Giáo án thực hành căn bản vi sinh học

MỤC LỤC

NỘI QUY PHÒNG THỰC TẬP VI SINH ................................................................................................ 5
MỤC TIÊU, YÊU CẦU VỀ THỰC TẬP VI SINH VẬT......................................................................... 6
Bài 1: CÁCH SỬ DỤNG KÍNH HIỂN VI VÀ CÁC LOẠI HÌNH THỂ CỦA VI KHUẨN ................. 7
I. SƠ LƢỢC VỀ LỊCH SỬ VÀ CÁC LOẠI KÍNH HIỂN VI ............................................................. 7
1. Sự phát minh ra kính hiển vi.......................................................................................................... 7
2. Các loại kính hiển vi ........................................................................................................................ 7
II. KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC NỀN SÁNG ................................................................................... 8
1. Cấu tạo ............................................................................................................................................. 8
2. Cách sử dụng ................................................................................................................................... 9
III. CÁCH BẢO QUẢN KÍNH HIỂN VI ............................................................................................10
IV. CÁC LOẠI HÌNH THỂ CỦA VI KHUẨN...................................................................................10
1. Cầu khuẩn (Cocci) .........................................................................................................................10
2. Trực khuẩn (Bacterium - Số nhiều Bacteria) ..............................................................................10
3. Xoắn khuẩn ....................................................................................................................................11
V. PHẦN THỰC TẬP ...........................................................................................................................11
Bài 2: CÁC KỸ THUẬT TIỆT KHUẨN, KHỬ KHUẨN TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM VI SINH
VẬT ............................................................................................................................................................12
I. KHÁI NIỆM .......................................................................................................................................12
II. THAO TÁC VÃ KỸ THUẬT VÔ KHUẨN ...................................................................................12
1. Ý nghĩa của thao tác và kỹ thuật vô khuẩn trong thực hành vi sinh vật..................................12
2. Các thao tác và kỹ thuật vô khuẩn ..............................................................................................13
III. CÁC PHƢƠNG PHÁP KHỬ KHUẨN.........................................................................................14
1. Các loại cồn ....................................................................................................................................14
2. Các hợp chất Phenol .....................................................................................................................14
3. Các hợp chất ammonium bậc 4 ....................................................................................................14
4. Các hợp chất halogen ....................................................................................................................14
5. Muối kim loại .................................................................................................................................15
6. Chọn lựa hoá chất để khử khuẩn .................................................................................................15
IV. CÁC KỸ THUẬT TIỆT KHUẨN .................................................................................................15

1. Đốt trên ngọn lửa nóng .................................................................................................................15
2. Sấy khơ bằng khơng khí nóng (dùng tủ sấy khơ) .........................................................................15
3. Tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm dƣới áp lực (nồi hấp Autoclave)........................................................16
4. Phƣơng pháp Tyndall ...................................................................................................................18


Thực hành Căn bản Vi sinh học

Khoa Y

5. Tiệt khuẩn bằng lọc ...................................................................................................................... 18
6. Hóa chất ......................................................................................................................................... 18
7. Phóng xạ ion hóa ........................................................................................................................... 19
V. PHẦN THỰC TẬP .......................................................................................................................... 19
Bài 3: KỸ THUẬT LÀM TIÊU BẢN VÀ CÁC KỸ THUẬT NHUỘM VI SINH VẬT..................... 20
I. ĐẠI CƢƠNG VỀ NHUỘM VI KHUẨN......................................................................................... 20
1. Khái niệm về nhuộm vi khuẩn ..................................................................................................... 20
2. Các loại thuốc nhuộm vi khuẩn ................................................................................................... 20
3. Giới thiệu sơ lƣợc các loại kỹ thuật nhuộm vi khuẩn ................................................................ 20
II. CÁCH LÀM TIÊU BẢN ................................................................................................................. 21
1. Dàn mỏng vết bôi .......................................................................................................................... 21
2. Làm khô ......................................................................................................................................... 21
3. Cố định........................................................................................................................................... 21
III. KỸ THUẬT NHUỘM ĐƠN .......................................................................................................... 21
1. Mục đích ........................................................................................................................................ 21
2. Nguyên tắc ..................................................................................................................................... 22
3. Thuốc nhuộm ................................................................................................................................ 22
4. Cách thực hiện .............................................................................................................................. 22
5. Kết quả soi kính ............................................................................................................................ 22
IV. PHƢƠNG PHÁP NHUỘM GRAM .............................................................................................. 22

1. Mục đích ........................................................................................................................................ 22
2. Nguyên tắc ..................................................................................................................................... 22
3. Thuốc nhuộm ................................................................................................................................ 23
4. Cách thực hiện .............................................................................................................................. 23
5. Kết quả soi kính ............................................................................................................................ 24
V. PHƢƠNG PHÁP NHUỘM ZIEHL-NEELSEN ........................................................................... 24
1. Nguyên lý ....................................................................................................................................... 24
2. Thuốc nhuộm ................................................................................................................................ 24
3. Kỹ thuật nhuộm ............................................................................................................................ 24
4. Kết quả soi kính ............................................................................................................................ 25
VI. PHẦN THỰC TẬP......................................................................................................................... 25
Bài 4: CÁCH LẤY, BẢO QUẢN VÀ VẬN CHUYỂN BỆNH PHẨM TRONG CHẨN ĐOÁN VI
SINH VẬT ................................................................................................................................................. 26
I. KHÁI NIỆM VÀ NGUYÊN TẮC LẤY BỆNH PHẨM ................................................................. 26
1. Khái niệm về bệnh phẩm ............................................................................................................. 26
2


Thực hành Căn bản Vi sinh học

Khoa Y

2. Một số nguyên tắc cơ bản .............................................................................................................26
II. CÁC LOẠI BỆNH PHẨM, MẪU NGHIỆM THƢỜNG LẤY ....................................................27
1. Máu .................................................................................................................................................27
2. Các bệnh phẩm đƣờng hơ hấp .....................................................................................................27
3. Các bệnh phẩm đƣờng tiêu hố ...................................................................................................28
4. Bệnh phẩm đƣờng tiết niệu, sinh dục ..........................................................................................28
5. Bệnh phẩm từ vết thƣơng, vết bỏng, áp xe, mụn nhọt ...............................................................29
6. Bệnh phẩm ở tử thi........................................................................................................................29

7. Các loại vật phẩm ..........................................................................................................................29
III. PHẦN THỰC TẬP .........................................................................................................................29
Bài 5: CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH VI KHUẨN ............................................30
I. KHẢO SÁT TRỰC TIẾP BẰNG KÍNH HIỂN VI.........................................................................30
II. PHÂN LẬP VÀ NI CẤY............................................................................................................30
1. Mơi trƣờng nuôi cấy ......................................................................................................................30
2. Nuôi cấy vi khuẩn ..........................................................................................................................32
3. Phân lập bằng ria cấy....................................................................................................................33
III. XÁC ĐỊNH VI KHUẨN .................................................................................................................34
IV. PHẦN THỰC TẬP .........................................................................................................................34
Bài 6: CÁC PHẢN ỨNG SINH HOÁ – MIỄN DỊCH DÙNG TRONG CHẨN ĐOÁN VI SINH VẬT
.....................................................................................................................................................................35
I. CÁC PHẢN ỨNG SINH HOÁ .........................................................................................................35
1. Những phản ứng liên hệ đến nguồn thức ăn có nitơ ..................................................................35
2. Những phản ứng liên hệ đến nguồn thức ăn có carbon .............................................................36
3. Những phản ứng liên hệ đến enzym ............................................................................................37
II. CÁC PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH .....................................................................................................37
1. Xét nghiệm Viêm gan B (HbsAg) .................................................................................................37
2. Xét nghiệm HIV.............................................................................................................................39
III. PHẦN THỰC TẬP .........................................................................................................................40
Bài 7: KHÁNG SINH ĐỒ ..........................................................................................................................41
I. ĐẠI CƢƠNG ......................................................................................................................................41
1. Định nghĩa ......................................................................................................................................41
2. Mục đích .........................................................................................................................................41
3. Các yêu cầu khi thực hiện kháng sinh đồ ....................................................................................41
4. Các kỹ thuật làm kháng sinh đồ ..................................................................................................42
II. KỸ THUẬT ĐĨA KHÁNG SINH KHUẾCH TÁN TRONG THẠCH (Kirby - Bauer) ............42
3

