KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH tự GEN PHÁT HIỆN đột BIẾN

Bài 04. Kỹ thuật giải trình tự gen phát hiện
đột biến (sequencing)

Giảng viên:
TS. Nguyễn Thị Hà- Trung tâm Xét nghiệm
Email:


Chuẩn đầu ra bài học
Sau khi học xong, sinh viên có khả năng:
1. Tóm tắt nguyên lý và ứng dụng của một số kỹ thuật SHPT ứng
dụng trong chẩn đoán một số bệnh di truyền
2. Trình bày được nguyên lý giải trình tự gen

3. Ứng dụng giải trình tự gen để xác định một số đột biến
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP


Khái niệm
Xác định trình tự ADN là việc xác định
trình tự sắp xếp các nucleotides trong một
đoạn DNA.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHAÄP


Các mốc giải mã hệ gen của các sinh vật
khác nhau

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP


Genome Sequencing

Supratim Mukherjee; Dimitri Stamatis; Jon Bertsch; Galina Ovchinnikova; Hema Y Katta; Alejandro Mojica; I-Min A Chen; Nikos
C Kyrpides; TBK Reddy. Genomes OnLine database (GOLD) v.7: updates and new features. Nucl. Acids Res. (2018) doi:
10.1093/nar/gky977

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP


Các phương pháp xác định trình tự
✓ Maxam-Gilbert method (1977)
✓ Sanger method (1977)
✓ Giải trình tự tự động
✓ Next generation sequencing
✓ Third generation sequencing

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP


TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP

Phương pháp Maxam-Gilbert
• Là phương pháp phân giải hóa học.
• Sử dụng hóa chất để phân hủy ADN ở các vị
trí base đặc hiệu→ tạo ra các đoạn có chiều
dài khác nhau.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP


Citation Trends

600
500
400
300
200
100
0

2004

2001

1998

1995

1992

1989

1986

1983

1980

Number of Citations

1977

Number of Citations

M-G 1977 Citations

Year

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHAÄP


Phương pháp Sanger
(chain termination or dideoxy method)
Nguyên tắc hoạt động: khi sinh tổng hợp sợi DNA,
DNA polymerase cần vị trí 3’OH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP

Nucleotide

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP


Đơn phân của ADN

Deoxyadenosine
monophosphas (dAMP)

Deoxythymidine
monophosphas (dTMP)

Deoxyguanosine
monophosphas (dGMP)

Deoxycytidine
monophosphas (dCMP)


Đơn phân của ARN

OH
OH

Adenosine monophosphas
(AMP)

OH

Uridine monophosphas
(UMP)

Guanosine monophosphas
(GMP)

OH

Cytidine monophosphas
(CMP)


DNA (Deoxyribonucleic acid )

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP


DNA (Deoxyribonucleic acid )

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP


Phương pháp Sanger
(chain termination or dideoxy method)
Nguyên tắc hoạt động: khi sinh tổng hợp sợi DNA,

DNA polymerase cần vị trí 3’OH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP


Phương pháp Sanger
(chain termination or dideoxy method)
•

Nguyên tắc hoạt động: trình tự của một sợi DNA đơn được
xác định dựa vào hoạt động của enzyme DNA polymerase
trong quá trình tổng hợp sợi DNA bổ xung. Các sợi DNA
được tổng hợp mới này được kết thúc tại các vị trí đặc hiệu là
các dideoxynucleotide.

• DNA polymerase xúc tác gắn các Nu
vào mạch đơn đang tổng hợp ở vị trí
3'OH, khi gặp nucleotid khơng có
nhóm 3'OH, phản ứng tổng hợp bị
dừng lại.
•

Nhân tố kết thúc đặc hiệu được sử dụng là các
dideoxynucleotide (phương pháp dideoxynucleotid)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP

Các yêu cầu cần thiết của phương pháp Sanger
•
•
•
•
•

Các bản sao của DNA khn ở dạng sợi đơn
Một mồi thích hợp (bắt cặp với DNA khuôn)
DNA polymerase
4 loại nucleotides
Một lượng nhỏ dideoxynucleotides được đánh dấu (phóng xạ hoặc chất
nhuộm huỳnh quang). Mỗi phản ứng chỉ bổ sung một loại ddNTP, thực
hiện trong 4 ống phản ứng riêng rẽ.

Chỉ cần đánh dấu hoặc với mồi hoặc
với dideoxynucleotides
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP


• Các phân tử ddNTP có thể kết hợp ngẫu nhiên vào chuỗi ADN đang
tổng hợp một cách bình thường qua nhóm 5 triphosphat nhưng lại
khơng tiếp tục kết hợp được với phân tử desoxynucleotit triphosphat
tiếp theo (dNTP).
• Kết quả sẽ cho một loạt các đoạn ADN được kết thúc một cách đặc hiệu
bởi gốc dideoxynucleotides.
• Tiến hành thí nghiệm tương tự cho 4 phản ứng tổng hợp ADN tách rời,
mỗi phản ứng có bổ sung một loại dideoxynucleotide khác nhau ta sẽ
thu được các đoạn ADN có kết thúc bằng các dideoxynucleotide khác

nhau và hơn kém nhau 1 nucleotit.
• Chạy điện di các đoạn này rồi hiện hình chúng, ta có thể xác định được
trình tự chuỗi ADN.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP


TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP


Mồi

4 ống phản ứng
riêng biệt

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP


TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP


Giải trình tự theo Sanger


Ưu điểm của phương pháp Sanger
• Tính ổn định cao, có thể tiến hành với quy mơ lớn.

• Phản ứng khơng phụ thuộc vào tính đặc trưng hố của các
chất hố học, khơng có phản ứng phụ.
• Nếu kết hợp dùng với phản ứng PCR thì chỉ cần lượng
ADN mẫu nhỏ, đồng thời có thể giảm được ảnh hưởng của
ADN cấu trúc bậc 2.
• Xác định được trình tự đoạn gen tương đối dài, khoảng
300 ~ 400 bp.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHAÄP


Có thể tự động hóa khơng?

Vấn đề đặt ra

Có thể chạy trên 1 giếng khơng vì sẽ tiết
kiệm thời gian, nguyên vật liệu và hiệu
quả hơn ➔ Sử dụng các ddNTPs huỳnh
quang khác nhau.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP