Tối ưu quy trình chuyển gene gfp vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens bằng phương pháp tiếp hợp ba thành phần

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC






KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP




TỐI ƢU QUY TRÌNH CHUYỂN GENE gfp VÀO VI KHUẨN
Pseudomonas fluorescens BẰNG PHƢƠNG PHÁP
TIẾP HỢP BA THÀNH PHẦN







Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2003 – 2007
Sinh viên thực hiện: TRẦN NGUYỄN THÚY AN

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 09/2007


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC






KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP




TỐI ƢU QUY TRÌNH CHUYỂN GENE gfp VÀO VI KHUẨN
Pseudomonas fluorescens BẰNG PHƢƠNG PHÁP
TIẾP HỢP BA THÀNH PHẦN

Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện
TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN TRẦN NGUYỄN THÚY AN





Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 09 / 2007

iii
LỜI CẢM ƠN
Thành kính ghi ơn ông bà, cha mẹ đã nuôi nấng, dạy bảo con trƣởng thành
nhƣ ngày hôm nay, cùng những ngƣời thân trong gia đình luôn tạo mọi điều kiện và
động viên con trong suốt quá trình học tập tại trƣờng.
Tôi xin chân thành cám ơn:
Ban giám hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh.
Ban chủ nhiệm cùng thầy cô Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học đã truyền đạt
mọi kiến thức, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian học tập ở
trƣờng.
Thầy Lê Đình Đôn đã tận tình hƣớng dẫn và động viên tôi trong thời gian
thực hiện khóa luận tốt nghiệp này.
Thầy Zhang Liqun ở Đại Học Nông Nghiệp Trung Quốc đã cung cấp mẫu vi
khuẩn E.coli DH5α (λ-pir) chứa plasmid pUT-gfp, vi khuẩn E.coli DH5α (λ-pir)

chứa plasmid pRK600 và các tài liệu phục vụ cho thí nghiệm.
Ban giám đốc cùng các anh chị trực thuộc Trung Tâm Phân Tích – Thí
Nghiệm Hóa Sinh Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh đã hƣớng
dẫn và chia sẻ cùng tôi những khó khăn trong thời gian thực hiện khóa luận.
Anh Nguyễn Văn Lẫm đã nhiệt tình giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này.
Tất cả các anh chị thuộc Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật Khoa Nông Học đã giúp
đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Các bạn bè lớp Công Nghệ Sinh Học 29 đã giúp đỡ và động viên tôi trong
suốt những năm học cũng nhƣ thời gian thực hiện khóa luận.

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2007
Sinh viên
Trần Nguyễn Thúy An

iv


TÓM TẮT
Đề tài “Tối ƣu quy trình chuyển gene gfp vào vi khuẩn Pseudomonas
fluorescens bằng phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần” do Trần Nguyễn Thúy
An, Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh thực hiện. Địa điểm: trƣờng Đại
học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, thời gian từ tháng 03/2007 đến tháng 08/2007.
Pseudomonas fluorescens là tác nhân kiểm soát sinh học đƣợc nghiên cứu
nhiều nhất do chúng có khả năng kháng nấm mạnh và có phổ kí chủ rộng. Việc phát
triển các phƣơng pháp nhạy để quan sát những tế bào vi khuẩn Pseudomonas
fluorescens trong biofilm hay trên rễ cây trồng đóng vai trò quan trọng khi muốn
nghiên cứu những hệ thống này. Đáp ứng nhu cầu đó, gần đây những marker phân
tử mới đã đƣợc phát triển nhƣ những phƣơng pháp chuyên biệt để đánh dấu sự phân
bố, quần thể và hoạt tính chuyển hóa của các vi sinh vật mục tiêu trong môi trƣờng.
Trong số những marker này, green fluorescent protein (GFP) từ loài sứa Aequorea

victoria đã đƣợc chứng tỏ là công cụ hữu hiệu nhất. Những dòng Pseudomonas
fluorescens đƣợc đánh dấu bởi marker GFP có thể dễ dàng quan sát và phát hiện
qua kính hiển vi phát huỳnh quang mà không cần phải phá hủy cấu trúc và cũng
không cần thêm vào các cơ chất ngoại sinh.
Nội dung nghiên cứu
1. Chọn lọc dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens có đặc tính đối
kháng mạnh với nấm, phát sáng mạnh trên môi trƣờng KB và có khả
năng kháng kháng sinh thích hợp cho mục đích nghiên cứu.
2. Khảo sát các điều kiện tối ƣu để chuyển gene gfp vào vi khuẩn
Pseudomonas fluorescens bằng phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần.
3. Thực hiện PCR để kiểm tra sự hiện diện của gene gfp trong vi khuẩn
Pseudomonas fluorescens sau khi tiếp hợp.
Kết quả đạt đƣợc
Chọn đƣợc dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens thích hợp cho mục đích
nghiên cứu. Đạt đƣợc quy trình tối ƣu để chuyển gene gfp vào vi khuẩn
Pseudomonas fluorescens bằng phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần.