Thực hành Căn bản Vi sinh học

Khoa Y

1. Nguyên lý ....................................................................................................................................... 42
2. Chuẩn bị phƣơng tiện................................................................................................................... 42
III. PHẦN THỰC TẬP ........................................................................................................................ 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................................................ 45

4


Thực hành Căn bản Vi sinh học

Khoa Y

NỘI QUY PHÒNG THỰC TẬP VI SINH
Để đảm bảo an toàn và trật tự trong buổi thực hành ở phịng thí nghiệm, sinh viên
có trách nhiệm thực hiện đúng các quy định sau:
1. Phải có mặt ở phịng thực tập 5 phút trước giờ vào lớp, phải mặc áo choàng
trắng và đeo bảng tên khi vào phòng thực tập.
2. Phải để cặp xách và đồ dùng cá nhân đúng quy định, không để trên bàn thực
tập.
3. Ở phòng thực tập phải tuyệt đối giữ gìn trật tự: ngồi đúng chỗ quy định, khơng
được đùa giỡn, không được hút thuốc hay ăn uống, ra khỏi phịng thí nghiệm cần xin
phép cán bộ hướng dẫn.
4. Sử dụng đúng quy cách dụng cụ thí nghiệm như kính hiển vi và các dụng cụ thí
nghiệm khác
+ Trước và sau khi sử dụng cần cấy vi khuẩn phải được tiệt khuẩn bằng cách nung
đỏ trên ngọn lửa.

+ Khi vô ý làm đổ, vỡ ống nghiệm hay hộp lồng có chứa vi khuẩn phải báo ngay
cho cán bộ hướng dẫn biết để xử lý.
+ Các lam kính đã dùng xong phải để vào bình chứa thuốc sát khuẩn đặt ở bàn
cuối phịng thực tập.
+ Kính hiển vi dùng xong phải lau sạch dầu ở vật kính (100x) bằng giấy lau kính
theo quy định và cuối buổi thực tập phải trả đúng vào tủ bảo quản.
5. Phải giữ gìn vệ sinh trong phịng thực tập: khơng được xả rác hay làm vấy bẩn
thuốc nhuộm xuống sàn nhà, sau mỗi buổi thực tập các dụng cụ thí nghiệm, chai thuốc
nhuộm cần đặt đúng nơi quy định ban đầu. Bàn nhuộm vi khuẩn ở cuối phịng sau khi
hồn tất buổi thực tập cần làm vệ sinh và trả về đúng vị trí như trước buổi thực tập.
6. Sau buổi thực tập phải rửa tay bằng xà phòng hay bằng nước sát khuẩn.
7. Ở phịng thí nghiệm sinh viên phải tn thủ quy định của phòng thực tập và các
hướng dẫn của cán bộ hướng dẫn.
Các sinh viên không tuân thủ nội quy và hướng dẫn trong buổi thực hành sẽ bị đề
nghị xử lý kỷ luật ở Bộ môn hay đề nghị mức kỷ luật của trường.

5


Thực hành Căn bản Vi sinh học

Khoa Y

MỤC TIÊU, YÊU CẦU VỀ THỰC TẬP VI SINH VẬT
1. Qua thực tập sinh viên rèn luyện từng bước thói quen tỉ mỉ, chính xác, trung
thực của người cán bộ.
2. Sinh viên học tập các phương pháp chuẩn đoán Vi sinh vật. Quá trình thực tập
giúp sinh viên nắm giữ một số nguyên tắc, kiến thức cơ bản sau:
- Sử dụng thành thạo kính hiển vi quang học
- Quan sát được hình thể tế bào vi khuẩn

- Thao tác nhuộm được một số phương pháp nhuộm vi khuẩn
- Nắm được các đặc tính sinh hóa cơ bản của vi khuẩn
- Biết được, thực hiện được quá trình phân lập, định danh một số vi khuẩn gây
bệnh quan trọng.
3. Thu thập những hiểu biết cần thiết về chỉ định các xét nghiệm Vi sinh vật và
giải thích được một số các kết quả xét nghiệm Vi sinh vật.
4. Thực hiện thành thạo một số xét nghiệm chẩn đoán Vi sinh vật đơn giản trong
những
trường
hợp
cần
thiết.

6


Thực hành Căn bản Vi sinh học

Khoa Y

Bài 1
CÁCH SỬ DỤNG KÍNH HIỂN VI VÀ CÁC LOẠI HÌNH THỂ CỦA VI KHUẨN
Mục tiêu:
1. Trình bày được đặc điểm cấu tạo của kính hiển vi quang học nền sáng.
2. Nắm được cách sử dụng và bảo quản khi sử dụng vật kính x100.
3. Nhận dạng và phân biệt được các loại hình thể của vi khuẩn.
I. SƠ LƢỢC VỀ LỊCH SỬ VÀ CÁC LOẠI KÍNH HIỂN VI
1. Sự phát minh ra kính hiển vi
Anton van Leeuwenhoek (1632 - 1723), người Hà Lan, là người đầu tiên ở thế kỷ
17 nhìn thấy vi sinh vật nhờ những kính hiển vi độ phóng đại 270 - 300 lần mà ông đã

chế tạo (1676). Ông đã chế tạo những kính hiển vi bằng cách xếp nhiều thấu kính ở
những khoảng cách khác nhau trên cùng một trục quang học, kết quả đã làm phóng đại
hình ảnh của các vật thể lên nhiều lần, ơng đã dùng để quan sát hồng cầu, phấn hoa, mao
mạch phổi và sau đó với chiếc kính hiển vi có độ phóng đại khoảng 300 lần ơng đã phát
hiện các vi sinh vật trong nước.
2. Các loại kính hiển vi
Kính hiển vi quang học nền sáng: thường được sử dụng tại các phịng thí nghiệm
để xét nghiệm với mục đích quan sát hình thể, tính chất bắt màu của vi khuẩn.
Kính hiển vi nền đen: là loại kính hiển vi quang học, nhưng bộ phận tụ quang được
thay thế bằng một cấu trúc khác để tạo nền tối, hay sử dụng để quan sát sự di động của vi
khuẩn.
Kính hiển vi tương phản phase: Kính hiển vi tương phản phase cung cấp một
phương tiện để đạt được độ tương phản thích hợp có thể nhìn thấy được vi sinh vật mà
khơng cần nhuộm. Kính hiển vi tương phản phase thường được sử dụng để khảo sát nấm
men, mốc và các nguyên bào.
Kính hiển vi huỳnh quang: kính hiển vi quang học nhưng có nguồn sáng là đèn
huỳnh quang, thường được dùng để quan sát các tiêu bản sử dụng thuốc nhuộm huỳnh
quang, phân biệt được các cấu trúc khác nhau trong tế bào vi sinh vật.
Kính hiển vi điện tử: sử dụng chùm tia điện tử có bước sóng rất ngắn, năng suất
phân li rất lớn nên độ phân giải cao, giúp phân biệt 2 điểm rất gần nhau, dùng để quan sát
virus, cấu trúc phân tử của tế bào.
Trong các phịng thí nghiệm vi sinh cơ bản, kính hiển vi quang học nền sáng là
loại kính được sử dụng phổ biến và dễ sử dụng nhất.

