tập bài giảng vi sinh vật thực phẩm công nghệ thực phẩm

Bài 1:
THIẾT BỊ , DỤNG CỤ PHỊNG THÌ NGHIỆM VI SINH VẬT
VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP TIỆT TRÙNG VI SINH VẬT
I.THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ PHỊNG THÌ NGHIỆM VI SINH VẬT HỌC
1. Tủ sấy ( vacuum oven ) : điều chỉnh nhiệt độ từ 60ºC - 200ºC , dùng để sấy
khô , khử trùng các loại dụng cụ chịu đựng được sức nóng khơ , chủ yếu là dụng cụ
thủy tinh , kim loại . Tùy vào đối tượng cần khử khuẩn mà sấy ở chế độ nhiệt và thới
gian khác nhau , thường sấy ở 160ºC trong 2 giờ hoặc 180ºC trong 30 phút.
2.Tủ ấm ( incubator or etuve ) : Nhiệt độ từ 20ºC - 60ºC , có chế độ ổn định
nhiệt độ , được sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật tại nhiệt độ thích hợp cho sự sinh
trưởng và phát triển của chúng . Tùy vào đối tượng nuôi cấy mà ủ ở nhiệt độ khác
nhau để sinh vật có thể phát triển tốt . Ví dụ coliform 30ºC trong 24 - 48 giờ , E . coli
thích hợp ở 44ºC trong 24 – 48 giờ .
3.Tủ lạnh hay tủ mát ( freezer ) : dùng bảo quản môi trường đã pha chế ,
giống vi khuẩn , các chế phẩm sinh học ( vaccin , huyết thanh , đĩa giấy kháng
sinh….) hóa chất , thuốc thử dễ phân hủy ở nhiệt độ thường .
4. Nồi hấp ướt ( autoclave ) : Thiết bị này cấp nhiệt bằng hơi nước ở áp suất
cao (hơi nước bão hòa ở áp suất cao ) , được sử dụng để hấp khử trùng môi trường ,
một số nguyên liệu và dụng cụ thì nghiệm . Tùy đối tượng mà sử dụng ở chế độ nhiệt
độ và áp suất thích hợp , thường dùng 121ºC/0.8 atm trong 15 phút ; 127ºC/1.5 atm
trong 30 phút với môi trường đất ; hay 117ºC/0.8 atm trong 15 phút với mội trường
chứa nhiều đường , mội trường sữa …..
Bảng 1.1.Tương quan giữa thể tích mơi trường và thời gian hấp tiệt trùng ở 121ºC
Thể tích môi trường nuôi cấy
Thời gian hấp tiệt trùng
(ml)
tối thiểu ( phút )
25
20
50
25

100
28
250
31
500
35
1000
40
2000
48
4000
63
Bảng 1.2.Tương quan giữa áp suất hơi ( chỉ số của áp kế nồi hấp ) và nhiệt độ.
Chỉ số áp kế của nồi0,0
0,2 0,4 0.5 0,6 0,7 0,8 0.9 1,0 1,5 2,0
áp
suất (atm)
Nhiệt độ sôi của 100 105 110 112 114 116 117 119 121 127 134
nước (ºC)
Nhiệt độ sôi nước 212 221 230 234 237 241 243 246 250 261 273
(ºF)


5.Cân phân tích điện tử (analytical balance ):cận trọng trường từ 100µg200g độ chính xác 10-4 Cân kỹ thuật ( technical balance ): độ chính sác 10 -2 g. Dùng
cân hóa chất , mơi trường . Trong q trình sử dụng , không đặt trọng lượng quá
khoảng lên cân.
6.Tủ sấy vơ khuẩn có đèn cực tím (flux laminar ) : có khơng gian vơ trùng
để sử dụng để thao tác với sinh vật nhờ hệ thống đèn tử ngoại và bộ phận thổi khí vơ
trùng.
7.Máy ly tâm (centrifuge) :dùng tách các chất ở các pha rắn – lỏng ra khỏi

nhau như tách sinh khổi tế bào ra khỏi môi trường nuôi cấy , tách hồng cầu ,
enzyme… Khi sử dụng , các ống ly tâm cần đặt đối xứng và nhất thiết phải có các
khổi lượng bằng nhau.
8.Máy lác ( shaker ) : Thiết bị dùng để nuôi cấy , nhân giống các sinh vật bằng
cách lắc các bình ni cấy theo các kiểu khác nhau ( lác vòng và lác ngang ) một cách
đểu đặn để tăng lượng oxi hóa trong mội trường.
9.Kính hiển vi ( microsope ) :Có vai trò rất quan trọng trong nghiên cứu vi
sinh vật . Dùng nghiên cứu , quan sát tế bào sinh vật về đặc điểm hình thái , sinh lí
nhờ vào khả năng phóng đại của kính ( sẽ giới thiệu chi tiết ở bài sử dụng kính hiển
vi).
10. Máy đo pH ( pH meter ) : Đo pH dung dịch , môi trường nuôi cấy sinh
vật.
11. Máy cất nước (single/double water stills ): Dùng để cất nước .
12. Bể ổn nhiệt (water bath ): chứa nước và được cài đặt ở nhiệt độ nhất định
để ổn định nhiệt độ cho những thí nghiệm cần sự ổn định về nhiệt độ .
13. Nồi lên men (fermenter/bioreactor) :thiết bị lên men nuôi cấy vi sinh vật
trong điều kiện tối ưu hóa và điểu chỉnh được các thông số môi trường nuôi cấy .
14. Các thiết bị khác như :máy đếm vi sinh vật , máy quang phổ , sấy đông
khô…
15. Dụng cụ thí nghiệm
Dụng cụ thủy tinh có nhiều loại với nhiều kích cỡ khác nhau như hình tam
giác,ống nghiệm ,đĩa petri , lam kính , đũa thủy tinh , qua trang , ống đong , cốc đong ,
bình định mức … Yêu cầu phải sạch , trong ,trung tính . Trước khi dùng đựng môi
trường phải được sấy khô , làm nút bông và khử trùng trong tủ sấy khô .
-Phiến kính ( lame ) : dùng làm tiêu bản quan sát hình thái , sinh lý tế bào vi
sinh vật .
-Lá kính ( lamelle ) : dùng để đậy lên vết bôi trên tiêu bản cố định vi sinh vật
trong quá trình nghiện cứu .
-Hộp lồng ( đĩa petri ): dùng để nghiên cứu các đặc điểm hình thái , đặc điểm
nuôi cấy và phân lập của tế bào vi sinh vật .

-Que gạt ( que trải ) : là dụng cụ để phân lập vi sinh vật theo phương pháp trải
đĩa .
-Que cấy : Gồm có ba loại : que cấy đầu tròn :dùng để thao tác vi sinh trên đối
tượng đơn bào như vi khuẩn , nấm men . Que cấy nhọn : dùng cấy sau trên môi O


-micro pipette : sử dụng khi cần hút một lượng chính xác mơi trường sử dụng
trong định lượng vi sinh vật .
.-Pipette Pasteur : dùng để lấy dung dịch môi trường nuôi cấy.
Các dụng cụ mới cần được ngâm nước hoặc dung dịch H 2SO4 lỗng trong
giờ.Sau đó mới rửa lại bằng nước hoặc xà phòng nhiều lân cho đến khi pH trung tính.
Các dụng cụ đã qua sử dụng cịn chứa mơi trường và vi sinh vật , cần khử
trùng rồi mới rửa bằng xà phòng , phơi và sấy khô .
Các dụng cụ bị bám bẩn cần được ngâm thêm với dung dịch sulfocromic vài
giờ , sau đó rửa lại bằng nước sạch .
Thành phần dung dịch sulfocromic
K2CrO7
:
60g
H2SO4
:
66ml
Nước cất đến
:
1000ml
Cách pha
+ Hòa tan 60g K2CrO7 vào 700ml nước cất , đặt bình vào chậu nước để
tránh bị bỏng khi bồ sung axit .
+Bổ sung từ từ 66ml dung dịch H 2SO4 vào dung dịch K2CrO7 trên đến
khi tan hết .

