Nghiên cứu phân lập và tác dụng điều trị bệnh đái tháo đường type 2 của các hoạt chất sinh học từ một số loại thực vật thu hái tại miền trung

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

NGUYỄN THỊ XUÂN THU

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ TÁC DỤNG ĐIỀU TRỊ
BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG TYPE 2 CỦA CÁC
HOẠT CHẤT SINH HỌC TỪ MỘT SỐ LOÀI
THỰC VẬT THU HÁI TẠI MIỀN TRUNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT

ĐÀ NẴNG - 2021


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

NGUYỄN THỊ XUÂN THU

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ TÁC DỤNG ĐIỀU TRỊ
BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG TYPE 2 CỦA CÁC
HOẠT CHẤT SINH HỌC TỪ MỘT SỐ LOÀI
THỰC VẬT THU HÁI TẠI MIỀN TRUNG
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 9420201

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
1. TS. ĐẶNG ĐỨC LONG
2. PGS.TS. THÀNH THỊ THU THỦY

ĐÀ NẴNG - 2021


i

LỜI CAM ĐOAN
Tơi cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả
nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai cơng bố trong bất kỳ cơng trình
nào khác. Việc tham khảo các nguồn tài liệu đã được trích dẫn và ghi nguồn tài liệu
tham khảo đúng quy định.

Nguyễn Thị Xuân Thu


ii

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành đề tài luận án này tôi xin được gửi lời biết ơn trân trọng nhất tới
TS.Đặng Đức Long và PGS.TS. Thành Thị Thu Thủy, người đã tận tâm hướng dẫn
khoa học, động viên, khích lệ và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt
thời gian thực hiện luận án.
Tôi cũng xin cảm ơn đến các thầy cô, cán bộ nghiên cứu công tác tại bộ mơn
Cơng nghệ Sinh học, Khoa Hóa, Trường Đại học Bách khoa đã ủng hộ và giúp đỡ tơi
trong suốt thời gian hồn thành luận án.
Tơi cũng xin cảm ơn đến các cán bộ nghiên cứu tại Trung tâm Các phương pháp
phổ ứng dụng – Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã
hỗ trợ đo phổ NMR, MS và giúp đỡ tôi rất nhiều trong q trình thực nghiệm và hồn
thành bản luận án.
Tôi trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Bách khoa Đà Nẵng đã tạo

mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian học tập.
Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng cảm ơn sâu sắc đến tồn thể gia đình và bạn bè
đã ủng hộ và động viên tơi hồn thành tốt luận án.
Xin chân thành cảm ơn!


iii

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................ii
MỤC LỤC.............................................................................................................iii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT .............................................. vi
DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................... ix
DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................... XI
MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1
1. Tính cấp thiết của đề tài .............................................................................. 1
2. Mục tiêu của luận án ................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu của luận án ................................................................ 2
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án................................................... 3
5. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ............................................................... 4
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .................................................................................. 5
1.1. Bệnh đái tháo đường ......................................................................................... 5
1.1.1. Bệnh đái tháo đường ............................................................................. 5
1.1.2. Bệnh sinh đái tháo đường type 2.......................................................... 10
1.1.3. Thuốc trong điều trị đái tháo đường..................................................... 14
1.2. Tổng quan về cây chè dây và lá đắng .............................................................. 17
1.2.1. Cây chè dây (Ampelosis cantoniensis (Hook. et Arn.) Planch) ............ 17
1.2.2. Giới thiệu về cây lá đắng (Vernonia amygdalina Del.) ........................ 20
1.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước về thảo dược trong điều trị đái

tháo đường ............................................................................................................ 24
1.3.1. Tình hình nghiên cứu về thảo dược trong điều trị ĐTĐ trên thế giới .... 24
1.3.2. Tình hình nghiên cứu về thảo dược trong điều trị ĐTĐ tại Việt Nam .. 42
CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 45
2.1. Nguyên liệu .................................................................................................... 45
2.1.1. Nguyên liệu thực vật ........................................................................... 45


iv

2.1.2. Nguyên liệu động vật .......................................................................... 47
2.2. Hóa chất và thiết bị thí nghiệm ....................................................................... 47
2.2.1. Hóa chất .............................................................................................. 47
2.2.2. Thiết bị thí nghiệm .............................................................................. 48
2.3. Thực nghiệm và phương pháp nghiên cứu ...................................................... 48
2.3.1. Phương pháp chiết xuất ....................................................................... 49
2.3.2. Phương pháp gây chuột nhắt ĐTĐ type 2 ............................................ 51
2.3.3. Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của 20 mẫu thực vật trên chuột nhắt
ĐTĐ type 2 ........................................................................................................... 55
2.3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của cao chiết thực vật lên cấu trúc mô tụy và gan
chuột ĐTĐ type 2 .................................................................................................. 56
2.3.5. Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của cao chiết phân đoạn mẫu lá chè
dây, lá đắng trên chuột nhắt ĐTĐ type 2................................................................ 57
2.3.6. Phương pháp khảo sát khả năng giảm hoạt tính enzyme α-glucosidase và
α-amylase của các hợp chất phân lập ..................................................................... 57
2.3.7. Phương pháp đánh giá hoạt động chống viêm và cải thiện tính kháng insulin
của các hợp chất tinh sạch dựa trên dòng tế bào Raw 264.7 và 3T3-L1...................... 58
2.3.8. Chuẩn bị cao hỗn hợp các thảo dược có khả năng hạ đường huyết....... 61
2.3.9. Xác định độc tính cấp của cao hỗn hợp................................................ 62
2.3.10. Phương pháp phân lập và xác định cấu trúc hóa học .......................... 62

2.3.11. Xử lý số liệu ...................................................................................... 65
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 66
3.1. Kết quả tách chiết mẫu.................................................................................... 66
3.2. Kết quả gây chuột nhắt ĐTĐ type 2 thực nghiệm............................................ 67
3.2.1. Gây chuột nhắt béo phì ........................................................................ 67
3.2.2. Các chỉ số mỡ máu ở chuột nhắt béo phì ............................................. 68
3.2.3. Gây ĐTĐ type 2 trên chuột béo sau tiêm STZ ..................................... 69
3.2.4. Định lượng insulin trong máu chuột nhắt sau khi tiêm STZ ................. 70
3.2.5. Nghiệm pháp dung nạp glucose ........................................................... 71


v

3.3. Kết quả tác dụng hạ đường huyết của các cao chiết thực vật trên chuột ĐTĐ type
2 ............................................................................................................................ 72
3.3.1. Sàng lọc đợt I ...................................................................................... 72
3.3.2. Sàng lọc đợt II ..................................................................................... 74
3.3.3. Sàng lọc đợt III.................................................................................... 75
3.3.4. Sàng lọc đợt IV ................................................................................... 76
3.4. Kết quả nghiên cứu cao chiết chè dây và lá đắng ............................................ 78
3.4.1. Ảnh hưởng của cao chiết chè dây và lá đắng lên kết quả mô bệnh học của
tụy và gan .............................................................................................................. 79
3.4.2. Nghiên cứu cao chiết phân đoạn lá chè dây ......................................... 81
3.4.3. Nghiên cứu các cao chiết phân đoạn lá đắng ........................................ 91
3.4.4. Khả năng ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase của các hợp chất
phân lập từ chè dây và lá đắng ............................................................................... 98
3.4.5. Hoạt động chống viêm và cải thiện tính kháng insulin của các hợp chất
phân lập từ chè dây và lá đắng ............................................................................. 100
3.4.6. Thảo luận về cơ chế hạ đường huyết của các hợp chất phân lập từ cây chè
dây và lá đắng...................................................................................................... 105

3.5. Kết quả cao hỗn hợp nguồn gốc từ thực vật có khả năng hạ đường huyết ..... 108
3.5.1. Phối hợp các cây thảo dược để tăng hiệu quả trong điều trị ĐTĐ....... 108
3.5.2. Hiệu quả hạ đường huyết của cao hỗn hợp ........................................ 109
3.5.3. Hiệu quả của cao hỗn hợp ở các chỉ số mỡ máu trên chuột ĐTĐ ....... 112
3.5.4. Hiệu quả cao hỗn hợp lên hàm lượng glycogen ở gan chuột ĐTĐ ..... 113
3.5.5. Khả năng ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase của cao hỗn hợp
............................................................................................................................ 114
3.6. Nghiên cứu độc tính cấp của cao hỗn hợp ..................................................... 114
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................... 116
CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CƠNG BỐ ......................................... 120
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 121
PHỤ LỤC .......................................................................................................... PL1


vi

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT
1

H-NMR

: 1H-Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ
hạt nhân proton)

13

C-NMR

:

13

C-Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hưởng

từ hạt nhân carbon)
Akt

: Protein Kinase B

ATP

: Adenosine triphosphate

CBuOH

: Cao n-buthanol

CC

: Cao cồn

CEtOAc

: Cao ethylacetate

CHe

: Cao n-hexane

COSY

: Chemical Shift Correlation Spectroscopy

COX-2

: cyclooxygenase 2

DEPT

: Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

ĐTĐ

: Đái tháo đường

ELISA

: Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Kỹ thuật miễn dịch liên kết
với enzym)

ERK

: Extracellular signal-regulated kinase (tín hiệu ngoại bào điều tiết
kinase)

FFA

: Free fatty acid (acid béo tự do)

g

: Gam

GLP

: Glucagon like peptide

GLUT

: Glucose transporter (yếu tố vận chuyển glucose)

Grb2

: Growth factorreceptor-bound

h

: Giờ

HFD

: High fat diet (Chế độ ăn giàu chất béo)

HMBC

: Heteronuclear Multiple Bond Connectivity

HSQC

: Heteronuclear Multiple Quantum Coherence

vii

IC50

: Half maximal inhibitory concentration (Nồng độ gây ức chế 50%
hoạt tính sinh học hoặc hóa sinh)

IDF

: International Diabetes Federation (Liên đoàn Đái tháo đường
Quốc tế)

IFG

: Impaired fasting glucose (rối loạn đường huyết lúc đói)

IGT

: Impaired glucose tolerance (rối loạn dung nạp glucose)

IKK-beta

: IkappaB kinase beta

IL-1β

: Interleukin-1 beta,

IL- 6

: Interleukin-6,

IL-8

: Interleukin-8

iNOS

: Nitric oxide synthase

IR

: Insulin receptor

IRS

: Insulin receptor substrate

JNK

: C-Jun NH2-terminal kinase

LD50

: Lethal dose, 50% (Liều gây chết 50% động vật thí nghiệm)

LPS

: Lipopolysaccharide

m

: Khối lượng

MAPK

: Mitogen activated protein kinase

μg

: Microgram

μl

: Microlit

mg

: Miligam

ml

: Mililit

MS

: Mass Spectroscopy (phổ khối lượng)

ND

: Normal diet (Ăn chế độ ăn bình thường)

NFκB

: Nuclear factor-кB

NMR

: Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ
hạt nhân)

