó. Sự khác biệt đó là cách hoạt động của tác nhân kiểm soát repressor. 2/21/2016 3:37:34 PM 2/21/2016. 7. Nguyễn Hữu Trí. 7. Kiểm soát dương: cảm ứng. 9. Nguyễn Hữu Trí. Phức hợp activator repressor không thể gắn với vị trí điều hòa Không phiên mã. 9. 2/21/2016 3:37:34 PM 2/21/2016. 10. Nguyễn Hữu Trí. 10. Kiểm soát âm: ức chế. Kiểm soát âm: cảm ứng Khi inducer hiện diện, repressor không thể gắn lên vị trí điều hòa. Xảy ra sự phiên mã.. Phức hợp repressorcorepressor gắn lên vị trí điều hòa Không phiên mã. Allolactose, inducer 2/21/2016 3:37:34 PM 2/21/2016. Nguyễn Hữu Trí. Kiểm soát dương: ức chế. Phức hợp activator inducer gắn lên vị trí điều hòa Xảy ra sự phiên mã. 2/21/2016 3:37:34 PM 2/21/2016. 8. 2/21/2016 3:37:34 PM. Tryptophan, corepressor 11. Nguyễn Hữu Trí. 11. 2/21/2016 3:37:34 PM 2/21/2016. 12. Nguyễn Hữu Trí. 12.

(58) 21/02/2016. Lac Operon. Lac Operon. • Sự biểu hiện của gene là do cảm ứng hay theo chương trình. • Repressor thường được biểu hiện từ gen i • Repressor gắn vào operator để chặn quá trình phiên mã của gene cấu trúc. • Inducer lactose gắn và làm bất hoạt repressor cho phép khởi đầu quá trình phiên mã. • Lactose operator là một vị trí cần thiết cho sự ức chế • Lactose promoter là một vị trí cần thiết cho sự phiên mã • Lac operon chứa vùng gen cấu trúc liên kết với gene điều hòa.. 13. 2/21/2016 3:37:34 PM. Nguyễn Hữu Trí. Khi không có lactose (controller), repressor gắn vào operator ức chế quá trình phiên mã bằng cách ngăn RNA polymerase gắn vào promoter.. Khi có cơ chất, allolactose (controller), gắn vào phân tử repressor đang nằm trên vùng operator của gene, khi đó repressor được tách khỏi gen. RNA polymerase có thể gắn vào promoter và gene mã hóa cho ba enzyme cần thiết cho việc sử dụng lactose được phiên mã.. 15. Nguyễn Hữu Trí. Lac operon. Lac Operon. 2/21/2016 3:37:34 PM. 14. 2/21/2016 3:37:34 PM. Nguyễn Hữu Trí. • Khi các enzyme được tổng hợp , lactose được sử dụng, bao gồm cả phân tử allolactose gắn vào repressor. Khi allolactose không còn gắn vào repressor protein, repressor khóa promoter (bằng cách gắn vào operator), làm quá trình phiên mã ngừng. Đây là cơ chế kiểm soát âm, bởi vì promoter bị khóa do operator bị gắn bởi repressor . • Lactose operon là một ví dụ điều hòa hoạt động của gen cảm ứng, bởi vì khi hiện diện cơ chất của con đường chuyển hóa (metabolic pathway) có thể cảm ứng quá trình tổng hợp enzyme. Bởi vì allolactose cảm ứng phiên mã, lactose operon được gọi là operon cảm ứng ( hoặc trong một số trường hợp, gọi là operon được giải ức chế - derepressable operon vì lactose làm ngừng hoạt động của repressor).. 2/21/2016 3:37:34 PM. Lac operon. 16. Nguyễn Hữu Trí. Lac Operon • Lactose operon có một phần của kiểm soát dương • Kiểm soát dương của lac operon liên quan đến cAMP-CRP (cyclic AMP receptor protein) gắn vào promoter để hoạt hóa quá trình phiên mã bởi RNA polymerase. • Phức cAMP-CRP điều hòa hoạt tính của lac operon. 2/21/2016 3:37:34 PM. 17. Nguyễn Hữu Trí. 2/21/2016 3:37:34 PM. 18. Nguyễn Hữu Trí.

(59) 21/02/2016. Lac Operon. Lac Operon. Khi mức glucose trong tế bào xuống thấp, cAMP (cyclic adenosine monophosphate), một chất truyền tin thứ hai trong việc truyền tín hiệu tế bào tích lũy lại. cAMP gắn vào vị trí allosteric của CRP hình thành một phức CRP- cAMP. CRP-cAMP gắn vào vị trí kế lactose operon promoter và nó làm RNA polymerase dễ dàng gắn vào vùng promoter tăng cường việc phiên mã các enzyme lactase (nếu lactose hiện diện sẽ tách phân tử lactose repressor).. 19. 2/21/2016 3:37:34 PM. Nguyễn Hữu Trí. 20. 2/21/2016 3:37:34 PM. Nguyễn Hữu Trí. Lac Operon. Lac Operon. 21. 2/21/2016 3:37:34 PM. Nguyễn Hữu Trí. Trp Operon. 23. Nguyễn Hữu Trí. Trp Operon. • Trp operon chứa các gen cấu trúc cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp tryptophan. • Trp operon hoạt hóa quá trình phiên mã khi không có sự hiện diện của tryptophan. • Hệ thống ức chế được điều hòa bởi một cơ chế kiểm soát ngược âm.. 2/21/2016 3:37:34 PM. 22. 2/21/2016 3:37:34 PM. Nguyễn Hữu Trí. • Trp operon được đóng khi tryptophan gắn vào và làm bất hoạt aporepressor. • Phức hợp tryptophan-repressor gắn vào operator và ngăn chặn quá trình phiên mã khi mức tryptophan cao. • Nếu mức tryptophan sụt giảm,phức hợp trp-repressor sẽ tách khỏi operator.. 2/21/2016 3:37:34 PM. 24. Nguyễn Hữu Trí.

(60) 21/02/2016. Trp Operon - Điều hòa giảm bớt (Attenuation). Trp Operon - Điều hòa giảm bớt. • Attenuation – một hình thức rất nhạy kết hợp với sự điều hòa dịch mã của Trp operon. • Trình tự trp attenuator có chứa một trình tự base bổ sung ở đầu 5’ trong mRNA và có thể bắt cặp bổ sung tao thành cấu trúc thân (stem) và vòng (loop).. 25. 2/21/2016 3:37:34 PM. Nguyễn Hữu Trí. Trp Operon - Điều hòa giảm bớt. 2/21/2016 3:37:34 PM. 26. Nguyễn Hữu Trí. Trp Operon - Điều hòa giảm bớt. • Sự điều hòa giảm bớt là nguyên nhân gây ra kết thúc phiên mã sớm mRNA vì sự hình thành cấu trúc kẹp tóc ngừng phiên mã ở vùng đầu 5’ của mRNA • Nếu tRNA-trp hiện diện, quá trình tổng hợp peptide leader dẫn tới sự bắt cặp bổ sung của mRNA tạo thành cấu trúc ngăn cản hoạt động của RNAP. 27. 2/21/2016 3:37:34 PM. Nguyễn Hữu Trí. 2/21/2016 3:37:34 PM. 28. Nguyễn Hữu Trí. Một số Operon điều hòa giảm bớt. Trp Operon - Điều hòa giảm bớt DNA. + trp RNA Leader peptide. RNA polymerase. Ngừng phiên mã. Cấu trúc ngừng phiên mã. DNA. - trp. RNA polymerase Phiên mã tiếp tục. RNA Leader peptide 2/21/2016 3:37:34 PM. 29. Nguyễn Hữu Trí. 2/21/2016 3:37:34 PM. 30. Nguyễn Hữu Trí.