+ Bổ sung nước cất vừa đủ 1000ml . Bảo quản trong bình tối màu , tránh
ánh sáng để dùng dân .
-Dụng cụ sạch khi đưa lên ánh sáng khơng có vết mờ và vết bợm
- Các dụng cụ khác như : đẻn cồn , giá ống nghiệm , que cấy , kẹp , kéo , bơm
tiêm nhựa , đầu tuýt , bếp điện …
II. CÁC PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG VI SINH VẬT
1.Nguyên tắc
Diệt trùng hay khử trùng là phương pháp nhằm ức chế hoặc loại bỏ , cuối cùng
là giết chết các vi sinh vật không mong muốn .
Người ta thường khử trùng bằng hai phương pháp chính .
2.Phương pháp
a) Phương pháp lý học
Nhiệt khô
-Đối với dụng cụ cấy kim loại , đôi khi cả thủy tinh , phương pháp thường
dunglà đốt ,: đốt trực tiếp trên ngọn lựa hoặc nhúng cồn đốt .
- Đối với dụng cụ thủy tinh có thể gói giấy cà sấy ở 160ºC trong 1 – 2 giờ hoặc
180ºC trong 30 phút . Dụng cụ đưa vào sấy phải chịu được nhiệt độ cao và không
buộc giây nhựa hoặc thung .
Nhiệt ẩm
-Phương pháp luộc : cho vật khử trùng vào nước sôi , nhiệt sẽ thấm nhanh vào
mẫu vật làm cho protein đông kết , dẫn đến giết chết các vi sinh vật . Tuy nhiên , chỉ
diệt tế bào sinh dưỡng , bào tử vẫn còn.
-Phương pháp Pasteur : chỉ diệt vi khuẩn gây bệnh ( ký sinh ) , không diệt bào
tử , và vi khuẩn hoại sinh . Phương pháp này khơng giệt hồn tồn mầm bệnh mà chỉ


chọn một số vi sinh vật đối kháng mạnh nhất . Vì vậy , phải biết nhiệt độ và thời gian
diệt trùng cho từng loại vi sinh vật .Phương pháp này thường dùng trong nhiệt độ
70ºC – 75ºC trong thới gian 10 – 15 phút .
-Phương pháp tyndall : đun cách thủy nhiều lần ở nhiệt độ 70-80ºC , mỗi lần

30 – 60 phút và liên tiếp trong ba ngày liền .
-Phương pháp hơi nước bão hòa ở áp suất cao : dùng autoclave . Nhiệt độ và
thời gian hấp tùy thuộc vào nguyên liệu cần hấp .Thường dùng nhất là ở nhiệt độ
121ºC trong thời gian 15 – 30 phút.
Diệt trùng bức xạ
-Tia tử ngoại hay UV : chỉ sát trùng bề mặt , không xuyên sâu vào mẫu vật .
-Tia âm cực : dùng trong diệt trùng dụng cụ giải phẫu , thuốc thực phẩm . Vật
khử trùng phải bao gói kín .
Sóng ngẳn khi tác động với cường độ và thời gian thích hợp có thể phá vỡ tế
bào vi sinh vật , làm chết các tế bào sông .
Diệt trùng bằng cách lọc
-Dụng cụ lọc thường là những màng xốp bằng sứ , aminate , cellulose… có
kích thước lỗ lọc từ 0,2- 0,45µm thường để lọc các vật phẩm lỏng không khử trùng
bằng nhiệt được .
-Đối với khử trùng khơng khí thì thiết bị khử trùng là mốt máy lọc khí có trang
bị màng lọc hay hấp phụ vi khuẩn .
b) Phương pháp hóa học
-Chất sát khuẩn ngồi da: xà phịng, cồn, iode, phẩm màu.
-Chất diệt khuẩn và tẩy uế: phenol, formol, hợp chất clor...
III.THỰC HÀNH CHUẨN BỊ DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM
1.Chuẩn bị ống nghiệm
Dùng để chứa đựng dung dịch với dung tích nhỏ , ni cấy vi sinh vật trên
môi trường lỏng hoặc mội trường thạch , thử các tính chất sinh hóa của vi sinh vật ….
Đối với các thì nghiệm khơng sẵn nắp ( nắp nhựa , nắp cao su , nắp inox….) ,
sinh viên tiến hành làm nút đậy bằng bông không thấm nước và bao gói bên ngồi
bằng giấy , u cầu của nút đạy bằng bơng và bao ngồi bằng giấy như sau .
-Nút bơng có độ chặt vừa phải đảm bảo độ kín và thuận tiện cho q trình thao
tác mở hoặc đậy . Kích thước phần bên trong ống nghiệm của nút khoản , 1,5-2 cm ,
phần bên ngồi khoảng 0,5cm . Đầu của nút bơng nhẵn , không gấp nếp hoặc xù tơ
lông .

- Bao giấy phải trùm kín được nút bơng của ống nghiệm với độ chặt vừa phải .
Mép giấy bên trong và ngoài phải được gấp chéo để thuận tiện cho quá trình tháo ra
hoặc đậy lại
2.Chuẩn bị đĩa petri
Đĩa petri chủ yếu dùng để nuôi cấy , phân lập các chung vi sinh vật hoặc làm
các test chuẩn đoán , kháng sinh đồ khoanh giấy , các thử nghiệm tính cạnh tranh giữa
các chủng vi sinh …. Trên môi trường thạch dinh dưỡng , mà qua đó ta có thể quan sát
được hình thái , tính chất khuẩn lạc của quần thể vi sinh vật .


Trước khi sử dụng đĩa petri được rửa sạch , sấy khơ sau đó bao gói và sấy hoặc
hấp tiệt trùng .
3. Chuẩn bị pipette
Dùng để đong , hút dung dịch cần có độ chính xác cao . Có rất nhiều loạipipette
thủy tih khác nhau nhau pipette Pasteur , pipette có chia vạch thơng thường ….được
thiết kế cho phù hợp với mục đích nghiện cứu . Hiện nay , trong các phịng thì nghiệm
nghiện cứu về sinh vật gây bệnh đều nghiêm cấm việc hút pipet bằng mồm, thay vì thế
người ta dùng quá boa bằng cao su , quả bóp hút và an tồn ba van , hoặc dùng piprtte
hút tự động (popette aid ) hoặc micropipette
4.Chuẩn bị bình tam giác
Thường sử dụng để chuẩn độ , chứa đựng môi trường , dung dịch , nuôi cấy
sinh vật , thực hiện các phản ứng … Bình tam giác , thường có thể có thể tích từ 50ml
đến 10 lit tùy theo dung dịch chứa để chọn loại bình thích hợp . Trước khi sử dụng ,
bình tam giác cần được rửa sạch , sấy khơ và bao gói , nút đậy bính có thể làm bằng
bơng khơng thấm nước .Yêu cầu của nút đậy phải tới phần cổ của bình đảm bảo độ
kín và tránh tạp nhiểm tối đa.
IV.NHỮNG ĐIỂM CẦN LƯU Ý
-Không làm vụn bông không thấm khi làm nút đậy cho các dụng cụ nhưng ông
nghiệm , bình tam giác .
-Khi nút bơng gịn vào đi pipette , độ chặt phải vừa đủ phải kiểm tra khả

năng hút dung dịch của pipette sau khi hút xong .
-Kích thước nút đậy ống nghiệm , bình tam giác phải phù hợp , tiện dụng
V.BÁO CÁO THỰC TẬP
1.Trình bày yêu cầu của việc bao gói dụng cụ ni cấy vi sinh vật.
-Phần giấy bao bên ngồi phải kín và chặt.
-Bao bằng giấy báo với dụng cụ sấy khô khi khử trùng ướt.
-Với dụng cụ như pipet, que trang phải dùng giấy báo bao kín tồn bộ. Có thể
dùng hộp nhơm để đựng các dụng cụ trên để khử trùng.
2.Công dụng và cách sử dụng các dụng cụ , thiết bị phịng thí nghiệm vi
sinh vật.
(Mục I: Thiết bị và dụng cụ phịng thí nghiệm vi sinh vật học)
3.Trình bày phương pháp tiệt trùng dụng cụ và môi trường nuôi cấy vi
sinh vật.
Có 2 phương pháp:
a) Phương pháp lý học
Nhiệt khơ
-Đối với dụng cụ cấy kim loại , đôi khi cả thủy tinh , phương pháp thường
dunglà đốt , đốt trực tiếp trên ngọn lựa hoặc nhúng cồn đốt .
- Đối với dụng cụ thủy tinh có thể gói giấy cà sấy ở 160ºC trong 1 – 2 giờ hoặc
180ºC trong 30 phút . Dụng cụ đưa vào sấy phải chịu được nhiệt độ cao và không
buộc giây nhựa hoặc thung .
Nhiệt ẩm