7


Thực hành Căn bản Vi sinh học

Khoa Y

II. KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC NỀN SÁNG
1. Cấu tạo
Gồm có giá kính, hệ thống điều chỉnh nhanh, tinh và hệ thống quang học.
1.1. Giá kính
Gồm có đế kính, thân kính, ống kính, bàn xoay, bàn kính.
- Đế kính khá nặng có lỗ để cắm đèn chiếu hoặc cắm gương phản chiếu.
- Thân kính có hình cong để cầm và di chuyển dễ dàng kính hiển vi.
- Ống kính mang thị kính, có thể cố định hoặc quay lúc nới lỏng con ốc nhỏ ở bên
dưới ống kính.
- Bàn xoay có nhiều lỗ để lắp các vật kính.
- Bàn kính dùng để mang tiêu bản, có 2 ốc để di chuyển tiêu bản theo những chiều
thẳng góc với nhau, có kẹp cố định tiêu bản, có thước đo và du xích để ghi toạ độ.
1.2. Hệ thống điều chỉnh nhanh và tinh
Cần thiết để điều chỉnh tiêu bản. Hệ thống gồm có 2 ốc đặt trên cùng một trục. Ốc
lớn (ốc vĩ cấp) điều chỉnh nhanh làm cho ảnh hiện ra, ốc nhỏ (ốc vi cấp) điều chỉnh chậm
và tinh nhằm điều chỉnh ảnh cho thật rõ. Chỉ khi nào ảnh hiện ra khi điều chỉnh ốc lớn rồi
mới vặn ốc nhỏ để làm rõ ảnh.
1.3. Hệ thống quang học
Gồm có vật kính, thị kính, kính tụ quang và đèn chiếu.
- Thị kính gồm một hệ thống 2 thấu kính, một hướng về mắt, một hướng về vật quan
sát.
- Vật kính là một hệ thống quang học phức tạp trực tiếp phóng đại mẫu vật quan
sát. Nó gồm một số thấu kính, thấu kính ngồi cùng hướng vào vật quan sát gọi là thấu
kính trực diện.
- Có 2 loại vật kính:
+ Vật kính thơ: Vật kính thơ có độ phóng đại nhỏ, đường kính thấu kính tương đối
lớn như vật kính 10, vật kính 40.
+ Vật kính dầu: có độ phóng đại lớn, hay dùng là vật kính 100, thấu kính có đường
kính nhỏ. Do đó chỉ có một phần của chùm tia sáng chiếu lọt vào vật kính, một phần ánh

sáng bị khúc xạ ra ngồi nên ảnh khơng rõ. Muốn có ảnh rõ phải đặt giữa mẫu vật và vật
kính một giọt dầu có chiết xuất n = 1,515 gần bằng chiết xuất của thuỷ tinh n =1,52 để
tạo nên một môi trường đồng nhất để ánh sáng không bị khúc xạ mà đi thẳng vào vật
kính.
Muốn biết độ phóng đại của thấu kính hiển vi người ta nhân độ phóng đại của thị
kính với độ phóng đại của vật kính.
- Kính tụ quang gồm có một hệ thống thấu kính tập trung ánh sáng và một hệ
thống chắn sáng có nhiệm vụ giảm bớt góc của hình nón ánh sáng thế nào để sau khi qua
mẫu vật và đến vật kính thì nó khơng vượt qua đường kính của thấu kính trực diện.
8


Thực hành Căn bản Vi sinh học

Khoa Y

- Đèn chiếu đặt ngay dưới tụ quang cung cấp một nguồn sáng thích hợp.

Cấu tạo kính hiển vi quang học
(1.Thị kính, 2.Giá điều chỉnh vật kính, 3.Vật kính, 4.Ốc vĩ cấp, 5.Ốc vi cấp, 6.Bàn
kính, 7.Nguồn sáng, 8.Tụ quang, 9.Vi chỉnh)
2. Cách sử dụng
2.1. Các bƣớc để soi kính
- Đặt tiêu bản lên bàn để tiêu bản, dùng kẹp để giữ tiêu bản, nhỏ 1 giọt dầu soi
kính để soi chìm trên phiến kính khi soi vật kính x100.
- Chọn vật kính: tùy theo mẫu tiêu bản và mục đích quan sát để chọn vật kính thích
hợp.
- Điều chỉnh ánh sáng.
- Điều chỉnh tụ quang: đối với vật kính x10 hạ tụ quang đến tận cùng, vật kính x40
để tụ quang ở đoạn giữa, vật kính x100 để tụ quang cao nhất.

- Điều chỉnh cỡ màn chắn tương ứng với vật kính.
- Nâng bàn kính để tiêu bản từ từ sát với vật kính (nếu dùng vật kính x100 thì để
tiêu bản chạm sát đầu vật kính). Phải quan sát khoảng cách giữa tiêu bản và vật kính để
tránh làm vỡ tiêu bản.
- Mắt nhìn thị kính, tay vặn ốc vĩ cấp để đưa bàn kính xuống cho đến khi nhìn thấy
hình ảnh mờ của vi trường, điều chỉnh ốc vi cấp để được hình ảnh rõ nét.
- Muốn quan sát được tốt tiêu bản thì: mắt nhìn vào thị kính và một tay điều chỉnh
ốc vi cấp sao cho hình ảnh quan sát luôn rõ nét, tay kia xoay ốc xe tiêu bản để chuyển
dịch vị trí cần quan sát.
- Cần phải soi tiêu bản một cách tuần tự, theo đường “dích dắc” cho đến lúc nào
tìm được hình thể vi khuẩn thì điều chỉnh ốc vi cấp để có hình thể vi khuẩn rõ nét nhất.
2.2. Ghi toạ độ của một điểm ở trên tiêu bản

9


Thực hành Căn bản Vi sinh học

Khoa Y

Để có thể tìm trở lại một điểm cần quan sát ở trên tiêu bản thì phải ghi toạ độ của điểm
đó, muốn thế đọc hoành độ và tung độ ở trên thước chia mm di động đồng thời với tiêu bản và
2 du xích cố định, 2 thước di động cũng như 2 du xích cố định thẳng góc với nhau.
III. CÁCH BẢO QUẢN KÍNH HIỂN VI
Sau khi sử dụng, kính hiển vi phải được bảo quản tốt để sử dụng lâu dài, cần thực
hiện đầy đủ các bước sau:
- Lúc sử dụng xong, hạ bàn kính rồi mới lấy tiêu bản khỏi bàn kính.
- Xoay vật kính dầu về vị trí dễ lau nhất.
- Dùng khăn mềm bằng vải mịn hoặc khăn giấy để lau vật kính, nhúng một góc
khăn với ít xylen rồi lau vật kính dầu. Sau đó lau khơ với một góc kia của khăn.

- Lau sạch bụi hoặc hơi nước bám vào thân, đế, bàn kính... bằng khăn vải mềm,
tránh làm xây xước kính.
- Đặt vật kính có độ phóng đại nhỏ nhất ở trên trục quang học.
- Hạ tụ quang xuống (cho đến khi đường trượt được che kín nhất).
- Đóng chắn sáng.
- Để thân kính, mâm kính... vào tư thế “nghỉ”.
- Cho kính vào tủ bảo quản có chất chống ẩm hoặc để ở phịng có máy điều hịa
hoặc có máy hút ẩm.
- Lúc di chuyển: đỡ đế kính bằng một tay, cầm thân kính ở tay kia để giữ kính ở vị
trí thẳng đứng như lúc đặt kính ở trên bàn.
IV. CÁC LOẠI HÌNH THỂ CỦA VI KHUẨN
Theo hình thái bề ngồi, vi khuẩn thường được chia thành 3 loại hình thể chính:
cầu khuẩn, trực khuẩn, xoắn khuẩn.
1. Cầu khuẩn (Cocci)
Là những vi khuẩn có hình cầu kích thước khoảng 0,5 x 1,2 µm, tuỳ theo cách
thức liên kết các tế bào, mặt giao tiếp mà cầu khuẩn được chia thành:
- Đơn cầu: Thường đứng riêng ra từng tế bào một, đa số là những tạp khuẩn gặp
trong nước, trong đất và trong không khí như: Micrococcus pyogenes.
- Tụ cầu (Staphylococcus): Các cầu khuẩn liên kết với nhau thành một tập đoàn
như chùm nho. Đặc trưng có lồi Staphylococcus aureus, S. epidermidis,...
- Song cầu: Là những cầu khuẩn đứng thành từng đơi một. Có một số lồi song
cầu có khả năng gây bệnh cho người như: Neisseria meningitidis, N. Gonorrhoeae,...
- Tứ cầu (Tetracoccus): Là những cầu khuẩn xếp thành cụm 4 cầu khuẩn.
- Liên cầu (Streptococcus): Các cầu khuẩn liên kết với nhau tạo thành chuỗi:
Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus viridans,...
2. Trực khuẩn (Bacterium - Số nhiều Bacteria)
Là những vi khuẩn có hình que hết sức đa dạng, kích thước khoảng 0,5 - 1,0 x 1 4 µm, các loại trực khuẩn thường gặp là:
10

