Nghiên cứu đặc điểm hệ gen ty thể và đơn vị mã hóa ribosome của một số loài sán lá ruột thuộc họ heterophyidae ký sinh gây bệnh trên người và động vật tại việt nam TT

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LÊ THỊ VIỆT HÀ

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HỆ GEN TY THỂ VÀ ĐƠN VỊ
MÃ HÓA RIBOSOME CỦA MỘT SỚ LỒI SÁN LÁ RUỘT
THUỘC HỌ HETEROPHYIDAE KÝ SINH GÂY BỆNH TRÊN
NGƯỜI VÀ ĐỘNG VẬT TẠI VIỆT NAM

Chuyên ngành: Hóa sinh học
Mã số: 9 42 01 16

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2021


Cơng trình được hồn thành tại Viện Cơng nghệ sinh học,
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học:

1. GS.TS. Lê Thanh Hịa
Viện Cơng nghệ sinh học
2. PGS.TS. Đồng Văn Quyền
Viện Công nghệ sinh học

Phản biện 1: PGS.TS. Kim Văn Vạn
Học viện Nông nghiệp Việt Nam
Phản biện 2: PGS.TS. Lê Trần Anh

Học viện Quân Y
Phản biện 3: PGS.TS. Nguyễn Quang Huy
Trường Đại học KHTN Hà Nội
Luận án được bảo vệ tại Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ Phiên
chính thức tại Viện Cơng nghệ sinh học, 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu
Giấy, Hà Nội
Vào hồi …….. giờ, ngày ….. tháng ….. năm ………

Có thể tìm hiểu luận án tại:
1. Thư viện Quốc gia Việt Nam
2. Thư viện Viện Công nghệ sinh học


1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Sán lá ruột nhỏ (SLRN) họ Heterophyidae lây nhiễm sang người thông
qua cá (do ăn cá chưa nấu chín) và co ít nhất 29 loài thuộc 13 chi (genus) phân bô
khắp thế giới. Khoảng hơn 7 triệu người bị nhiễm bệnh SLRN (heterophyidiasis),
hầu hết sông ở các nước Châu Á, bao gồm Hàn Quôc, Trung Quôc, Đài Loan, Việt
Nam, Lào, Thái Lan, Malaysia, Indonesia, Philippin và Ấn Độ. Thực tế báo cáo
còn chưa đầy đủ về tình hình nhiễm và phòng chơng SLRN do chẩn đốn và phát
hiện còn thiếu và sô liệu từ nhiều quôc gia còn chưa chính xác. Một sô dạng sinh
trưởng của chúng (trứng), ấu trùng lông (redia), ấu trùng đuôi (cercariae) và ấu
trùng nang (metacercariae) co hình thái giơng các lồi khác. Mặc dù vậy, hơn 100
năm qua, các loài SLRN cơ bản đã được xếp vào các chi riêng biệt tương ứng trên
cơ sở phân loại hình thái học (HTH), co bổ sung kết hợp dữ liệu sinh học phân tư
(SHPT).
Chỉ thị phân tư (molecular genetic marker) và các công nghệ thao tác và
công cụ phân tích phân tư đã gop phần to lớn trong nghiên cứu ứng dụng. Nguồn

cung cấp chỉ thị phân tư là trình tự DNA và amino acid suy diễn (nếu co) của hệ
gen ty thể (mitochondrial genome, mtDNA) và hệ gen nhân (nuclear genome,
nDNA), trước hết là đơn vị mã hoa ribosome (rTU). Trình tự mtDNA cần thiết cho
sư dụng bao gồm toàn bộ hệ gen, một sơ gen hay tồn bộ sơ gen mã hoa protein
(protein coding gene, PCG) và các gen RNA ribosome ty thể (mitoribosomal gene,
MRG). Dữ liệu trình tự DNA của đơn vị mã hoa ribosome (ribosomal transcription
unit, rTU), cũng được khai thác sư dụng. Nhu cầu ứng dụng SHPT làm sáng tỏ
điều kiện và vị trí phân loại, môi quan hệ về loài/chi/họ/liên họ và liên họ/phân bộ
là rất lớn. Đôi với SLRN, co thêm các nghiên cứu phân loại học dựa trên phân tích
các chỉ thị phân tư của họ Heterophyidae và liên họ Opisthorchioidea/phân bộ
Opisthorchiata là cần thiết để cơng nhận chính xác danh pháp mỡi lồi/chi/họ. Đo
cũng là dữ liệu khai thác tạo cơ sở cho các chương trình phòng chơng và kiểm sốt
các do sán lá ruột nhỏ qua thức ăn/cá truyền lây hoặc tái xuất hiện trên thế giới.
Xuất phát từ nhu cầu và yêu cầu thực tế, nhằm bổ sung dữ liệu mtDNA và
rTU của một sơ lồi SLRN lưu hành tại Việt Nam, chúng tôi tiến hành đề tài:


2
“Nghiên cứu đặc điểm hệ gen ty thể và đơn vị mã hóa ribosome của một số lồi
sán lá ruột thuộc họ Heterophyidae ký sinh gây bệnh trên người và động vật tại
Việt Nam”.
2. Tính cấp thiết của luận án
Cho đến nay dữ liệu mtDNA và rTU hoàn chỉnh và gần hoàn chỉnh của
lớp Sán lá (class Trematoda) chưa bao phủ hết tất cả các chi và các họ, kể cả họ
Heterophyidae. Do vậy, giải trình, phân tích và khai thác dữ liệu mtDNA và rTU
của sán lá noi chung và của SLRN noi riêng, trong đo co các loài ở họ
Heterophyidae đang được đẩy mạnh trong những năm gần đây. Thực tế, cho đến
khi đề tài này tiến hành, họ Heterophyidae chỉ mới co 2 mtDNA hoàn chỉnh được
thu nhận và phân tích. Trong đề tài này chúng tôi chọn SLRN loài Haplorchis
taichui Nishigori, 1924 (mẫu Việt Nam) để nghiên cứu gen học hệ gen ty thể và

đơn vị mã hoa ribosome. Ngoài ra, loài Haplorchis pumilio Looss, 1899, cũng
được chọn để nghiên cứu rTU và một sô SLRN khác họ Heterophyidae phục vụ
một sô chỉ tiêu nghiên cứu của đề tài. Các chỉ thị toàn phần và một phần mtDNA
và rTU của các loài SLRN họ Heterophyidae là những dữ liệu gen học lần đầu tiên
được công bô từ kết quả nghiên cứu của đề tài, do vậy, đây là dữ liệu rất co giá trị
cho các nghiên cứu và ứng dụng tiếp theo.
3. Mục tiêu nghiên cứu
“Thu được toàn bộ hệ gen ty thể và đơn vị mã hóa ribosome của một sớ lồi sán lá
ruột nhỏ họ Heterophyidae tại Việt Nam, phân tích đặc điểm của các gen và hệ gen
nhằm phục vụ nghiên cứu dịch tễ học phân tử và ứng dụng trong chẩn đoán phân
loại ”.
4. Nội dung nghiên cứu
Nghiên cứu này tập trung giải quyết hai nội dung chính sau:
1. Nghiên cứu giải trình tự hệ gen ty thể loài sán lá ruột nhỏ Haplorchis
taichui, phân tích đặc điểm gen và xây dựng phả hệ.
2. Nghiên cứu giải trình tự đơn vị mã hóa ribosome của một sớ lồi sán lá
ruột nhỏ (Haplorchis taichui, Haplorchis pumilio), phân tích đặc điểm gen và xây
dựng phả hệ.
5. Những đóng góp mới của luận án
+ Đã giải trình tự toàn bộ hệ gen ty thể của loài SLRN Haplorchis taichui,