-Phương pháp luộc : cho vật khử trùng vào nước sôi , nhiệt sẽ thấm nhanh vào
mẫu vật làm cho protein đông kết , dẫn đến giết chết các vi sinh vật . Tuy nhiên , chỉ
diệt tế bào sinh dưỡng , bào tử vẫn còn.
-Phương pháp Pasteur : chỉ diệt vi khuẩn gây bệnh ( ký sinh ) , không diệt bào
tử , và vi khuẩn hoại sinh . Phương pháp này khơng giệt hồn tồn mầm bệnh mà chỉ
chọn một số vi sinh vật đối kháng mạnh nhất . Vì vậy , phải biết nhiệt độ và thời gian

diệt trùng cho từng loại vi sinh vật .Phương pháp này thường dùng trong nhiệt độ
70ºC – 75ºC trong thới gian 10 – 15 phút .
-Phương pháp tyndall : đun cách thủy nhiều lần ở nhiệt độ 70-80ºC , mỗi lần
30 – 60 phút và liên tiếp trong ba ngày liền .
-Phương pháp hơi nước bão hòa ở áp suất cao : dùng autoclave . Nhiệt độ và
thời gian hấp tùy thuộc vào nguyên liệu cần hấp .Thường dùng nhất là ở nhiệt độ
121ºC trong thời gian 15 – 30 phút.
Diệt trùng bức xạ
-Tia tử ngoại hay UV : chỉ sát trùng bề mặt , không xuyên sâu vào mẫu vật .
-Tia âm cực : dùng trong diệt trùng dụng cụ giải phẫu , thuốc thực phẩm . Vật
khử trùng phải bao gói kín .
Sóng ngẳn khi tác động với cường độ và thời gian thích hợp có thể phá vỡ tế
bào vi sinh vật , làm chết các tế bào sông .
Diệt trùng bằng cách lọc
-Dụng cụ lọc thường là những màng xốp bằng sứ , aminate , cellulose… có
kích thước lỗ lọc từ 0,2- 0,45µm thường để lọc các vật phẩm lỏng không khử trùng
bằng nhiệt được .
-Đối với khử trùng khơng khí thì thiết bị khử trùng là mốt máy lọc khí có trang
bị màng lọc hay hấp phụ vi khuẩn .
b) Phương pháp hóa học
-Chất sát khuẩn ngồi da: xà phịng, cồn, iode, phẩm màu.
-Chất diệt khuẩn và tẩy uế: phenol, formol, hợp chất clor...

Bài 2 :
PHƯƠNG PHÁP PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG
NUÔI CẤY VI SINH VẬT


I.Nguyên tắc
Các chất dinh dưỡng là hợp chất tham gia vào q trình trao đổi chất nội bào .

Mơi trường dinh dưỡng là hôn hợp gồm các chất dinh dưỡng và các chất có nhiệm vụ
duy trì thế oxi hóa – khử , áp xuất thẩm thấu của tế bào và sự ổn định độ pH của môi
trường
Yêu cầu môi trường dinh dưỡng : có đủ chất dinh dưỡng cần thiết ; có độ pH
thích hợp ; có độ nhớt nhất định ; không chứa các yếu tố độc hại ; hồn tồn vơ trùng
đảm bảo sự phát triển của vi sinh vật.
Phân loại môi trường dinh dưởng ; người ta dựa trên cơ sở khác nhau để phân
loại môi trường .
a)Phân loại theo nguồn gốc
-Môi trường tự nhiên : dịch nước chiết thịt , nước chiết khoai tây , máu động
vật
-Môi trường nhân tạo: Czapeck , hansen , EMB ….
-Môi trường bán tự nhiên : Potato glucose agar (PGA) , giá đậu đường …
b)Phân loại theo trạng thái vật lý
-Mơi trường lỏng : dạng lỏng , khơng có agar hay các chất làm giá thể khác
trong thành phần môi trường
-Mơi trường rắn : mỗi 1000ml mơi trường có 15-20g agar hay các chất làm giá
thể
-Môi trường bán lỏng ( bán rắn ) : mỗi 1000ml mơi trường có 3-5g agar hay các
chất làm giá thề khác.
c)Phân loại theo công dụng
-Môi trường phân lập
-Môi trường tăng sinh
-Môi trường lưu giữ giống
-Mơi trường thử nghiệm sinh hóa
Mơi trường ni cấy vi sinh vật được pha chế theo nguyên tắc :
-Dựa trên cơ sở nhu cầu về các chất dinh dưỡng và khả năng đồng hóa các chất
dinh dưỡng của từng loại sinh vật .
-Để đảm bảo sự cân bằng về áp suất thẩm thấu giữa môi trường và tế bào vi
sinh vật nên cần điều chỉnh tỷ lệ và nồng độ các chất trong thành phân môi trường

-Đảm bảo các điều kiện hóa lý cần thiết cho các hoạt động trao đổi chất của vi
sinh vật .
II. DỤNG CỤ , MÔI TRƯỜNG VÀ HÓA CHẤT
1.Dụng cụ
STT
Tên dụng cụ , thiết bị mỗi nhóm
Đơn vị tính
Số
( 3 sinh viên)
lượng
1
Gía ống nghiệm
Cái
1
2
Ơng nghiệm Φ18
Cái
5
3
Bình tam giác
Cái
1


4
5
6
7
8
9

10
11
12
13
14
15

Phễu thủy tinh
Đũa khuấy thủy tinh
Cốc 100ml
Cốc 500ml
Đĩa cân nhựa
Bình tia
Bếp điện
Dụng cụ dùng chung
Máy đo pH
Cân kỹ thuật
Cân Phân tích
Nồi hấp cao áp
Tủ sấy

Cái
Cái
Cái
Cái
Cái
Cái
Cái

1

1
3
1
3
1
1

Cái
Cái
Cái
Cái
Cái

1
1
1
1
1

2.Mơi trường và hóa chất
a)Mơi trường nuôi cấy vi khuẩn
Môi trường cao thịt-peptone
-Cao thịt : 3g
-Peptone : 10g
-NaCl : 5g
-Agar : 20g
-Thêm nước cất cho đủ 1000ml
Lắc đều , điều chỉnh pH 7,0 ± 0,2
Nấu sôi nhẹ để agar tan hồn tồn , phân phối mơi trường vào các dụng cụ để
khử trùng ở 121ºC trong 30 phút .

b)Môi trường nuôi cấy nấm men
Môi trường Hansen
-Glucose , maltose ( hoặc đường kính ):50g
-Peptone : 10g
-K2HPO4 :3g
-MgSO4.7H2O : 2-5g
-Agar : 20g
-Thêm nước cất đủ ; 1000ml
Lắc đều điểu chỉnh pH 6,0±0,2
Nấu sơi nhẹ để agar tan hồn tồn , phân phối mơi trường vào các dụng cụ để
khử trùng ở 121ºC trong 30 phút.
c)Môi trường cấy nấm mốc
Môi trường Czapek
-Saccarose : 30g
-NaNO3 : 3g
-K2HPO4 : 1g


-MgSO4 :0.5g
-FeSO4 :0,01g
-Thạch ( agar ) : 20g
-Thêm nước cất đầy đủ : 1000ml
pH 6,0±0,2 khử trùng 1 atm/30 phút
d)Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn
Môi trường Gauze 1
-Tinh bột tan : 20g
-K2HPO4 : 0.5 g
-MgSO4.7H2O : 0.5g
-KNO3 : 1,0g
-NaCl :0.5g

-FeSO4 : 0,1g
-Agar : 20g
-Nước cất đủ : 1000ml
pH 7,2 ÷7,4 khử trùng 1 atm trong thời gian 30 phút
e)Môi trường nuôi cấy tảo
Môi trường Tamiya
-KNO3 : 5,000
-MgSO4 : 2,500
-KH2PO4 : 1,250
-FeSO4.7H2O : 0,003 – EDTA ; 0,037
-Vi lượng Ạ5 : 1 ml
-Agar : 20g
-Nước cất đủ 1000ml
Thành phần vi lượng A5
-H3BO3 : 2,860
-MnCl2.4H2O : 0.222
-MoO3 :176,4
-NH4VO3 : 229,6
-Nước cất đủ 1000ml
3.Nguyên liệu khác
-Giấy lọc
-Bông không thấm nước
-Bông thấm nước
III. TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM
Làm mơi trường để thực hiện việc phân lập , nhân giống giữ giống vi sinh vật ,
đồng thời để nuôi cấy cà nghiên cứu các đặc điểm sinh học của chúng .
Các bước để tạo môi trường dinh dưỡng
1.Chuẩn bị dụng cụ