Thực hành Căn bản Vi sinh học

Khoa Y

- Trực khuẩn khơng sinh nha bào. Ví dụ: Escherichia coli, Shigella, Salmonella,
Klebsiella pnuemoniae, Pseudomonas aeruginosa, …
- Trực khuẩn hiếu khí sinh nha bào (Bacillus): Bacillus anthracis,...
- Trực khuẩn kỵ khí khơng sinh nha bào: Lactobacillus acidophylus,...
- Trực khuẩn kỵ khí tùy tiện: Klebsiella pnuemoniae.
- Trực khuẩn kỵ khí sinh nha bào (Clostridium): C. tetani, C. Botulinum,...
3. Xoắn khuẩn
Gồm có 3 dạng sau:
- Phẩy khuẩn (Vibrio): Là loại vi khuẩn xoắn nửa vòng nên có hình giống như dấy
phẩy, được coi là dạng trung gian giữa trực khuẩn và xoắn khuẩn thực thụ. Ví dụ: Vibrio
cholera.
- Dạng xoắn thưa (Spirillum): Gồm các vi khuẩn có 2 đến 3 vịng xoắn nên có hình
chữ S. Ví dụ: Spirillum rubrum, Spirillum serpens.
- Dạng xoắn khít (Spirochetes): Gồm có các vi khuẩn dài mảnh, có nhiều vịng
xoắn. Một số có khả năng gây bệnh cho người như xoắn khuẩn giang mai (Treponema
pallidum), xoắn khuẩn Leptospira, xoắn khuẩn sốt hồi quy (Borrelia).
V. PHẦN THỰC TẬP
Sinh viên xem hình thể của các loại vi khuẩn trên kính hiển vi.
CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ:
1. Kể tên các bộ phận chính của kính hiển vi quang học và nêu tác dụng của từng
bộ phận.
2. Trình bày các động tác sử dụng kính hiển vi vật kính dầu để soi tiêu bản nhuộm
vi khuẩn; động tác nào cần lưu ý nhất, tại sao?
3. Nêu các dạng hình thể của vi khuẩn.

11

Thực hành Căn bản Vi sinh học

Khoa Y

Bài 2
CÁC KỸ THUẬT TIỆT KHUẨN, KHỬ KHUẨN TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM
VI SINH VẬT
Mục tiêu:
1. Nắm được các thao tác kỹ thuật vô khuẩn trong thực hành vi sinh vật.
2. Trình bày được các phương pháp tiệt khuẩn trong phịng thí nghiệm vi sinh vật.
3. Trình bày được một số hố chất dùng để khử khuẩn trong phịng thí nghiệm vi
sinh vật.
I. KHÁI NIỆM
Khử khuẩn là công việc cần thiết và được thực hiện hằng ngày trong phịng thí
nghiệm vi sinh, một số thuật ngữ thường dùng hằng ngày để chỉ công việc này được định
nghĩa dưới đây:
Vô khuẩn (Aseptic) là một quá trình thao tác nhằm ngăn chặn hay dự phịng sự
xâm nhập của vi sinh vật đến các dụng cụ chuyên mơn, tới phịng mổ, buồng tiêm, buồng
thay băng, buồng pha chế thuốc hoặc vết thương, vết mổ…
Tiệt khuẩn (Sterilization) là các biện pháp vật lý, hoá học nhằm loại bỏ hoàn toàn
hoặc tiêu diệt hết vi sinh vật sống trên các dụng cụ, phương tiện, dịch truyền,…
Khử khuẩn (Disinfection) là dùng các biện pháp vật lý, hoá học để giết chết hầu
hết các vi sinh vật. Khử khuẩn có thể khơng giết chết tồn bộ các dạng đề kháng của vi
sinh vật như nha bào, vi khuẩn Mycobacteria, các virut và nấm. Người ta chia các chất
khử khuẩn ra các mức độ khác nhau mức độ thấp, mức độ trung gian và mức độ cao.
Làm vệ sinh (Sanitation): là quá trình làm sạch một vật dụng, một diện tích bị
nhiễm bẩn vi khuẩn, làm cho vật dụng hoặc vùng diện tích đó trở nên an tồn khi sử
dụng.

Sát khuẩn (Antiseptic) là việc dùng hoá chất để giết chết, làm giảm số lượng vi
sinh vật trên bề mặt da. Các hoá chất dùng để sát khuẩn được chọn lọc kỹ để đảm bảo
tính an tồn khơng làm tổn thương tổ chức cơ thể vật chủ và phải có hiệu lực.
Trong chẩn đoán vi sinh vật gây bệnh yêu cầu cơ bản cho người làm kỹ thuật là
phải đảm bảo vô khuẩn, làm tốt các công tác tiệt khuẩn.
II. THAO TÁC VÃ KỸ THUẬT VÔ KHUẨN
1. Ý nghĩa của thao tác và kỹ thuật vô khuẩn trong thực hành vi sinh vật
- Tránh sự tạp nhiễm cho mẫu nghiệm và đem lại kết quả chẩn đốn chính xác.
- Tránh được lây nhiễm cho người tiếp xúc và lây lan cho môi trường xung quanh.

12


Thực hành Căn bản Vi sinh học

Khoa Y

2. Các thao tác và kỹ thuật vô khuẩn
Trong thực hành vi sinh vật, để đảm bảo vô khuẩn, yêu cầu người làm kỹ thuật
phải thực hiện các thao tác kỹ thuật sau:
2.1. Sử dụng que cấy
- Cầm que cấy như cầm bút, “mềm” cổ tay để dễ làm thao tác.
- Khử khuẩn đầu kim loại que cấy trên ngọn lửa đèn cồn: vừa đốt vừa xoay que
cấy. Phải khử khuẩn đầu kim loại que cấy trước và sau khi lấy bệnh phẩm.
2.2. Sử dụng ống nghiệm
- Cách cầm ống nghiệm: có 2 cách
+ Cầm bằng 3 ngón tay 1,2,3. Thân ống nghiệm lót giữa 3 ngón tay. Đáy ống
nghiệm đặt giữa lịng bàn tay.
+ Cầm 2 ngón tay 1,2. Thân ống nghiệm kẹp giữa 2 ngón tay. Thường dùng
tay trái cầm ống nghiệm. Tay phải cầm que cấy.

- Mở nút ống nghiệm: dùng mô út của bàn tay phải mở nút ống nghiệm. Tay trái
xoay và kéo ống nghiệm ra khỏi nút.
- Đóng nút ống nghiệm: làm như mở nút nhưng đẩy ống nghiệm vào nút theo
hướng ngược lại khi mở nút.
- Khử khuẩn ống nghiệm:
+ Sau khi mở nút ống nghiệm, phải hơ nóng miệng ống nghiệm trên ngọn lửa đèn
cồn trước khi lấy bệnh phẩm (vừa hơ vừa xoay tròn miệng ống nghiệm).
+ Phải khử khuẩn lại trước khi đậy ống nghiệm.
2.3. Sử dụng hộp Petri (hộp lồng)
- Cách cầm hộp Petri: (có 2 cách) thường dùng tay trái để cầm hộp Petri.
+ Dùng cả bàn tay để đỡ đáy hộp và dùng một ngón tay cố định lên bờ nắp
hộp.
+ Dùng ngón tay 3,4,5 đỡ đáy hộp, hai ngón 1 và 2 vòng theo chu vi nắp hộp
- Mở và đóng nắp hộp Petri: dùng ngón 1 để mở và đóng nắp hộp.
* Chú ý: Ít khi mở tồn bộ nắp hộp, thường mở một phần để hạn chế vi khuẩn từ
khơng khí rơi vào trong hộp Petri.
2.4. Sử dụng ống hút
- Có 2 loại ống hút: ống hút khắc độ và ống hút Pasteur.
- Các ống hút đều có bơng nút ở đầu, được bọc giấy và được khử khuẩn ở
170 C/30p trước khi sử dụng. khi dùng, các ống hút không phải khử khuẩn lại.
0

- Dùng quả bóp cao su để hút dung dịch.
- Cắm ống hút đã dùng vào bình chứa dung dịch khử khuẩn.
13