3
xác định cấu trúc và sắp xếp gen/hệ gen ty thể của SLRN H. taichui; và đã phân
tích đầy đủ đặc điểm gen và cấu trúc bậc hai của MRG (12S và 16S), các gen
tRNA và vùng không mã hoa của mtDNA của H. taichui.
+ Đã phân tích phương thức sư dụng nucleotide, giá trị “độ lệch”
(“skew”) trong mtDNA, đặc điểm gen và sự “thiên vị” sư dụng bộ mã của PCG và
khoảng cách di truyền giữa H. taichui và các loài sán lá khác ở họ Heterophyidae
và họ Opisthorchiidae dựa trên cộng hợp amino acid của ba PCG (cob+nad1+cox1)

và 12 PCG; và đã phân tích môi quan hệ về lồi và xây dựng thành cơng phả hệ
SLRN dựa trên chuỗi amino acid cộng hợp của ba PCG (cob+nad1+cox1) và của
12 PCG.
+ Đã giải trình tự toàn bộ phần mã hoa ribosome của loài SLRN
Haplorchis taichui và H. pumilio, xác định cấu trúc rTU và sắp xếp gen/vùng giao
gen; đã phân tích đầy đủ đặc điểm gen và cấu trúc bậc hai của các gen 5.8S, 18S,
28S rRNA, vùng giao gen ITS-1 và ITS-2 của rTU của Haplorchis taichui và H.
pumilio.
+ Đã phân tích phương thức sư dụng nucleotide, giá trị “độ lệch”
(“skew”) trong rTU, khoảng cách di truyền và mức độ tương đồng của gen 18S,
28S, 18S+28S rRNA và phần mã hoa rTU giữa H. taichui và các loài SLRN khác ở
họ Heterophyidae dựa trên các gen rRNA và rTU; và đã phân tích mơi quan hệ về
lồi và xây dựng thành công phả hệ H. taichui và H. pumilio dựa trên một gen 28S
rRNA và cộng hợp hai gen 18S+28S rRNA toàn phần.
Bên cạnh đo, cơ sở dữ liệu mtDNA của SLRN H. taichui thu thập tại Việt
Nam (chủng QT3) được so sánh với H. taichui (mẫu của Lào) và lồi M.
yokogawai (mẫu Hàn Qc) về các đặc điểm gen/hệ gen và phả hệ. Tương tự, cơ
sở dữ liệu rTU của H. taichui và H. pumilio thu thập tại Việt Nam cũng được so
sánh với các loài cùng họ Heterophyidae, Cryptocotyle lingua (Nga) và Euryhelmis
costaricensis (Nhật Bản), về các đặc điểm gen/vùng giao gen, cấu trúc bậc hai,
tương đồng và phả hệ.
Luận án đã giải quyết thành công nghiên cứu gen học mtDNA của H. taichui
và rTU của H. taichui và H. pumilio, gop phần cung cấp cơ sở dữ liệu gen, đặc


4
điểm gen/hệ gen cần thiết cho nghiên cứu tiến hoa, phả hệ, nguồn gơc và làm sáng
tỏ danh pháp, lồi, họ để co cơ sở đề xuất phương thức phòng chông bệnh KST.
6. Bố cục của luận án
Luận án gồm 149 trang, phần Mở đầu (2 trang), phần Kết luận và Kiến

nghị (2 trang), phần Danh sách công bô (1 trang), phần Tom tắt luận án bằng tiếng
Anh (8 trang) và phần Tài liệu tham khảo (20 trang). Ngoài phần Lời cảm ơn; Lời
cam kết; Mục lục; Danh mục các chữ viết tắt; Danh mục các bảng; Danh mục các
hình; Luận án bao gồm 4 chương: Chương 1: Tổng quan tài liệu (40 trang);
Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (15 trang); Chương 3: Kết quả
nghiên cứu (39 trang); Chương 4: Bàn luận kết quả (22 trang). Luận án gồm 11
Bảng chính; 29 Hình chính; 7 Bảng phụ lục; 5 Hình phụ lục. Luận án co 178 tài
liệu tham khảo (14 tài liệu tiếng Việt và 164 tài liệu tiếng Anh).
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình nghiên cứu sán lá ruột nhỏ họ Heterophyidae
Phân loại sán lá ruột nhỏ họ Heterophyidae
Sán lá ruột nhỏ họ Heterophyidae lây nhiễm sang người thông qua thực
phẩm (cá chưa nấu chín), ít nhất co 29 loài thuộc 13 chi (genus) phân bô khắp thế
giới, khoảng hơn 7 triệu người bị nhiễm bệnh, đo cũng là bệnh động vật lây sang
người (ĐVLSN) do các loài trong họ này gây ra. Theo Chai, Jung (2017), SLRN
họ Heterophyidae gồm các loài thuộc chi Haplorchis (H. taichui, H. pumilio, H.
yokogawai, và H. vanissimus), chi Metagonimus (M. yokogawai, M. takahashii, M.
miyatai, M. minutus và M. katsuradai), chi Stellantchasmus (S. falcatus), chi
Centrocestus (C. formosanus, C. armatus, C. cuspidatus và C. kurokawai), chi
Heterophyes (H. heterophyes, H. nocens, H. dispar và H. aequalis), chi
Pygidiopsis (P. summa và P. genata), chi Heterophyopsis (H. continua), Stictodora
(S. fuscata và S. lari), chi Procerovum (P. varium và P. calderoni), chi
Acanthotrema (A. felis), chi Apophallus (A. donicus), chi Ascocotyle (A. longa) và
chi Cryptocotyle (C. lingua).
Theo Dòng phân loại (Lineage), như sau: cellular organisms; Eukaryota;
Opisthokonta;

Metazoa;

Eumetazoa;

Bilateria;

Protostomia;

Spiralia;


5
Lophotrochozoa;
Opisthorchiata;

Platyhelminthes;
Heterophyidae;

Trematoda;

(Centrocestus;

Digenea;

Opisthorchiida;

Haplorchis;

Metagonimus;

Procerovum; Stellantchasmus).
Theo Hệ thông thông tin phân loại tích hợp (ITIS, Integrated Taxonomic
Information System)/ cấp bậc phân loại:

+ Thuộc Ngành (Phylum): Sán dẹt (Platyhelminthes Minot, 1876); Dưới
Ngành (Subphylum): Neodermata.
+ Thuộc Lớp (Class): Sán lá (Trematoda, Rudolphi, 1808); Dưới Lớp
(Subclass): Digenea, Carus, 1863.
+ Thuộc Bộ (Order): Opisthorchiida/(Plagiochiida); Phân Bộ (Suborder):
Opisthorchiata La Rue 1957.
+ Thuộc Liên Họ (Superfamily): Opisthorchioidea Looss, 1899.
+ Thuộc Họ (Family): Heterophyidae Leiper, 1909.
- Thuộc Chi (Genus): Haplorchis Looss, 1899.
Loài (Species): Haplorchis taichui Nishigori, 1924.
Loài (Species): Haplorchis pumilio Looss, 1896.
Loài (Species): Haplorchis yokogawai Katsuta, 1932.
- Thuộc Chi (Genus): Stellantchasmus Looss, 1899.
Loài (Species): Stellantchasmus falcatus Onji et Nishio, 1916.
- Thuộc Chi (Genus): Metagonimus Katsurada, 1912.
Loài (Species): Metagonimus yokogawai Katsurada, 1912.
Các lồi được chọn làm đơi tượng chủ ́u trong nghiên cứu của đề tài
này là Haplorchis taichui Nishigori, 1924; Haplorchis pumilio Looss, 1896.
Nghiên cứu và phân bố sán lá ruột nhỏ
Sán lá ruột nhỏ truyền qua cá rất phổ biến trên thế giới, tập trung ở các nước
châu Á. Haplorchis taichui và H. pumilio phân bô xuyên suôt Đông Á, Đông Nam
Á sang Tây Á và Bắc Phi, bao gồm Thái Lan, Lào, Campuchia, Việt Nam, Nam
Trung Quôc, Đài Loan, Philippin, Hawaii, Ai Cập, Palestine, Iraq, Ấn Độ, Sri
Lanka, Bangladesh và Malaysia. Hai mươi tám loài sán lá ruột nhỏ (15 lồi phở


6
biến và 14 lồi ít phở biến) gây nhiễm từ cá truyền sang người, nguồn nhiễm và
phân bô địa lý đã được ghi nhận (Hình 1.4).
Ở Việt Nam, nhiều loài SLRN thuộc họ Heterophyidae ký sinh chủ yếu trên

động vật và người được điều tra và xác định bằng HTH và SHPT ở 20 tỉnh/thành,
trong đo co 16 tỉnh phía Bắc, 2 tỉnh miền Trung và 2 tỉnh phía Nam. Tuy nhiên
điều tra SLRN còn chưa phủ khắp cả nước, tổng kết sô liệu còn chưa hợp lý, do
được thực hiện thường xuyên hơn ở phía Bắc so với miền Trung và phía Nam. Mặc
dù vậy, những sô liệu thu thập được và xác minh lồi đã giúp cho cơng tác phòng
chông hiệu quả và thiết thực hơn. Mẫu SLRN họ Heterophyidae của nghiên cứu
này đã được thẩm định bằng SHPT sư dụng chỉ thị ITS-2 và 18S, 28S ribosome; và
ty thể (cox1, nad1, cob…) so sánh thành phần chuỗi gen, khoảng cách di trùn,
phả hệ, nguồn gơc các lồi H. pumilio, H. taichui của Việt Nam và quôc tế.