OD

: Optical Density (Mật độ quang)

P-value

: Probability value (Trị số p)


viii

PDK1

: Phosphoinositide-Dependent Kinase 1

PDK2

: Phosphoinositide-Dependent Kinase 2

PGE2

: Prostaglandin E2

PI3K

: phosphatidylinositol 3-kinase

PIP2

: phosphatidyl-Inositol-(4,5) biphosphate

PIP3

: Phosphatidylinositol- (3,4,5) -triphosphate

PPAR

: Peroxisome proliferator activator receptor

PPARγ

: Peroxisome proliferator-activated receptor

PTP1B

: Protein tyrosine phosphatase 1B

R

: Receptor

R2

: Hệ số tương quan

Rf

: Hệ số di chuyển

ROS

: Reactive oxygen species (các chuỗi phản ứng oxy hóa)

SGLT1

: Sodium-glucose linked transporter

STZ

: Streptozocin

TNF-α

: yếu tố hoại tử khối u-alpha

TV

: Thực vật

USD

: Đô la Mỹ

WHO

: World Health Organization - Tổ chức Y tế thế giới


ix

DANH MỤC CÁC BẢNG
Số hiệu

Tên bảng

bảng

Trang

1.1.

Phân loại bệnh ĐTĐ

6

1.2.

Tổng quan bệnh ĐTĐ ở Việt Nam

9

1.3.

Một số thuốc và nhóm thuốc chống tăng đường huyết

15

1.4.

Thảo dược trong điều trị đái tháo đường

25

1.5.

1.6.

2.1.
2.2.
2.3.
2.4.
2.6.

Các hợp chất có khả năng chống viêm hoặc cải thiện tính
kháng insulin
Các dịch chiết và hợp chất chiết xuất từ thực vật ức chế
α-amylase hoặc α-glucosidase

Các loại thực vật (20 loài) được thu nhận tại miền Trung
Việt Nam
Thiết bị được sử dụng trong thí nghiệm
Thành phần dinh dưỡng trong khẩu phần ăn của chuột
thí nghiệm
Bố trí thí nghiệm gây chuột ĐTĐ type 2
Bố trí thí nghiệm nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết
của cao chiết phân đoạn chè dây và lá đắng

30

36

45
48
51
53
57

3.1.

Kết quả tách chiết các mẫu thực vật

66

3.2.

Trọng lượng của chuột sau 8 tuần nuôi

67

3.3.

3.4.

3.5.
3.6.

Sự khác biệt về các chỉ số mỡ máu chuột ở nhóm ND và
HFD
Phần trăm hàm lượng cao của các cao chiết phân đoạn lá
chè dây
Nồng độ đường huyết chuột ĐTĐ type 2 sau khi uống
cao chiết phân đoạn lá chè dây
Các số liệu phổ của phloretin

68

81

82
87


x

Số hiệu

Tên bảng

bảng
3.7.
3.8.

3.9.
3.10.
3.11.
3.12.
3.13.
3.14.

Các số liệu phổ của myricitrin (CDE4)
Phần trăm hàm lượng cao của các cao chiết phân đoạn lá
đắng
Nồng độ đường huyết chuột ĐTĐ type 2 sau khi uống
cao chiết phân đoạn lá đắng
Các số liệu phổ của vernonioside E
Sự ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase của các
hợp chất phân lập từ chè dây và lá đắng
Nồng độ đường huyết của chuột ĐTĐ type 2 sau khi uống các
cao chiết
Nồng độ đường huyết của chuột ĐTĐ type 2 sau khi uống các
cao hỗn hợp
Kết quả đánh giá số chuột chết ở các nhóm thử nghiệm sau
khi uống cao hỗn hợp

Trang
89
91

92
96
98
110
110
115


xi

DANH MỤC CÁC HÌNH
Sớ hiệu

Tên hình

hình

Trang

1.1.

Con đường truyền tin nội bào của insulin

11

1.2.

Cơ chế phân tử của tính kháng insulin

13

1.3.

Cấu trúc của một số hợp chất phân lập được từ cây chè dây

18

1.4.

Cấu trúc của một số hợp chất phân lập được từ cây lá đắng

22

2.1.

Các loại thực vật (20 lồi) được thu nhận tại miền Trung Việt
Nam

46

2.2.

Sơ đồ tóm tắt nghiên cứu

49

2.3.

Sơ đồ chiết xuất phân đoạn

50

2.4.

Nguyên liệu và thành phẩm thức ăn chuột béo

51

2.5.

Tóm tắt quy trình định lượng insulin

54

2.6.
3.1.
3.2.

Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa mật độ quang và nồng độ
insulin
Chuột sau 8 tuần nuôi
Sự thay đổi nồng độ đường huyết của các lô chuột ở các thời
điểm khác nhau

55
68
69

3.3.

Nồng độ insulin huyết tương của các lô chuột khác nhau

71

3.4.

Khả năng dung nạp glucose của các lô chuột

72

3.5.

3.6.

3.7.

3.8.

Đường huyết của chuột ĐTĐ type 2 sau 21 ngày điều trị bằng
cao chiết thực vật
Đường huyết của chuột ĐTĐ type 2 sau 21 ngày điều trị bằng
cao chiết thực vật
Đường huyết của chuột ĐTĐ type 2 sau 21 ngày điều trị bằng
cao chiết thực vật
Đường huyết của chuột ĐTĐ type 2 sau 21 ngày điều trị bằng
cao chiết thực vật

73

74

75

77


xii

Sớ hiệu

Tên hình

hình

Trang

3.9.