Tất cả dụng cụ cần sử dụng trong suốt quá trình pha chế mơi trường phải được
chuẩn bị đầy đủ . Các dụng cụ được rửa sạch , tráng bằng nước cất ,sấy khơ trước khi
sử dụng
2.Cân đong hóa chất pha chế mơi trường
Cân , đong thật chính xác từng thành phân mơi trường cà pha chế đúng trình tự
hướng dẫn trong tài liệu . Dùng đĩa cân nhựa hoạc cốc thủy tinh để cân đong các loại
hóa chất dễ hút ẩm
3.Phối chế tạo môi trường nuôi cấy
-Các thành phần của mơi trường được hịa tan riêng rẽ trong nước cất trước khi
phôi trộn .
-Phối trộn thành phần theo các trình tự nhất định tránh sự tương tác trực tiếp
của các thành phần có thể phản ứng tạo kết tủa với nhau . Phối trộn dựa trên nguyên
tắc thể tích tăng dần .
-Sau khi phối chế các thành phần , cần tiến hành học môi trường qua giấy lọc ,
bông thấm nước ( đối với môi trường lỏng ) hoặc vải màn ( đối với môi trường đặc )
để làm trong môi trường , đảm bảo việc quan sát vi sinh vật được dễ dàng .
-Đối với môi trường rắn , sau khi phối trộn các thành phần , phải tiến hành nấu
sơi mơi trường để làm tan hồn tồn agar trước khi phần phôi vào dụng cụ chứa .
4.Điều chỉnh độ pH của mội trường
-Muốn điều chỉnh độ pH của mơi trường có thể dùng HCl 10% hay NaCl 10% .
Ngồi ra có thể dùng một số hóa chất khác như : H3PO4 , KOH, H2SO4 ….
-Muốn kiển tra độ pH của môi trường nên dùng máy đo pH (pH – metre ) .
Phương pháp này nhanh nhạy và cho độ chính xác cao . Trong thí nghiệm có thể dùng
chỉ thị màu xanh .bromotomol hay giấy quỳ để đo pH . Phương pháp này tiện lợi ,
nhanh nhưng cho độ chính xác cao .
5.Phần phối mơi trường vào dụng cụ chứa
-Môi trường sau khi pha chế xong thường được phân phối mơi trường vào ống
nghiệm , bình tam giác . Trình tự phân phối gồm các bước sau :
+Mơi trường cần được đun hóa chất lỏng rồi đổ qua phễu thủy tinh vào
các dụng cụ.

+Tay trái giữ dụng cụ chứa môi trường , tay phải kẹp nút bông và kéo ra
+Nhanh tay rót mơi trường vào dụng cụ đạy nút bông lại.
-Đối với ống nghiệm : Nếu dùng mơi trường làm thạch nghiêng thì lượng mơi
trường cần được phân phối chiếm ¼ thế tích của ống nghiệm . Nếu làm thạch đứng thì
lượng mơi trường cần được phân phối từ ½ - 1/3 thể tích ống nghiệm
-Đối với bình cấu hay bình tam giác , lượn mơi trường phân phơi chiếm ½-1/3
thể tích của bình
-Đối với đĩa petri , môi trường chỉ được phân phối vào đĩa sau khi đã tiệt trùng.
Thể tích mơi trường khoảng 12 – 15 ml mỗi đĩa , lớp môi trường thạch dảy khoảng
2mm
-Viết nhãn môi trường lên các dụng cụ chưa bao gồm các thông tin :
+Tên môi trường


+Ngày khử trùng
+Ngày pha chế
6.Khử trùng mơi trường
-Tùy theo tính chất và điều kiện cụ thể của từng loại môi trường mà ta có chế
độ và phương pháp khử trùng khác nhau . Môi trường được hấp tiệt trùng bằng nồi
hấp cao áp . Thời gian hấp tiệt trùng môi trường ở nhiệt độ 121ºC phụ thuộc vào
lượng môi trường phân phối vào dụng cụ chứa ( xem bài 1 )
-Đối với mơi trường có các thành phần dễ bị biến tính ở nhiệt độ cao ( vitamin ,
chất kháng sinh , chất kích thích sinh trưởng …) , cần hấp tiệt trùng mơi trường nước ,
sau đó bổ sung các thành phần này sau khi hấp xong .
-Một số loại mội trường không được hấp tiệt trùng theo quy định của nhà sản
xuất , (Ví dụ : Mơi trường Selenit cystine broth , Xylose lysin ,deoxycholate agar ,
Chormocult coliform agar … ) , cần chuẩn bị nước vô trùng trước , sau đó pha chế và
sử dụng ngay.
7.Làm thạch nghiêng , thạch đứng , đổ thạch vào đĩa petri
-Làm thạch nghiêng : cần tiến hành ngay sau khi sử dụng môi trường vừa kết

thúc và môi trường chưa đông đặc . Ống nghiệm đặt nghiêng cố định trên giá đỡ .
Phần đỉnh nghiêng phải cách nút đậy 3-5 cm . Phần đáy phải có 1 phần thạch đứng
0,5– 1 cm.
-Làm thạch đứng : đặt các ống nghiệm đã có môi trường làm thạch đứng vào
giá , để yên cho đến khi môi trường nguội hoặc đông đặc .
-Độ thạch vào đĩa petri : môi trường vô trùng chưa ống nghiệm hoặc bình tam
giác được rót vào phân đáy của đĩa petri . Tồn bộ quy trình đổ thạch vào đĩa petri đều
được thực hiện tron tủ cấy vô trùng hoặc trong pham vi vô trùng của ngọn lửa đèn cồn
8.Kiểm tra độ vô trùng và bảo quản
-Môi trường sau khi pha chế xong , được đặt ở điểu kiện nhiệt độ phòng 24 giờ.
Sau thời gian này kiểm tra độ vô trùng của môi trường bằng cách quan sát môi
trường.
-Môi trường chưa dùng cần được bảo quản ở chỗ mát , hạn chế tác dụng của
ánh sáng , nhiệt độ từ 0 – 5 ºC và không để môi trường bị khô . Thời gian lưu trữ tối
đá là 15 ngày.
-Trước khi sử dụng kiểm tra độ vô khuẩn của môi trường , người ta thường đặt
vào tủ ấm 37ºC , trong 48 – 72 giờ . sau đó lấy ra quan sát , loại bỏ các ống vi sinh vật
phát triển và chỉ sử dụng những ống nghiệm , những đĩa petri có mơi trưởng đạt u
cầu .
IV.NHỮNG ĐIỀU CẦN LƯU Ý
-Khi pha chế môi trường rắn hoặc bán rắn , thành phần agar trong mơi trường
có thể bổ sung sau khi điều chỉnh pH của mội trường .
-Đối với môi trường rắn hoạc bán rắn , cần phải nấu sơi để làm tan agar hồn
tồn trước khi phân phôi vào dụng cụ chứa .