(61) 21/02/2016. Điều hòa từng tầng (Cascade regulation) • Một cơ chế điều hòa nhanh chóng và tiết kiệm năng lượng ở prokaryote là sử dụng các nhâc tố σ khác nhau. • Mỗi σ định hướng cho RNA polymerase xác định và gắn lên promoter. Những promoter này kiểm soát sự biểu hiện của những nhóm genes liên quan đến một hoạt động chuyển hóa chuyên biệt của tế bào. • Sau đây là hai ví dụ về sự điều hòa biểu hiện của gen bằng cách sử dụng các nhân tô sigma khác nhau – Sử dụng luân phiên nhân tố σ bởi E. coli cho sự tự điều chỉnh thích hợp với môi trường mới – Sử dụng luân phiên nhân tố σ bởi SPO1 bacteriophage trong suốt quá trình xâm nhiễm. 31. 2/21/2016 3:37:34 PM. Sử dụng luân phiên nhân tố σ ở E. coli • Ở trạng thái bình thường, RNA polymerase holoenzyme chứa σ70, nhân tố σ phổ biến nhất, sự nhận biết promoter của các gen cấu trúc hầu hết là nhờ σ70. • Khi E. coli gặp môi trường shock nhiệt (heat shock) do sự tăng lên đột ngột nhiệt độ của môi trường, một nhân tố σ mới, σ32, được tổng hợp một lượng lớn và thay thế cho σ70 để định hướng cho RNA polymerase gắn vào heat- shock gene promoter. Sản phẩm biểu hiện của những gen này giúp cho tế bào chống lại những nguy hiểm do shock nhiệt. • Sự gia tăng hàm lượng σ32 vì : – (1) tăng cường dịch mã mRNA σ32 – (2) Sự ổn định của protein σ32. • Các nhân tố σ cũng được luân phiên sử dụng trong những hoàn cảnh môi trường khác nhau để biểu hiện các gen khác nhau 2/21/2016 3:37:34 PM. Nguyễn Hữu Trí. •. • •. 33. Nguyễn Hữu Trí. Kiểm soát phiên mã của virus • Virus sử dụng vật liệu của tế bào chủ để nhân lên, phiên mã và dịch mã các gene của virus, ngay khi hoạt hóa quá trình này chính là nguyên nhân làm tan tế bào chủ. Phage ôn hòa (temperate phage) được xác định khi provirus tách khỏi DNA tế bào chủ và trờ thành dạng lytic. Virus sẽ làm ngừng mọi hoạt động phiên mã và dịch mã bộ gen tế bào chủ. • Kiểm soát di truyền của Lamba (l) phage ôn hòa đã được nghiên cứu. Phage l trở thành dạng lysogenic khi tế bào chủ ở trong một môi trường thuận lợi và chúng có khả năng nhân lên nhanh chóng. Khi tế bào chủ tạo nên nhiều thế hệ mới, mỗi tế bào mang một phage l. phage l trở thành dạng tan khi tế bào chủ yếu đi. 2/21/2016 3:37:34 PM. 35. Nguyễn Hữu Trí. Nguyễn Hữu Trí. Sử dụng luân phiên nhân tố σ bởi SPO1 bacteriophage trong quá trình xâm nhiễm. Sử dụng luân phiên nhân tố σ ở E. coli. 2/21/2016 3:37:34 PM. 32. SPO1 phage xâm nhiễm vào Bacillus subtilis có bước biểu hiện gene – các gen sớm, trung gian và các gene muộn được biểu hiện ở những thời điểm khác nhau của quá trình xâm nhiễm của phage. Các gen sớm của phage được biểu hiện bởi RNA polymerase của vi khuẩn với việc sử dụng nhân tố σ của vi khuẩn. Một trong những sản phẩm của gene sớm được biểu hiện đó là nhân tố σ28 của phage. nhân tố σ28 của phage sẽ thay thế nhân tố σ của vi khuẩn để định hướng RNA polymerase đến các promoter của các gene trung gian của phage. Trong số sản phẩm của các gene trung gian có một nhân tố σ34. Tới lượt nó, nhân tố σ34 tham gia vào quá trình biểu hiện của các gene muộn của phage. 2/21/2016 3:37:34 PM. 34. Nguyễn Hữu Trí. Kiểm soát phiên mã của virus Hai virus protein, Cro và cI kiểm soát sức khỏe của tế bào chủ. Khi tế bào chủ khỏe, cI protein tích lũy để hoạt hóa chức năng gene lysogenic gene và ức chế chức năng gene lytic. Khi tế bào chủ suy yếu, Cro protein tích lũy, sẽ ức chế chức năng gene lysogenic và thúc đẩy hoạt động của gene lytic. Tỉ lệ của Cro với cI quyết định khi nào l phage sẽ là lysogenic hay Iytic. Các virus khác có cơ chế kiểm soát tương tự. 2/21/2016 3:37:34 PM. 36. Nguyễn Hữu Trí.

(62) 21/02/2016. Kiểm soát phiên mã của virus. Điều hòa sự biểu hiện của gen ở Prokaryote ở mức độ dịch mã • Ở prokaryotes, kiểm soát sự biểu hiện của gen ở mức độ dịch mã dựa vào các cơ chế sau : 1. Hiệu suất khởi đầu dịch mã khác nhau do những trính tự xung quanh start codon AUG. 2. Hiệu suất kéo dài dịch mã khác nhau do việc hình thành cấu trúc thứ cấp trên mRNA . 3. Tốc độ phân rã của các mRNA là khác nhau.. 2/21/2016 3:37:34 PM. 21/02/2016 3:37 CH. Nguyễn Hữu Trí. 37. 39. Nguyễn Hữu Trí. 2/21/2016 3:37:34 PM. 38. Nguyễn Hữu Trí.

(63) Các công cụ sử dụng trong kỹ thuật tạo dòng. Chương 7. Kỹ thuật tạo dòng. Enzymes - cắt, nối nucleic acid … Vector- tạo dòng phân tử PCR (Polymerase chain reaction) Giải trình tự DNA (DNA sequencing) Điện di (Electrophoretic separation) Phát hiện gene: DNA-Southern blotting; lai tại chỗ (in situ hybridization); kỹ thuật FISH; RNA- Northern blotting Pr-Western blotting; lai miễn dịch IHC (immunohistochemistry) • Tinh sạch • Sinh vật chuyển gene …… • • • • • •. 2/21/2016. 1. Nguyễn Hữu Trí. 2/21/2016. • Được tìm thấy trong các loài vi khuẩn khác nhau là các endonuclease có khả năng thủy giải DNA mạch đôi ở những vị trí xác định. • Vi khuẩn sử dụng restriction enzyme để bảo vệ chúng khỏi các DNA ngoại lai. • Vi khuẩn có một cơ chế để bảo vệ DNA của chúng khỏi hoạt động của các restriction enzyme của bản thân. • Các RE hợp thành hệ thống bảo vệ ở prokaryote, chưa có hệ thống tương tự nào được phát hiện ở eukaryote. • Chúng được phân lập và sử dụng cho các phòng thí nghiệm 3. Nguyễn Hữu Trí. • Hệ thống biến đổi giới hạn-restriction enzyme được hoạt động cùng với hệ thống methylase. • Methylases là enzyme thêm nhóm methyl vào nucleotide chuyên biệt (vào A hay C) trong trình tự nhận biết (recognition sequence). Sự methyl hóa ngăn chặn sự nhận biết của restriction enzyme. • Do đó, restriction enzyme trong một tế bào không phân cắt DNA của chính nó. Tuy nhiên restriction enzyme có thể phân cắt DNA ngoại lai xâm nhập vào trong tế bào như của bacteriophage. 2/21/2016. Restriction Endonuclease. 5. Nguyễn Hữu Trí. 4. Restriction Enzyme. Loại I- có nhiều tiểu đơn vị,có hoạt tính endonuclease và methylase, cắt một cách ngẫu nhiên tại vị trí cách vị trí nhận biết (recognition sequence) 1000 bp Loại II- cắt DNA ngay vị trí nhận biết, không cần ATP, hầu hết ở dạng đơn phân Loại III- có nhiều tiểu đơn vị, có hoạt tính endonuclease và methylase cắt cách 25 bp từ trình tự nhận biết.. 2/21/2016. Nguyễn Hữu Trí. Vai trò sinh học của RE. Restriction Enzyme (RE). 2/21/2016. 2. Nguyễn Hữu Trí. • Restriction enzyme (endonulease) cắt DNA tại trình tự đặc hiệu • Những loại cầu nối nào bị RE cắt? – Cầu nối đồng hóa trị (trong một chuỗi) – Cầu nối hydrogen (giữa hai chuỗi). 2/21/2016. Cầu nối hydrogen. 6. Cầu nối đồng hóa trị Nguyễn Hữu Trí. 1.

(64) RE hoạt động như thế nào? • Vị trí nhận biết của enzyme –. Mỗi enzyme cắt DNA tại một trình tự đặc biệt  restriction site. –. Enzyme nhận biết 4-, 6- hoặc 8cặp base, trình tự lặp đảo (palindromic sequence). 2/21/2016. 7. Đầu dính và đầu bằng • Khi các enzyme cắt, chúng có thể tạo ra – Đầu dính: một số RE, vị trí cắt lệch nhau trên hai mạch. Trong trường hợp này các đầu dính có thể bắt cặp trở lại – Đầu bằng: một số RE cắt hai mạch DNA tại cùng một điểm, sau khi cắt hai đầu bằng không có khả năng tự kết hợp lại. Để nối chúng lại phải dùng enzyme T4 ligase.. Nguyễn Hữu Trí. 2/21/2016. EcoRI. là một ví dụ. Chủng R của vi khuẩn E.coli I là restriction enzyme đầu tiên của E.coli được khám phá.. 2/21/2016. 9. Nguyễn Hữu Trí. Việc sử dụng RE có ý nghĩa quyết định trong sự phát triển của sinh học phân tử eukaryote. Chúng cho phép cắt nhỏ bộ nhiễm sắc thể khổng lồ ở eukaryote Các RE chủ yếu được sử dụng trong việc tạo dòng với mục đích tạo ra một số lượng lớn các bản sao của một trình tự DNA xác định. Chúng cũng được ứng dụng để lập bản đồ cắt giới hạn (restriction map) vào việc phân tích so sánh bộ gen ở các loài khác nhau thông qua kỹ thuật RFLP (Restriction Fragments Length Polymorphism – Tính đa hình kích thước của các trình tự giới hạn). 2/21/2016. Polymerase. DNA pol I (Klenow pol): polylerase 5’→ 3’ , exonuclease 3’→ 5’ T4 DNA pol: giống Klenow pol nhưng exonuclease 3’→ 5’ mạnh hơn Taq pol: phân lập từ Thermus aquaticus Pfu pol : phân lập từ Pyroccus furiosus Reverse transcriptase:do các Retrovirus sản sinh DNA terminal transferase: li trích từ tuyến ức bê. • RNA pol tham gia vào việc tổng hợp RNA theo chiều 5’→ 3’, thông dụng nhất là: – SP6 RNA polymerase: có nguồn từ phage xâm nhiễm Salmonella typhimurium – T3 và T7 RNA polymerase: có nguồn gốc từ phage xâm nhiễm E.coli 2/21/2016. 11. 10. Nguyễn Hữu Trí. Các ligase. • DNA pol xúc tác sự tổng hợp DNA theo chiều 5’→ 3’ như: – – – – – –. Nguyễn Hữu Trí. Ứng dụng RE. Tên của restriction enzyme đến từ: • Loại vi khuẩn mà enzyme được tìm thấy • Thứ tự mà restriction enzyme được xác định và phân lập.. 8. Nguyễn Hữu Trí. • Đây là enzyme xúc tác cho phản ứng nối giữa hai đoạn DNA (DNA ligase) hay RNA (RNA ligase). • Có các ligase sau: – T4 DNA (RNA) ligase: li trích từ phage T4 xâm nhiễm E. coli – T4 polynucleotide kinase: li trích từ phage T4 xâm nhiễm E. coli – Alkaline phosphastase: li trích từ E. coli hay từ ruột bê. 2/21/2016. 12. Nguyễn Hữu Trí. 2.