Ảnh vi thể tiêu bản đúc cắt tụy của chuột (vật kính 400)

79

3.10.

Ảnh vi thể tiêu bản đúc cắt gan của chuột (vật kính 400)

80

3.11.

Cấu trúc của myricetin (CDE1)

84

3.12.

Cấu trúc của dihydromyricetin (CDE2)

85

3.13.

Cấu trúc của phloretin (CDE3)

87

3.14.

Cấu trúc của myricitrin (CDE4)

90

3.15.

Cấu trúc của quercetin (CDE5)

91

3.16.

Cấu trúc của cynaroside (LĐE)

94

3.17.
3.18.
3.19.

3.20.

Chất tinh sạch LĐB (trái) và sắc kí bản mỏng của vernonioside
E (LĐB) (phải)
Cấu trúc của vernonioside E (LĐB)
Đánh giá khả năng gây độc của các hợp chất chè dây đối với
Raw 264.7 (A) và 3T3-L1 (B)
Đánh giá khả năng gây độc của các hợp chất lá đắng đối với
Raw 264.7 (A) và 3T3-L1 (B)

97
98
100

100

Ảnh hưởng của các hợp chất phân lập từ cây chè dây lên quá
3.21.

trình sản xuất TNF-α (A), IL-6 (B), IL-8 (C) và IL-10 (D) trong

101

tế bào Raw 264.7 được kích thích bằng LPS
Ảnh hưởng của các hợp chất phân lập từ cây lá đắng lên quá
3.22.

trình sản xuất TNF-α (A), IL-6 (B), IL-8 (C) và IL-10 (D) trong

102

tế bào Raw 264.7 được kích thích bằng LPS
3.23.

3.24.
3.25.

Hoạt động giảm tính kháng insulin của hợp chất phloretin và
vernonioside E trong tế bào 3T3-L1 được xử lý với TNF-α
Ảnh hưởng của phloretin lên mức độ biểu hiện của hai protein
IRS1 và pY20
Phối hợp các cây thảo dược để tăng hiệu quả trong điều trị ĐTĐ

104

104
109


xiii

Sớ hiệu

Tên hình

hình
3.26.

3.27.

3.28.

Chỉ số triglyceride và cholesterol của chuột ĐTĐ type 2 sau 21
ngày uống cao hỗn hợp
Hàm lượng glycogen gan ở chuột bệnh ĐTĐ type 2 sau khi
uống cao hỗn hợp
Sự ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase của cao chiết
hỗn hợp

Trang

112

113

114


1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài

Đái tháo đường (ĐTĐ) là một bệnh rối loạn chuyển hóa đặc trưng bởi tình trạng
tăng đường huyết mãn tính, do hậu quả của tình trạng giảm tiết insulin hoặc kháng
insulin hoặc kết hợp cả hai. Hậu quả của sự tăng đường huyết là những biến chứng
nghiêm trọng có thể đe dọa đến tính mạng của người bệnh [4]. Trên tồn cầu, tỷ lệ
người mắc bệnh ĐTĐ năm 2016 là 8,5% dân số trưởng thành (422 triệu người) và
con số được dự đoán sẽ tăng lên tới 9,9% vào năm 2045 [142]. Các trường hợp tử
vong liên quan đến bệnh ĐTĐ phổ biến hơn ở các nước có thu nhập thấp và trung
bình, nơi có hơn 80% trường hợp tử vong xảy ra. Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) cho
rằng bệnh ĐTĐ sẽ là một trong bảy nguyên nhân hàng đầu gây ra tử vong vào năm
2030. Sự gia tăng đột biến về tỷ lệ người mắc bệnh đái tháo đường hiện nay đang là
một gánh nặng cho ngành y tế. Theo cơng bố của WHO, chi phí trực tiếp mỗi năm
cho bệnh nhân ĐTĐ ước tính khoảng 153-286 tỷ USD, thậm chí cịn cao hơn thế, ước
tính đến năm 2025, tồn bộ chi phí cho bệnh nhân ĐTĐ trên thế giới là 213-396 tỷ
USD, chiếm khoảng 7-13% ngân sách chăm sóc sức khoẻ của thế giới [84].
Tại Việt Nam, ĐTĐ cũng khơng nằm ngồi tình hình chung của thế giới, đang
có xu hướng gia tăng nhanh chóng. Ước tính năm 2006, 2,5% dân số ở độ tuổi trên
20 tại Việt Nam mắc ĐTĐ type 2, dự kiến năm 2025 sẽ tăng lên 3,5% [2]. Theo điều
tra quốc gia năm 2008, tỷ lệ bệnh ĐTĐ ở các đối tượng 30-64 tuổi tại các thành phố
lớn là 7-10% [1]. Theo ước tính năm 2006, Việt Nam phải chi phí cho bệnh ĐTĐ là
606.251 USD, khoản chi này dự kiến sẽ tăng lên 1.114.430 USD vào năm 2025 [2].
Hiện nay, các thuốc điều trị ĐTĐ có nguồn gốc tổng hợp hố học thường kèm
theo nhiều tác dụng khơng mong muốn, chi phí điều trị cao và người bệnh có xu
hướng phải tăng liều sau một thời gian dài dùng thuốc [4]. Để đáp ứng được nhu cầu
sử dụng thuốc ngày càng gia tăng và hạn chế được những biến chứng gây ra bởi bệnh
đái tháo đường, việc kế thừa nền y học cổ truyền của dân tộc để từ đó nghiên cứu,
sản xuất ra các loại thuốc có nguồn gốc từ thảo dược thiên nhiên hiệu quả và an tồn
cao, có khả năng bổ sung và thay thế thuốc điều trị ĐTĐ đang là hướng quan tâm