v


SUMMARY
Tran Nguyen Thuy An, Nong Lam university, Ho Chi Minh city,
“Establishing an optimal protocol to transfer gfp gene into Pseudomonas
fluorescens by triparental mating”. This subject was conducted at Nong Lam
University from March to August in 2007.
Pseudomonas fluorescens is the most extensively studied biocontrol-agent
because of their strongly antifungal ability and their broad host range. The
development of sensitive methods for observing Pseudomonas fluorescens cells in a
population in biofilms or in plant roots is of great importance for studying these
systems. In response to this problem, novel molecular markers have been developed

recently as specific methods for tracing the distribution, population and metabolic
activity of target microorganisms in a certain environment. Among them, the green
fluorescent protein (GFP) of the jellyfish Aequorea victoria has proved to be the
most powerful tool. The GFP-marked Pseudomonas fluorescens strain can be
conveniently observed by using fluorescence microscopy to study their behaviour.
Researching contents are
1. Selecting the Pseudomonas fluorescens strains which have strongly
antifungal ability, appropriate antibiotic resistance and fluoresce
under short wave length ultraviolet light.
2. Researching the optimal conditions to transfer gfp gene into
Pseudomonas fluorescens by triparental mating.
3. Performing PCR to confirm the gfp gene in Pseudomonas fluorescens
after conjugation.
Obtaining results
The appropriate Pseudomonas fluorescens strains have been selected.
The optimal protocol to transfer gfp gene into Pseudomonas fluorescens by
triparental mating has been obtained.



vi


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

aa acid amin
bp base pair
DNA Deoxyribonucleic acid
2,4 – DAPG: 2,4 – Diacetylphloroglucinol
ETDA Ethylenediamine tetraacetic acid

F Fertility
GFP Green Fluorescent Protein
Hfr High frequency recombinance
IS Insert sequence
kb Kilo base
kDa Kilo dalton
MCS Multi cloning site
Nm Nano metre
PCR Polymerase Chain Reaction
RBS Ribosome binding site
RNA Ribonucleic acid
SDS Sodium dodecyl sulfate
TAE Tris Acetate EDTA
Tn Tranposon
UV Ultraviolet (light)
w/v Weight for volume
KB King’s B
NST Nhiễm sắc thể
TGE Transposable genetic element
dNTP deoxyribonucleotide_5_triphosphate
LB Luria – Bertain


vii


DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Cơ chế lai giữa F
+

và F
-
......................................................................................... 7
Hình 2.2 Sự hình thành thể Hfr từ thể F
+
............................................................................ 8
Hình 2.3 Cơ chế lai giữa Hfr và F
-
...................................................................................... 8
Hình 2.4 Cơ chế hình thành thể F’ từ thể Hfr .................................................................... 8
Hình 2.5 Cơ chế lai giữa F’và F
-
.......................................................................................... 9
Hình 2.6 Cấu trúc một trình tự chèn .................................................................................. 11
Hình 2.7 Cấu trúc transposon ............................................................................................. 12
Hình 2.8 Cơ chế phƣơng pháp tiếp hợp 3 thành phần .................................................... 15
Hình 2.9 Cơ chế hoạt động của thiết bị electroporation ................................................. 17
Hình 2.10 Quy trình biến nạp bằng phƣơng pháp CaCl
2
................................................ 18
Hình 2.11 Cấu trúc protein GFP ........................................................................................ 24
Hình 3.1 Cấu trúc plasmid pUT-gfp ......................................................................... 29
Hình 4.1 Khuẩn lạc Pseudomonas fluorescens trên môi trƣờng KB ............................ 36
Hình 4.2 Khuẩn lạc hình thành trên môi trƣờng M9 ....................................................... 38
Hình 4.3 Khuẩn lạc hình thành trên môi trƣờng M9 ....................................................... 39
Hình 4.4 Khuẩn lạc hình thành trên môi trƣờng M9 ....................................................... 40
Hình 4.5 Đối chứng trên môi trƣờng M9 .......................................................................... 41
Hình 4.6 Kết quả đối chứng ............................................................................................... 45