(65) Các nuclease • Đây là nhóm phân cắt DNA hay RNA. Gồm các enzyme chính sau: – DNAase I: có nguồn gốc từ tụy tạng bò – Nuclease S1: ly trích từ Aspergillus oryzae – Exonuclease III: tách chiết từ E. coli – RNAase A: hiện diện khắp mọi nơi – RNAase H: dùng trong tổng hợp cDNA. 2/21/2016. 13. Kỹ thuật tạo dòng. Nguyễn Hữu Trí. 2/21/2016. 14. DNA tái tổ hợp. Tạo dòng phân tử (molecular cloning) - Tạo dòng phân tử dùng kỹ thuật di truyền phân lập và làm thuần một gen: + Tách và phân đoạn DNA nguồn + Gắn các đoạn DNA bị cắt vào vector dòng hóa + Biến nạp và giữ DNA tái tổ hợp trong tế bào chủ: ngân hàng DNA (DNA library, DNA bank) + Phát hiện và làm thuần dòng mục tiêu + Nuôi cấy dòng mục tiêu để ly trích và nghiên cứu DNA tái tổ hợp. 2/21/2016. Nguyễn Hữu Trí. 15. Nguyễn Hữu Trí. •. Restriction enzyme và DNA ligase có thể được sử dụng để tạo DNA tái tổ hợp, DNA có thể được cắt nối lại với nhau từ các nguồn khác nhau. •. Tạo dòng (Cloning) có nghĩa là gắn một đoạn DNA (một gen vào một vector tạo dòng (cloning vector) sau đó đặt vào một tế bào sống (“Biến nạp”) để khuếch đại gen mục tiêu.. 2/21/2016. Nguyễn Hữu Trí. 16. Vị trí cắt giới hạn. DNA tái tổ hợp. DNA 1. Vị trí cắt giới hạn DNA 1. 5 3. 3 5. Enzyme RE cắt sườn đường - phosphate. 3 5. Enzyme RE cắt sườn đường - phosphate. DNA tái tổ hợp 2. Đầu dính. 5 3. Đầu dính. Đoạn DNA mục tiêu được cắt bằng cùng RE, bắt cặp xảy ra.. Một khả năng tái tổ hợp. 3.

(66) Vị trí cắt giới hạn DNA 1. 5 3. Tại sao phải tạo dòng DNA?. 3 5. Enzyme RE cắt sườn đường - phosphate. DNA tái tổ hợp Đầu dính. 2. Đoạn DNA mục tiêu được cắt bằng cùng RE, bắt cặp xảy ra.. Một khả năng tái tổ hợp 3. DNA ligase nối lại. Phân tử DNA tái tổ hợp. Sử dụng các DNA được tạo dòng là cách đầu tiên xây dựng bản đồ cắt giới hạn. – phân tích giải trính tự DNA được tạo dòng – Sử dụng DNA tạo dòng làm probe xác định rõ mức độ phiên mã, kích thước của mRNA – Sử dụng DNA tạo dòng như một probe để xác định DNA tương tự trong các loài khác nhau hoặc tạo thành thư viện tạo dòng – Sản xuất thật nhiều gen được tạo dòng (Ví dụ insulin protein) – Sử dụng tạo dòng để tạo antisense mRNA cho gene silencing – Tạo một reporter gene để xác định sự biểu hiện của gen 2/21/2016. Công cụ tạo dòng. 21. Nguyễn Hữu Trí. Thể mang gen: vector. – Restriction endonuclease để cắt DNA – DNA Ligase để nối DNA – Vector để gắn DNA – Tế bào chủ để khuếch đại DNA – Công cụ để chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ – Công cụ để giữ DNA trong tế bào chủ – Công cụ để xác định xem tế bào nào đã được tạo dòng thành công (tầm soát). 2/21/2016. 20. Nguyễn Hữu Trí. – Một vector cần có các đặc điểm tiêu chuẩn sau: – Có khả năng tự sao chép trong tế bào chủ, sao chép không phụ thuộc vào tế bào chủ – Có đặc tính giúp dễ xác định tế bào có chúng – Mang những vị trí nhận biết duy nhất của các enzyme cắt giới hạn – Có kích thước càng nhỏ càng tốt, dễ xâm nhập, sao chép nhanhhiệu quả. – Có số lượng bản sao trong tế bào cao – Các vector cần biểu hiện thì phải có promoter mạnh. 2/21/2016. Thể mang gene: vector. 22. Nguyễn Hữu Trí. Vector. – Vector: phân tử DNA kích thước nhỏ dùng để mang gene, sao chép, thao tác trên gene. – Vector tạo dòng và vector biểu hiện – Vector tạo dòng: chuyển và lưu trữ gen tái tổ hợp trong tế bào chủ, nhân bản, thao tác, phân tích sau đó trên DNA tái tổ hợp sẽ dễ dàng hơn – Vector biểu hiện: tạo sản phẩm của gen tái tổ hợp ở mức phiên mã, dịch mã, phân tích trình tự điều hòa sự biểu hiện của gene.. 2/21/2016. 23. Nguyễn Hữu Trí. 2/21/2016. 24. Nguyễn Hữu Trí. 4.

(67) Sự khác nhau của các vector tạo dòng • Loại tế bào mà chúng có thể vào • Cách thức mà chúng xâm nhập (bằng biến nạp hay bằng cách xâm nhiểm của virus/phage) • Độ lớn của đoạn DNA ngoại lai mà chúng có thể mang • Vị trí cắt giới hạn chính xác của enzyme cắt giới hạn • Sự ổn định của DNA khi được chèn vào • Những khía cạnh quan tâm – Hiệu quả tạo dòng – Số lượng bản sao (trên một tế bào chủ) – Khả năng tầm soát (ví dụ hệ thống Lac Z). 2/21/2016. 25. Nguyễn Hữu Trí. Plasmid là các vector tạo dòng • Vị trí cắt hạn chế duy nhất để chèn DNA mục tiêu (vùng polylinker), có thể nằm cắt ngang gen lacZ mã hóa cho Betagalactosidase, một enzyme chuyển khuẩn lạc thành màu xanh khi hiện diện X-gal (khuẩn lạc chuyển thành màu tráng khi có một đoạn DNA ngoại lai chèn thành công vào vùng polylinker và làm bất hoạt gen lacZ…) • Có promoter mạnh nằm ở hai phía của vùng polylinker để biểu hiện DNA được tạo dòng. • Một oriC • Marker chọn lọc (Ví dụ. Gen kháng kháng sinh) nếu không có biến nạp vi khuẩn sẽ chết (chắc chắn rằng chỉ có những vi khuẩn được biến nạp thành công mới sống) 2/21/2016. Plasmid. 27. Nguyễn Hữu Trí. Các loại plasmid. – Plasmid là những đoạn DNA ngắn (2-5kb) dạng chuỗi xoắn kép, dạng vòng, có thể tự nhân đôi độc lập với DNA bộ gen – Có số bản copy cao trong tế bào E. coli (100) – Gen khác kháng sinh (marker chọn lọc, VD. AmpR; có nghĩa là E. coli có khả năng kháng khi biến nạp thành công nhận được plasmid) – Tạo dòng tốt với đoạn DNA 5-10 kb (nhỏ) – Rất dễ sử dụng. 2/21/2016. 26. Nguyễn Hữu Trí. • Plasmid thế hệ thứ nhất: tìm thấy trong tự nhiên (ColE1, pSC101…) • Plasmid thế hệ thứ hai: plasmid nhân tạo (pBR322: kích thước 4364 bp, mang hai gen ApR, TetR và 20 vị trí nhận biết duy nhất của các enzyme cắt giới hạn) • Plasmid thế hệ thứ ba: đây là các plasmid mạnh hiện nay có hai đặc tính cơ bản – Kích thước nhỏ – Có mang một polylinker. 2/21/2016. 28. Nguyễn Hữu Trí. Vector tạo dòng là phage. Vector tạo dòng là phage + Bacteriophage vector + Được thiết kế để đi vào chu trình tan + Có khả năng sinh sôi nhanh, hiệu quả xâm nhiễm cao hơn hẳn plasmid + Tạo dòng tốt với những đoạn DNA lớn hơn nhiều so với plasmid (10-23 kb) + Phage không dễ thao tác như plasmid + Phage  được loại bỏ 1/3 bộ gen chỉ giữ lại vùng chứa gen xâm nhập, tự sao và lắp ghép + DNA ngoại lai được đưa vào tế bào chủ qua phage này, nhân bản và lưu trữ cùng với phage + Vector phage  chứa ít trình tự nhận biết của enzyme cắt giới hạn. + Thực khuẩn thể M13 + Bộ gen mạch đơn có kích thước 6,4 kb + Ưu điểm của vector này là tạo được một số lượng lớn DNA mạch đơn + Thường dùng để giải trình tự DNA. 2/21/2016. 29. Nguyễn Hữu Trí. 2/21/2016. 30. Nguyễn Hữu Trí. 5.