2

nghiên cứu của các nhà khoa học [151].
Các loài thực vật luôn là nguồn nguyên liệu cây thuốc quý giá, rất nhiều loại
thuốc hiện có sẵn trên thị trường có nguồn gốc trực tiếp hoặc gián tiếp từ chúng. Có
ít nhất 1200 loài thực vật được sử dụng trong y học cổ truyền vì có tác dụng chống
đái tháo đường, tuy nhiên chỉ có khoảng 450 cây đã được nghiên cứu để khám phá
tác dụng của chúng được công bố [129]. Vì vậy, việc tìm kiếm các loại thuốc trị đái
tháo đường mới từ thực vật tự nhiên vẫn luôn hấp dẫn, đặc biệt ở Việt Nam, một nước
có thảm thực vật phong phú, tài nguyên dược liệu vô cùng quý giá.
Cây chè dây (Ampelosis cantoniensis (H. & A.) PL.), họ Nho (Vitaceae) đã được
nghiên cứu nhiều về thành phần hóa học và hoạt tính chống oxy hóa [146], tuy nhiên
cho đến nay chưa có cơng trình khoa học nào nghiên cứu hoạt tính chống ĐTĐ. Bên
cạnh đó, cây lá đắng (Vernonia amygdalina Del.), họ cúc (Asteraceae) đã có cơng
trình nghiên cứu trên thế giới về khả năng chống ĐTĐ, tuy nhiên các nghiên cứu chưa
nhiều và chưa mang tính tồn diện [35].
Do vậy, để góp phần nghiên cứu tác dụng trị ĐTĐ của một số loài thực vật ở miền
Trung, Việt Nam, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu phân lập và tác dụng điều
trị bệnh đái tháo đường type 2 của các hoạt chất sinh học từ một số loài thực vật
thu hái tại miền Trung”.

2. Mục tiêu của luận án
Sàng lọc một số thực vật ở miền Trung có tác dụng hạ đường huyết, từ đó tiến
hành nghiên cứu thành phần hoá học của các thực vật này để tìm hiểu về cơ chế hạ
đường huyết của các hợp chất có hoạt tính sinh học.

3. Nội dung nghiên cứu của luận án
- Thu thập một số mẫu thực vật ở miền Trung được tham khảo là có tác dụng
trong điều trị ĐTĐ. Tách chiết các mẫu thực vật bằng cồn 70°, sàng lọc tác dụng hạ
đường huyết của các cao chiết trên mơ hình chuột ĐTĐ type 2.
- Chiết phân đoạn lá chè dây và lá đắng bằng các dung mơi có độ phân cực khác

nhau và thử nghiệm khả năng hạ đường huyết của các cao phân đoạn đó trên chuột
ĐTĐ type 2.


3

- Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập từ các phân đoạn có hoạt
tính hạ đường huyết tốt nhất.
- Nghiên cứu về cơ chế hạ đường huyết của các hợp chất phân lập qua việc đánh
giá hiệu quả ức chế enzyme α-glucosidase và α-amylase cùng với thử nghiệm ảnh
hưởng của chúng đến quá trình sinh các cytokine tiền viêm TNF-α, IL-6 và IL-8 (các
các cytokine tiền viêm là một trong những nguyên nhân chính gây nên tình trạng
kháng insulin), cytokine kháng viêm (IL-10) và tác dụng khôi phục biểu hiện hai
protein pIRS-1 và pY20 của tế bào bào (đây là hai protein rất cần thiết cho con đường
truyền tín hiệu insulin).
- Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của cao hỗn hợp, tác dụng của cao hỗn
hợp lên nồng độ cholesterol, triglyceride, hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase, αamylase và hàm lượng glycogen ở chuột ĐTĐ type 2. Xác định độc tính cấp của cao
hỗn hợp.

4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án
Nội dung nghiên cứu của luận án có ý nghĩa khoa học và thực tiễn như sau:
- Ý nghĩa khoa học:
+ Kết quả thu được của luận án đã cung cấp thông tin khoa học về khả năng
điều trị bệnh ĐTĐ của một số thực vật miền Trung, đồng thời xác định được cấu trúc
hóa học của các hợp chất phân lập từ các thực vật có hoạt tính hạ đường huyết tốt
nhất. Kết quả này đóng góp vào cơ sở dữ liệu về hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh
học của Việt Nam
+ Kết quả nghiên cứu của luận án đã góp phần làm rõ cơ chế hạ đường huyết
của các hợp chất phân lập qua việc đánh giá hiệu quả ức chế enzyme α-glucosidase
và α-amylase cùng với thử nghiệm ảnh hưởng của chúng đến quá trình sinh các

cytokine tiền viêm TNF-α, IL-6 và IL-8, cytokine kháng viêm (IL-10) và tác dụng
khôi phục biểu hiện hai protein pIRS-1 và pY20 của tế bào.
- Ý nghĩa thực tiễn:
+ Kết quả của luận án là bằng chứng khoa học góp phần đáp ứng việc sử dụng
các sản phẩm có nguồn gốc thực vật trong phòng và điều trị bệnh ĐTĐ type 2, hạn


4

chế được các tác dụng phụ của thuốc có nguồn gốc tổng hợp và những biến chứng
gây ra bởi bệnh đái tháo đường. Kết quả này là cơ sở để phát triển dược phẩm mới từ
những nguồn nguyên liệu sẵn có ở miền Trung.
+ Kết quả của luận án cũng là cơ sở khoa học để khai thác, sử dụng có hiệu quả
cũng như bảo tồn, phát triển bền vững nguồn tài nguyên thực vật chứa các hợp chất
có hoạt tính sinh học.