-Khi điều chỉnh pH , cần dủng từng lượng nhỏ các dung dịch điểu chỉnh ( dung
dich NaOH , HCl ) tránh vượt quá pH cần . pH môi trường cần được kiểm tra trước và
sau khi hấp tiệt trùng.
-Các thao tác phân phối môi trường cần phải nhanh gọn , khéo léo ,để mơi

trường khơng dính trên miệng dụng cụ hoạc nút bông và việc phân phối cần thực hiện
xong trước khi môi trường được đông đặc .
V.BÁO CÁO THỰC TẬP
1.Trình bày khái niệm mơi trường và phân loại môi trường nuôi cấy vi
sinh vật.
Khái niệm môi trường ding dưỡng: môi trường dinh dưỡng là hỗn hợp các chất
dinh dưỡng và các chất này có nhiệm vụ duy trì thế oxy hóa khử, áp suất thẩm thấu
của tế bào và ổn định của pH trong mơi trường. Trong đó các chất dinh dưỡng là
những hợp chất tham gia vào q trình trao đổi chất nội bào.
Phân loại mơi trường dinh dưỡng:
a)Phân loại theo nguồn gốc
-Môi trường tự nhiên : dịch nước chiết thịt , nước chiết khoai tây , máu động
vật
-Môi trường nhân tạo: Czapeck , hansen , EMB ….
-Môi trường bán tự nhiên : Potato glucose agar (PGA) , giá đậu đường …
b)Phân loại theo trạng thái vật lý
-Mơi trường lỏng : dạng lỏng , khơng có agar hay các chất làm giá thể khác
trong thành phần môi trường
-Mơi trường rắn : mỗi 1000ml mơi trường có 15-20g agar hay các chất làm giá
thể
-Môi trường bán lỏng ( bán rắn ) : mỗi 1000ml mơi trường có 3-5g agar hay các
chất làm giá thề khác.
c)Phân loại theo công dụng
-Môi trường phân lập
-Môi trường tăng sinh
-Môi trường lưu giữ giống
-Mơi trường thử nghiệm sinh hóa
2.Trình bày quy trình pha chế môi trường nuôi cấy vi sinh vật .
-Chuẩn bị dụng cụ
-Cân hóa chất

-Phối chế tạo mơi trường ni cấy
-Điều chỉnh độ pH của môi trường
-Phân phối môi trường vào dụng cụ
-Khử trùng môi trường
-Làm thạch nghiêng, làm thạch đứng, đỗ thạch vào đĩa petri
-Kiểm tra độ vô trùng và bảo quản


3.Yêu cầu của môi trường trong đĩa petri , ống nghiệm thạch nghiêng và
thạch đứng.
Làm thạch nghiêng:
Cần tiến hành ngay sau khi khử trùng môi trường và môi trường chưa đơng
đặc.
-Đặt ống nghiệm có mơi trường lên giá đặt nghiêng và không được để môi
trường chạm vào nút.
-Để yên cho tới khi môi trường đông đặc. Yêu cầu mặt thạch phải thẳng, nhẵn,
liên tục.
Làm thạch đứng:
-Đặt các ống nghiệm có môi trường là thạch đứng vào giá, để yên tới khi mơi
trường đơng đặc.
Đổ mơi trường vào đĩa petri:
Tồn bộ q trình đổ mơi trường vào đĩa petri phải thực hiện trong môi trường
cô trùng và gồm các thao tác su:
-Một tay cầm mơi trường
-Tay cịn lại mở nút và hơ miệng bình trên ngọn lửa đèn cồn.
-Mở hé nắp đĩa, rót mơi trường vào
-Đậy nắp lại, làm mơi trường phân phối đều trong đĩa
-Để yên cho môi trường đông đặc
-Lật úp đĩa lại và bảo quản
4.Giải thích tại sao không phân phối môi trường vào đĩa petri trước khi

khử trùng.
Vì sẽ nhiễm các vi sinh vật khơng mong muốn, có thể nhiễm một số tạp chất, vì
vậy sau q trình ni cấy khó xác định kết quả. Có thể tránh được hơi nước tiếp xúc
vào môi trường nuôi cấy và vì sau khi cấy phải để n mơi trường để cứng môi
trường.
5.Đĩa petri chứa môi trường trước khi cấy vi sinh vật nên đặt úp hay
ngửa? Tại sao ?
Nên để úp vì tránh nước đọng rơi vào mơi trường.


Bài 3
PHƯƠNG PHÁP NI CẤY VI SINH VẬT
I.Ngun tắc
Qúa trình nuôi cấy vi sinh vật gồm 2 khâu : cấy và nuôi . Cấy là thao tác chuyển
vi sinh vật từ môi trường đang sống sang môi trường thuận lợi hơn cho sự phát triển
của chúng . Nuôi là quá trình đảm bảo và duy trì nhưng điểu kiện thuận lợi nhất cho
sự hoạt động và phát triển của vi sinh vật . Hai khâu này ln gắn bó với nhau trong
quá trình nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật .
1.Mục đích ni cấy
-Phát hiện sự có mặt của vi sinh vật trong các nguyên liệu và vật phẩm cần
nghiên cứu .
-Tiến hành việc nhân giống các vi sinh vật một cách nhanh chóng
-Bảo tồn các giống vi sinh vật cần thiết
-Nghiên cứu các đặc tính sinh học và sự phát triển của từng loại vi sinh vật
2.Nguyên tắc nuôi cấy vi sinh vật
-Mọi thao tác nuối cấy đều phải thực hiện trong điểu kiện vô trùng để tránh tạp
nhiễm các vi sinh vật không mong muốn từ môi trường ngồi .
-Mơi trường và dụng cụ ni cấy đều phải được khử trùng triệt để .

-Duy trì tốt các điều kiện ni cấy ( Nhiệt độ , độ ẩm , ánh sáng , oxi …) để vi
sinh vật phát triển thuận lợi .
II. DỤNG CỤ, MƠI TRƯỜNG VÀ HĨA CHẤT
1.Dụng cụ
STT
Tên dụng cụ , thiết bị mỗi nhóm
Đơn vị tính
Số lượng
( 3 sinh viên )
1
Gía ống nghiệm
Cái
1
2
ống nghiệm Φ18
Cái
1
3
Cốc 100ml
Cái
1
4
Cốc 500ml
Cái
1
5
Đèn cồn
Cái
1
6

Que cấy
Cái
1
7
Bình tia
Cái
1
Dụng cụ dùng chung
8
Tủ ấm
Cái
1
9
Tủ cấy vơ trùng
Cái
1
2.Mơi trường hóa chất
Mơi trường nuôi cấy vi sinh vật : đã được chuẩn bị ở bài 2 , bao gồm các loại
+ Môi trường cao thịt – peptone : nuôi cấy vi khuẩn
+ Môi trường hansen : nuôi cấy nấm men
+ Môi trường Czapeck : nuôi cấy nấm mốc
0
-Cồn 96
3.Chủng giống vi sinh vật
-Nấm mốc : Aspergillus niger , Aspergillus oryzea
-Nấm men : Saccharomyces cerevisiae , Saccharomyces vini
-Vi khuẩn : Escherichia coli , Bacillus subtilis
4.Nguyên liệu khác
-Giấy lọc
-Bông không thấm

-Bông thấm nước
III. TIẾN HÀNH THÌ NGHIỆM
1.Cấy truyền vi sinh vật trong mơi trường lỏng
Cấy truyền là phương pháp lấy vi sinh vật từ ống nghiệm này sang ống nghiện
khác . Trước khi cấy , tiến hành dán nhãn ghi : tên loại vi sinh vật , ngày cấy vào
thành ống nghiệm bên dưới nút ống nghiệm .
a)Cấy truyền bằng pipette Pasteur
-Khử trùng pipette Pasteur qua ngọn lửa đèn cồn .
-Tay trái cầm giống gốc , dùng ngịn tay út phải mở nút bơng của ống giống hơ
và xoay miệng ống giống qua ngọn lửa đèn cồn để sát khuẩn .


-Cho pipette Pasteur vào ống lòng để lấy dịch vi khuẩn ( dịch nâng trong
pioette từ từ theo lực mao dẫn ) nhanh chóng đặt ngịn tay phải lên đầu pipette , rút
pipette ra khỏi ống , đạy nút bông lại rồi đặt ống giống vào giá .
-Cầm ống môi trường mới bằng tay trái , mở nút bằng ngón út tay phải , khử
khuẩn miệng ống , cho pipette vào tới khi đầu pipette chạm tới đầu môi trường và để
chảy ra giọt dịch chứa vi khuẩn . Rút pipette ra , khử trùng miệng ống , đậy nút.
-Đặt pipette vào bình đựng thuốc sát khuẩn
b) Cấy truyền bằng que cấy vòng
-Tay trái cầm 2 ống nghiệm ; 1 ống giống , 1 ống môi trường .
-Tay phải cầm que cấy và khử trùng trên ngọn lữa đèn côn cho đến khi nóng đỏ
dây cấy
-Dùng ngón út và ngịn áp út kẹp ống nghiệm vào lòng bàn tay xoay nhẹ , kéo
nút ống nghiệm ra .
-Hơ nóng đề khử trùng khơng khí ở miệng 2 ống nghiệm
-Đợi khi que cấy vừa nguội , khéo léo đưa que cấy tiếp xúc với khuẩn lạc trong
ống giống
-Rút que cấy ra , không để que cấy chạm vào thành ống nghiệm và đưa ống
môi trường . Khi đầu que cấy chạm vào ống mơi trường thì lác khẽ que cấy cho vi