Hình 1.4. Phân bơ tồn cầu của SLRN Haplorchis spp. (H. taichui, H. pumilio và
H. yokogawai) dựa trên sự hiện diện của vòng đời của chúng được mô tả (Nguồn:
Chai, 2019).
1.2. Đặc điểm hệ gen ty thể và đơn vị mã hóa ribosome và ứng dụng
Đặc điểm hệ gen ty thể
Hệ gen ty thể ở động vật, kể cả KST đa bào, là một vòng DNA khép kín,
co độ dài khoảng 13–25 nghìn nucleotide, chứa 12–13 gen PCG, gồm phức hợp
cytochrome oxidase subunit 1–3 (cox1; cox2; cox3); phức hợp enzyme
nicotinamide dehydrogenase subunit 1–6 (nad1; nad2; nad3; nad4; nad4L, nad5;
nad6); gen cytochrome b (cob hay cytB) và gen adenosine triphosphate synthase Fo


7
subunit 6 (atp6). Ở KST khơng co gen atp8. Ngồi ra còn co 2 gen RNA ribosome
ty thể (MRG), 22 gen tRNA vận chuyển và một vùng không mã hoa (NCR), dài
ngắn khác nhau. Ty thể tồn tại hàng trăm đến hàng nghìn bản sao trong một tế bào,
ở thể đơn bội, di truyền dòng mẹ, không tái tổ hợp, mtDNA co tỷ lệ biến đổi
nucleotide cao và bền với thời gian.
Các gen PCG ở sán dẹt (Ngành Platyhelminthes) sư dụng bộ mã ATG,
GTG và TAA, TAG làm khởi đầu và kết thúc gen; và được dịch mã bằng bộ mã di

truyền ty thể riêng của sán lá (bảng sô 9, GenBank), co tên gọi là “Echinoderm
Mitochondrial Genetic Code”. Thành phần nucleotide sư dụng thiên về A+T và các
bộ mã thiên về nhiều nhất (Phe, Leu) và ít nhất (Gln, Arg), tùy loài. mtDNA co 2
MRG là rrnL (hay 16S rRNA) và rrnS (hay 12S rRNA); 22 tRNA vận chuyển co
cấu trúc bậc hai gấp khúc, dạng giông “lá sồi” (clover leaf), chia làm 4 cánh tay
(arm): AA arm (cánh tay tiếp nhận amino acid); DHU-arm (cánh tay
dihydrouridine (DHU)); TC-arm (cánh tay TC); và AC-arm (cánh tay “đôi
mã”/anticodon). Ở sán dẹt, DHU-arm co khi bị khuyết ở tRNA Ser hoặc/và tRNALeu.
Vùng không mã hoa, NCR (hay D-loop; control region) không chứa gen, thường
co các chuỗi lặp (các cấu trúc) liền kề gọi là TRU, từ một vài đến trên một chục
đơn vị, dài ngắn khác nhau (60 bp – 319 bp ở sán lá).
Đặc điểm đơn vị mã hóa ribosome
Đơn vị mã hoa ribosome (rTU) sắp xếp nôi tiếp thành dãy; mỗi đơn vị dài
khoảng 7–10 kb, khung đặc trưng là: 5’-18S-ITS1-5.8S-ITS2-28S-IGS(ETS)-3’,
chứa 3 gen rRNA mã hoa ribosome (18S, 5.8S và 28S rRNA), 2 vùng giao gen, lần
lượt là ITS-1 và ITS-2 và vùng bản lề (IGS) nôi các rTU với nhau. Các gen rRNA
và ITS đều co cấu trúc bậc hai gồm nhiều nhánh “kẹp toc” (hairpin) và “vòm”
(loop) khá phức tạp. Chuỗi gen 18S rRNA và 28S rRNA bảo tồn cao giữa các lồi,
nhưng một sơ vùng/miền (domain) ở 28S rRNA được ký hiệu là D1–D12, co mức
độ sai khác lớn, trong đo trước đây chuỗi D1–D3 (khoảng 1,1–1,2 kb), ngày nay xu
hướng toàn bộ (3,8–3,9 kb) và cộng hợp 18S+28S rRNA (khoảng 5,8–5,9 kb) là
đôi tượng khai thác đa dạng khi so sánh phân tích phả hệ và quan hệ về loài ở sán
lá.
Ứng dụng mtDNA và rTU
Bất kỳ gen nào hay toàn bộ mtDNA hay rTU đều được sư dụng trong nghiên
cứu chẩn đoán, di truyền, dịch tễ, phân tích phân loại, quan hệ tiến hoa, phả hệ,


8
truy x́t nguồn gơc lồi. Các chỉ thị mtDNA sư dụng được trích xuất từ cob, cox1,

nad1, nad3, atp6; 12S và 16S rRNA. Các chỉ thị rTU thường sư dụng là một phần
hay toàn phần gen 18S và 28S ribosome. Vùng giao gen ITS-1 và ITS-2 cũng được
tận dụng cho phân loại, chẩn đoán và di truyền quần thể, tuy nhiên cần chú ý các
cấu trúc lặp trong ITS co thể cản trở độ chính xác so sánh loài. Phân tích phả hệ và
quan hệ lồi tơt nhất là tồn bộ amino acid cộng hợp của nhiều gen ( 2–3 gen) hay
toàn bộ 12 PCG của mtDNA hoặc/và toàn bộ chuỗi 18S, 28S hoặc cộng hợp
18S+28S rRNA của rTU đôi với các loài/họ/lớp sán dẹt và sán lá.
1.3. Ý nghĩa và sự cần thiết nghiên cứu đặc điểm mtDNA và rTU của sán lá
ruột nhỏ
Hệ gen ty thể và rTU gần hoàn chỉnh và hoàn chỉnh của hàng chục loài sán
lá đã được thu nhận và phân tích đầy đủ, cung cấp nguồn dữ liệu đa dụng. Tuy
nhiên, cơ sở dữ liệu mtDNA và rTU vẫn còn thiếu rất nhiều nghiên cứu đặc điểm
gen/hệ gen, quan hệ loài/họ và phả hệ đơi với các lồi SLRN ở họ Heterophyidae,
đơi tượng trực tiếp của nghiên cứu này.
Do đo, nghiên cứu này tập trung giải quyết 2 vấn đề chính:
+ Giải trình tự toàn bộ mtDNA của loài SLRN Haplorchis taichui của Việt
Nam; sư dụng phương pháp tin-sinh học phân tích đặc điểm gen/hệ gen, khẳng
định vị trí phân loại, phả hệ và di truyền quần thể của các loài H. taichui trong họ
Heterophyidae ở nghiên cứu này.
+ Giải trình tự toàn bộ rTU của các loài SLRN H. taichui và H. pumilio
(Việt Nam), phân tích đặc điểm gen/vùng giao gen, ứng dụng chỉ thị gen 18S/28S
rRNA ribosome để nghiên cứu phả hệ và phân loại các loài họ Heterophyidae trong
lớp Sán lá thuộc ngành Sán dẹt
CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Được phân chia và liệt kê trong các mục sau:
2.1. Đối tượng, vật liệu, địa điểm nghiên cứu
+ Đôi tượng và vật liệu nghiên cứu: SLRN H. taichui và H. pumilio.
+ Mẫu nghiên cứu của các loài thuộc họ Heterophyidae: Xác định bằng HTH và
SHPT sư dụng 2–5 chỉ thị phân tư co từ mtDNA và rTU.
+ Địa điểm và thời gian nghiên cứu: Thực hiện tại Viện Công nghệ sinh học (Viện

HL KH và CN Việt Nam). Thời gian: 2014–2019.