(68) Vector tạo dòng là phage. Vector tạo dòng là phagemid – Kết hợp giữa bacteriophage và plasmid – Tạo ra, đóng gói ssDNA với sự trợ giúp của phage – Hoặc có thể biến nạp vào E. coli khi nó thể hiện giống một plasmid (kích thước hạn chế giống một plasmid) – Ví dụ. pBluescript (pBS) – Có promoter phage T3 và T7 trên mỗi hướng cho việc tổng hợp ssRNA in vitro.. 2/21/2016. 31. Nguyễn Hữu Trí. 2/21/2016. Vector tạo dòng là Phagemid. 32. Nguyễn Hữu Trí. Vector tạo dòng là Cosmid – Thiết kế nhân tạo bởi sự kết hợp được ưu điểm plasmid DNA và trình tự cos từ phage  – Khi vào trong tế bào chủ, có khả năng sao chép như plasmid. Plasmid tái tổ hợp bền hơn trong tế bào chủ –Rất tốt để tạo dòng những đoạn gen rất lớn DNA (32-47 kb). Hiệu suất chuyển gen cao hơn – Plasmids càng lớn thì càng khó thao tác. 2/21/2016. 33. Nguyễn Hữu Trí. 2/21/2016. Vector tạo dòng là Cosmid. 34. Nguyễn Hữu Trí. Vector tạo dòng là BAC • BAC (Bacterial artificial chromosome – NST nhân tạo vi khuẩn) – Nhiễm sắc thể nhân tạo vi khuẩn – Dùng để tạo dòng những đoạn DNA rất lớn vào E. coli (tốt và ổn định – sử dụng trong tạo dòng HGP) – Có chứa ORI của nhân tố f; sử dụng giống plasmid. – BAC có thể mang đoạn DNA với kích thước từ 150-350 kb.. 2/21/2016. 35. Nguyễn Hữu Trí. 2/21/2016. 36. Nguyễn Hữu Trí. 6.

(69) Eukaryotic vector. Ưu điểm của Prokaryote. – Ti plasmid của Agrobacterium tumefaciens dùng để tạo dòng ở thực vật. Kích thước từ 180 - 205kb, có thể mang đoạn DNA kích thước khá lớn, lên đến khoảng từ 30 - 150 kb. – YAC (Yeast artificial chromosome – NST nhân tạo nấm men) Kích thước 10kb mang được DNA 100 – 1000kb. Sao chép như một nhiễm sắc thể bình thường của nấm men. Dùng để tạo bản đồ vật lý bộ gen ví dụ bộ gen người (nhưng không bền như BAC). 2/21/2016. 37. Nguyễn Hữu Trí. 1. Phát triển nhanh 2. Thao tác dễ dàng. Nhược điểm của Prokaryote 1. Không thể tách các intron ra 2. Intron cần thiết cho sự biểu hiện của gen 3. Kích thước DNA đưa vào vi khuẩn bị hạn chế 4. Prokaryote không có cơ chế glycosyl hóa protein. 2/21/2016. Nguyễn Hữu Trí. Cải tiến tế bào chủ E. coli. Tế bào chủ - E. coli: + Tế bào chủ phổ biến nhất, dễ nuôi, sinh sản nhanh + Vi sinh vật gây bệnh cơ hội + Không tiết enzyme - Bacillus subtilis: + Không gây bệnh, không tạo nội độc tố, tiết protein + Pasmid không ổn định trong tế bào chủ. - Saccharomyces cerevisiae: + Tế bào eukaryote được nghiên cứu di truyền kỹ nhất + Sử dụng để thể hiện gene eukaryote.. 2/21/2016. 38. Nguyễn Hữu Trí. 39. • Thông thường E. coli dùng để tạo dòng thường được cải tiến: – Loại bỏ các hệ thống sửa đổi hạn chế bằng cách gây đột biến trong hệ thống sửa đổi hạn chế nội sinh – Hệ thống tái tổ hợp DNA được sửa đổi để ngăn chặn sự tái tổ hợp – Thay đổi hoạt tính endonuclease nhằm làm tăng lượng plasmid tích lũy trong tế bào 2/21/2016. Nguyễn Hữu Trí. 40. Các bước tạo dòng. Vi khuẩn tái tổ hợp. 3. Tế bào chứa gene mục tiêu. Vi khuẩn 1. Gene được chèn vào plasmid. Protein được biểu hiện bởi gene mục tiêu. Gene mục tiêu Nhiều bản sao của gene. Nhiễm sắc thể Plasmid vi khuẩn. Gene mục tiêu. DNA tái tổ hợp (plasmid) 2. Plasmid được đưa vào tế bào vi khuẩn. DNA nhiễm sắc thể. Nghiên cứu cơ bản về gene. Tế bào chủ được nuôi để hình thành một dòng tế bào có chứa gene mục tiêu đã được tạo dòng.. Thu nhận protein 4 Nghiên cứu cơ bản và rất nhiều ứng dụng. Nghiên cứu cơ bản về protein. Vi khuẩn tái tổ hợp. Gene kháng sâu bệnh được đưa vào thực vật. Gene được dùng để tạo vi khuẩn tẩy sạch chất thải độc. Protein làm tan cục Hormone tăng trưởng máu động trong liệu điều trị chống còi cọc pháp chống đau tim. 7.

(70) Tạo dòng một gene từ Eukaryotic vào một plasmid. • Trong tạo dòng gene, plasmid được gọi là vector tạo dòng. • Một vector tạo dòng là một phân tử DNAcó thể mang DNA ngoại lai vào một tế bào chủ và nhân lên độc lập với DNA tế bào chủ.. Tạo dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp • Các bước để tạo dòng gene β-globin từ chim ruồi (hummingbird) vào một plasmid vi khuẩn. Tế bào chim ruồi. Kỹ thuật Tế bào vi khuẩn lacZ gene Restriction site ampR gene. Tạo dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp. Đầu dính. Plasmid vi khuẩn. Gene mục tiêu Các mảnh DNA của chim ruồi. Tạo dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp Tế bào chim ruồi. Tế bào chim ruồi Tế bào vi khuẩn Tế bào vi khuẩn. lacZ gene lacZ gene Restriction site. ampR gene. Đầu dính. Plasmid vi khuẩn. Gene mục tiêu. Restriction site ampR gene. Các mảnh DNA của chim ruồi. Đầu dính. Plasmid vi khuẩn. Gene mục tiêu Các mảnh DNA của chim ruồi. Plasmid không taí tổ hợp. Plasmid không taí tổ hợp Các plasmid tái tổ hợp. Các plasmid tái tổ hợp. Vi khuẩn mang plasmid. Kỹ thuật. Tế bào chim ruồi. Tế bào vi khuẩn. Tái tạo dòng (subcloning). lacZ gene Restriction site ampR gene. Đầu dính. Plasmid vi khuẩn. Gene mục tiêu Các mảnh DNA của chim ruồi. Plasmid không taí tổ hợp Các plasmid tái tổ hợp. Tạo dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp. Vi khuẩn mang plasmid. • Tái tạo dòng là kiểu đơn giản nhất của thí nghiệm tạo dòng, là quá trình chuyển DNA đã được tạo dòng từ vector này sang vector khác để biểu hiện nó trong một chủng chủ nhất định. • Các bước cơ bản của tái tạo dòng cũng tương tự như tạo dòng. Kết quả Khuẩn lạc mang plasmid không tái tổ hợp với gene lacZ còn nguyên.. Khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp với gene lacZ bị bất hoạt Các tế bào cùng dòng. 2/21/2016. 48. Nguyễn Hữu Trí. 8.