Thực hành Căn bản Vi sinh học

Khoa Y

III. CÁC PHƢƠNG PHÁP KHỬ KHUẨN
Nhiều loại hoá chất khác nhau dùng cho mục đích này:
1. Các loại cồn
Cồn etylic và isopropylic 60-850 có tác dụng khử khuẩn, cồn methylic có tác dụng
khử khuẩn kém hơn cồn etylic và isopropylic. Cồn có tính chất giết chết vi khuẩn, nấm và
vi khuẩn lao, không có tác dụng diệt nha bào. Cồn etylic có tác dụng giết nhiều loại virut
hơn isopropylic. Cả cồn etylic và isopropylic đều có tác dụng chống lại HIV.
Sự hiện diện của nhiều chất hữu cơ có thể làm giảm tác dụng của cồn. Trong
phịng thí nghiệm các chất có nhóm acol dùng để làm sạch các bề mặt của dụng cụ. Cồn
bay hơi và dễ cháy nên cần dùng nơi thoáng và cách xa ngọn lửa.
2. Các hợp chất Phenol
Phenol khơng dùng như chất khử khuẩn vì độc tính cao, gây ung thư và làm tổn
thương da. Các dẫn chất phenol trong đó các nhóm hố học chloro, bromo, alky, benzyl,
phenyl thay thế một nguyên tử hydro ở nhân thơm thường được dùng làm chất khử
khuẩn. Việc thay thế các nhóm hố học này làm giảm độc tính, giảm tính chất ăn mòn và
giảm khả năng gây ung thư của phenol. Tuy nhiên nó vẫn cịn tính chất gây kích thích và
có thể hấp thụ qua da, do vậy khi dùng cần chú ý.
Các dẫn chất phenol thường làm chất khử khuẩn là ortho-phenyl phenol, ortho
benzyl-parachlorphenol. Khi thêm chất có tác dụng tẩy vào công thức cơ bản tạo nên chất
có tác dụng tẩy rửa và khử khuẩn. Các dẫn chất phenol khơng có tác dụng diệt nha bào,
nhưng khi dùng với nồng độ thích hợp và cho tác dụng ở thời gian thích hợp chúng có tác
dụng diệt vi khuẩn, diệt nấm, vi khuẩn lao và virut. HIV bị bất hoạt ở nồng độ 0,5%,
nồng độ bất hoạt nấm là 2%. Dung dịch khử khuẩn thường sử dụng có nồng độ từ 2-5%.
Khi sử dụng với nồng độ thấp thì cần để thời gian lâu hơn.
3. Các hợp chất ammonium bậc 4
Các ammonium bậc 4 là các chất tẩy có tác dụng bề mặt, chúng có tác dụng kìm
khuẩn, kháng nấm ở nồng độ khá thấp. Khi ở nồng độ trung bình và nồng độ cao chúng
có tác dụng diệt vi khuẩn, nhưng khơng có tác dụng diệt nha bào, vi khuẩn Mycobacteria
và nhiều loại virut ngay với nồng độ cao. Vi khuẩn Pseudomonas có thể phát triển trong

các hợp chất ammonium bậc 4, và nhiều vụ dịch bệnh do nhiễm khuẩn các vi khuẩn
Gram âm được báo cáo do các vi khuẩn này nhiễm bẩn các dung dịch ammonium bậc 4.
Tác dụng giết chết vi khuẩn của các ammonium bậc 4 do làm phá vỡ màng tế bào, bất
hoạt enzyme, làm biến tính protein.
Các ammonium bậc 4 khơng có màu, khơng có tính chất nhuộm màu, khơng có tác
dụng ăn mịn, khơng độc và rẻ. Tác dụng của các chất ammonium bậc 4 giảm khi có mặt
các chất hữu cơ, các chất tẩy xà phòng, những chất vải, băng gạc.
4. Các hợp chất halogen
Các nhóm chất halogen như bromine, chlorine, fluorine và iodine. Tuy nhiên chỉ
có chlorine và iodine thường dùng để khử khuẩn trong phịng thí nghiệm. Những chất
thuần khiết của chlorine hoặc iodine không ổn định, có tính chất ăn mịn và độc. Do vậy
14


Thực hành Căn bản Vi sinh học

Khoa Y

các halogen này được phối hợp với các hoá chất khác như chlorine kết hợp với p-toluensulfonamide gọi là chloramine-T chất thường dùng để khử khuẩn và tẩy uế nền phịng thí
nghiệm. Iodine kết hợp với các chất mang như polyvinylpyrrolidone. Chlorine là một
chất khử khuẩn thường dùng, chlorine dạng vô cơ như natri hypochlorite (NaOCl) dùng
để khử khuẩn nước và tẩy trắng ở nồng độ 1-5%. Chlorine bị bất hoạt bởi máu, huyết
thanh và các chất có chứa protein.
5. Muối kim loại
Thường dùng các hợp chất muối kim loại như muối thuỷ ngân, dung dịch HgCl2
1/1000 đã từng được sử dụng như chất khử khuẩn trong phịng thí nghiệm. Các hợp chất
thuỷ ngân hữu cơ ít độc hơn và có tác dụng cản khuẩn nên được dùng là chất sát khuẩn
như merthiolate…Một số muối kim loại khác được dùng làm chất sát khuẩn như nitrate
bạc dùng làm dung dịch nhỏ mắt (1%)…
Hiện nay những hợp chất muối kim loại không được dùng làm chất khử khuẩn và

tẩy uế phịng thí nghiệm vì độc tính cao và gây ơ nhiễm mơi trường.
6. Chọn lựa hố chất để khử khuẩn
Khơng có một chất khử khuẩn nào là chất lý tưởng. Do vậy khi sử dụng trong
phịng thí nghiệm cần chọn lựa các chất khử khuẩn cẩn thận dựa vào các yếu tố sau:
- Loại và số vi khuẩn cần loại bỏ.
- Loại và lượng chất hữu cơ hiện diện.
-Thời gian tác dụng.
- Kiểu bề mặt diện tích cần khử khuẩn, khả năng bị ăn mịn và hỏng.
- Loại nước dùng để hồ lỗng, vì nước cứng làm giảm khả năng giết vi khuẩn của
một số chất khử khuẩn.
- An toàn khi sử dụng và không gây ô nhiễm môi trường.
- Dễ pha chế và sử dụng.
- Giá cả phải chăng.
- Khả năng nhà sản xuất ghi đúng tác dụng của chất khử khuẩn.
IV. CÁC KỸ THUẬT TIỆT KHUẨN
Tiệt khuẩn có thể thực hiện bằng dùng các biện pháp vật lý, lọc hay bằng các hóa
chất.
1. Đốt trên ngọn lửa nóng
Biện pháp này thường dùng để tiệt khuẩn đầu pipet, miệng ống nghiệm, miệng
chai, lọ, bình thủy tinh, lam kính hoặc nung đỏ quai cấy.
2. Sấy khơ bằng khơng khí nóng (dùng tủ sấy khơ)
2.1. Ngun lý: dùng tủ kín bằng kim loại có nguồn nhiệt nâng nhiệt độ khơng khí
trong tủ lên tới 170-1800C. Ở 1700C /60 phút hoặc 1600C /120 phút tất cả các vi khuẩn và
nha bào đều bị diệt do quá trình mất nước của tế bào vi sinh vật.
2.2. Cấu trúc của tủ sấy:
15


Thực hành Căn bản Vi sinh học

Khoa Y

- Bộ phận điều chỉnh dòng điện
- Nhiệt kế
- Bộ phận ngắt tự động (phòng khi nhiệt độ lên quá mức yêu cầu)
- Các đèn hiệu (để báo cho dịng điện có hoạt động hay không).
2.3. Cách sử dụng:
- Cho các đồ vật cần sấy vào tủ (ống nghiệm, ống hút, hộp lồng Petri,…), các dụng
cụ này sau khi được rửa sạch, phơi khơ, phải được gói thành từng gói bằng giấy. Để đồ
vật trên giá lưới thép, tránh chạm vào thành tủ vì nhiệt độ ở thành tủ cao có thể làm cháy
giấy bọc hoặc làm vỡ đồ thủy tinh.
- Đóng mạch điện (mở nguồn nhiệt) chờ khi nhiệt kế chỉ đủ nhiệt độ u cầu thì
duy trì ở nhiệt độ đó trong 30 phút. Tắt nguồn nhiệt.
- Chờ nhiệt độ hạ xuống khoảng 50-600C (mùa hè) và 30-400C (mùa đông) mới
được mở tủ lấy dụng cụ ra.
* Lưu ý:
+ Tủ sấy chỉ dùng để sấy dụng cụ thủy tinh, không sấy đồ nhựa, cao su. Dụng cụ
kim loại có thể sấy, nhưng nếu sấy thì sẽ bị gỉ, giịn và dể gãy.
+ Cửa tủ sấy và lổ thông hơi phải được đậy kín khi bắt đầu sấy. Chú ý theo dõi các
đèn hiệu và nhiệt kế. khi nhiệt độ nâng cao không được mở tủ. Muốn mở tủ sấy phải mở
lỗ thông hơi trước.
+ Sau khi sấy, đồ vật được lấy ra nên để trên giấy, vãi, gỗ vì để trực tiếp xuống
nền đá lạnh thì làm đồ vật dễ vỡ. Có thể kiểm tra nhiệt độ sấy có đủ đảm bảo khử khuẩn
không bằng cách xem các nút bông: nếu có màu nâu là vừa, nếu nút bơng cịn màu trắng
là nhiệt độ thấp (<1400C) chưa đạt yêu cầu; nút bông cháy đen là nhiệt độ quá cao.
+ Dụng cụ sấy vơ khuẩn có thể dùng trong 7 ngày. Khi để quá thời gian này thì
phải sấy lại.
3. Tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm dƣới áp lực (nồi hấp Autoclave)
3.1. Nguyên lý:
Trong một nồi kín khơng có khơng khí, chỉ có hơi nước, khi áp lực hơi nước tăng