5. Đới tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu của luận án là 20 loại thực vật
sinh trưởng tại miền Trung, trong đó hai đối tượng nghiên cứu chủ yếu là cây chè dây
và lá đắng.
- Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu hoạt tính, ứng dụng và cơ chế hạ đường huyết
của các hợp chất phân lập được từ các loại thực vât nghiên cứu.


5

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Bệnh đái tháo đường
1.1.1. Bệnh đái tháo đường
1.1.1.1. Định nghĩa

Đái tháo đường (ĐTĐ) là bệnh rối loạn chuyển hoá do nhiều nguyên nhân khác
nhau gây nên, đặc trưng của bệnh là tăng đường huyết mạn tính cùng với rối loạn
chuyển hoá lipid, protein ... do thiếu insulin có kèm hoặc khơng kèm kháng insulin
với các mức độ khác nhau. Các triệu chứng rõ rệt của tăng đường huyết mạn tính là
khát nước, mắt nhìn mờ, tiểu nhiều và giảm cân. Tăng đường huyết mãn tính của
bệnh ĐTĐ có liên quan đến các biến chứng lâu dài bao gồm bệnh võng mạc với khả
năng mất thị lực; suy thận; bệnh thần kinh ngoại biên, các triệu chứng tim mạch và
tăng huyết áp [33].
Bệnh nhân được chẩn đoán xác định là mắc bệnh ĐTĐ khi [33]:
- Hemoglobin (A1c) ≥ 6,5% hoặc nồng độ glucose huyết lúc đói ≥ 7,0 mmol
/l(≥ 126 mg/dl).
- Nồng độ đường huyết ở thời điểm hai giờ sau nghiệm pháp dung nạp glucose
đường uống ≥ 11,1 mmol/l (200 mg/dl) hoặc có các triệu chứng điển hình của tăng
đường huyết và nồng độ đường huyết ở thời điểm bất kỳ ≥ 11,1 mmol/l (200 mg/dl).
Có một số trường hợp nồng độ đường huyết không đáp ứng tiêu chí chẩn đốn
cho bệnh ĐTĐ nhưng lại cao hơn so với nồng độ đường huyết bình thường. Những
trường hợp này được xác định là rối loạn đường huyết lúc đói (impaired fasting
glucose-IFG) hoặc rối loạn dung nạp glucose (impaired glucose tolerance-IGT).
Người bệnh được coi là tiền ĐTĐ (cho thấy nguy cơ tương đối cao cho sự phát triển
của bệnh ĐTĐ trong tương lai khi) khi:
+ Đường huyết lúc đói từ 100 mg/dl (5,6 mmol/l) đến 125 mg/dl (6,9 mmol/l)
(IFG).
+ Đường huyết ở thời điểm hai giờ sau sau khi thực hiện thử nghiệm khả năng
dung nạp glucose, glucose huyết từ 140 mg/dl (7,8 mmol/l) đến 199 mg/dl (11,0
mmol/l) (IGT).


6

1.1.1.2. Phân loại

Theo báo cáo của Hiệp hội đái tháo đường Hoa Kỳ (ADA), việc phân loại ĐTĐ
được nêu ở bảng 1.1 như sau:
Bảng 1.1. Phân loại bệnh ĐTĐ
Đặc
điểm

ĐTĐ type 1

ĐTĐ type 2

ĐTĐ thai kỳ

Liên quan đến gen di Liên quan đến gen di truyền, Hormon

sản

truyền, hệ thống miễn dịch béo phì, chế độ ăn uống và sinh lúc mang
của chính cơ thể người ít vận động gây nên tình thai, theo gen di
bệnh tấn công và phá hủy trạng kháng insulin. Trong truyền, do chế
một phần của tuyến tụy sản tình trạng kháng insulin, độ ăn uống và
xuất insulin dẫn đến việc gan, cơ và các tế bào mỡ béo phì.
Ngun
nhân

khơng thể sản xuất insulin. giảm khả năng sử dụng
Sự thiếu hụt hoàn toàn insulin, tác động này làm
insulin làm glucose không cản trở mang glucose vào
thể đi vào tế bào để sinh trong các tế bào của cơ thể,
năng lượng mà tăng cao tụy buộc phải hoạt động
trong máu.

nhiều hơn để bù đắp, về lâu
dài khiến tụy bị tổn thương,
giảm cả về số lượng và chất
lượng của insulin.

Do thiếu hụt insulin tuyệt Bệnh diễn biến âm thầm Bệnh thường ít
đối nên các triệu chứng trong nhiều năm, ít triệu triệu chứng. Hay
xuất hiện rầm rộ và đột chứng. Do đó, triệu chứng đói bụng hơn và
ngột, bao gồm: đi tiểu của bệnh chỉ xuất hiện khi khát nước hơn,
Triệu

nhiều lần trong ngày, khát bệnh ở giai đoạn bùng phát. thường xuyên đi

chứng

nước liên tục, đói và mệt Thường bao gồm một số vệ sinh.
mỏi, sụt cân không rõ triệu chứng như: mệt mỏi
nguyên nhân, mờ mắt, hơi bất thường, tê bì tay chân,
thở có mùi trái cây lên da khô, ngứa, dễ bị nhiễm
men. Do triệu chứng rõ trùng, vết thương chậm


7

ràng nên người bệnh đái lành. Thường được phát
tháo đường type 1 thường hiện muộn hơn, khi người
được phát hiện từ khá sớm. bệnh có kèm theo một số
biến chứng khác.
Diễn ra nhanh, thường cấp Diễn ra chậm hơn, thường Các thai phụ

tính với tình trạng hơn mê xuất hiện âm thầm sau vài mắc ĐTĐ thai
– Biến chứng mãn tính: năm bắt đầu từ khi bị đường kỳ tăng nguy cơ
nhồi máu cơ tim, đột quỵ, huyết cao.

tiến triển thành

bệnh võng mạc, suy thận, – Biến chứng mãn tính: ĐTĐ type 2 và
biến chứng thần kinh, loét, Tương tự như người bệnh các biến chứng
Biến

nhiễm trùng bàn chân.