9
2.2. Các phương pháp nghiên cứu
Các phương pháp nghiên cứu SHPT chung được mô tả ở phần Phụ lục,
chúng tôi chỉ giới thiệu những phương pháp xư lý phân tích sô liệu.
Phương pháp nghiên cứu hệ gen ty thể (mtDNA)
+ Phương pháp xác định cấu trúc và sắp xếp hệ gen ty thể
+ Phương pháp phân tích đặc điểm gen RNA ribosome (MRG) ty thể
+ Phương pháp phân tích đặc điểm gen RNA vận chuyển (tRNA) ty thể
+ Phương pháp xư lý phân tích vùng không mã hoa ở hệ gen ty thể
+ Phân tích phương thức sư dụng nucleotide và tính toán giá trị độ lệch
(skew/skewness)
+ Phân tích đặc điểm gen mã hoa protein và sự “thiên vị” sư dụng bộ mã
+ Phương pháp tính toán khoảng cách di truyền dựa trên cộng hợp 3 PCG
(cob+nad1+cox1) và cộng hợp 12 PCG
+ Phương pháp phân tích phả hệ dựa trên chuỗi amino acid cộng hợp của 3 PCG
(cob+nad1+cox1) và 12 PCG
2.3. Phương pháp nghiên cứu đơn vị mã hóa ribosome (rTU)
+ Phương pháp xác định cấu trúc và sắp xếp đơn vị mã hoa ribosome
+ Phương pháp xác định độ dài và đặc điểm gen rRNA và vùng giao gen ở đơn vị
mã hoa ribosome
+ Phương pháp phân tích phương thức sư dụng nucleotide trong đơn vị mã hoa
ribosome
+ Phương pháp phân tích tương đồng nucleotide của các gen rRNA và phần mã
hoa ribosome của sán lá ruột nhỏ họ Heterophyidae
+ Phương pháp phân tích đặc điểm cấu trúc bậc hai gen rRNA (5.8S, 18S, 28S
rRNA) và ITS (ITS-1 và ITS-2)
+ Phương pháp phân tích phả hệ của H. taichui và H. pumilio dựa trên chuỗi gen

28S rRNA và cộng hợp (18S+28S rRNA) toàn phần
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Kết quả nghiên cứu hệ gen ty thể loài Haplorchis taichui mẫu Việt Nam
3.1.1. Cấu trúc và sắp xếp mtDNA của sán lá ruột nhỏ Haplorchis taichui
Toàn bộ mtDNA hoàn chỉnh của H. taichui mẫu Việt Nam (Htai-QT3-VN) co
độ dài 15.120 bp; 11 bp ngắn hơn so với chủng của Lào (15.131 bp). Cấu trúc vòng


10
mtDNA khép kín của H. taichui chứa 36 gen, gồm 12 gen PCG, 2 gen MRG, 22
gen tRNA và một vùng NCR, sô GenBank: MG972809. Mở vòng tại cox3, cấu trúc
như sau: 5’-cox3-H-cob-nad4L-nad4-QFM-atp6-nad2-VAD-nad1-NPIK-nad3S1W-cox1-T-rrnL-C-rrnS-cox2-nad6-YL1S2L2R-nad5-E-NCR[TRU1-5]-G-3’
(mạch thẳng) (Hình 3.2). Vùng NCR chứa 5 TRU (TRU1–5/182 bp hoặc 183
bp/mỗi chuỗi).

Hình 3.2. Sơ đồ hệ gen ty thể của sán lá ruột nhỏ H. taichui. A. Dạng vòng tròn; B. Dạng
mạch thẳng, mở vòng tại 5’ của gen cox3 (Ngân hàng gen: MG972809, mẫu Việt Nam và
KF214770, mẫu Lào). Các gen PCG và MRG được viết tắt theo Boore (1999) và các công
bô trước đây của chúng tôi (Le et al., 2002; 2019; 2020b; Lee et al., 2013). Các gen tRNA
vận chuyển được đánh dấu bằng viết tắt ba chữ của amino acid hoặc một chữ cái mà tRNA
đo vận chuyển. Vùng không mã hoa (NCR) nằm giữa tRNA Glu và tRNAGly bao gồm 5 đơn vị
cấu trúc lặp (TRU1–5) và 2 chuỗi nôi (Long Int. Seq. 1 và 2) xen kẽ.

3.1.2. Đặc điểm gen RNA ribosome (12S, 16S rRNA) và RNA vận chuyển
(tRNA) của ty thể
Các gen RNA ribosome ty thể ở H. taichui co độ dài, cấu trúc, thứ tự sắp
xếp bảo tồn nằm xen giữa các gen PCG. Hai gen MRG là 16S (rrnL) và 12S
(rrnS), cách nhau bởi tRNACys (trnC) ở giữa; co cấu trúc bậc hai suy diễn điển hình

11
của các loài sán dẹt. Độ dài của 22 tRNA từ 60 bp (ở tRNA Val) đến 73 bp (ở
tRNAGlu), đa phần 62–64 bp, cấu trúc bậc hai co dạng hình “lá sồi” (clover leaf);
chỉ co tRNASer1 bị khuyết thiếu cánh tay DHU.
3.1.3. Đặc điểm vùng khơng mã hóa ở hệ gen ty thể
Vùng NCR ở mtDNA của H. taichui giới hạn giữa tRNAGlu và tRNAGly
(độ dài 1.692 bp); gồm 2 tiểu vùng. Tiểu vùng thứ nhất chứa 2 cấu trúc lặp là
TRU1 và TRU2 (182 bp/mỗi một cấu trúc); Tiểu vùng thứ hai chứa 3 cấu trúc lặp,
TRU3–4–5 (183 bp/mỗi một cấu trúc). Vùng NCR của H. taichui (mẫu Lào) tương
tự; nhưng mtDNA của lồi M. yokogawai (Hàn Qc) co 3,4 đơn vị lặp liền kề
ngắn STR1–3.4 (174 bp/một chuỗi) và 2,9 đơn vị lặp liền kề dài LTR1–2.9 (311
bp/mỗi một chuỗi).
3.1.4. Phương thức sử dụng nucleotide và tính toán giá trị độ lệch (“skew”)
trong hệ gen ty thể
Bảng 3.2. Tỷ lệ sư dụng thành phần nucleotide A, T, G, C và giá trị độ lệch
(skew/skewness) sư dụng của các gen mã hoa protein (PCG), các gen riobosome ty
thể (MRG) và toàn bộ hệ gen ty thể của các loài SLRN trong ho

Heterophyidae

Độ dài
(bp)

A
(%)

T
(%)

G

(%)

C
(%)

A+T
(%)

ATskew

G+C
(%)

GCskew

mtDNA

15.120

19.56

39.71

28.35

12.38

59.27

–0.340

40.73

0.392

PCGs

10.164

17.02

43.06

27.99

11.92

60.08

–0.433

39.92

0.403

Loài
HETEROPHYIDAE

Haplorchis
(VN)

1 taichui
(MG972809)

Haplorchis
(LA)
2 taichui
(KF214770)
Metagonimus
yokogawai
3 (KR)
(KC330755)

MRGs

1.730

22.25

34.97

29.36

13.42

57.22

–0.222

42.78

0.373

mtDNA

15.131

19.56

39.67

28.34

12.42

59.23

–0.340

40.97

0.390

PCGs

10.164

17.02

43.08

27.96

11.93

60.11

–0.434

39.89

0.402

MRGs

1.728

22.34

35.01

29.28

13.37

57.35

–0.221

42.65

0.373

mtDNA

15.258

17.79

37.89

30.11

14.21

55.68

–0.361

44.32

0.359

PCGs

10.245

15.31

40.65

29.68

14.35

55.96

–0.453

44.04

0.348

MRGs

1.736

19.93

34.22

30.82

15.03

54.15

–0.264

45.85

0.344

Ghi chú: A: Adenine; T: Thymine; G: Guanine; C: Cytosine. PCGs: protein-coding genes
(các gen mã hoa protein); MRGs: mitoribosomal genes (các gen ribosome ty thể); mtDNA:
toàn bộ hệ gen ty thể. VN: Việt Nam; LA: Lào; KR: Hàn Quôc.