viii


DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Đặc tính và nguồn gốc một số dòng vi khuẩn và plasmid liên quan
trong thí nghiệm ........................................................................................................ 30
Bảng 4.1 Kết quả kiểm tra tính kháng với kháng sinh kanamycin của một số
dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens ................................................................. 34
Bảng 4.2 Kết quả kiểm tra tính kháng với kháng sinh chloramphenicol của
một số dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens ...................................................... 35
Bảng 4.3 Nguồn gốc các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens thích
hợp làm đối tƣợng nghiên cứu .................................................................................. 36
Bảng 4.4 Kết quả đếm số khuẩn lạc hình thành trên môi trƣờng M9 thay đổi
theo thời gian nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn ............................................................... 37
Bảng 4.5 Kết quả đếm số khuẩn lạc hình thành trên môi trƣờng M9 thay đổi
theo tỉ lệ vi khuẩn ...................................................................................................... 38
Bảng 4.6 Kết quả đếm số khuẩn lạc hình thành trên môi trƣờng M9 thay đổi
theo nhiệt độ ủ khi nuôi chung trên môi trƣờng KB ................................................. 40

ix


MỤC LỤC
Chƣơng 1 ............................................................................................................................... 1
MỞ ĐẦU ............................................................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề ..................................................................................................... 1
1.2 Mục đích ....................................................................................................... 2
1.3 Yêu cầu ......................................................................................................... 3
Chƣơng 2 ............................................................................................................................... 4
TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................................................... 4
2.1 Sự trao đổi thông tin di truyền ở vi khuẩn ................................................... 4
2.1.1 Giới thiệu ....................................................................................................... 4
2.1.2 Những cơ chế chuyển gene ở vi khuẩn .......................................................... 4
2.1.2.1 Biến nạp (transformation) .......................................................................... 4
2.1.2.2 Tải nạp (transduction) ................................................................................ 5
2.1.2.3 Tiếp hợp (conjugation) .............................................................................. 7
2.1.3 Những yếu tố di truyền có khả năng chuyển vị (transposable genetic
element_TGE) .............................................................................................................. 10

2.1.3.1 Đặc tính của những yếu tố di truyền có khả năng chuyển vị ................... 11
2.1.3.2 Các loại yếu tố di truyền có khả năng chuyển vị ..................................... 11
2.2 Plasmid ....................................................................................................... 13
2.3 Các phƣơng pháp thƣờng dùng để chuyển DNA plasmid ......................... 15
2.3.1 Phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần (triparental mating) .......................... 15
2.3.2 Phƣơng pháp điện biến nạp .......................................................................... 16
2.3.2.1 Phƣơng pháp ............................................................................................ 16
2.3.3 Phƣơng pháp Calcium chloride.................................................................... 18
2.5 Phòng trừ sinh học bệnh cây và tác nhân phòng trừ sinh học .................... 19
2.5.1 Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens ............................................................ 20
2.5.1.1 Phân loại vi khuẩn Pseudomonas fluorescens ......................................... 20
2.5.1.2 Các nghiên cứu về vi khuẩn Pseudomonas fluorescens .......................... 21
2.6 Protein GFP ................................................................................................ 24
2.6.1 Cấu trúc và đặc điểm ................................................................................... 24
2.6.2 Tình hình nghiên cứu về gene gfp ............................................................... 25
Chƣơng 3 ............................................................................................................................. 28
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................. 28
3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện ................................................................. 28
3.2 Vật liệu và hóa chất, dụng cụ thí nghiệm ................................................... 28
3.2.1 Vật liệu ......................................................................................................... 28
3.2.1.1 Vi khuẩn E.coli DH5α (λ-pir) chứa plasmid pUT-gfp ............................. 28
3.2.1.2 Vi khuẩn E.coli DH5α (λ-pir) chứa plasmid pRK600 ............................. 29
3.2.1.3 Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens ........................................................ 29
3.2.2 Các loại môi trƣờng dùng trong nuôi cấy vi khuẩn ..................................... 31
3.2.3 Các loại dụng cụ, thiết bị dùng trong nghiên cứu ........................................ 31
3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................ 31
Chƣơng 4 ............................................................................................................................. 34
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................................. 34
4.1 Kết quả ....................................................................................................... 34
4.1.1 Kết quả kiểm tra tính kháng kháng sinh của vi khuẩn ................................. 34

x


4.1.2 Kết quả kiểm tra khả năng phát sáng trên môi trƣờng KB .......................... 36
4.1.3 Kết quả khảo sát các điều kiện tối ƣu để chuyển gene gfp vào vi khuẩn
Pseudomonas fluorescens bằng phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần ........................ 37
4.1.3.1 Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn .............. 37
4.1.3.2 Khảo sát ảnh hƣởng của mật độ vi khuẩn ................................................ 38
4.1.3.3 Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ khi nuôi chung trên môi trƣờng KB ... 39
4.1.3.4 Kết quả đối chứng .................................................................................... 40
4.2 Thảo luận .................................................................................................... 41
4.2.1 Các thông số tối ƣu cho quá trình tiếp hợp .................................................. 41
4.2.2 Cơ chế quá trình tiếp hợp ba thành phần ..................................................... 41
4.2.3 Môi trƣờng tối ƣu cho chọn lọc ................................................................... 43
4.2.4 Kết quả đối chứng ........................................................................................ 42
4.2.5 Quy trình tiếp hợp tối ƣu cho dòng vi khuẩn nhận Pseudomonas fluorescens
1.8 44
Chƣơng 5 ............................................................................................................................. 47
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................................. 47
5.1 Kết luận ...................................................................................................... 47
5.2 Đề nghị ....................................................................................................... 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................... 48
PHỤ LỤC ............................................................................................................................ 51