(71) Thư viện bộ gen (Genomic library). Thư viện DNA • Dựa vào bản chất của DNA cần tạo dòng người ta phân biệt hai loại thư viện gen: – thư viện bộ gen và thư viện cDNA. 2/21/2016. 49. Nguyễn Hữu Trí. Thư viện bộ gen (Genomic library) Toàn bộ genome được cắt bằng enzyme cắt giới hạn. Hoặc. Phage DNA pái tổ hợp Các dòng vi khuẩn. Các plasmid tái tổ hợp. (a) Thư viện Plasmid. Các dòng Phage. (b) Thư viện Phage. Thư viện cDNA. 53. 2/21/2016. 50. Nguyễn Hữu Trí. Thư viện bộ gen (Genomic library) Plasmid lớn. Đoạn chèn lớn với nhiều gene mục tiêu. • Bacterial artificial chromosome (BAC) là một plasmid lớn đã được biến đổi để có thể mang được đoạn DNA lớn. • BACs là một loại khác của vector được sử dụng trong xây dựng thư viện DNA.. Các dòng BAC. (c) Một thư viện các dòng bacterial artificial chromosome (BAC). Tổng hợp cDNA. – Thư viện cDNA là tập hợp các bản sao cDNA từ tất cả các mRNA của một tế bào. Như vậy không giống với thư viện bộ gen, thư viện cDNA được thiết lập từ một tế bào xác định trong đó gen cần nghiên cứu phải biểu hiện thành mRNA – Thường được lập cho eukaryote – cDNA được tổng hợp từ mRNA trưởng thành (eukaryote) (Không có các đoạn intron) sử dụng enzyme Reverse transcriptase, RNase H , DNA Polymerase I, và nuclease S1.. 2/21/2016. – Thư viện bộ gen được lập là tập hợp tất cả các trình tự DNA cấu thành bộ gen đầy đủ đã được gắn vào vector. Các vector tái tổ hợp sau đó được đưa vào tế bào chủ. Các tế bào chủ sau đó được nuôi cấy trên môi trường và tạo thành các dòng. Vector có thể là plasmid hoặc phage. – Thư viện bộ gen thường được lập cho prokaryote. DNA trong nhân mRNAs trong tế bào chất. Nguyễn Hữu Trí. 9.

(72) Tổng hợp cDNA. Tổng hợp cDNA DNA trong nhân. DNA trong nhân. mRNA trong tế bào chất. mRNAs trong tế bào chất. mRNA. Reverse transcriptase. mRNA. Reverse transcriptase. Đuôi Poly-A. Đuôi Poly-A DNA Primer Phân cắt mRNA. DNA Primer. RNase H. DNA trong nhân. DNA trong nhân. mRNA trong tế bào chất. mRNA. Reverse transcriptase. mRNA trong tế bào chất. Tổng hợp cDNA. Đuôi Poly-A. DNA Primer Phân cắt mRNA. RNase H. DNA polymerase I. mRNA. Reverse transcriptase. Đuôi Poly-A. DNA Primer Phân cắt mRNA. RNase H. DNA polymerase I. nuclease S1. cDNA. Tuyển chọn dòng mục tiêu • Để có thể phân lập dòng tế bào chủ tái tổ hợp chứa gen mục tiêu trong một thư viện DNA hay một thư viện cDNA, người ta phải sử dụng các phương pháp sàng lọc. • Thông thường các phương pháp sàng lọc được xây dựng dựa trên việc sử dụng mẫu dò DNA. • Mẫu dò DNA (probe) là một đoạn oligonucleotide được đánh dấu và nó bổ sung hoặc bổ sung một phần với gen mục tiêu.. 2/21/2016. 59. Nguyễn Hữu Trí. Tuyển chọn dòng mục tiêu - Gen được biểu hiện trong tế bào chủ là vi khuẩn: +Lai miễn dịch (Western blotting, Immunoblotting) + Hoạt tính enzyme + Bổ trợ đột biến (gen ngoại lai đồng dạng với gen của tế bào chủ) - Gen ngoại lai không biểu hiện trong tế bào chủ: + Lai insitu: + Lai khuẩn lạc (colony hybridization): vector là plasmid + Lai plaque (plaque colonization): vector là phage. 2/21/2016. Nguyễn Hữu Trí. 60. 10.

(73) Tuyển chọn dòng mục tiêu. Tuyển chọn dòng mục tiêu. • Một dòng mang gene mục tiêu có thể được xác định bằng cách dùng nucleic acid probe có trình tự bổ sung với gene. Gene mục tiêu. 5 …G G C T AA C TT AG C … 3. Probe (Được đánh dấu). 3 C CG A TTG A A T C G 5. Phân tử Probe được đánh dấu phóng xạ Đĩa nhiều giếng chứa các dòng của thư viện. Probe DNA. Gene mục tiêu DNA mạch đơn từ tế bào. Film. •. Màng nylon. • Quá trình này được gọi là lai nucleic acid.. Vị trí của DNA với trình tự bổ sung. Vector biểu hiện (expression vector). Màng nylon. Ứng dụng thực tiễn của kỹ thuật di truyền. - Để biểu hiện gen ngoại lai: + Thu protein tái tổ hợp + Nghiên cứu các yếu tố điều hòa thể hiện của gen. - Gen ngoại lai được kiểm soát bằng promoter được nhận diện bởi RNA polymerase của tế bào chủ: + Promoter mạnh + Khung dịch mã đúng + Promoter thường dùng: lac, trp (cơ chế tắt mở). 2/21/2016. 2/21/2016. Nguyễn Hữu Trí. 65. 63. - Sản xuất những sản phẩm trao đổi chất của vi sinh vật - Sản xuất vắcxin phòng chống virus - Sản xuất protein của động vật hữu nhũ - Tạo ra các thực vật, động vật chuyển gen - Phân lập và ứng dụng nguồn gen vi sinh trong xử lý môi trường - Tạo các thuốc điều hòa sự thể hiện của gen - Liệu pháp gen chữa trị các bệnh di truyền. 2/21/2016. 64. Nguyễn Hữu Trí. Nguyễn Hữu Trí. 11.

(74) Chương 8. Các kỹ thuật phân tích trong Sinh học phân tử. Tách chiết DNA • •. • • •. 1. 21/02/2016 3:46 CH. Để thu nhận DNA tinh sạch cần loại bỏ những thành phần tạp nhiễm, mà quan trọng nhất là protein. Sự tách chiết DNA dựa trên nguyên tắc hòa tan khác nhau của các phân tử khác nhau (nucleic acid/protein) trong hai pha không hòa tan (phenol, chloroform/nước). Mục đích là thu được các phân tử nucleic acid ở trạng thái nguyên vẹn tối đa, không bị phân hủy bởi các tác nhân cơ học hay hóa học. Các nucleic acid cần được tách chiết trong điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động của các enzyme nội bào (DNase và RNase). Sau công đoạn tách chiết, nucleic acid tinh sạch nằm trong một thể tích dung dịch lớn. Sự tủa kết hợp với ly tâm cho phép thu nhận nucleic acid dưới dạng cặn tủa dễ bảo quản và khi cần có thể hòa lại trong nước theo nồng độ mong muốn.. Nguyễn Hữu Trí. 21/02/2016 3:46 CH. Tách chiết DNA • Bước 1: phá màng tế bào, màng nhân • Bước 2: loại protein • Bước 3: thu hồi nucleic acid •. •. 3. Nguyễn Hữu Trí. Phá màng tế bào, màng nhân: nghiền tế bào, mô trong một hỗn hợp chất tẩy (SDS) và proteinase để phá vỡ màng tế bào, màng nhân, giải phóng DNA ra môi trường đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA. • Chất tẩy là phân tử lưỡng cực, sẽ kết hợp với protein màng và các phân tử phospholipid làm phá vỡ cấu trúc màng. • Chất tẩy ion hóa có tác dụng phá màng mạnh, chất tẩy không ion hóa có tác dụng phá màng nhẹ hơn. Loại protein: lắc mẫu trong dung dịch phenol:chloroform để biến tính protein đồng thời không hòa tan nucleic acid. Protein bị biến tính không hòa tan trong pha nước có chứa nucleic acid và sau khi li tâm sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nước và pha phenol:chloroform. Thu hồi nucleic acid trong pha nước. Tủa nucleic acid: nhằm thu nhận nucleic acid dưới dạng cô đặc để bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme và khi cần có thể hòa lại trong nước theo nồng độ mong muốn. Có thể tủa trong ethanol hoặc isopropanol. Sau đó li tâm để thu nhận lại nucleic acid. Cặn tủa được rửa trong ethanol 70% để loại bỏ các muối hoặc các dấu vết của isopropanol.. 21/02/2016 3:46 CH. Tách chiết DNA. 4. Nguyễn Hữu Trí. Tách chiết DNA Ly tâm đẳng tỷ trọng (isopycnic) phân tách các phần tử trong hỗn hợp dựa trên tỷ trọng của chúng. Thời gian và lực ly tâm là chung cho các nhóm phần tử. Dung dịch ly tâm có tỷ trọng với giá trị đi từ thấp đến cao hơn tỷ trọng của các phần tử cần phân tách.. Ly tâm phân đoạn (a) và phân đoạn vùng (b) phân tách các trình tự trong hỗn hợp dựa trên khối lượng của chúng. Thời gian và lực ly tâm được xác định cho từng nhóm phần tử. Dung dịch ly tâm có tỷ trọng thấp hơn các phần tử cần phân tách.. 21/02/2016 3:46 CH. Nguyễn Hữu Trí. Tách chiết DNA •. 21/02/2016 3:46 CH. 2. Ly tâm trên gradient liên tục CsCl: trong quá trình ly tâm, dung dịch CsCl sẽ tự động hình thành một gradient đẳng tỉ trọng với tỉ trọng tăng dần từ miệng ống xuống đáy ống. Dưới tác động của lực ly tâm, các nucleic acid di chuyển trong ống và đến vị trí có tỉ trọng bằng với tỉ trọng của chính nó sẽ ngừng lại và hình thành một lớp cố định trong ống. Lớp này được thu nhận lại sau ly tâm. 5. Nguyễn Hữu Trí. 21/02/2016 3:46 CH. 6. Nguyễn Hữu Trí. 1.