Rõ ràng tỷ lệ sư dụng nucleotide ở mtDNA, PCG và MRG của H. taichui
(Việt Nam) đều thông nhất theo mô hình (T > G > A > C), “thiên vị” về sư dụng


12
A+T hơn G+C. Ở mtDNA, tổng thể thành phần A+T là 59,27% và G+C là 40,73%,
giá trị độ lệch (skew/skewness) ở A+T là lệch âm (–0.340) và G+C là dương
(0,392). Để xây dựng 12 PCG tổng thành phần A+T được sư dụng là 60,08% và
G+C là 39,92%, giá trị skew = –0,433 cho (A+T) và 0,403 cho (G+C). A+T được
sư dụng ít hơn (57,22%) ở hai gen MRG so với mtDNA (59,27%) và PCG
(60,08%); và G+C nhiều hơn (42,78%) so với mtDNA (40,43%) và PCG (39,92%),
do vậy giá trị độ lệch skew cũng thấp hơn. Chủng của Lào cũng co tỷ lệ sư dụng
nucleotide tương tự (Bảng 3.2).
3.1.5. Đặc điểm gen PCG và “thiên vị” sử dụng bộ mã
Tất cả 64 bộ mã đều được sư dụng; mã khởi đầu ATG (cho 8 gen) và GTG
(4 gen); các bộ mã TAA và TAG kết thúc; TGA cho Tryptophan (W). H. taichui sư
dụng 10.164 bp mã hoa cho 3.376 amino acid, kiến tạo 12 gen PCG. Sư dụng bộ
mã “thiên vị” ở mtDNA của H. taichui thể hiện nhiều nhất là 301 cho Phe-TTT,
224 cho Leu-TTG, 171 cho Val-GTT; ít nhất là 5 bộ mã cho Gln-CAA và ArgCGC.
3.1.6. Khoảng cách di truyền giữa Haplorchis taichui và các loài sán lá khác ở
họ Heterophyidae và Opisthorchiidae dựa trên cộng hợp amino acid của 3 gen
(cob+nad1+cox1) và 12 PCG
Bảng 3.5. Tính toán khoảng cách di truyền theo tỷ lệ sai khác (%) sư dụng độ dài
chuỗi amino acid cộng hợp của 12 PCG giữa chủng nghiên cứu Htai-QT3-VN với

các chủng/loài trong họ Heterophyidae và Opisthorchiidae
1
2
3
4
5
6
7

Chủng/loài
Htai-QT3-VN-MG972809
Htai-LA-KF214770
Myok-KR-KC330755
Csin-Amur-RU-FJ381664
Csin-GD-CN-JF729303
Csin-KR-JF729304
Mori-HLJ-CN-KT239342
Ofel-UstTula-RUEU921260

1
0.46
27.06
31.31
31.37
31.31
31.57

2

26.83

31.18
31.24
31.18
31.41
30.9
8

3

31.47
31.57
31.51
31.44

4

5

6

7

8

0.37
0.37
0.40
13.31 13.45 13.48
12.5
8

31.21
32.17
12.75 12.62 13.38
8
14.5
9 Oviv-LA-JF739555
31.64 31.47 32.57
14.77 14.64 13.41 15.14
8
Ghi chú: 1. Htai-QT3-VN-MG972809: Haplorchis taichui (Việt Nam); 2. Htai-LA-KF214770: H.
taichui (Lào); 3. Myok-KR-KC330755: Metagonimus yokogawai (Hàn Quôc); 4. Csin-Amur-RU-


13
FJ381664: Clonorchis sinensis (Nga); 5. Csin-GD-CN-JF729303: C. sinensis (Trung Quôc); 6. CsinKR-JF729304: C. sinensis (Hàn Quôc); 7. Mori-HLJ-CN-KT239342: Metorchis orientalis (Trung
Quôc); 8. Ofel-UstTula-RU-EU921260: Opisthorchis felineus (Nga); 9. Oviv-LA-JF739555:
Opisthorchis viverrini (Lào). Sô đăng kí Ngân hàng gen ghi ở cuôi mỗi ch̃i. Sơ liệu KCDT giữa lồi
H. taichui so với các lồi khác được bơi đậm chữ sơ. Phần bơi khung là biểu thị KCDT nội loài của các
chủng trong cùng một loài Haplorchis taichui (giữa 2 chủng) hoặc Clonorchis sinensis (giữa 3 chủng).

+ So sánh 3 PCG: Khoảng cách di truyền trong cùng một loài (nội
loài) là rất thấp (chỉ là 0,3%) ở cùng họ Heterophyidae, giữa các chủng khác loài
(ngoại loài), khác họ Opisthorchiidae là cao (17,2–26,6% và 26,3–32,0%), giữa
loài H. taichui của Việt Nam với các loài sán lá khác.
+ So sánh 12 PCG: Sai khác nội loài giữa các chủng cùng loài H. taichui
(Việt Nam và Lào) chỉ là 0,46%; trong khi đo, KCDT ngoại loài giữa H. taichui
với loài M. yokogawai cùng họ Heterophyidae là 26,83–27,06%; và với các loài
Clonorchis sinensis, Metorchis orientalis, Opisthorchis felineus và O. viverrini
khác họ (Opisthorchiidae) là rất cao, 31,21–31,64% (Bảng 3.5).
3.1.7. Phân tích phả hệ sán lá ruột nhỏ dựa trên chuỗi amino acid cộng hợp 3

PCG (cob+nad1+cox1)
+ Phả hệ dựa trên 3 PCG: Cây phả hệ cho thấy 23 chủng/loài thuộc vào 6
họ, trong đo 4 chủng thuộc 3 loài (H. taichui, M. yokogawai và S. falcatus) vào
nhom của họ Heterophyidae, cùng với loài tham chiếu H. taichui của Lào và lồi
M. yokogawai của Hàn Qc. Nhom họ Heterophyidae gồm H. taichui và M.
yokogawai ở vị trí “đồng vị”/(“chị em”), còn S. falcatus lại ở vị trí “lệch vị” với
nhom họ Opisthorchiidae.
3.1.8. Phân tích phả hệ sán lá ruột nhỏ dựa trên chuỗi amino acid cộng hợp 12
PCG
Cây phả hệ xác định mơi quan hệ lồi và phả hệ so sánh 36 chủng/loài sán lá
(Bảng PL2.3) thuộc các họ Cyclocoelidae; Echinochasmidae; Echinostomatidae;
Fasciolidae; Gastrodiscidae; Gastrothylacidae; Heterophyidae; Himasthlidae;
Opisthorchiidae; Paramphistomatidae, cho thấy nhom liên họ Opisthorchioidea (co
hai họ Heterophyidae và Opisthorchiidae) thuộc Phân bộ Opisthorchiata, luôn luôn
tập hợp cùng nhau (Hình 3.6). Chỉ sô tin tưởng (bootstrap) co giá trị 100% ở cả 3
nút chính (nút phân định liên họ) và 98–100% ở các nút phân định các họ thuộc các


14
đôi tượng so sánh. Nhom họ Heterophyidae gồm H. taichui (chủng của Việt Nam
và Lào) và M. yokogawai sắp xếp ở vị trí “đồng vị”/(“chị em”), với nhom họ
Opisthorchiidae.

Hình 3.6. Cây phả hệ xác định mơi quan hệ lồi và phả hệ dựa trên phân tích chuỗi amino acid suy
diễn cộng hợp từ 12 gen PCG của ty thể. Ghi chú: Môi quan hệ được xác định giữa các chủng SLRN
của Việt Nam (dấu hình thoi) và các loài sán lá khác đại diện 5 họ (Cyclocoelidae; Echinochasmidae;
Echinostomatidae; Fasciolidae; Gastrodiscidae; Gastrothylacidae; Heterophyidae; Himasthlidae;
Opisthorchiidae; Paramphistomatidae) và họ Schistosomatidae (ngoại hợp). Cây phả hệ được xây dựng
bằng chương trình MEGA X, phương pháp “tiếp cận cực đại” (Maximum likelihood, ML), với hệ sô
tin tưởng bootstrap là 1000 lần lặp lại (Kumar et al., 2018). Dấu hình thoi chỉ hai loài H. taichui của

Việt Nam và SLRN thuộc đôi tượng nghiên cứu (đong khung trong). Nhom của Phân bộ Opisthorchiata
và Liên họ Opisthorchioidea được đong khung ngoài. Mũi tên chỉ 3 nút chính phân định các Liên họ
Opisthorchioidea, Echinostomatoidea và Paramphistomoidea. Ở mỗi ch̃i, bắt đầu là tên lồi (tồn bộ
tên), tiếp theo là ký hiệu chủng (trong ngoặc) lấy từ tên địa phương phân lập (nếu co) và sô đăng ký
Ngân hàng gen (nếu co), liệt kê tại Bảng PL2.3. Hệ sô tin tưởng (bootstrap) được ghi ngay tại mỗi nhom
phân nhánh. Sô đăng ký Ngân hàng gen được đặt ở cuôi chuỗi. Vạch ngang ở cuôi hình (0.1) biểu thị sai
khác nucleotide (1/100 nucleotide) ở mỗi nhánh.