1
Chƣơng 1
MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Thuốc trừ sâu hóa học đƣợc sử dụng trong sản xuất nông nghiệp đem lại cho
chúng ta năng suất cao và nhiều lợi ích kinh tế, tuy nhiên chúng cũng đem đến
những vấn đề nhƣ ô nhiễm môi trƣờng và ảnh hƣởng đến sức khỏe của con ngƣời.
Do đó, nhu cầu ngày càng cao trong nông nghiệp là tìm ra phƣơng pháp bảo vệ cây
trồng hòa hợp với hệ sinh thái tự nhiên. Kiểm soát sinh học là một sự lựa chọn thay
thế có nhiều tiềm năng trong việc ngăn cản sự tàn phá do bệnh cây trồng mà không
gây ô nhiễm.
Kiểm soát sinh học liên quan đến việc sử dụng vi sinh vật để ức chế bệnh cây
và tăng cƣờng sức khỏe cây trồng. Nó đặc biệt thích hợp để ngăn chặn những bệnh
từ đất mà việc sử dụng thuốc trừ sâu tổng hợp hóa học cho đến nay vẫn chƣa đem
lại hiệu quả.
Kháng sinh đƣợc cho là một trong những cơ chế quan trọng nhất trong việc
kiểm soát sinh học những bệnh từ đất. Nhiều loài vi khuẩn sử dụng trong những
nghiên cứu kiểm soát sinh học là những loài có thể tạo ra kháng sinh.
Agrobacterium tạo ra agrocin 84 và 434 có nguồn gốc từ nucleoside. Chủng
Baccillus kiểm soát bệnh cây trồng tạo ra lipopeptide fengycin, một phức hợp
aminopolyol zwittermycin A và kanosamine. Tác nhân kiểm soát sinh học
Pseudomonas là đối tƣợng đƣợc nghiên cứu nhiều nhất về khả năng tạo ra kháng
sinh. Chúng tạo ra một chuỗi những kháng sinh phenolic, nhƣ là 2,4-
diacetylphloroglucinol (2,4-DAPG), pyoluteorin, pyrrolnitrin, và ít nhất 4 loại
phenazine khác nhau. Bên cạnh đó, chúng có phổ kí chủ rộng, bao gồm cà chua, bí,
cà rốt, và bắp cải. Những điều kiện trên đem đến cho chúng tiềm năng phát triển
nhƣ một loại thuốc trừ sâu sinh học đối với nhiều loại cây trồng. Vì vậy, việc
nghiên cứu xác định khả năng định cƣ của vi khuẩn Pseudomonas trên rễ cây trồng

2


rất quan trọng. Cần phát triển một phƣơng pháp hữu hiệu để quan sát những tế bào
vi khuẩn riêng lẻ trong một tập đoàn vi khuẩn trong những mô hình thí nghiệm và

môi trƣờng tự nhiên nhƣ trong biofilm hay trên rễ cây trồng khi muốn nghiên cứu
những hệ thống này.
Protein green fluorescent (gfp) từ loài sứa Aequorea victoria đã đƣợc chứng
minh là có giá trị trong nhiều nghiên cứu sinh học khác nhau. Theo Bloemberg và
ctv (1997) gfp mang lại khả năng nghiên cứu nghiên cứu tế bào mà không phải phá
hủy cấu trúc và cũng không cần thêm vào các cơ chất ngoại sinh. Thêm vào đó,
những tế bào đƣợc đánh dấu gfp có thể quan sát bằng kính hiển vi có gắn bộ lọc
huỳnh quang thông thƣờng nếu đƣợc kích thích ở bƣớc sóng thích hợp, đáp ứng đầy
đủ tính chất cho một hệ thống “marker gene”, “reporter gene” nhằm kiểm soát khả
năng định cƣ của vi khuẩn đối kháng trên đất hay cây trồng. Để đánh dấu vi khuẩn
Pseudomonas fluorescens với marker GFP chúng ta có thể sử dụng nhiều phƣơng
pháp, trong đó tiếp hợp ba thành phần là một trong những phƣơng pháp đơn giản,
dễ thực hiện và có chi phí thấp.
Xuất phát từ những vấn đề trên chúng tôi thực hiện đề tài “Tối ƣu quy trình
chuyển gene gfp vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens bằng phƣơng pháp tiếp
hợp ba thành phần”.
Đề tài này tiếp tục từ nghiên cứu “Chuyển gene gfp (Green Fluorescent
Protein) vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens bằng phƣơng pháp tiếp hợp ba
thành phần” do Đỗ Thị Ngọc Hân, trƣờng Đại học Nông Lâm thực hiện, và nghiên
cứu “Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α” do
Phạm Duy và Huỳnh Văn Thái, Đại học Nông Lâm thực hiện.
1.2 Mục đích
1- Chọn lọc dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens có đặc tính đối
kháng mạnh với nấm, phát sáng mạnh trên môi trƣờng KB và có khả
năng kháng kháng sinh thích hợp cho mục đích thí nghiệm.