(75) RNA tổng số. Tách chiết RNA. •Messenger RNA (mRNA): 1-5% Là mạch khuôn cho quá trình sinh tổng hợp protein • Ribosomal RNA (rRNA): >80% Thành phần cấu trúc nên ribosom • Transfer RNA (tRNA): 10-15% Vận chuyển acid amino tương ứng với codon trên mRNA. Phương pháp sắc ký • Sắc ký ái lực: trên poly U-Sepharose hay oligodTcellulose, dùng để tinh sạch mRNA. • Sắc ký lọc gel dùng trong phân tách các nucleic acid và nucleotic tự do sau quá trình tạo mẫu dò (probe) đánh dấu. • Sắc ký trao đổi ion trên vi cột để thu hồi những lượng rất nhỏ DNA. • Sắc ký lỏng hiệu suất cao: có độ phân giải rất cao, được dùng trong tinh sạch các oligonucleotide tổng hợp, plasmid, phân tách các đoạn DNA.. 21/02/2016 3:46 CH. 9. Nguyễn Hữu Trí. Phương pháp điện di. Các phương pháp định tính và định lượng thô nucleic acid • Điện di gel – Agarose – Polyacrylamide. • Quang phổ kế: đo mật độ quang (OD – Optical density). 21/02/2016 3:46 CH. 10. Nguyễn Hữu Trí. Điện di - Electrophoresis. • Mục tiêu: • • •. Định tính: sự hiện diện, cấu hình phân tử, kích thước Định lượng: hàm lượng tương đối so với thang hàm lượng Chuẩn bị: thu hồi đoạn DNA (dùng tạo dòng, …). • Nguyên tắc: dựa vào đặc tính cấu trúc của các nucleic acid: tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt của một điện trường nên sẽ di chuyển về cực dương của điện trường. • Tính linh động của phân tử khi di chuyển trong điện trường phụ thuộc vào khối lượng phân tử và nồng độ các chất cấu thành gel. • Kiểu điện di: Agarose, điện di trong trường xung (PFGE - Pulse Field Gel Electrophoresis).. 21/02/2016 3:46 CH. 11. Nguyễn Hữu Trí. • Chuẩn bị mẫu, gel (agarose, polyacrylamide…), bồn điện di, buffer, dung dịch điện di… • Nạp mẫu • Chạy điện di • Nhuộm gel.. 21/02/2016 3:46 CH. 12. Nguyễn Hữu Trí. 2.

(76) Điện di trên gel. Chất nhộm gel - Stain. • Chuẩn bị mẫu, gel (agarose, polyacrylamide…), bồn điện di, buffer, dung dịch điện di… • Nạp mẫu • Chạy điện di • Nhuộm gel.. 21/02/2016 3:46 CH. 13. Nguyễn Hữu Trí. •. •. 21/02/2016 3:46 CH. 15. Nguyễn Hữu Trí. • Được dùng để tách các đoạn có kích thước nhỏ, dưới 1000 cặp base. • Điện di theo phương thẳng đứng • Độ phân giải cao, phân biệt được những trình tự chỉ cách nhau 1 nucleotide. • Phương pháp phát hiện: DNA – phóng xạ tự ghi, xanh methylene, ethidium bromide, protein – xanh Coomassie, nhuộm nitrate bạc. • Ứng dụng: tinh sạch các oligonucleotic tổng hợp, giải trình tự DNA, tách các trình tự DNA có kích thước gần bằng nhau, SDS-PAGE (phân tích protein). Gel agarose là loại gel thông dụng nhất, thường dùng để phân tách những đoạn có kích thước 0,5-20 kb. Điện di theo phương nằm ngang Độ phân giải thay đổi khi nồng độ agarose hay loại agarose thay đổi. Phát hiện bằng phóng xạ tự ghi, nhuộm ethidium bromide. Chất này có khả năng gắn xen vào giữa các base của nucleic acid và sẽ phát huỳnh quang dưới tia tử ngoại. Ứng dụng: phát hiện 1 trình tự DNA, phân tích hỗn hợp các trình tự DNA (Southern blot), chuẩn bị nguyên liệu. • •. 14. Điện di trên gel polyacrylamide. Điện di trên gel agarose •. 21/02/2016 3:46 CH. Nguyễn Hữu Trí. 21/02/2016 3:46 CH. 16. Nguyễn Hữu Trí. Phương pháp định lượng bằng quang phổ kế • Cho phép định lượng tương đối nồng độ nucleic acid có trong mẫu. • Nguyên tắc: dựa vào sự hấp thu mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm của các base. • Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm của các mẫu đo cho phép xác định nồng độ nucleic acid trong mẫu dựa vào mối tương quan: • Một đơn vị OD260nm tương ứng với nồng độ: • •. •. Các phương pháp lai phân tử. 50μg/ml cho một dung dịch DNA sợi đôi 40 μg/ml cho một dung dịch DNA hay RNA sợi đơn. Định tính: độ sạch dựa trên tỉ số OD260/OD280, tính chất của nucleic acid (mạch đôi/đơn) (280 nm là bước sóng ở đó các protein có mức độ hấp thụ cao nhất.. • 21/02/2016 3:46 CH. 17. Nguyễn Hữu Trí. 21/02/2016 3:46 CH. 18. Nguyễn Hữu Trí. 3.

(77) Cơ sở của sự lai phân tử . . . Khi một phân tử DNA mạch đôi được đun lên một nhiệt độ vượt quá nhiệt độ nóng chảy (Tm) thì hai mạch sẽ tách rời nhau do sự phá vỡ các liên kết H giữa hai mạch. Sau khi hai mạch tách rời, nếu nhiệt độ phản ứng được làm giảm từ từ cộng với điều kiện thí nghiệm thích hợp, chúng sẽ bắt cặp trở lại. Hiện tượng này được gọi là sự lai phân tử. Đặc điểm của sự lai phân tử:  Đặc hiệu tuyệt đối: sự tái bắt cặp chỉ xảy ra giữa hai trình tự hoàn toàn bổ sung với nhau.  Các trình tự bổ sung có thể là DNA hay RNA, dẫn đến sự hình thành các phân tử DNA-DNA, RNA-RNA hay các phân tử lai DNA-RNA. 19. 21/02/2016 3:46 CH. Nguyễn Hữu Trí. Các kiểu lai phân tử • Lai trên pha lỏng • Lai trên pha rắn • Lai tại chỗ. 21/02/2016 3:46 CH. Các kiểu lai phân tử. 20. Nguyễn Hữu Trí. Các kiểu lai phân tử Lai trong pha rắn: Một trong hai trình tự cần lai được cố định trên giá thể rắn (màng lai). Phát hiện phân tử lai thông qua mẫu dò (probe) có đánh dấu đồng vị phóng xạ. Ba kĩ thuật lai trên pha rắn thông dụng là Southern blot, Northern blot, Dot blot.. Lai trong pha lỏng: Các trình tự cần lai nằm trong pha lỏng, là một dung dịch đệm. Sự lai phân tử xảy ra khi các trình tự này gặp nhau do chuyển động nhiệt và khi nhiệt độ môi trường thấp hơn Tm. Phương pháp này được sử dụng để phát hiện các trình tự tương đồng (giữa các loài hay trong một cá thể). 21. 21/02/2016 3:46 CH. Nguyễn Hữu Trí. 21/02/2016 3:46 CH. Các kiểu lai phân tử. Nguyễn Hữu Trí. Southern blot • Nguyên tắc của Southern blot là màng lai nitrocellulose có khả năng tiếp nhận DNA đã được biết từ lâu và đã được sử dụng trong các nghiên cứu lai axit nucleic khác nhau vào những thập niên 1950 và 1960. • Đầu thập niên 1970, sự ra đời của phương pháp điện di trên gel đã cho phép các đoạn DNA được cắt bởi enzyme hạn chế có thể được phân tách dựa trên cơ sở kích thước của chúng. • Từ đó bước phát triển tiếp theo của phương pháp là chuyển các đoạn DNA phân tách từ gel lên màng lai nitrocellulose. • Phương pháp này được E. M. Southern mô tả tại Ðại học Edingburgh vào năm 1975.. Lai tại chỗ: Trình tự nucleic acid cần tìm không được tách chiết ra khỏi mô hay tế bào. Quá trình lai với mẫu dò đã được đánh dấu và phát hiện các phân tử lai được thực hiện ngay trên nhiễm sắc thể, tế bào hay lát cắt mô.. 21/02/2016 3:46 CH. 22. 23. Nguyễn Hữu Trí. 21/02/2016 3:46 CH. 24. Nguyễn Hữu Trí. 4.