15
3.2. Kết quả nghiên cứu đơn vị mã hóa ribosome loài Haplorchis taichui và
loài H. pumilio mẫu Việt Nam
3.2.1. Cấu trúc và sắp xếp gen/vùng giao gen của đơn vị mã hóa ribosome của
Haplorchis taichui và H. pumilio
Phần mã hoa ribosome (coding rDNA) của loài H. taichui (Htai-QT3-VN)
co độ dài là 7.268 bp, của loài H. pumilio (Hpum-HPU8-VN) co độ dài là 7.416
bp, còn thiếu vùng IGS chưa thu được ở cả hai loài. Năm gen/vùng giao gen (ITS)
đã được xác định, lần lượt: gen 18S rRNA, ITS-1, gen 5.8S rRNA, ITS-2 và gen
28S rRNA, so sánh với rTU của 2 loài SLRN cùng họ Heterophyidae là
Cryptocotyle lingua (Nga) và Euryhelmis costaricensis (Nhật Bản) (Hình 3.8).

Hình 3.8. Trật tự sắp xếp gen của phần mã hoa của đơn vị mã hoa ribosome ở sán lá
ruột nhỏ họ Heterophyidae gồm Haplorchis taichui (Việt Nam), H. pumilio (Việt Nam),
Cryptocotyle lingua (Nga) và Euryhelmis costaricensis (Nhật Bản). TRU: tandem
repeat unit: các cấu trúc chuỗi lặp liền kề, ở H. taichui co 3 TRU (TRU1–3), ở H.
pumilio co 5 TRU (TRU1–5) và ở Eu. costaricensis co 2,5 TRU (TRU1–2.5). Lồi
Cryptocotyle lingua khơng chứa TRU ở ITS-1 và ITS-2.

3.2.2. Độ dài gen rRNA và vùng giao gen ở đơn vị mã hóa ribosome của các
lồi Haplorchis taichui và Haplorchis pumilio

16
Cả H. taichui và H. pumilio co gen 18S rRNA cùng độ dài là 1.992 bp và
5.8S rRNA là 160 bp, nhưng gen 28S rRNA là 3.875 bp ở H. taichui và 3.870 bp ở
H. pumilio. ITS-1 ở H. taichui co độ dài là 797 bp, không chứa cấu trúc lặp (TRU);
nhưng ITS-1 ở H. pumilio (1.106 bp) chứa 5 TRU bao gồm 3 TRU (TRU1–3/136
bp/mỗi một cấu trúc) và 2 TRU (TRU4–5/116 bp/mỡi một cấu trúc). ITS-2 ở lồi
H. pumilio (280 bp) không chứa bất kỳ TRU nào, nhưng ITS-2 ở H. taichui (444
bp) chứa 3 TRU (83–85 bp/mỗi một cấu trúc). Vùng giao gen ITS co chứa các cấu
trúc lặp là đặc điểm gen học đáng chú ý ở Haplorchis spp.
3.2.3. Đặc điểm cấu trúc bậc hai gen rRNA (5.8S, 18S, 28S rRNA) và vùng giao
gen (ITS-1, ITS-2)
Mô hình cấu trúc bậc hai xây dựng bằng chương trình RNAfold và
RNAalifold co tại: />Cấu trúc bậc hai các gen rRNA: Gen 5.8S rRNA co các “kẹp tóc” và
“vòm” nội gen, kích thước ngắn, không phức tạp. Gen 18S rRNA và 28S rRNA của
Haplorchis spp. và các chuỗi “đồng thuận” (consensus) đều co cấu trúc bậc hai khá
phức tạp, chứa các “kẹp tóc” gồm nhánh chính và nhánh phụ và cuôi mỗi nhánh
đều co các “vòm” gắn kết.
Cấu trúc bậc hai các vùng giao gen ITS: ITS-1 của H. taichui và H.
pumilio co cấu trúc bậc hai phức tạp. Ở H. taichui, những chuỗi đôi ngược tạo nên
các “kẹp toc” (29–30), nhiều “kẹp tóc” không co “vòm” ở cuôi. Ở H. pumilio, chia
2 phần rõ rệt, vùng chứa TRU1–5 co các “kẹp tóc” rất cân đôi và phần còn lại chứa
các nhánh dài ngắn khác nhau không cân đôi. ITS-2 của cả 4 loài (H. taichui, H.
pumilio, C. lingua và Eu. costaricensis) đều cấu trúc 4 nhánh “kẹp tóc” chính là mô
hình chung gọi là dạng “bốn ngón tay” (four finger) bảo tồn. ITS-2 của H. taichui
co thêm 2 nhánh phụ được hình thành chủ yếu từ bắt cặp ở các cấu trúc lặp nhỏ co
trong ITS-2 của loài này.
3.2.4. Kết quả phân tích phương thức sử dụng nucleotide và tương đờng trong
đơn vị mã hóa ribosome

Bơn đơn vị so sánh: gen 18S, 28S, 18S+28S và phần mã hoa rTU (tạm gọi
là rTU*). Sư dụng nhiều nhất là G, tiếp đến là T và ít nhất là A và C, tạo nên công


17
thức: G >> T > A≈ C. Tổng thể A+T sư dụng ít hơn G+C cho giá trị lệch âm rất
thấp ở A+T; và lệch dương không cao ở G+C ở cả 4 đơn vị so sánh. Mức độ tương
đồng của H. taichui với 3 loài SLRN là rất cao, ở 18S rRNA: 98,94%/H. pumilio;
97,80%/C. lingua; 97,69%/Eu. costaricensis; ở 28S rRNA: 97,39%/H. pumilio;
96,02%/C. lingua; 95,60%/Eu. costaricensis; ở 18S+28S rRNA: 97,92%/H.
pumilio; 96,63%/C. lingua; 96,32%/Eu. costaricensis; và ở rTU*: 97,30%/H.
pumilio; 95,52%/C. lingua; 95,07%/Eu. costaricensis (Bảng 3.8).
Bảng 3.8. Mức độ tương đồng nucleotide (%) của từng gen 18S, 28S, 18S+28S rRNA và
rTU của 4 loài SLRN họ Heterophyidae, H. taichui,

H. pumilio, C. lingua, Eu.

costaricensis
STT
1
2
3
4

Tên chủng/loài
(GenBank)
Htai-QT3-VN
(KX815126)
Hpum-HPU8-VN
(KX815125)

Clin-Kartesh-RU
(MW361240)
Ecos-Fuku-JP
(AB521797)

1

Gen 18S rRNA
2
3

98.94

4

1

Gen 28S rRNA
2
3

4

97.39

97.80

98.01

97.69

97.64

98.83

96.02

95.13

95.60

94.65

97.52

18S rRNA + 28S rRNA
Phần mã hóa rTU
Htai-QT3-VN
1
(KX815126)
Hpum-HPU8-VN
2
97.92
97.30
(KX815125)
Clin-Kartesh-RU
3
96.63
96.12
95.52

94.91
(MW361240)
Ecos-Fuku-JP
4
96.32
95.68
97.97
95.07
94.47
97.45
(AB521797)
Ghi chú: Htai-QT3-VN: Lồi Haplorchis taichui chủng QT3, Việt Nam; Hpum-HPU8-VN: loài
Haplorchis pumilio chủng HPU8, Việt Nam; Clin-Kartesh-RU: loài Cryptocotyle lingua, chủng Kartesh
của Nga; Ecos-Fuku-JP: loài Euryhelmis costaricensis, chủng Fuku của Nhật Bản. Sô đăng ký Ngân
hàng gen (GenBank) được cung cấp ở mỡi lồi. Tỷ lệ đồng nhất cao nhất và thấp nhất giữa 2 loài SLRN
được bôi đậm và tô màu.