3


2- Khảo sát các điều kiện tối ƣu để chuyển gene gfp vào vi khuẩn

Pseudomonas fluorescens bằng phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần.
1.3 Yêu cầu
Chọn lọc đƣợc dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens có đặc tính đối
kháng mạnh với nấm, phát sáng mạnh trên môi trƣờng KB và có khả năng kháng
kháng sinh thích hợp cho mục đích thí nghiệm.
Xây dựng đƣợc quy trình tiếp hợp plasmid pUT-gfp vào vi khuẩn
Pseudomonas fluorescens bằng phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần tối ƣu cho
dòng vi khuẩn nhận.
Thực hiện PCR để kiểm tra sự hiện diện của gene gfp trong vi khuẩn
Pseudomonas fluorescens sau khi tiếp hợp.


















4

Chƣơng 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Sự trao đổi thông tin di truyền ở vi khuẩn
2.1.1 Giới thiệu
Trong các quần thể vi khuẩn, đột biến liên tục xảy ra do các lỗi trong quá
trình sao chép. Nếu có sự chọn lọc thuận lợi cho một đột biến cụ thể nào đó (ví dụ
nhƣ tính kháng kháng sinh), thể đột biến đó sẽ nhanh chóng trở thành thành phần
chính trong quần thể nhờ vào tốc độ tăng trƣởng nhanh chóng. Thêm vào đó,vì vi
khuẩn là những sinh vật đơn bội nên ngay cả những đột biến lặn cũng sẽ đƣợc biểu
hiện. Do đó, những đột biến trong quần thể vi khuẩn có thể gây ra vấn đề trong việc
chữa trị các bệnh nhiễm khuẩn. Mặt khác, vi khuẩn có những cơ chế chuyển gene
sang vi khuẩn khác nên 1 đột biến xảy ra trong 1 tế bào có thể lan truyền sang các tế
bào khác.
Chuyển gene ở vi khuẩn chỉ đi theo một hƣớng duy nhất là từ tế bào vi khuẩn
cho sang tế bào vi khuẩn nhận. Thể cho thƣờng chỉ truyền đi một phần nhỏ DNA
của chúng nên không tạo thành các hợp tử hoàn chỉnh mà chỉ tạo thành các hợp tử
không hoàn chỉnh. Các gene của vi khuẩn thƣờng chỉ truyền trong cùng loài nhƣng
thỉnh thoảng sự chuyển gene tới các loài khác cũng có thể xảy ra.
2.1.2 Những cơ chế chuyển gene ở vi khuẩn
2.1.2.1 Biến nạp (transformation)
Biến nạp là phƣơng pháp chuyển gene nhờ sự thu nhận các DNA tự do trong
môi trƣờng xung quanh của thể nhận, các DNA này có nguồn gốc từ thể cho.
Các yếu tố ảnh hƣởng đến biến nạp