(78) Southern blot. Southern blot Southern blot bao gồm các bước cơ bản sau: 1. Cắt DNA bằng enzyme hạn chế thích hợp. 2. Ðiện di sản phẩm cắt trên gel agarose. 3. Làm biến tính DNA ngay trên gel, DNA sợi kép sẽ được tách thành DNA sợi đơn. Chỉ DNA sợi đơn mới có thể chuyển lên màng lai. 4. Chuyển DNA đã biến tính lên màng lai (màng nitrocellulose hay màng nylon). Việc chuyển DNA thường được tiến hành bằng hoạt tính mao dẫn trong khoảng vài tiếng hoặc có thể dùng một thiết bị thấm chân không. Trong quá trình chuyển, vị trí các đoạn DNA vẫn được giữ nguyên không thay đổi. 5. Lai DNA đã được cố định trên màng với mẫu dò (probe) DNA có đánh dấu. Quá trình này dựa trên nguyên tắc bổ sung giữa DNA trên màng lai với mẫu dò. Ðể đánh dấu người ta thường sử dụng P32, biotin/streptavidin hoặc một mẫu dò phát quang sinh học. 6. Ðịnh vị các phân tử lai DNA-mẫu dò. Nếu sử dụng mẫu dò đánh dấu phóng xạ thì dùng phương pháp phóng xạ tự ghi (autoradiograph) để xác định, nếu sử dụng biotin/streptavidin thì dùng phương pháp so màu hoặc nếu sử dụng mẫu dò phát quang sinh học thì phát hiện bằng sự phát quang.. 21/02/2016 3:46 CH. 25. Nguyễn Hữu Trí. Northern blot. Northern Blot: RNA-DNA*(RNA*) • Sau khi E. M. Southern mô tả phương pháp Southern blot vào năm 1975, Alwine đã dùng một phương pháp tương tự để xác định các đoạn RNA đặc biệt gọi là Northern blot vào năm 1977. • Không cần phải cắt RNA bằng restriction enzyme. • Dùng formaldehyde để phá cầu nối Hydrogen và biến tính RNA vì mạch đơn RNA sẽ tạo cấu trúc thứ cấp và gấp cuộn.. 27. • Northern blot bao gồm các bước cơ bản sau: Tách RNA (RNA tổng số hoặc chỉ mRNA) và xử lý với formaldehyde 1. 2. RNA được phân tách bằng điện di trên gel agarose biến tính (có formaldehyde). RNA sau khi đã phân tách được chuyển lên màng lai (các phân tử RNA 3. giữ nguyên vị trí như ở trên gel), thông thường màng nitrocellulose được dùng, tuy nhiên có thể dùng màng nylon được tích điện dương. 4. RNA cố định trên màng được lai với mẫu dò DNA sợi đơn (hoặc RNA) có đánh dấu phóng xạ hoặc được gắn với một enzyme (alkalin phosphatase hoặc horseradish peroxidase) tạo thành phân tử lai RNADNA (hoặc RNA-RNA) sợi kép. 5. Vị trí của mẫu dò được phát hiện nhờ kỹ thuật phóng xạ tự ghi nếu nó được đánh dấu phóng xạ. Trong trường hợp mẫu dò được gắn với enzyme thì đem ủ với một cơ chất không màu. Enzyme liên kết với nó sẽ biến đổi thành một sản phẩm màu có thể nhìn thấy hoặc phát ra ánh sáng mà sẽ được phát hiện bằng phim X quang một cách trực tiếp. 21/02/2016 3:46 CH. 28. Nguyễn Hữu Trí. Phương pháp PCR • PCR (polymerase chain reaction-phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymease) là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất trong lĩnh vực Sinh học phân tử. Phương pháp này do Kary Mullis phát minh vào năm 1985; được giới thiệu lần đầu tiên tại Hội thảo lần thứ 51 ở Cold Spring Harbor vào năm 1986 và ông đã nhận được giải thưởng Nobel Hoá sinh học vào năm 1993. • Nguyên tắc của phương pháp PCR: dựa vào đặc tính hoạt động của DNA polymerase: cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt để hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn. Như vậy, nếu ta cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA, ta sẽ chỉ tổng hợp đoạn DNA nằm giữa hai mồi. • Phương pháp PCR cho phép tổng hợp rất nhanh và chính xác từng đoạn DNA riêng biệt. Ðây thực sự là phương pháp hiện đại và thuận tiện cho việc xác định sự có mặt của một gen nào đó trong tế bào với độ chính xác cao.. Northern blot. 21/02/2016 3:46 CH. 29. Nguyễn Hữu Trí. 21/02/2016 3:46 CH. 30. Nguyễn Hữu Trí. 5.

(79) Ba giai đoạn trong một chu kỳ của phản ứng PCR Giai đoạn biến tính (denaturation) Trong giai đoạn này phân tử DNA mẫu bị biến tính ở nhiệt độ cao (thường là từ 94-950C, lớn hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử) trong vòng 30 giây đến 1 phút, tất cả các liên kết hydro giữa hai mạch của phân tử bị bẻ gãy và tạo thành các DNA sợi đơn. Giai đoạn lai (hybridization) Nhiệt độ được hạ thấp ( thường từ 40-700C, thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của mồi được sử dụng khoảng từ 3-50C) cho phép các mồi bám vào các phân tử DNA sợi đơn, đánh dấu phần DNA cần được khuyếch đại. Giai đoạn này kéo dài từ 30 giây đến một phút. Giai đoạn kéo dài (elongation) Nhiệt độ được tăng lên đến 720C giúp cho DNA polymerase xúc tác tổng hợp DNA tốt nhất. Công việc của DNA polymerase là di chuyển dọc theo DNA sợi đơn và sử dụng nó làm khuôn để tổng hợp sợi DNA mới bổ sung với DNA mẫu bằng cách kéo dài các phần đã được đánh dấu bởi các mồi. Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào kích thước của DNA mẫu, 31 Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 3:46 CH thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút.. Các thành phần của phản ứng PCR 1. Primer (mồi):  Mồi là những đoạn DNA sợi đơn ngắn và cần thiết cho việc xúc tiến phản ứng dây chuyền tổng hợp DNA. Chúng bắt cặp bổ sung với một đầu của DNA mẫu và tạo ra vị trí bắt đầu tái bản. Các mồi này có chiều ngược nhau, bao gồm một mồi xuôi (forward primer) và một mồi ngược (reverse primer).  Mồi là một chỉ tiêu quan trọng của phản ứng PCR để quyết định tính đặc trưng và hiệu quả của phản ứng. Do đó việc thiết kế mồi cần được tuân thủ một số nguyên tắc nhất định: dài khoảng 18-24 base; Tm của 2 mồi gần nhau; thành phần nucleotic của các mồi cần bằng tránh các cặp GC lặp đi lặp lại nhiều lần; mồi phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuyếch đại; không hình thành primer dimer, không phải là trình tự lặp lại. 2. DNA bản mẫu (DNA template): hàm lượng đủ nhưng không quá cao, tinh sạch – không chứa các chất ức chế phản ứng (SDS, chất ức chế từ mẫu (hemoglobin, sắc tố, heparin, …). PCR vẫn cho kết quả tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ tế bào hay những mẫu DNA không được bảo quản tốt. 3. Nồng độ MgCl2: cần cho hoạt động của Taq polymerase, hàm lượng quá cao sẽ tạo nhiều sản phẩm ký sinh, quá thấp thì làm giảm hiệu quả nhân bản của enzyme. Nồng độ tối ưu phải được xác định cho từng phản ứng qua nhiều thử nghiệm.. 21/02/2016 3:46 CH. Các thành phần của phản ứng PCR. 33. 1 Biến tính. 5. 3 Gene mục tiêu. DNA bộ gene. 3. 5. Nguyễn Hữu Trí. 5. 3. 3. 5. 2 Bắt cặp Chu kỳ 1 thu 2 phân tử. Nguyễn Hữu Trí. Phương pháp PCR. 4. dNTP: thành phần 4 loại dNTP phải cân bằng, sự mất cần bằng làm tăng các lỗi sao chép của polymerase; hàm lượng thường không đổi nhưng có thể thay đổi tùy điều kiện thực tế. 5. Enzyme polymerase chịu nhiệt Tag-polymerase là DNA polymerase chịu nhiệt sử dụng cho phản ứng PCR lần đầu tiên được bán trên thị trường. Tag-polymerase được nhà Vi sinh vật học Thomas Brock phát hiện ở Thermus aquaticus một loài vi khuẩn phát triển mạnh ở nhiệt độ cao. Enzyme chịu nhiệt này giúp giải quyết vấn đề của enzyme biến tính sau mỗi chu kỳ. Từ đó đến nay, một số vi sinh vật chịu nhiệt khác đã được khám phá và người ta đã tách chiết thêm được các DNA polymerase chịu nhiệt để sử dụng cho phản ứng PCR như Vent/DeepVent DNA polymerase (Thermococcus litoralis), Pfu DNA polymerase (Pyrococcus furiosus), Tth DNA polymerase (Thermus thermophilus), UlTma DNA polymerase (Thermotoga maritima)... 6. Số lượng chu kỳ phản ứng tùy thuộc vào số lượng bản mẫu ban đầu, thông thường số lượng chu kỳ nhỏ hơn 40 cho một phản ứng PCR. Thời gian của từng chu kỳ phụ thuộc thiết bị và kích thước sản phẩm. 7. Thiết bị và dụng cụ cho phản ứng PCR: cần đáp ứng được nhu cầu thay đổi nhiệt độ thật nhanh và chính xác. Những cải tiến máy luân nhiệt quan tâm đến microtiler plate 96 giếng, các block nhiệt riêng biệt trong 1 máy, block dùng cho lam kính để tiến hành in situ PCR. 21/02/2016 3:46 CH. 32. Phương pháp PCR Chu kỳ 2 thu 4 phân tử. Primer. 3 Kéo dài. nucleotide mới. Chu kỳ 3 thu 8 phân tử. Chu kỳ n thu 2n phân tử. 6.