ĐTĐ type 2.

liên quan đặc
biệt

chứng

là

biến

chứng tim mạch.
Trẻ sinh ra từ
các bà mẹ bị
ĐTĐ thai kỳ có
nguy cơ béo phì,
sớm ĐTĐ type
2.

Được chẩn đoán ở trẻ em khởi phát ở người trưởng Chẩn đoán ở phụ

Tuổi

hoặc người trưởng thành thành và người cao tuổi, thể nữ mang thai.
trẻ tuổi, thể trạng gầy.

trạng béo (chiếm 85,2%).

Bắt buộc dùng insulin.

viên hoặc insulin tùy thuộc Sử dụng thuốc

Điều trị

vào thời điểm phát hiện và điều trị bệnh như
triệu chứng.

metformin.

Đây là một bệnh nguy Thay đổi lối sống, thường Tăng cường tập
Phịng

hiểm, khơng có cách nào xun tập thể dục, thay đổi thể dục và thay

ngừa

phòng tránh được.

chế độ ăn uống có lợi cho đổi chế độ ăn

sức khỏe.

1.1.1.3. Tình hình bệnh ĐTĐ trên thế giới và Việt Nam

uống.


8

a. Tổng quan bệnh ĐTĐ trên thế giới
Do lão hóa, tốc độ gia tăng dân số, đơ thị hóa cùng với lối sống ít vận động và
tỷ lệ béo phì cao, số người mắc bệnh ĐTĐ đang gia tăng trên tồn cầu với tốc độ
nhanh chóng [129]. Ước tính năm 2017 có 451 triệu người có bệnh ĐTĐ trên tồn
thế giới. Những con số này dự kiến sẽ tăng lên 693 triệu vào năm 2045. Ước tính rằng
gần một nửa số người (49,7%) sống chung với bệnh ĐTĐ không được chẩn đốn.
Khoảng 5 triệu ca tử vong trên tồn thế giới được cho là do bệnh ĐTĐ ở độ tuổi 20.
Chi phí chăm sóc sức khỏe tồn cầu cho người mắc bệnh ĐTĐ được ước tính là 850
tỷ USD vào năm 2017 [57].
Ở các nước thu nhập thấp và trung bình, phần lớn những người mắc bệnh
ĐTĐ nằm trong độ tuổi 45-64 [92]. Ngược lại, phần lớn những người mắc bệnh
ĐTĐ ở các nước phát triển đều nhỏ hơn 64 tuổi. Đến năm 2030, ước tính số người
mắc bệnh ĐTĐ nhỏ hơn 64 tuổi sẽ là hơn 82 triệu ở các nước thu nhập thấp đến
trung bình và lớn hơn 48 triệu ở các nước thu nhập cao [157]. Sự gia tăng lớn nhất
trong bệnh nhân ĐTĐ được dự kiến là trong các nhóm tuổi có hiệu quả kinh tế cao
nhất [45].
Mỗi năm trên thế giới có 7 triệu người mắc bệnh ĐTĐ, chủ yếu là bệnh ĐTĐ
type 2. Tỷ lệ hiện mắc bệnh ở người trưởng thành trong độ tuổi 20-70 dự kiến sẽ
tăng từ 285 triệu người vào năm 2010 lên 438 triệu người vào năm 2030. Người
mắc bệnh ĐTĐ type 2 có nguy cơ mắc bệnh tim mạch cao gấp 2-4 lần và 80%
những người mắc bệnh ĐTĐ sẽ chết vì bệnh này. WHO ước tính rằng có tới 15%

ngân sách y tế hàng năm được chi cho các bệnh liên quan đến bệnh ĐTĐ. Trong
khi ĐTĐ type 2 đặt ra gánh nặng kinh tế lớn cho tất cả các quốc gia, các nước
đang phát triển phải chịu gánh nặng cao nhất vì hơn 80% trường hợp xảy ra ở các
quốc gia này. Xu hướng hiện nay cho thấy hơn 60% dân số mắc bệnh ĐTĐ trên
thế giới sẽ ở các nước Châu Á [127].
b. Tổng quan bệnh ĐTĐ ở Việt Nam
Trong những năm gần đây, bệnh ĐTĐ ở Việt Nam đang có chiều hướng gia
tăng theo thời gian và theo mức độ phát triển kinh tế cũng như đơ thị hóa. Tình hình


9

ĐTĐ ở Việt Nam được trình bày ở bảng 1.2.
Bảng 1.2. Tổng quan bệnh ĐTĐ ở Việt Nam
Đặc