5


Kích thƣớc DNA: DNA mạch đôi có trọng lƣợng ít nhất 5x10

5
dalton cho kết
quả biến nạp tốt nhất (Mayer, 2007). Do đó, biến nạp dễ bị ảnh hƣởng bởi các
nuclease có trong môi trƣờng.
Tính khả nạp của thể nhận: một số vi khuẩn có thể hấp thụ DNA một cách tự
nhiên. Tuy nhiên, chúng chỉ có thể thực hiện điều đó vào một thời kì cụ thể trong
chu kì sinh trƣởng khi chúng tạo ra một loại protein đặc biệt gọi là yếu tố khả biến.
Ở giai đoạn này, vi khuẩn đƣợc gọi là khả nạp. Những loài vi khuẩn khác thì không
thể thu nhận DNA một cách tự nhiên nhƣng ta có thể tạo ra tính khả nạp in vitro
bằng cách xử lý với hóa chất (ví dụ nhƣ CaCl
2
).
Các giai đoạn trong biến nạp
1. Thu nhận DNA: sự hấp thu DNA ở vi khuẩn G
-
và G
+
khác nhau. Vi khuẩn G
+
thu nhận DNA dƣới dạng mạch đơn còn mạch bổ sung đƣợc tạo thành trong thể
nhận. Trái lại, vi khuẩn G
-
thu nhận DNA mạch đôi.
2. Tái tổ hợp tƣơng đồng: sau khi DNA từ thể cho đƣợc thu nhận, xuất hiện một sự
tái tổ hợp qua lại giữa NST và DNA từ thể cho. Sự tái tổ hợp này đòi hỏi tính
tƣơng hợp và gây ra sự thay thế DNA giữa thể cho và thể nhận.
3. Sự tái tổ hợp đòi hỏi các gene điều khiển tái tổ hợp ở vi khuẩn (recA, B, và C)
và tính tƣơng đồng giữa các DNA liên quan. Kiểu tái tổ hợp này gọi là tái tổ hợp
chung hay tái tổ hợp tƣơng đồng. Vì đòi hỏi sự tƣơng đồng, chỉ DNA từ các loài
vi khuẩn có mối liên quan gần mới có nhiều khả năng biến nạp thành công. Tuy

nhiên, cũng có những trƣờng hợp hiếm chuyển gene xảy ra giữa những loài vi
khuẩn ít liên quan.
Về tầm quan trọng, biến nạp xảy ra trong tự nhiên có thể dẫn đến sự gia tăng
độc tính. Ngoài ra, biến nạp còn đƣợc sử dụng trong công nghệ DNA tái tổ hợp.
2.1.2.2 Tải nạp (transduction)
Tải nạp là quá trình chuyển thông tin di truyền từ thể cho sang thể nhận nhờ
1 bacteriophage (hay phage).

6


Lớp vỏ của phage có thể bảo vệ DNA không bị ảnh hƣởng bởi các nuclease
trong môi trƣờng. Hầu hết các trƣờng hợp chuyển gene bằng con đƣờng tải nạp xảy
ra trong cùng loài. Tuy nhiên, đối với phage có phổ kí chủ rộng thì chuyển gene
cũng có thể xảy ra giữa các loài. Khả năng tải nạp của phage liên quan đến vòng đời
của chúng. Thông thƣờng ngƣời ta chia tải nạp thành hai loại là tải nạp phổ biến và
tải nạp đặc hiệu.
Tải nạp phổ biến là quá trình tải nạp mà bất kì gene nào của vi khuẩn cho
cũng có tiềm năng đƣợc chuyển qua vi khuẩn nhận. Phage làm trung gian tải nạp
phổ biến sẽ làm gãy DNA tế bào chủ thành những mảnh nhỏ. Trong quá trình chúng
gói DNA vào các hạt phage nhờ cơ chế “headfull”, thỉnh thoảng một số mảnh của
DNA tế bào chủ cũng đƣợc gói ngẫu nhiên vào lớp vỏ của phage. Do đó, bất kì
gene nào từ thể cho cũng có khả năng đƣợc chuyển đi miễn là kích thƣớc của chúng
vừa với phần đầu của phage. Khi phage có chứa DNA của thể cho xâm nhiễm vào
thể nhận, DNA thể cho sẽ xâm nhập vào thể nhận và xảy ra sự tái tổ hợp tƣơng
đồng thay thế DNA giữa thể cho và thể nhận.
Tải nạp đặc hiệu: là quá trình tải nạp mà chỉ có những gene nhất định nào đó
từ thể cho có thể chuyển sang thể nhận. Những phage khác nhau có thể chuyển
những gene khác nhau nhƣng 1 phage cụ thể nào đó chỉ chuyển đƣợc những gene
nhất định nào đó. Tải nạp đặc hiệu có trung gian là phage tiềm tan hay phage ôn

hòa, gene nào đƣợc chuyển phụ thuộc vào vị trí mà prophage chèn vào NST.
Trong quá trình tách ra của prophage, thỉnh thoảng xảy ra lỗi làm một số
DNA của tế bào chủ cũng đƣợc tách ra cùng với DNA phage. Chỉ có những DNA
của tế bào chủ ở 2 phía nơi prophage chèn vào mới có thể đƣợc chuyển. Sau khi
nhân lên và đƣợc phóng thích, các phage xâm nhiễm vào thể nhận. Sự tiềm tan hóa
xảy ra giúp các gene từ thể cho đƣợc chuyển ổn định.Thể nhận lúc này có hai bản
sao của gene đƣợc chuyển. Cũng có thể xảy ra sự tái tổ hợp tƣơng đồng giữa các
gene của thể cho và thể nhận.
Về tầm quan trọng, sự biến đổi tiềm tan (phage) xuất hiện trong tự nhiên là
nguồn tạo ra các chủng vi khuẩn độc.