3.2.5. Phân tích phả hệ của H. taichui và H. pumilio dựa trên toàn phần gen
28S rRNA và cộng hợp (18S+28S rRNA)
Hình 3.14 trình bày cây phả hệ của 34 chủng/28 loài kể cả H.
taichui và H. pumilio dựa trên phân tích chuỗi gen 28S rRNA toàn phần
(~3,8–3,9 kb).
Bảy nhom của 7 họ tập hợp trong 3 phân bộ gồm: i) Phân bộ Troglotremata


18
(các họ Paragonimidae, Nanophyetidae, Collyriclidae); ii) Phân bộ Opisthorchiata
(các họ Opisthorchiidae, Heterophyidae): iii) Phân bộ Echinostomata (các họ
Echinostomatidae, Fasciolidae) tách biệt nhau khá rõ ràng. Tuy nhiên, trong họ
Heterophyidae, nhom của hai loài C. lingua và Eu. costaricensis sắp xếp ở vị trí

“đồng vị”/“chị em” với nhom họ Opisthorchiidae, đẩy nhom của hai loài H. taichui
và H. pumilio nằm ở vị trí “lệch vị”.

Hình 3.14. Cây phả hệ xác định mơi quan hệ lồi và phả hệ dựa trên phân tích ch̃i gen 28S rRNA tồn
phần (~3.8–3.9 kb) của SLRN H. taichui và H. pumilio của Việt Nam và các loài sán lá khác. Ghi chú:
Các loài H. taichui và H. pumilio của Việt Nam (đánh dấu hình tròn và đong khung) cùng với
Cryptocotyle lingua và Euryhelmis costaricensis cùng họ Heterophyidae và các loài sán lá khác đại diện
6 họ (Nanophyetidae; Paragonimidae; Collyriclidae; Opisthorchiidae; Echinostomatidae và Fasciolidae)
và họ Schistosomatidae (ngoại hợp). Cây phả hệ được xây dựng bằng chương trình MEGA X, ”tiếp cận
cực đại” (Maximum likelihood (ML)), với hệ sô tin tưởng bootstrap là 1000 lần lặp lại (Kumar et al.,
2018). Mũi tên chỉ nút chính phân định Liên họ Opisthorchioidea. Ở mỗi chuỗi, bắt đầu là ký hiệu tên
lồi, tiếp theo là ký hiệu chủng và qc gia phân lập (nếu co), sau đo là gen 28S với sô nucleotide so
sánh (trong ngoặc) và cuôi cùng là sô đăng ký Ngân hàng gen (nếu co), liệt kê tại Bảng PL2.5. Hệ sô tin
tưởng (bootstrap) được ghi ngay tại mỗi nhom phân nhánh. Vạch ngang ở cuôi hình (0.02) biểu thị sai
khác nucleotide (2/100 nucleotide) ở mỗi nhánh.

Hình 3.15 trình bày cây phả hệ của 23 chủng/17 loài kể cả H. taichui và H.


19
pumilio dựa trên phân tích ch̃i gen 18S+28S rRNA tồn phần (~5,8–5,9 kb).
Ngoài nhom ngoại hợp, năm nhom của 5 họ tập hợp trong 2 phân bộ: phân bộ
Opisthorchiata

(các

họ

Opisthorchiidae,

Heterophyidae):

và

phân

bộ

Echinostomata (các họ Echinostomatidae, Fasciolidae và Philophthalmidae) và hai
nhom phân bộ tách biệt nhau rõ ràng. Tuy nhiên, trong họ Heterophyidae, nhom
của hai loài C. lingua và Eu. costaricensis co xu hướng sắp xếp vào giữa gần với
nhom họ Opisthorchiidae, đẩy nhom của hai loài H. taichui và H. pumilio ra vị trí
“lệch vị”.

Hình 3.15. Cây phả hệ xác định môi quan hệ lồi và phả hệ dựa trên phân tích ch̃i gen cộng hợp
18S+28S rRNA toàn phần (5.846–5.870 bp) của SLRN H. taichui và H. pumilio của Việt Nam và các
loài sán lá khác. Ghi chú: Các loài SLRN H. taichui và H. pumilio của Việt Nam (đánh dấu hình tròn)
và các loài sán lá khác đại diện 5 họ (Heterophyidae, Opisthorchiidae, Fasciolidae, Philophthalmidae,
Echinostomatidae) và họ Schistosomatidae (ngoại hợp). Cây phả hệ được xây dựng bằng chương trình
MEGA X, ”tiếp cận cực đại” (maximum likelihood (ML), với hệ sô tin tưởng (bootstrap) 1000 lần lặp
lại (Kumar et al., 2018). Khung vuông bôi màu phân định hai phân bộ Opisthorchiata và
Echinostomata. Ở mỡi ch̃i, bắt đầu là ký hiệu tên lồi, tiếp theo là ký hiệu chủng và quôc gia phân
lập, sau đo là sô đăng ký Ngân hàng gen (nếu co) liệt kê tại Bảng PL2.6. Hệ sô tin tưởng (bootstrap)


20
được ghi ngay tại mỗi nhom phân nhánh. Vạch ngang ở cuôi hình (0.01) biểu thị sai khác nucleotide
(1/100 nucleotide) ở mỗi nhánh.

CHƯƠNG IV. BÀN LUẬN KẾT QUẢ

Đề tài đã thực hiện thành công các nội dung nghiên cứu, đáp ứng mục tiêu
đề ra. Luận án đã xây dựng, hoàn thành và cung cấp các kết quả nghiên cứu đã đạt
được, trong đo co một sô điểm nổi bật mà chúng tôi cho rằng đã gop phần đong
gop cho nghiên cứu gen học mtDNA và rTU của các loài SLRN noi riêng và sán lá
noi chung. Kết quả của luận án từng bước đáp ứng nhu cầu cần thiết về nghiên cứu
xác định lồi, chẩn đốn, dịch tễ học, phả hệ, tiến hoa và di truyền quần thể còn
thiếu ở các chi Haplorchis và họ Heterophyidae cũng như môi quan hệ loài/ho
̣/phân bộ trong phả hệ và tiến hoa phân tư. Luận án cũng đã cung cấp dữ liệu
mtDNA và rTU co giá trị cho bộ dữ liệu gen/hệ gen sán lá trên thế giới.
4.1. Về nghiên cứu hệ gen ty thể sán lá ruột nhỏ Haplorchis taichui
+ Trong nghiên cứu này, mtDNA hoàn chỉnh của H. taichui Nishigori, 1924
(chủng QT3 của Việt Nam) đã được giải trình tự và mô tả đầy đủ các đặc điểm gen
học. H. taichui co kích thước mtDNA trên trung bình (15.120 bp); như H. taichui
(mẫu Lào, 15.131 bp; KF214770) và loài Metagonimus yokogawai (mẫu Hàn
Quôc, 15.258 bp; KC330755) ở họ Heterophyidae. Dữ liệu mtDNA của H. taichui
do chúng tôi cung cấp rất co giá trị cho các nghiên cứu và ứng dụng tiếp theo.
+ Sự sắp xếp trật tự gen, vùng giao gen và vùng NCR được xác định bảo tồn
cao, như đa sơ lồi sán lá, ngoại trừ họ Schistosomatidae. Hai gen rRNA ty thể co
cấu trúc bậc hai phức tạp, điển hình của RNA tham gia ribosome. Trật tự sắp xếp
tRNAGly và tRNAGlu thay đởi tùy lồi, co thể đảo vị trí trong vùng NCR. Hai mươi
môt (21) tRNA co cấu trúc bậc hai hình “lá sồi” (cloverleaf), phân phôi 4 hướng
của 4 “cánh tay” (arm) hoạt động vận chuyển amino acid; chỉ co tRNA Ser1 bị
khuyết thiếu cánh tay DHU. Khuyết thiếu cánh tay DHU ở tRNA thường gặp ở
một sô sán lá khác như Fasciola hepatica, F. jacksoni, Fascioloides magna,
Echinostoma miyagawai và Ech. revolutum. Cấu trúc lặp liền kề (TRU) trong
mtDNA của H. taichui là nét đặc trưng của loài SLRN này và cũng là điển hình đa
hình