(80) Các ứng dụng của phương pháp PCR. . . . Hiện nay thành tựu của PCR mở ra nhiều triển vọng cho sinh học phân tử, với nhiều ứng dụng trong sinh học, trong y khoa, trong nông nghiệp, … Một số ứng dụng có tính tổng quát: Sản xuất mẫu dò: PCR giúp sản xuất nhanh một lượng lớn mẫu dò đánh dấu khi thực hiện các phản ứng với cặp mồi chuyên biệt và các nucleotide đánh dấu. Khuyếch đại số lượng các RNA: sử dụng kĩ thuật phối hợp RT-PCR (kết hợp enzyme phiên mã ngược và Taq polymerase; hoặc sử dụng Tth polymerase). RT-PCR cho phép nghiên cứu các mRNA thông tin tồn tại với hàm lượng rất thấp, không thể phát hiện bằng phương pháp cổ điển như Northern blot, … Kĩ thuật in situ RT-PCR cho phép khuyếch đại các RNA ngay trên mô và tế bào. Định lượng bằng phương pháp PCR: dùng để nghiên cứu các trình tự RNA hay DNA có số lượng bản sao rất thấp. Trình tự đích được khuyếch đại đồng thời với một trình tự chứng có nồng độ đã biết, sau phản ứng so sánh hàm lượng sản phẩm, và suy ra số lượng bản mẫu ban đầu. 37. 21/02/2016 3:46 CH. • Giải trình tự gen theo phương pháp hóa học. Lần đầu tiên công bố vào năm 1977. • Nguyên tắc của phương pháp là dựa trên phản ứng hóa học thủy giải đặc hiệu, các DNA không tự xoắn lại với nhau, tạo thành tập hợp nhiều phân đoạn có kích thước khác nhau. • Trước hết, phân tử DNA được đánh dấu đồng vị phóng xạ P32 ở đầu 5’ của mạch đơn, tạo những đoạn đánh dấu có thể phát hiện bằng hình phóng xạ. • Xử lí hóa học đặc hiệu phân hủy đặc trưng một loại nucleotide của mạch DNA đã đánh dấu phóng xạ, tạo các đoạn oligonucleotide có chiều dài hơn kém nhau 1 nucleotide được phát hiện bằng điện di. Kết qủa các phản ứng hóa học xử lí mạch DNA được phát hiện bằng điện di trên gel polyacriamid có thể xác định được trình tự mạch đơn.. Phương pháp Maxam và Gilbert. G A. Mảnh ngắn nhất G. • Phương pháp xác định vị trí sắp xếp các nucleotid trong phân tử DNA – Phương pháp Maxam và Gilbert – Phương pháp Sanger – Pyrosequencing – Array sequencing. Nguyễn Hữu Trí. Phương pháp Maxam và Gilbert. Mảnh dài nhất. Phương pháp giải trình tự (DNA sequencing). G+A. T+C. C. 3′ A A G C A A C G T G C A G 5′. Phương pháp Maxam và Gilbert Mạch đơn đã đánh dấu phóng xạ có thể xử lí theo 4 nhóm phản ứng - Nhóm phản ứng thứ nhất xử lí mạch đơn DNA bằng dimethyl sulphat làm đứt mạch tại G. - Nhóm phản ứng thứ hai xử lí mạch đơn DNA bằng axit (pH=2) gây đứt mạch đơn tại A hoặc G. - Nhóm phản ứng thứ ba xử lí mạch đơn DNA bằng hydrazin gây đứt mạch đơn tại T và C. - Nhóm phản ứng thứ 4 xử lí mạch đơn DNA bằng hydrazin với nồng độ muối cao làm đứt mạch đơn tại C.. DMS. FA. G. H. G. G. H+S. C. A G. T T. G. G. G. C. A G. C C C C. T C A A. C T. Phương pháp Sanger Nguyên lý: Sanger, Smith và Coulson công bố vào năm 1977, dựa theo cơ chế tổng hợp DNA. Đã giải trình tự hoàn chỉnh bộ gen thực khuẩn thể X 174 Trong quá trình tổng hợp mạch đơn DNA bỏ sung một hàm lương nhỏ dideoxinucleotid (ddNTP). Do ddNTP mất cả 2 nhóm OH (carbon số 2 và 3) ngẫu nhiên làm cho phản ứng tổng hợp DNA ngừng lại.. Trình tự được đọc theo thứ tự từ dưới lên (5′ - 3′). Dideoxynucleotide dùng trong DNA sequencing. 7.

(81) Phương pháp Sanger. Phương pháp Sanger A. Sự kéo dài kết thúc do sự hiện diện của dideoxynucleotide. ddATP + four dNTPs. C. ddCTP + four dNTPs. G. ddGTP + four dNTPs. T. ddTTP + four dNTPs. ddA dAdGdCdTdGdCdCdCdG dAdGddC dAdGdCdTdGddC dAdGdCdTdGdCddC dAdGdCdTdGdCdCddC dAddG dAdGdCdTddG dAdGdCdTdGdCdCdCddG. G. Mảnh dài nhất. A. ddG. Mảnh ngắn nhất ddG. dAdGdCddT dAdGdCdTdGdCdCdCdG. T. C. 3′ G G T A A A T C A T G 5′. Trình tự được đọc theo thứ tự từ dưới lên (5′ - 3′). 44. Giải trình tự bằng máy tự động (Sequencer) • Theo nguyên tắc sử dụng ddNTP do Sanger và cộng sự phát minh • Trong quá trình tổng hợp DNA sử dụng mồi và dNTP đánh dấu huỳnh quang, mỗi loại dNTP có màu khác nhau • Máy tổng hợp mạch đơn trên cả 2 mạch khuôn, dùng phần mềm để xử lý kết quả.. Giải trình tự bằng máy tự động (Sequencer). ABI 3100. 5-46. Chromatogram. Microarray. Nguyên tắc: dựa vào kỹ thuật lai 1.Cố định các mẫu dò (oligonucleotide hay sản phẩm PCR) có trình tự xác định trên giá thể rắn thích hợp theo thứ tự.. 2.DNA mục tiêu được đánh dấu, sau đó lai với mẫu dò trên giá thể.. 3.Dựa vào cường độ phát tín hiệu của phân tử đánh dấu để xác định sự có mặt DNA mục tiêu có trong mẫu ban đầu.. 8.

(82) Mẫu dò (Probe). DNA mục tiêu. •. cDNA: sản phẩm PCR các cDNA trong thư viện cDNA hay từ bộ sưu tập dòng. •. Oligonuclotide: dài 20-25 mer. • Được đánh dấu và sử dụng các chất chỉ thị. – Được in lên giá thể. phát hiện:. – Tổng hợp in situ trực tiếp lên giá thể. – Chất phát huỳnh quang (Cy3/ Cy5, streptavidin/. – Các oligonucleotide được tổng hợp sẵn và in lên giá thể – Gần đây các oligonucleotide dài hơn (50-100 mer) đã được phát triển để tăng độ nhạy và tính đặc hiệu.. •. Phương pháp microarray có thể đồng thời phân tích sự biểu hiện của hơn 30.000 gen. •. Ứng dụng phát hiện các mẫu có mật độ thấp vì microarray chỉ cần một lượng nhỏ mẫu.. phycoerythrin) – Chất phóng xạ ( 32P, 33P , 35P) – Chất phát huỳnh quang hoá học (digoxigenein, biotin, Ag, Au). Image analysis of cDNA Microarray array. Microarray. cDNA microarray. The process Microarray MASSIVE PCR. Oligonucleotide microarray. Microarray. PCR PURIFICATION and PREPARATION. PREPARING SLIDES. PRINTING. Chuẩn bị RNA Nuôi và thu tế bào. Lai Array Tách RNA tổng số. Tổng hợp cDNA. Đánh dấu cDNA. 9.

(83) Chân thành cảm ơn. 21/02/2016 3:46 CH. 55. Nguyễn Hữu Trí. 10.

(84)

Bai giang Sinh hoc phan tu

Tài liệu liên quan

Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về