7


F
+
F
-

F
+
F
-

F
+
F
+
F
+

F
+

Hình 2.1: Cơ chế lai giữa F
+
và F
-
(Mayer, 2007).
2.1.2.3 Tiếp hợp (conjugation)
Tiếp hợp là quá trình chuyển DNA từ thể cho sang thể nhận qua sự tiếp xúc
trực tiếp giữa các tế bào. Ở vi khuẩn có 2 kiểu giới tính là thể cho (male) và thể
nhận (female). Sự truyền vật chất di truyền chỉ đi theo một con đƣờng là từ thể cho
sang thể nhận.
Các kiểu giới tính ở vi khuẩn
Thể cho: vi khuẩn có khả năng của 1 thể cho nếu trong tế bào có sự hiện diện
của yếu tố giới tính F. Yếu tố F là 1 đoạn DNA dạng vòng có khả năng tự sao chép
trong tế bào, chúng là 1 đơn vị sao chép độc lập còn đƣợc gọi chung là plasmid.
Yếu tố F có những gene cần thiết cho sự tự sao chép và khả năng truyền DNA của
chúng cho thể nhận. Yếu tố F còn mã hóa cho khả năng tạo pili giới tính trên bề mặt
vi khuẩn. Các pili này đóng vai trò quan trọng trong quá trình tiếp hợp.
Thể nhận: vi khuẩn là 1 thể nhận khi chúng không có yếu tố F.
Các trạng thái tồn tại của yếu tố F
(i) F
+
: vi khuẩn đƣợc gọi là F
+
khi chúng có chứa yếu tố F, mà yếu tố F trong
trƣờng hợp này chỉ chứa các gene cần thiết cho sự tự sao và chuyển DNA, không có
gene nào của NST đƣợc kết hợp vào.

8


F
+

Hfr
Hình 2.2: Sự hình thành thể Hfr từ thể F
+
(Mayer, 2007).
Hfr F
-

Hfr F
-

Hfr F
-
Hfr F
-

Hình 2.3: Cơ chế lai giữa Hfr và F
-
(Mayer, 2007).
Hfr F’
Hình 2.4: Cơ chế hình thành thể F’ từ thể Hfr
(Mayer, 2007).
Khi lai F
+
với F
-
, F
-
sẽ trở thành F
+
trong khi F
+
vẫn là F
+
. Do đó, yếu tố F có
khả năng lan truyền. Mức độ chuyển gene NST trong trƣờng hợp này rất thấp.
(ii) Hfr (high frequency
recombinance): vi khuẩn đƣợc gọi là 1
thể Hfr khi chúng có yếu tố F kết hợp vào
NST nhờ sự tái tổ hợp. Khi lai Hfr với F
-
,
F
-
hiếm khi trở thành Hfr còn Hfr vẫn là

Hfr. Mức độ chuyển các gene của thể cho
trong trƣờng hợp này khá cao.














(iii) F’: trong trƣờng hợp này
yếu tố F độc lập với NST của tế bào
chủ nhƣng chúng có mang một số
gene của tế bào chủ. F’ tạo thành khi
tách yếu tố F ra khỏi NST trong 1 thể
Hfr. Thỉnh thoảng khi yếu tố F đƣợc

9


tách ra, các gene ở 2 bên có thể đƣợc tách ra theo tạo thành thể F’.
Khi lai F’ với F
-
, F

-
sẽ trở thành F’ còn F’ vẫn là F’. Mức độ chuyển gene cao
với các gene của NST nằm trên F’ và thấp với các gene vẫn nằm trong NST thể cho.













Về tầm quan trọng, đối với vi khuẩn G
-
đây là con đƣờng chính để chuyển
gene. Chuyển gene có thể xảy ra giữa các loài vi khuẩn khác nhau. Việc truyền tính
kháng nhiều loại kháng sinh bằng con đƣờng tiếp hợp hiện là vấn đề lớn trong việc
chữa trị các bệnh cho vi khuẩn. Vì thể nhận sẽ trở thành thể cho sau khi nhận
plasmid nên có thể dễ dàng hiểu đƣợc tại sao 1 gene kháng kháng sinh chứa trên
plasmid có thể nhanh chóng chuyển 1 quần thể nhạy thành 1 quần thể kháng với
kháng sinh đó. Vi khuẩn G
+
cũng có những plasmid chứa các gene kháng với nhiều
loại kháng sinh, các gene này có thể đƣợc chuyển đi bằng con đƣờng tiếp hợp hay
tải nạp. Theo Mayer (2007), cơ chế tiếp hợp ở vi khuẩn G
+

hơi khác với vi khuẩn G
-

đó là thể cho sẽ tạo 1 chất dính gây ra sự kết hợp với thể nhận và chuyển DNA.
Cameron (2007) cho rằng tiếp hợp là một phƣơng pháp rất hiệu quả để đƣa
DNA vào thể nhận. Nó có thuận lợi là DNA đƣa vào ở dạng mạch đơn nên dễ dàng
hơn cho việc tái tổ hợp tƣơng đồng so với DNA đƣa vào ở dạng mạch kép (biến nạp
F’ F’ F’ F’
F’ F
-