thì nhiệt độ cũng tăng theo một tương quan nhất định. Trong nồi kín khi nhiệt độ duy trì
ở 110-1210C /30 phút tương ứng với áp lực 1-1,2 at thì các vi khuẩn và nha bào đều bị
tiêu diệt.
3.2. Cấu trúc nồi hấp:
- Nồi hấp là một loại thùng có 2 lớp vỏ:
+ Lớp vỏ ngồi rất dày, có thể chịu được áp suất tới 5-6 at.
+ Lớp vỏ trong dùng để đựng đồ cần hấp.
- Nắp nồi hấp bằng thép dày, chắc, có các ốc để vặn giữ cho nắp khơng bị bật khi
áp suất trong nồi lên cao.
- Đồng hồ đo áp lực và nhiệt độ.
16


Thực hành Căn bản Vi sinh học

Khoa Y

- 1 van xả hơi.
- 1 van an toàn.
- 1 van ở nơi đổ nước vào.

Nồi hấp tiệt khuẩn áp suất cao
3.3. Cách sử dụng:
- Đổ nước cất vào nồi với số lượng quy định (quan sát vạch mức nước). Mỗi lần
hấp nên thay nước.
- Mở nắp nồi, xếp các đồ vật cần hấp vào (môi trường, sinh phẩm, đồ vải, đồ
nhựa…). Giữa các vật thuỷ tinh bên trong có chứa chất lỏng thì nên chèn vải để khi sơi
khơng chạm vào nhau, đồ vật hấp không nên để sát với nhau và sát thành quá. Đậy nắp,
vặn ốc từng cặp đối diện nhau để tránh kênh nồi hấp.
- Điều chỉnh kim đồng hồ áp kế (1at).

- Đóng mạch điện. Khi nước sơi thì mở van xả hơi, lúc đầu hơi trắng và chưa đều,
khi hơi ra đều và trong xanh thì mới đóng van lại. Làm như vậy để khơng khí trong nồi
hấp ra hết nhằm tránh sai lệch về nhiệt độ, áp suất (có thể kiểm tra khơng khí trong nồi
cịn hay hết bằng cách dùng 1 ống cao su, một đầu lắp vào khố thốt khí, đầu kia nhúng
vào một chậu nước lạnh. Khi không thấy sủi bọt trong chậu nước là chứng tỏ khơng khí
trong nồi đã ra hết). Đóng van xả hơi và van an tồn.
- Tiếp tục đun nóng đến khi kim áp kế chỉ 1at, nhiệt độ 1210C thì duy trì trong 30
phút. Với các mơi trường dinh dưỡng chỉ cần duy trì 1210C trong 15-20 phút. Ngắt điện
khi đủ thời gian cần thiết.
- Chờ kim áp kế chỉ về số 0 mới mở nắp nồi cho thoát hơi ra từ từ và lấy dụng cụ
hoá chất đã khử khuẩn (phải vặn ốc nắp nồi ngay vì nếu chờ nguội hẳn thì nắp sẽ dính
chặt vào nồi rất khó mở).
* Lưu ý:
+ Phải kiểm tra van an tồn, vì nếu van hỏng có thể gây nổ rất nguy hiểm.
17


Thực hành Căn bản Vi sinh học

Khoa Y

+ Phải có mặt thường xuyên bên cạnh chỗ hấp suốt thời gian vận hành.
+ Không để nhiệt độ tăng quá cao làm vỡ dụng cụ hoặc hỏng môi trường.
+ Không tháo hơi ra quá nhanh làm thuỷ tinh có thể bị nứt và các nút bình mơi
trường có thể bị bật ra ngoài.
+ Dụng cụ hấp ướt chỉ dùng trong 3 ngày. Mơi trường trong bình kín hoặc ống
nghiệm có thể giữ được 1 tuần.
* Ứng dụng: Đây là phương pháp tiệt khuẩn rất tốt và thường được dùng tại các
bệnh viện, các phịng thí nghiệm và các cơ sở y tế để khử khuẩn dụng cụ kim loại, cao su,
nhựa, băng gạc, mơi trường, hố chất…

4. Phƣơng pháp Tyndall
4.1. Ngun lý: ở nhiệt độ 60-80ưC trong một giờ, protein của vi khuẩn bị đơng
vón lại. Khi nhiệt độ này trở về bình thường, nha bào phát triển thành thể sinh dưỡng.
Sau 24 giờ lại đun nóng lần 2, làm như vậy 3-4 ngày liền và cuối cùng các vi khuẩn còn
lại sẽ bị tiêu diệt.
4.2. Ứng dụng: Thường dùng để tiệt khuẩn sinh phẩm, huyết tương, huyết thanh.
Vì một số hố chất, sinh phẩm sẽ bị huỷ hoại khi khử khuẩn ở nhiệt độ cao.
5. Tiệt khuẩn bằng lọc
Có 2 kỹ thuật lọc vô khuẩn: lọc bằng màng lọc và lọc sâu
5.1. Dùng màng lọc
Dùng màng lọc với các khe hở vô cùng nhỏ để giữ lại các vi sinh vật trên bề mặt.
Những chất khí và lỏng nếu khơng thể dùng nhiệt độ để tiệt khuẩn được thì phải lọc vơ
khuẩn; ví dụ như vaccine, sản phẩm huyết thanh, mơi trường nuôi cấy tết bào, các dung
dịch nhạy cảm với nhiệt độ hoặc đồ uống, khơng khí và các chất khác.
5.2. Lọc sâu
Dòng chảy đi qua một lớp vật liệu có cấu tạo sợi, hạt. Việc giữ lại vi sinh vật dựa
trên nguyên tắc gắn những vi sinh vật vào cấu trúc mang, nhờ hiệu lực vật lý khác nhau
nên có thể giữ lại được cả những vật thể rất nhỏ. Thông thường người ta dùng sợi thủy
tinh để lọc khơng khí (khả năng giữ được vật thể lớn hơn 0,5µm là 99,95%) và dùng cây
nến gốm để lọc chất lỏng.
So với các biện pháp vật lý để tiệt khuẩn thì lọc vơ khuẩn có nhiều yếu tố khơng
chắc chắn, nên chỉ dùng cho những thuốc hoặc các chất liệu không thể áp dụng được các
biện pháp tiệt khuẩn khác.
6. Hóa chất
Các hóa chất người ta thường dùng để tiệt khuẩn là ethylenoxid và formaldehyd.
Tiệt khuẩn bằng ethylenoxid (CH2OCH2) là dựa trên phản ứng hóa học, nhờ hoạt tính của
ngun tử oxy trong cấu tạo phân tử. Ethylenoxid là một chất độc, gây dị ứng, kích thích
mạnh niêm mạc và dễ cháy, ngồi ra nó cịn là chất gây ung thư. Vì vậy, khi sử dụng phải
hết sức thận trọng và đề phòng nổ.
18

Thực hành Căn bản Vi sinh học

Khoa Y

7. Phóng xạ ion hóa
Tia bức xạ ion hóa giàu năng lượng có thể giết chết vi sinh vật. Lị vi sóng có thể
sử dụng để tiệt khuẩn môi trường, tia gama được áp dụng để tiệt khuẩn chỉ catgút và các
vật dụng nhạy cảm với ethylenoxid hay nhiệt độ như catheter và các mảnh ghép. Ngồi
ra, tia gama cịn được dùng để tiệt khuẩn các dụng cụ và bông băng trong những túi đóng
sẵn.
V. PHẦN THỰC TẬP
Sinh viên làm các kỹ thuật vơ khuẩn trong phịng thí nghiệm Vi sinh vật và xem
cách thực hiện các kỹ thuật tiệt khuẩn.
CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ:
1. Nêu ý nghĩa của thao tác kỹ thuật vô khuẩn trong thực hành vi sinh vật.
2. Trình bày quy trình sử dụng tủ sấy để tiệt khuẩn các dụng cụ.
3. Trình bày quy trình sử dụng nồi hấp để tiệt khuẩn.
4.