khuẩn tan trong mơi trường .
-Khử trùng phần phơng khí nơi miệng hai ống nghiệm rồi đậy nút lại
-Khử trùng que cấy sau khi đã sử dụng xong
Chú ý
-Nếu ống giống là canh trường lỏng có vi sinh vật thì dùng pipette hút canh
trường thay que cấy
-Thao tác khử trùng ống hút bắt đầu thực hiện ở đầu nhỏ của ống hút sau khi đã
tháo giấy bao gói .
-Sử dụng xong cắm ống hút vào dung dịch sunfocromic để khử trùng
2.Phương pháp cấy truyền trên môi trường thạch
a)Cấy truyền trên ống nghiệm thạch nghiêng
Phương pháp dùng để cấy truyền các vi sinh vật hiếu khí ; gồm các thao tác
như sau :
-Dán nhãn ghi : tên loại vi sinh vật , ngày cầy vào thành ông nghiệm
-Sử dụng các que cấy đầu tròn thực hiện các thao tác cấy
-Tay tráu cầm 2 ống nghiệm : 1 ống giống , 1 ống môi trường
-Tay phải cầm que cấy và khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn cho đến khi nóng đỏ
kéo nút đậy ra
-Dùng ngón út và ngịn áp út kẹp nút đậy ống nghiệm vào lòng bàn tay xoay
nhẹ , kéo nút đậy ra .
-Rút que cấy ra , không để que cấy chạm vào thành ông nghiệm và đưa vào ống
mơi trường để thực hiện thao tác cấy :
-Hịa giống ở đầu que cấy vào giọt nước ở đáy ống nghiệm
-Nhẹ nhàng lướt que cấy trên mặt thạch theo các kiểu :


+ Hình chữ chi
+Hình vịng xoắn
+Hình vạch ngang song song
-Khử trùng lại phần khơng khí nơi miệng hai ống nghiệm rồi đậy nút bông

-Khử trùng lại que cấy sau khi đã sử dụng xong
*Đối với nấm mốc hoặc các vi sinh vật đa bào sinh bào từ khác , khi cấy
trên ống nghiệm thạch nghiêng, dùng que cấy móc vơ trùng lấy bào tử từ ống
giống . Cấy truyền bảo tử sang ống nghiệm môi trường mới theo hai cách :
-Cấy điểm : cắm ngập đầu que cấy thành 3 điểm cách đều nhau trên mặt thạch.
-Cấy gõ : đưa que cấy có mang bào tử vào ống nghiệm mơi trường , gõ nhẹ
lưng que cấy vào thành ống nghiệm đối diện với mặt thạch để rải bào tử xuống.
b)Cấy trên ống nghiệm thạch đứng
- Phương pháp này dùng để cấy các vi sinh vật kỵ khí .
- Sử dụng que cấy đầu nhọn
- Sau khi lấy giống vi sinh vật , dùng que cấy này đâm sâu vào phần khối thạch
hình trụ
-Đâm sát ống nghiệm và đâm thành ba đường : một đường chính giữa ,
haiđường sát thành ống tùy yêu cầu .
-Đường cấy phải thằng , nhẹ nhằng để không gây nứt , vỡ môi trường
c)cấy truyền trên thạch đĩa
- Dùng que đầu tròn hoặc que trải thủy tinh
-Dùng que cấy đầu tròn lấy vi sinh vật bằng tay phải theo đúng quy cách đã
hướng dẫn ở trên .
-Tay trái cầm hộp petri khẽ hơ nhẹ trên ngọn lửa đẻn cồn . Sau đó để cách đèn
cồn 1 – 2 cm , khẽ mở nghiêng 1 bên hộp ( phần hơ lữa ) , sao cho vửa đủ để đưa que
cấy vào .
-Nhẹ nhàng , nhanh chóng lướt que cấy trên mặt thạch theo mốt trong các kiểu
sau :
+Theo hình zích zắc trên tồn bộ mặt thạch
+ Theo những đường song song
+Theo hình zích zắc 3 hoặc 4 góc
-Khi dùng que trải , hút sẵn một lượng khoảng 0,1 dịch vi sinh vật nhỏ lên trên
bề mặt thạch đĩa . Khử trùng que trãi thủy tinh bằng cách nhúng vào cồn và đốt trên
ngọn lửa . Làm nguội que trải và trải đều giọt vi sinh vật lên khắp bề mặt môi trường

thạch đĩa .
3)Các điều kiện nuôi cấy của vi sinh vật
-Nhiệt độ : phụ thuộc vào từng loại vi sinh vật .Duy trì sự ổn định đó bằng tủ ủ
vi sinh vật
-Độ ẩm : để duy trì độ ẩm , trong q trình ni cần đảm bảo , đủ lượng nước
khi làm môi trường .Trong điểu kiện cần thiết có thể phun nước vơ khuẩn vào phịng
ni hoặc để nước bốc hơi trong tủ ấm .


-Oxy : Đối với sinh vật thiếu khí , cung cáp thường xuyên và đầy đủ oxi . Lớp
môi trường ni cấy có độ đày vừa phải . Các bình chứa mơi trường được lác thường
xun trong q trình ni để được cung cấp thêm oxy cho vi sinh vật . Nếu ni cấy
trong mơi trường có khối lượng lớn phải tiến hành sục khí thường xun hay định kì .
Đối với sinh vật kị khí : Hạn chế sự tiếp xúc với oxi bằng cách đổ lên mặt môi trường
parafin , dầu vaselin hoặc cấy trích sâu vào mơi trường đặc , ni cấy trong bình hút
chân khơng,ni trong ống nghiệm đặc biệt , sau khi rút hết không khí và hàn khí lại ,
đun sơi mơi trường trong một thời gian để loại hết khí oxy , để nguội 45ºC . Dùng
pipette cấy sinh vật vào đáy ống nghiệm . Làm nguội nhanh rồi đổ vaselin lên bề mặt
hạn chế tiếp súc với oxy .
4)Quan sát sinh vật sau khi nuôi cấy Sau khi nuôi cấy một thời gian và nhiệt
độ thích hợp cho mỗi loại sinh vật ta thấy :
-Trong môi trường lỏng : vi khuẩn phát triển sẽ làm đục môi trường
-Trong môi trường đặc ở thạch nghiêng : Nấm men vi khuẩn phát triển sẽ tạo
nên vệt nổi trên mặt thạch trong hay trắng đục . Nấm mốc sẽ tạo lên những sợi mảnh
từ vết cấy .
-Trong môi trường thạch đứng : Các vi khuẩn kị khí phát triển ở đáy của cột
mơi trường .
IV.NHỮNG ĐIỀU CẦN LƯU Ý
-Mơi trường thạch phải có bề mắt khơ , phẳng . Nếu ống mơi trường cịn đọng
nước cần đựng ống mới cấy vào giá ống nghiệm , tránh nước làm hoen vết cấy .

-Khi tiến hành truyền tránh chạm vào đầu que cấy dùng để lấy vi khuẩn vào bất
cứ vật gì
-Nếu vi khuẩn cấy truyền rơi xuống mặt bàn cần lau ngay bằng panh kẹp bông
thấm cồn hoặc nước sát trùng .
-Khi cấy truyền vi khuẩn , dùng tay trái cầm hai ống nghiệm : ống có vi sinh
vật ở xa và ống mơi trường ở gần người thao tác . Trước và sau khi cấy truyền xong
phải hơ que cấy trên ngọn lửa đèn cồn để vơ trùng que cấy .
V.BÁO CÁO THỰC TẬP
1.Trình bày phương pháp cấy truyền vi khuẩn , nấm men , nấm mốc .
Phương pháp cấy:
*Phương pháp của việc cấy truyền:
Cấy truyền là phương pháp lấy vi sinh vật từ ống nghiệm này sang ống nghiệm
khác. Gồm các thao tác:
-Dán nhãn ghi: tên vi sinh vật, ngày cấy
-Tay trái cầm hai ống nghiệm: 1 ống giống, 1 ống môi trường.
-Tay phải cầm phải cầm que cấy và khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn cho đến
khi nóng đỏ dây cấy.
-Dùng ngón út và ngón áp út kẹp nút vào lịng bàn tay rồi xoay nhẹ lấy nút ra.
-Hơ miệng ống nghiệm để khử trùng khơng khí ở miệng ống.
-Đợi khi que cấy nguội, khéo léo đưa que cấy tiếp xúc với vi sinh vật trong ống
nghiệm.