(polymorphism)

thường

gặp

ở

rất

nhiều

loài

SLRN

họ


21
Echinostomatidae/Echinochasmidae và các loài sán lá ở các họ khác.
+ H. taichui (Việt Nam và Lào) “thiên vị” về sư dụng A+T nhiều hơn G+C
(A+T > G+C) trong mtDNA, tương tự như ở một sơ lồi sán lá họ Fasciolidae) và
họ Opisthorchiidae, khoảng 60%, nhưng khác xa và ít hơn nhiều so với các loài sán
máng Schistosoma spp. thuộc họ Schistosomatidae (sư dụng đến 70% A+T). Do
đo, giá trị độ lệch (skewness) cũng thiên về lệch âm. Sư dụng nhiều nhất thuộc về
bộ mã Phe-TTT) và Leu-TTG, ít nhất là Gln-CAA, Arg-CGC; ở M. yokogawai còn
thêm Thr-ACA/ACC, thường gặp ở mtDNA sán lá đã công bô.
+ Phân tích phả hệ dựa trên các gen ty thể đơn lẻ, cộng hợp 3 hay 12 PCG,
đều cho thấy H. taichui (Việt Nam và Lào) được sắp xếp cùng M. yokogawai trong
một nhom, đo là nhom họ Heterophyidae. Nhom họ này luôn co quan hệ gần nhất
(vị trí “đồng vị”/“chị em”(sister)) với nhom họ Opisthorchiidae. Các vị trí phân loại

của các loài trong họ Heterophyidae, trong đo co H. taichui hoàn toàn đã được
khẳng định một cách chắc chắn.
4.2. Về nghiên cứu đơn vị mã hóa ribosome của sán lá ruột nhỏ Haplorchis
taichui và H. pumilio
+ Trong nghiên cứu này, phần mã hoa toàn phần của rTU (tạm ký hiệu
rTU*) của hai loài SLRN của Việt Nam, H. taichui (chủng QT3) và H. pumilio
(chủng HPU8) đã được thu nhận và mô tả đầy đủ các đặc điểm gen và vùng giao
gen. Độ dài rTU* của H. taichui là 7.268 bp; của H. pumilio là 7.416 bp) bao gồm
toàn bộ vùng DNA mã hoa cho 18S rRNA, vùng giao gen ITS1, vùng gen 5.8S
rRNA, vùng giao gen ITS2 và toàn bộ vùng gen 28S rRNA đã được xác định và so
sánh với rTU* của hai loài hai loài C. lingua và Eu. costaricensis cùng họ
Heterophyidae co trong Ngân hàng gen. Dữ liệu rTU của H. taichui và H. pumilio
vừa thu nhận rất co giá trị cho các nghiên cứu và ứng dụng tiếp theo.
+ Cấu trúc bậc hai của 18S rNA và chuỗi “đồng thuận” (consensus) bảo tồn
giữa các chủng trong cùng loài và chi Haplorchis; của 28S rRNA phức tạp hơn
hình thành nhiều nhánh “kẹp toc (hairpin) phụ và “vòm” (loop) tự do, đặc trưng
theo loài co trong họ Heterophyidae. Cấu trúc bậc hai của ITS-1 phức tạp, co vùng
“cân đôi” và “không cân đôi” phân phôi nhánh/vòm khác nhau; của ITS-2 co dạng


22
hình “bôn ngon tay” (four finger), bảo tồn ở mọi loài sinh vật, tuy nhiên ở H.
taichui co nhánh phụ.
+ Tỷ lệ sư dụng 4 loại nucleotide ở 4 loài SLRN co thể nhận thấy theo mô
hình tương tự nhau, nhiều nhất là G, tiếp đến là T và ít nhất là A và C với tỷ lệ như
nhau, tạo nên công thức: G >> T > A≈ C; tổng thể A+T được sư dụng ít hơn G+C
(A+T < G+C).
+ Phân tích phả hệ sư dụng một gen 28S rRNA và cộng hợp 18S+28S
rRNA, đều cho thấy ở cấp họ (family), họ Heterophyidae sắp xếp vị trí “chị
em”/”sister” (monophyly) với họ Opisthorchiidae trong phân bộ Opisthorchiata.

Phân bộ Opisthorchiata tách biệt khá rõ ràng với các phân bộ Echinostomata (họ
Echinostomatidae, Fasciolidae) và phân bộ Troglotremata (họ Paragonimidae,
Nanophyetidae, Collyriclidae). Tuy nhiên, ở cấp độ loài (species) sự co mặt SLRN
khác chi cùng họ khác (Cryptocotyle lingua và Euryhelmis costaricensis) đã đẩy
nhom loài Haplorchis spp. sang vị trí “lệch vị” (paraphyly) với nhom họ
Opisthorchiidae. Cần thiết co thêm dữ liệu rTU của nhiều loài SLRN khác để làm
sáng tỏ vị trí phân loài/họ trong Heterophyidae và Opisthorchiata.
4.3. Về đóng góp cung cấp cơ sở dữ liệu hệ gen ty thể và đơn vị mã hóa
ribosome
Hiện nay nhu cầu áp dụng các kỹ thuật SHPT bao gồm việc sư dụng các chỉ
thị trích xuất từ chuỗi DNA của mtDNA và rTU/rDNA để phôi hợp với kiểm tra
đặc điểm HTH trong phân loại, giám định, phát hiện lồi, chẩn đốn, định type,
dịch tễ phân tư, phả hệ, tiến hoa, nguồn gôc và di truyền quần thể là rất lớn và
được coi là công cụ tin tưởng nhất. Chúng tôi đã thực hiện đề tài cung cấp dữ liệu
hoàn chỉnh của mtDNA từ loài SLRN Haplorchis taichui và phần mã hoa rTU từ 2
loài Haplorchis taichui và Haplorchis pumilio ký sinh gây bệnh trên người.
. Kết quả nghiên cứu gen học thu được từ SLRN các lồi H. taichui và H.
pumilio của Việt Nam đã bở sung thêm hiểu biết và ứng dụng SHPT mà một sô
nghiên cứu trước đây đã ghi nhận, đồng thời mở ra định hướng nghiên cứu SLRN
họ Heterophyidae còn thiếu rất nhiều trong cơ sở dũ liệu thế giới.


23
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
1. Đã nghiên cứu giải trình tự thu nhận toàn bộ mtDNA của loài SLRN H.
taichui họ Heterophyidae, mẫu Việt Nam; đã xác định cấu trúc và sắp xếp gen
trong hệ gen, phân tích đầy đủ đặc điểm gen, tính toán khoảng cách di truyền các
loài trong họ Heterophyidae và họ Opisthorchiidae và xây dựng phả hệ SLRN với
các loài sán lá. Toàn bộ mtDNA hoàn chỉnh của loài H. taichui co độ dài 15.120 bp

(MG972809), chứa 36 gen, gồm 12 gen mã hoa protein, PCG (cox1–3; nad1–6 và
nad4L; cob và atp6), 2 gen ribosome ty thể, MRG (16S/rrnL và 12S/rrnS), 22 gen
vận chuyển amino acid (tRNA) và một vùng không mã hoa (NCR), chứa 5 đơn vị
cấu trúc lặp liền kề, TRU1–5/182 và 183 bp/mỗi một chuỗi.
2. Tổng thành phần A+T và G+C sư dụng theo mô hình (A+T > G+C), giá trị
độ lệch (skew/skewness) sư dụng A+T thiên về lệch âm và G+C lệch dương. Sự
“thiên vị” bộ mã sư dụng nhiều nhất và ít nhất; và khoảng cách di truyền giữa các
loài SLRN họ Heterophyidae và họ Opisthorchiidae cũng đã được xác định. Đã
phân tích mơi quan hệ về lồi và xây dựng thành công phả hệ SLRN dựa trên chuỗi
amino acid cộng hợp của 3 PCG (cob+nad1+cox1) và 12 PCG, xác định vị trí
“đồng vị”/”chị em”(sister) (monophyly) của họ Heterophyidae với họ
Opisthorchiidae.
3. Đã nghiên cứu giải trình tự thu nhận toàn bộ phần mã hoa của rTU (ký hiệu
rTU*) của SLRN Haplorchis taichui và H. pumilio, mẫu Việt Nam, xác định cấu
trúc và sắp xếp gen/vùng giao gen trong rTU*, phân tích đầy đủ đặc điểm gen/vùng
giao gen, cấu trúc bậc hai, tính tốn khoảng cách di trùn các lồi trong họ
Heterophyidae và họ Opisthorchiidae; và xây dựng phả hệ SLRN họ
Heterophyidae và các loài sán lá khác. Vùng mã hoa ở rTU của H. taichui co kích
thước 7.268 bp và của H. pumilio co độ dài là 7.416 bp, chứa gen 18S rRNA, 5.8S
rRNA và 28S rRNA hoàn chỉnh; và 2 vùng giao gen ITS-1 và ITS-2, đặc biệt đã
tìm thấy các cấu trúc lặp (co 5 TRU) trong ITS-1 ở loài H. pumilio và trong ITS-2
(co 3 TRU) ở loài H. taichui.