Kể tên các hoá chất dùng để khử khuẩn trong phịng thí nghiệm.

19


Thực hành Căn bản Vi sinh học

Khoa Y

Bài 3
KỸ THUẬT LÀM TIÊU BẢN VÀ CÁC KỸ THUẬT NHUỘM VI SINH VẬT
Mục tiêu:
1. Nắm được khái niệm và các loại kỹ thuật nhuộm vi khuẩn.
2. Trình bày được cách làm tiêu bản vi sinh vật.
3. Nắm được thao tác kỹ thuật của phương pháp nhuộm đơn.
I. ĐẠI CƢƠNG VỀ NHUỘM VI KHUẨN
1. Khái niệm về nhuộm vi khuẩn
Người ta có thể soi tươi vi khuẩn, do tính chất chiết quang của vi khuẩn người ta
có thể nhận biết hình thể của chúng nhưng khó quan sát. Những nhà vi khuẩn học đầu
tiên như Pasteur đã quan sát trực tiếp vi khuẩn không nhuộm. Hiện nay soi tươi chỉ sử
dụng để quan sát sự di động của vi khuẩn và người ta thường khảo sát các tiêu bản vi
khuẩn đã bị giết chết và nhuộm màu. Nhuộm vi khuẩn lần đầu tiên do Weigert áp dụng
năm 1877, tiếp theo do Koch, Gram, Unna…
Phương pháp nhuộm giúp cho chúng ta quan sát vi khuẩn, phát hiện những đặc
điểm hình thái cũng như một số cấu trúc dễ dàng hơn, rõ hơn.
2. Các loại thuốc nhuộm vi khuẩn
Các thuốc nhuộm vi khuẩn thường là các muối. Căn cứ vào thành phần mang màu
của thuốc nhuộm mà người ta chia các thuốc nhuộm làm 2 loại:
- Thuốc nhuộm bazơ gồm các cation có màu và một anion khơng màu. Ví dụ:
Xanh Methylene. Tế bào vi khuẩn giàu protein và acid nucleic chứa những nhóm PO4 có
điện tích âm, những nhóm này kết hợp với các cation của thuốc nhuộm bazơ làm cho dễ
dàng nhuộm màu các thành phần của tế bào vi khuẩn. Vì acid nucleic tập trung dày đặc ở
trong nguyên tương, cũng như trong nhân nên thuốc nhuộm bazơ nhuộm đều tế bào vi
khuẩn.
- Thuốc nhuộm acid thì ngược lại, các anion có màu và một cation khơng màu, ví
dụ sodium, eosinat. Thuốc nhuộm acid không nhuộm tế bào vi khuẩn mà thường được sử
dụng để nhuộm nền tiêu bản tạo nên một màu tương phản, đó là nhuộm âm. Nhuộm âm
thường được áp dụng đối với những tế bào hoặc cấu trúc khó nhuộm trực tiếp.
3. Giới thiệu sơ lƣợc các loại kỹ thuật nhuộm vi khuẩn

Người ta chỉ sử dụng một loại thuốc nhuộm trong phương pháp nhuộm đơn; trong
phương pháp nhuộm kép, 2 hoặc nhiều thuốc nhuộm được sử dụng trên cùng một tiêu
bản.

20


Thực hành Căn bản Vi sinh học

Khoa Y

Trong các phương pháp nhuộm kép, quan trọng nhất là phương pháp nhuộm Gram
và phương pháp nhuộm Ziehl-Neelsen có thể giúp phân biệt các nhóm vi khuẩn nên đây
là các phương pháp nhuộm phân biệt.
Người ta còn sử dụng những phương pháp nhuộm đặc biệt để nhận biết những cấu
trúc bên trong riêng biệt của tế bào vi khuẩn như vỏ, vách, màng tế bào, nhân, bào tử,
những hạt dị nhiễm sắc…
II. CÁCH LÀM TIÊU BẢN
Làm tiêu bản để nhuộm gồm 3 bước:
1. Dàn mỏng vết bôi
Vết bôi phải được dàn đều và đủ mỏng.
Muốn thế phải chọn phiến kính thật sạch và khô không dây dầu mỡ, không bị mốc.
Khử khuẩn que cấy, lấy một quai canh khuẩn hoặc một quai vi khuẩn ở mơi trường đặc
hồ trong một giọt nước cất vơ khuẩn đã đặt trước ở trên phiến kính.
Dùng que cấy từ từ dàn mỏng bằng động tác nhẹ nhàng theo đường xoắn ốc từ
trong ra ngoài tạo nên một diện tích khoảng 1 cm2 hình vng hoặc hình trịn.
2. Làm khô
Làm khô là một động tác đơn giản nhưng cần tách rời cố định thành một bước. Tốt
nhất là để khơ tự nhiên ở nhiệt độ trong phịng hoặc để vào tủ ấm 370C. Cũng có thể đưa
tiêu bản gần ngọn lửa.

Trường hợp cố định bằng cồn nếu vết bơi chưa khơ mà cố định thì vi khuẩn sẽ trôi
mất. Trường hợp cố định bằng nhiệt nếu vết bôi chưa khơ mà cố định thì vi khuẩn sẽ
khơng chết hoặc biến dạng.
3. Cố định
Cố định có 3 mục đích:
- Giết chết vi khuẩn
- Làm cho vi khuẩn gắn chặt vào phiến kính
- Làm cho vi khuẩn bắt màu tốt hơn (protein chết bắt màu tốt hơn protein sống).
Có nhiều phương pháp cố định tiêu bản:
- Cố định bằng nhiệt: Đưa phiến kính qua lại trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần, lâu
chừng vài giây. Hơ mặt dưới, không hơ đến nóng bỏng.
- Cố định bằng rượu etylic 96% trong 5-20 phút.
- Cố định bằng rượu metylic trong 5 phút.
III. KỸ THUẬT NHUỘM ĐƠN
1. Mục đích
Quy trình này hướng dẫn nhuộm tiêu bản bằng phương pháp nhuộm xanh
Methylene để phát hiện hình thể tế bào, vi khuẩn.

21


Thực hành Căn bản Vi sinh học

Khoa Y

2. Nguyên tắc
Thuốc nhuộm xanh Methylene là thuốc nhuộm cation, màng tế bào mang điện tích
âm nên khi cho thuốc nhuộm gây ra hiện tượng bắt màu do sự kết hợp của hai loại điện
tích trái dấu. Đây là phương pháp nhuộm đơn giản để quan sát hình dạng của tế bào, vi
khuẩn, được sử dụng trong phản ứng phình vỏ, định danh Corynebacterium diphtheriae.