-Khử trùng lại phần khơng khí ở ống nghiệm rồi đậy nút lại.
-Khử trùng lại que cấy sau khi sử dụng.
*Phương pháp cấy trên thạch nghiêng:
-Dãn nhãn: tên vi sinh vật, ngày cấy.
-Sử dụng que cấy đầu tròn thực hiện thao tác cấy.
-Thao tác giống như phương pháp cấy truyền.
-Đợi que cấy nguội rồi khéo léo đưa que cấy tiếp xúc với vi sinh vật trong ống

giống.
-Rút que cấy ra, không để que cấy chạm vào thành ống giống và đưa vào ống
môi trường để thực hiện thao tác cấy.
-Nhẹ nhàng lướt que cấy trên mặt thạch theo kiểu:
+Hình chữ chi
+Hình vịng xoắn
+Hình vạch ngang song song
-Khử trùng lại phần khơng khí nơi miệng hai ống nghiệm rồi đậy nút bông
-Khử trùng lại que cấy sau khi đã sử dụng xong
*Đối với nấm mốc hoặc các vi sinh vật đa bào sinh bào từ khác , khi cấy
trên ống nghiệm thạch nghiêng, dùng que cấy móc vơ trùng lấy bào tử từ ống
giống . Cấy truyền bảo tử sang ống nghiệm môi trường mới theo hai cách :
-Cấy điểm : cắm ngập đầu que cấy thành 3 điểm cách đều nhau trên mặt thạch.
-Cấy gõ : đưa que cấy có mang bào tử vào ống nghiệm môi trường , gõ nhẹ
lưng que cấy vào thành ống nghiệm đối diện với mặt thạch để rải bào tử xuống.
*Cấy trên ống nghiệm thạch đứng
- Phương pháp này dùng để cấy các vi sinh vật kỵ khí .
- Sử dụng que cấy đầu nhọn
- Sau khi lấy giống vi sinh vật , dùng que cấy này đâm sâu vào phần khối thạch
hình trụ
-Đâm sát ống nghiệm và đâm thành ba đường : một đường chính giữa ,
haiđường sát thành ống tùy yêu cầu .
-Đường cấy phải thằng , nhẹ nhằng để không gây nứt , vỡ môi trường
*Cấy truyền trên thạch đĩa
- Dùng que đầu tròn hoặc que trải thủy tinh
-Dùng que cấy đầu tròn lấy vi sinh vật bằng tay phải theo đúng quy cách đã
hướng dẫn ở trên .
-Tay trái cầm hộp petri khẽ hơ nhẹ trên ngọn lửa đẻn cồn . Sau đó để cách đèn
cồn 1 – 2 cm , khẽ mở nghiêng 1 bên hộp ( phần hơ lữa ) , sao cho vửa đủ để đưa que
cấy vào .

-Nhẹ nhàng , nhanh chóng lướt que cấy trên mặt thạch theo mốt trong các kiểu
sau :
+Theo hình zích zắc trên toàn bộ mặt thạch
+ Theo những đường song song


+Theo hình zích zắc 3 hoặc 4 góc
-Khi dùng que trải , hút sẵn một lượng khoảng 0,1 dịch vi sinh vật nhỏ lên trên
bề mặt thạch đĩa . Khử trùng que trãi thủy tinh bằng cách nhúng vào cồn và đốt trên
ngọn lửa . Làm nguội que trải và trải đều giọt vi sinh vật lên khắp bề mặt môi trường
thạch đĩa .
2.Nêu các điều kiện nuôi ủ nấm mem và vi khuẩn sau khi gieo cấy
-Nhiệt độ : phụ thuộc vào từng loại vi sinh vật .Duy trì sự ổn định đó bằng tủ ủ
vi sinh vật.
-Độ ẩm : để duy trì độ ẩm , trong quá trình nuôi cần đảm bảo , đủ lượng nước
khi làm môi trường .Trong điểu kiện cần thiết có thể phun nước vơ khuẩn vào phịng
ni hoặc để nước bốc hơi trong tủ ấm.
-Oxy:
Đối với vi sinh vật hiếu khí:
+Cung cấp thường xuyên và đẩy đủ oxy.
+ Lớp môi trường nuôi cấy có độ dày vừa phải.
+Các bình chứa mơi trường cần được lắc thường xuyên hay định kì.
Đối với vi sinh vật kị khí:
Hạn chế tiếp xúc với oxy bằng cách đổ lên môi trường một lớp parafin, dầu
vaselin... hoặc nuôi cấy trích sâu vào mơi trường đặc.
3.Đĩa petri sau khi cấy vi sinh vật nên đặt úp hay ngửa mặt thạch ? Giải
thích ?
Nên ni úp thạch vì:
-Tránh đỗ vỡ khi sử dụng
-Tránh tình trạng bị nhiễm các vi sinh vật khơng mong muốn.

-Tránh bị nước đọng do q trình hô hấp, do nhiệt độ... rơi vào bề mặt giống
cấy.
4.Khi cấy truyền vi sinh vật trong ống thạch nghiêng , giải thích tại sao
phải ria que cấy được từ đáy ống nghiệm lên phía trên .
Phải ria que cấy ngược từ đáy ống nghiệm lên phía trên vì:
-Nếu ria từ trên xuống sẽ khó thao tác và làm rách thạch.
-Ria từ dưới lên, que cấy sẽ đi theo chiều từ dưới đi lên và ra khỏi ống nghiệm
mà không cần di chuyển qua đường đã cấy, tánh được tình tạng vi sinh vật mọc lan ra
khỏi đường cấy.
-Khi môi trường được chuẩn bị xong sẽ có 1 giọt nước ở đáy ống nghiệm. Khi
thao tác thường dùng que cấy hòa vào giọt nước và bắt đầu ria, như vậy vi sinh vật sẽ
mọc đều ờ đường cấy.



BÀI 4
PHƯƠNG PHÁP QUAN SÁT VI SINH VẬT
BẰNG KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC
I.NGUYÊN TẮC
1. Giới thiệu về kính hiển vi
a)Kính hiển vi nền đen
Ánh sáng thường chiếu từ dưới lên , qua rìa của tụ quang nên đen , chiếu hắt
vào xung quanh tiêu bản , những tia sáng được tiêu bản làm khúc xạ rồi đưa vào vật
kính . Tiêu bản được soi sáng rực trên nền đen , giống như trong phịng tối có 1 tia
sáng mạnh chiếu vào , giúp thấy rõ từng hạt bụi trong không khí bị tia sáng chiếu vào .
Chức năng : quan sát hình thái và đặc tính của một số vi khuẩn mà kính hiển vi
thường khó quan sát.
b)Kính hiển vi đổi pha
Ánh sáng thường bị đổi pha và biên độ dao động bởi cấu trúc đặc biệt của tụ
quang kính , vật kính và thị kính . Chức năng : dùng quan sát rõ nét các cấu trúc nhỏ

như tiêu mao , các lớp màng .
c)Kính hiển vi huỳnh quang
Chùm tia tử ngoại chiếu vào tiêu bản đã nhuộm màu bằng các chất huỳnh
quang .Trong tế bào , các cấu trúc khác nhau sẽ phát quang với các màu sắc khác
nhau: Chức năng : Quan sát và phân biệt các cấu trúc khác nhau trong tế bào vi sinh
vật .
d)Kính hiển vi điện tử
Trùm tia điện tử bước sóng rất ngắn ,năng suất phân ly rất lớn nên độ phân giải
cao , giúp phân biệt hai điểm rất gần nhau . Chức năng : dùng quan sát virut , cấu trúc
phân tử của tế bào .
đ)Kính hiển vi quang học
Dùng ánh sáng có bước sóng từ 500nm – 560nm trong trùm ánh sáng thường
để tạo năng suất phân ly lớn giúp phân biệt hai điểm cách nhau khoảng 0.2µm trở lên .
Hệ thống phóng to của kính hiển vi quang học gồm 2 bộ phận .
Vật kính ( quay về phía vật quan sát ) và thị kính ( Quay về phía mắt nhìn ) .
Mỗi bộ phận này là một hệ thống thấu kính hội tụ phức tạp , mẫu vật cần quan sát AB