Tổng quan ĐTĐ ở Việt Nam

điểm
Năm 2008, tỷ lệ ĐTĐ chung là 5,7%, thành phố 6,9%, đồng bằng 6,3%,
ven biển 3,8%, miền núi 4,8%, tỷ lệ rối loạn dung nạp glucose là 15,4% và
tỷ lệ rối loạn đường huyết lúc đói là 18,2% [5]. Năm 2013, trong kết quả
Tỷ lệ báo cáo của “Dự án phòng chống ĐTĐ Quốc gia” do Bệnh viện Nội tiết
người Trung ương thực hiện trên 11.000 người tuổi 30-69 tại 6 vùng gồm: Miền
mắc

núi phía Bắc, Đồng bằng sông Hồng, Duyên hải miền Trung, Tây Nguyên,

bệnh

Đông Nam Bộ và Tây Nam Bộ đã cho thấy tỷ lệ mắc bệnh ĐTĐ là 5,7%

ĐTĐ

(tỷ lệ mắc cao nhất ở Tây Nam Bộ là 7,2%, thấp nhất là Tây Nguyên 3,8%)
[1]. Năm 2015, Việt Nam có 3,5 triệu người trưởng thành mắc đái tháo
đường, tương đương 6% dân số và dự kiến đến năm 2040 sẽ có 6,1 triệu
người trưởng thành có thể mắc đái tháo đường, tăng 74% [168].
Những người trên 45 tuổi có nguy cơ mắc ĐTĐ type 2 cao gấp 4 lần những

Nhóm người dưới 45 tuổi. Kết quả điều tra do Bộ Y tế thực hiện năm 2015 ở
tuổi

nhóm tuổi từ 18-69, cho thấy tỷ lệ ĐTĐ tồn quốc là 4,1%, tiền ĐTĐ là
3,6% [21].

Tình
hình
quản
lý
bệnh
ĐTĐ

Năm 2006 của Tạ Văn Bình cho thấy rằng 36% đối tượng đã được phát
hiện từ trước và 64% mắc bệnh ĐTĐ mà không được phát hiện [3]. Tỷ lệ
bệnh ĐTĐ chưa được chẩn đốn ở thành phố Hồ Chí Minh, qua điều tra
dịch tễ năm 2001 xấp xỉ 40% [67]. Gần một nửa số người đang sống với
bệnh đái tháo đường (độ tuổi 20-79) khơng được chẩn đốn (46,5%). Đái
tháo đường được quản lý tại cơ sở y tế mới chỉ 28,9% trong khi số chưa
được quản lý theo số liệu thống kê mới nhất năm 2015 là 71,1% [168].

Nhìn chung các nghiên cứu cho thấy bệnh ĐTĐ đang ngày càng tăng nhanh,
không chỉ ở các khu công nghiệp, thành phố mà còn cả miền núi, trung du, tỷ lệ bệnh
nhân ĐTĐ khơng được chẩn đốn cịn cao, tỷ lệ bệnh nhân ĐTĐ ngày càng trẻ hóa


10

cũng như nhận thức chung của cộng đồng về bệnh ĐTĐ còn thấp.

1.1.2. Bệnh sinh đái tháo đường type 2
1.1.2.1. Cơ chế tác dụng của insulin
Insulin là một peptide 51 axit amin, được sản xuất và tiết ra bởi các tế bào đảo
tụy. Nó bao gồm hai chuỗi polypeptide, A và B, gồm 21 và 30 axit amin tương ứng,
được nối với nhau bằng cầu nối disulfide. Hoạt động sinh học của insulin bắt đầu khi
nó liên kết với thụ thể. Bản thân thụ thể của insulin (insulin receptor -IR) là gồm 2
tiểu đơn vị α và 2 tiểu đơn vị β. Tiểu đơn vị α có chứa vị trí gắn insulin nằm ở mặt
ngoài của màng plasma. Tiểu đơn vị β xuyên qua màng với miền tyrosine kinase nội
bào được kích hoạt bởi q trình phosphoryl hóa. Insulin liên kết với tiểu đơn vị α
của thụ thể và kích hoạt hoạt động tyrosine kinase của tiểu đơn vị β dẫn đến q trình
tự phosphoryl hóa và kích hoạt thụ thể insulin. Kinase này lại hoạt hóa tiếp nhiều
protein kinase khác bằng phản ứng phosphoryl hóa các gốc tyrosine đặc hiệu. Cuối
cùng những enzym này có thể phosphoryl hóa một nhóm các phân tử cơ chất nội bào
điển hình như là thụ thể insulin nền (insulin receptor substrate -IRS). Quá trình
phosphoryl hóa có thể kích hoạt con đường tín hiệu phosphatidylinositol-3-kinase
(PI3K)/AKT, còn được gọi là protein kinase B (PKB), chịu trách nhiệm cho hầu hết
các hoạt động trao đổi chất như thúc đẩy sự chuyển vị của protein vận chuyển glucose,
glycogen, tổng hợp lipid, protein và kiểm sốt q trình tân tạo đường ở gan [156].
Các protein IRS phosphoryl hóa liên kết với các tiểu đơn vị điều tiết
phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K), điều này dẫn đến việc kích hoạt PI3K và PI3K

phosphoryl

hóa

phosphatidylinositol

4,5-biphosphate

(PIP2)

thành

phosphatidylinositol (3,4,5)-triphosphate (PIP3). PIP3 lại kích hoạt các kinase: PDK1 và PDK-2 và cuối cùng là kích hoạt AKT/PKB kinase. Sau đó, AKT xúc tác q
trình phosphoryl hóa protein cơ chất AS160 kích thích sự dịch chuyển các chất vận
chuyển glucose GLUT-4 từ các túi tế bào chất đến bề mặt màng tế bào và do đó làm
tăng sự vận chuyển glucose phụ thuộc insulin vào tế bào (hình 1.1) [143].