3. Thuốc nhuộm
Xanh Methylene
4. Cách thực hiện
- Chuẩn bị một tiêu bản đã cố định.
- Phủ thuốc nhuộm Xanh Methylene duy trì 1-3 phút, rửa dưới vịi nước chảy nhẹ.
- Thấm khơ tiêu bản.
- Soi kính hiển vi (vật kính x100)
5. Kết quả soi kính
- Quan sát hình thể của vi khuẩn, tế bào.
- Tế bào vi khuẩn bắt màu xanh trung tính trên nền xanh nhạt.
- Tế bào bạch cầu xanh sáng, có nhân màu xanh đậm. Đếm số lượng tế bào, tính
trung bình trên 1 vi trường.
- Với C. diphtheriae xuất hiện từng đám, dải, có các hạt nhỏ trên nền tế bào chất
màu xanh đậm.
IV. PHƢƠNG PHÁP NHUỘM GRAM
1. Mục đích
Quy trình này hướng dẫn nhuộm tiêu bản bằng phương pháp nhuộm Gram để phân
loại vi khuẩn dựa vào hình thể, cách sắp xếp, tính chất bắt màu của vi sinh vật.
2. Nguyên tắc
Khi nghiên cứu để kiểm tra tế bào vi khuẩn trong tổ chức động vật nhà khoa học
Đan Mạch Christian Gram và cộng sự (1884) đã phát minh một phương pháp nhuộm đặc
biệt được gọi là phương pháp nhuộm gram.
Trong phương pháp nhuộm này tiêu bản vi khuẩn được nhuộm với dung dịch tím
gentian, cắm màu bằng dung dịch lugol rồi tẩy màu bằng cồn và cuối cùng nhuộm tương
phản bằng dung dịch safranin. Người ta nhận thấy vi khuẩn được phân loại thành 2 nhóm,
vi khuẩn bắt màu tím được gọi là vi khuẩn gram dương, vi khuẩn bị tẩy mất màu tím là vi
khuẩn gram âm, loại vi khuẩn này sẽ bắt màu hồng nhạt ở bước nhuộm tương phản.
Sự sai biệt trong bắt màu gram liên hệ đến các đặc tính sinh vật học và di truyền học
của vi khuẩn. những nghiên cứu cho thấy giữa 2 nhóm vi khuẩn gram dương và vi khuẩn
gram âm có những sai khác về cấu trúc của vách tế bào, vì thế có sự khác nhau về tính thấm

đối với cồn, các vi khuẩn gram dương có vách dày, khó thấm đối với cồn nên khơng bị tẩy
màu sau bước tẩy cồn, vì vậy vi khuẩn giữ ngun màu tím của gentian, cịn các vi khuẩn
gram âm do vách mỏng hơn, dễ thấm đối với cồn nên bị tẩy mất màu tím ở bước nhuộm đầu
22


Thực hành Căn bản Vi sinh học

Khoa Y

tiên, sau đó sẽ bắt màu hồng của safranin khi nhuộm tương phản. vì thế bước tẩy màu bằng
cồn trong nhuộm gram rất quan trọng. nếu cho cồn tác dụng cồn lâu quá thì vi khuẩn gram
dương cũng bị tẩy màu và trở thành bắt màu của vi khuẩn gram âm và ngược lại.
Nhuộm gram là phương pháp nhuộm phân biệt, nó cho phép phân loại vi khuẩn
thành 2 nhóm là vi khuẩn gram dương và vi khuẩn gram âm, điều này có ý nghĩa giúp
cho chuẩn đoán và sơ bộ giúp cho người thầy thuốc có hướng cho kháng sinh điều trị
bệnh.
3. Thuốc nhuộm
- Dung dịch tím gentian hoặc tím tinh thể:
- Dung dịch lugol
- Dung dịch tẩy màu: ethanol 95%
- Dung dịch Safranin 0,25%
4. Cách thực hiện
- Chuẩn bị tiêu bản đã cố định.
- Nhỏ dung dịch tím gentian lên tiêu bản duy trì 1 phút. Nghiêng tiêu bản và đổ
thuốc nhuộm, rửa nước nhẹ.
- Nhỏ dung dịch lugol lên tiêu bản duy trì 1 phút. Nghiêng tiêu bản và đổ dung
dịch lugol, rửa nước nhẹ.
- Tẩy màu: nghiêng phiến kính, nhỏ từng giọt để cồn chảy qua vết bôi, mắt quan
sát màu tím, khi nào vết bơi hết tím thì rửa nước ngay. Thời gian tẩy màu từ 10 đến 30

giây tùy theo bề dày của vết bôi.
- Nhỏ dung dịch safranin lên tiêu bản cho tác dụng trong một phút. Nghiêng tiêu
bản đổ thuốc nhuộm, rửa nước nhẹ. Thấm khơ soi kính.

23


Thực hành Căn bản Vi sinh học

Khoa Y

Các bước tiến hành nhuộm Gram
5. Kết quả soi kính
Cho thấy vi khuẩn gram dương bắt màu tím, gram âm bắt màu hồng hay màu đỏ
Fuchsin.
V. PHƢƠNG PHÁP NHUỘM ZIEHL-NEELSEN
1. Nguyên lý
Ehrlich là người đầu tiên phát minh phương pháp nhuộm vi khuẩn kháng acid
(1882), ông nhuộm vi khuẩn lao bằng dung dịch tím gentian. Sau đó ơng phát hiện nếu
tẩy màu bằng HCl ( acid chlohydric) thì vi khuẩn lao khơng bị mất màu trong khi những
vi khuẩn khác và tổ chức động vật đều bị mất màu. Sau đó Ziehl (1882) và Neelsen
(1883) đã cải tiến phương pháp nhuộm và xây dựng một quy trình nhuộm thường được
gọi là phương pháp nhuộm Ziehl - Neelsen.
Nguyên lý của phương pháp nhuộm là dùng một loại thuốc nhuộm mạnh, dung
dịch fuchsin có phenol của Ziehl cho tác dụng một thời gian dài hoặc dùng nhiệt độ, hóa
chất giúp cho thuốc nhuộm thấm ngấm qua vách tế bào vi khuẩn. sau khi rửa sạch nước
người ta tẩy màu bằng hỗn hợp acid vô cơ mạnh và cồn, vi khuẩn không bị tẩy màu (vi
khuẩn vẫn bắt màu đỏ) được gọi là vi khuẩn kháng acid- cồn.
2. Thuốc nhuộm
- Dung dịch Fuchsin có phenol

+ Fuchsin

0,3g

+ Ethanol

10ml

+ Phenol

5g

+ Nước cất

100ml

- Dung dịch HCl, cồn 95%
Cho từ từ 3ml HCl đậm đặc vào 97ml cồn 95% để được 100ml.
- Dung dịch xanh Methylene kiềm
+ Xanh Methylene
+ Nước cất

0,3g
100ml

3. Kỹ thuật nhuộm
3.1. Kỹ thuật nhuộm cổ điển bằng nhiệt:
- Phủ lên tiêu bản đã cố định một lớp Fuchsin có phenol, hơ nóng dưới ngọn lửa
đèn cồn cho đến khi bốc khói trắng. Để 5 phút. Rửa nước.
Chú ý: không để dung dịch thuốc nhuộm sôi hoặc khô.

24


Thực hành Căn bản Vi sinh học

Khoa Y

- Ngâm vào dung dịch acid, cồn trong 3 phút cho đến khi các tiêu bản khơng cịn
màu đỏ. Rửa nước.
- Phủ dung dịch xanh Methylene kiềm, cho tác dụng trong 30s, rửa nước.
- Thấm khơ, soi kính hiển vi.
3.2. Kỹ thuật nhuộm lạnh:
- Phủ lên tiêu bản đã cố định một lớp Fuchsin, thêm một giọt viso 1%, cho tác
dụng trong 2 phút, rửa nước.
- Ngâm vào dung dịch acid, cồn trong 3-5 phút cho đến khi tiêu bản khơng có màu
đỏ, rửa nước.
- Phủ dung dịch xanh Methylen, cho tác dụng trong 3 phút, rửa nước.
- Thấm khơ, soi kính hiển vi.
4. Kết quả soi kính
Vi khuẩn kháng acid-cồn như vi khuẩn lao, BCG, vi khuẩn bệnh phong bắt màu đỏ
tươi. Những vi khuẩn thơng thường tìm thấy trong đàm và các tế bào của tổ chức động
vật bạch cầu, tế bào thượng bì bắt màu xanh, tất cả trên một màu xanh nhạt.
VI. PHẦN THỰC TẬP
Sinh viên làm các kỹ thuật nhuộm mẫu vi sinh vật, quan sát đánh giá kết quả.
CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ:
1. Trình bày mục đích của nhuộm vi sinh vật.
2. Kể tên các kỹ thuật nhuộm vi sinh vật.
3. Trình bày cách làm tiêu bản vi sinh vật.
4. Trình bày nguyên tắc của phương pháp nhuộm Gram.

5. Trình bày nguyên tắc của phương pháp nhuộm Ziehl-Neelsen.

25