được đặt trước vật kính một khoảng cách lớn hơn tiêu cự của vật kín một chút . Ảnh
thật đảo ngược A’B’ của vật sẽ thu được ở bên kia vật kính , nằm trong khoảng tiêu cự
của thị kính . Thị kính hoạt động như một kính lúp . Qua thị kính , người ta sẽ thấy
ảnh ảo A’’B’’ được phóng to lên của ảnh thật A’B’.
Chức năng của kính hiển vi quang học dùng để quan sát tế bào vi sinh vật , ký
sinh trùng , tế bào động vật , thực vật .
2.Cấu tạo và nguyên tắc hoạt động của kính hiển vi quang học
a)Cấu tạo
Kính hiển vi quang học được cấu tạo làm 2 phần :
-Hệ thống cơ học : giá kính gồm chân kính , thanh kính , trụ đỡ và xoay thị
kính , ổ gắn và xoay vật kính , bàn kính ,thanh trượt ,di chuyển tiêu bản , ốc di chuyển
thanh trượt , kẹp giữ tiêu bản , ốc di chuyển trụ quang kính , ốc điều chỉnh sơ thơ cấp ,

ốc điều chỉnh thứ cấp ( vi cấp ).
-Hệ thống quang học gồm : thị kính , vật kính , tụ quang kính nàm chắn sáng ,
nguồn chiếu sáng ( đẻn điện chiếu sáng và / hoặc kính chiếu sáng ) . Ngồi ra , ở kính
dùng nguồn chiếu sáng là đèn điện thì có thêm bộ phân cung cấp điện như pich cắm ,
dây điện , cầu chì , mạch điện ( trong chân kính ) và nút điều chình cường độ chiếu
sáng .
b)Nguyên tắc hoạt động của kính hiển vi quang học
Vật kính là hệ thống quang học phức tạp gồm một số thấu kính , trực tiếp
phóng đại mẫu vật . Các thấu kính sắp xếp theo thứ tự , thấu kính nhỏ ngồi cùng và
hướng vào tiêu bản , có độ phóng đại lớn nhất . Độ phóng đại của kính phụ thuộc vào
tiêu cự , tức bán kính cong của thấu kính . Thấu kính càng cong , tiêu cụ càng ngắn ,
thì độ phóng đại càng lớn .
Có hai loại vật kính
+ Vật kính khơ có độ phóng đại nhỏ như x4 , x10,x15 , x40
+Vật kính đầu có độ phóng đại lớn như x90 , x100
-Thị kính cũng có cấu tạo phức tạp , gồm hai thấu kính , một hướng về mắt
người xem , một hướng về vật kính . Thị kính phóng đại một lần nữa ảnh do vật kính
thu vào , làm to lên , xem rõ hơn .
Độ phóng đại của kính = độ phóng đại của vật kính x độ phóng đại của thị
kính.
Ví dụ : độ phóng đại của vật kính : x100 , độ phóng đại của thị kính : x10.
Như vậy :độ phóng đại của kính : 100x10 = 1000 lần
Năng suất phân li của kính quan trọng hơn độ phóng đại , và là tiêu chuẩn để
chọn kính hiển vi . Năng suất phân ly ( độ phân giải ) của kính hiển vi là đại lượng
cho biết khả năng phân biệt hai điểm của vật quan sát nằm sát nhau. Nếu khoảng cách
giữa hai điểm nằm càng sát nhau mà vẫn có thể phân biệt được thì năng suất phân ly
của kính càng cao .
Khoảng cách này phụ thuộc chiều dài sóng ánh sáng sử dụng và số lượn tia
sáng đi vào vật kính ,được biểu hiện bằng công thức .

Trong đó :ƛ là độ dài bước sóng phát ra từ mẫu vật .
n chỉ số chiệt quang của môi trường giữa mẫu vật và vật kín
α : nửa góc mở của vật kín
2nsinα : trị số mở của vật kín
-Qua đó , ta thấy muốn có độ phân ly cao phải dùng ánh sáng có bước sóng thật
ngắn , hoặc dùng vật kính có trị số lớn . Nếu dùng vật kính có trị số mở 0,65 và so với
ánh sáng trắng ( có bước sóng trung bình α = 0,55µm ) thì khoảng cách nhỏ nhất có
thể nhìn thấy rõ được là :
Bảng 4.1 .Thông số của vật kính và thị kính
Kí hiệu ghi
Độ phóng đại Độ mở Khoảng cách từ vật
trên vật kính
của vật kính
kính đến tiêu bản
(mm)

Đường kính thị
trường khi quan
sát bằng thị kính
(mm)

Vật kính khơ
8x0.20
8
0.20
8.91
1.75
10x0.25
10

0.25
6.80
40x0.65
40
0.65
0.60
0.35
Vật kính dầu
90x1.25
90
1.25
0.15
0.15
100x1.25
100
1.25
0.12
Triết suất ánh sáng của khơng khí nhỏ hơn thủy tinh , nên tia sáng khi đưa qua
tiêu bản thủy tính sẽ bị khúc xạ một phần . Phần phía ngồi tia sáng do bị khúc xạ nên
khơng đi vào được vật kính . Vật kính có độ phóng đại lớn thì đường kính của thấu
kính càng nhỏ , lượng tia sáng đi vào được vật kính rất ít , nên ko thấy rõ ảnh . Để hạn
chế nhược điểm này ta dùng đầu soi có chiết suất ánh sáng gần bằng thủy tinh . Thủy
tinh và đầu soi được xem như một môi trường đồng nhất . Ánh sáng đi qua không bị
khúc xạ nên tập chung đầy đủ vào vật kính , giúp xem rõ ảnh .
II.DỤNG CỤ , MƠI TRƯỜNG VÀ HĨA CHẤT
1.Dụng cụ
STT
1
2
3

4
5
6
7
8

Tên dụng cụ thiết bị mỗi
nhóm ( 3 thành viên )
Gía ơng nghiệm
Ống nghiệm Φ18
Cốc 100ml
Đèn cồn
Que Cấy
Bình tia
Lame ( Phiến kính )
Lamelle ( lá kính )

Đơn vị tính

Số lượng

Cái
Cái
Cái
Cái
Cái
Cái
Tấm
Tấm

1
1
3
1
1
1
5
5


9
10

Phiến kính lõm
Tấm
1
Kính hiển vi
Cái
1
Dụng cụ dùng chung
11
Nồi hấp cao áp
Cái
1
12
Tủ cấy vơ trùng
Cái
1
2.Hóa chất
-Cồn 96º

-Dịch xà phịng lỗng
-Dung dịch xylen
3.Chủng giống vi sinh vật dùng quan sát
-Nấm mốc : aspergillus niger , aspergillus oryzea
-Nấm mem : Saccharomyces cerevisiae , Saccharomyces vini
-Vi khuẩn : Escherichia coli , Bacillus subtilis
4.Nguyên liệu khác
-Giấy lọc
-Bơng khơng thấm
-Bơng thấm nước
III.TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM
1.Làm tiêu bản sinh vật sống
a)Làm tiêu bản giọt ép
-Dùng que cấy hoặc ống hút chuyển giống vi sinh vật từ ống nghiệm ni cấy
lên tấm phiến kính . Nếu vi sinh vật được nuôi trên môi trường thạch , khi làm tiêu
bản , nhỏ sẳn một giọt nước muối sinh lý lên phiến kính , sau đó hịa sinh khối vi sinh
vật vào giọt nước muối này .
-Đặt là kính lên giọt canh trường thật nhẹ nhàng tránh không tạo thành bọt khí
giữa hai tấm kính . Muốn vậy để một lớp là kính tiếp xúc với phiến kính rồi từ từ hạ là
kính xuống .
-Đưa tiêu bản lên quan sát trên kính hiển vi ở vật kính x10 rồi x40
Chú ý :
-Nếu giọt dịch nhiều quá , tràn ra phần ngồi tiếp xúc của phiến kính và là kính
ta dùng giấy thấm bớt nước đi .
-Nếu cần quan sát tiêu bản lâu thì dùng vazolin bơi quanh mép là kính để giọt
dịch khỏi bị khô
b)Làm tiêu bản giọt treo
Loại tiêu bản này dùng để theo dõi sự sinh sản , sự hình thành bào tử , khả nẳng
di động và phản ứng của tế bào vi sinh vật với các loại kích thích .
-Dùng phiến kính đặc biệt có phần lõm hình trịn ở giữa

-Bơi vazolin quanh phần lõm của phiến kính
-Cho 1 giọt canh trường lên giữa là kính
-Thận trọng xoay ngược là kính cho giọt canh trường xuống phía dưới rồi đặt
lên phần lõm của phiến kính