F’ F
-

Hình 2.5: Cơ chế lai giữa F’ và F
-
(Mayer, 2007).

10


và điện biến nạp). Tiếp hợp cũng là con đƣờng thƣờng đƣợc sử dụng để đƣa DNA
từ E.coli vào vi khuẩn vùng rễ.
Cơ chế quá trình tiếp hợp
Việc truyền yếu tố F từ một vi khuẩn F
+
sang một vi khuẩn F
-
đòi hỏi một sự
tiếp xúc trực tiếp giữa hai tế bào. Khi nuôi chung với vi khuẩn F

-
các vi khuẩn F
+
sẽ
có phản ứng của giới tính đực kéo dài pili sinh dục của mình và bám vào một thụ
thể của tế bào vi khuẩn nhận, sau đó pili co lại để kéo tế bào nhận lại gần. Giai đoạn
tiếp theo vi khuẩn cho tiết ra enzyme làm tan vách tế bào của vi khuẩn nhận và
truyền DNA của mình vào. Hiện tƣợng tái tổ hợp sẽ diễn ra sau đó. Quá trình truyền
vật chất di truyền từ vi khuẩn cho sang vi khuẩn nhận xảy ra theo các giai đoạn sau:
Giai đoạn 1: sự tiếp xúc ngẫu nhiên xuất hiện vài phút sau khi trộn vi khuẩn
với nhau. Xác suất của sự tiếp xúc phụ thuộc vào nồng độ của hai nòi vi khuẩn.
Giai đoạn 2: là sự bắt cặp giữa tế bào nhận và tế bào cho. Tế bào nhận đóng
vai trò thụ động, màng tế bào của nó bị hòa tan tại chổ tiếp xúc với pili sinh dục của
vi khuẩn đực, tạo thành những cầu nguyên sinh chất có đƣờng kính từ 10 – 30 µm.
Quá trình này phụ thuộc vào pH, điều kiện dinh dƣỡng trong môi trƣờng.
Giai đoạn 3: các DNA của tế bào cho chuyển sang tế bào nhận theo cấu trúc
thẳng. Số lƣợng gene chuyển sang phụ thuộc vào thời gian tiếp hợp.
Giai đoạn 4: là quá trình tái tổ hợp giữa nhiễm sắc thể của thể nhận và đoạn
vật chất di truyền của thể cho, quá trình này đòi hỏi tính tƣơng đồng.
Cuối cùng là sự tái tạo nhiễm sắc thể trong những thế hệ sau, thể lai đƣợc
hình thành.
2.1.3 Những yếu tố di truyền có khả năng chuyển vị (transposable genetic
element_TGE)
Những yếu tố di truyền có khả năng chuyển vị (TGE) là những đoạn DNA có
khả năng di chuyển từ vị trí này sang vị trí khác.

11


Transposase

ABCDEFG
GFEDCBA
Hình 2.6: Cấu trúc một trình tự chèn (Mayer, 2007).
2.1.3.1 Đặc tính của những yếu tố di truyền có khả năng chuyển vị
(i) Di chuyển ngẫu nhiên, TGE có thể di chuyển từ bất kì phân tử DNA nào
đến bất kì phân tử DNA nào khác, thậm chí đến 1 vị trí khác trên cùng 1 phân tử.
Thực ra, sự di chuyển này không hoàn toàn là ngẫu nhiên, cũng có những vị trí trên
phân tử DNA mà TGE sẽ ƣu tiên chèn vào. (ii) Chúng không có khả năng tự sao
chép: các TGE không có cơ chế tự sao chép (ngoại trừ một số phage có khả năng
chuyển vị), do đó, để nhân lên chúng phải kết hợp với các đơn vị sao chép khác.
(iii) Sự chuyển vị đƣợc điều khiển bởi cơ chế tái tổ hợp tại vị trí đặc hiệu. Sự
chuyển vị đòi hỏi ít hoặc không cần tính tƣơng đồng giữa các vị trí. Sự chuyển vị
xảy ra nhờ 1 transposase mã hóa cho TGE. Và cuối cùng, sự chuyển vị có thể xảy ra
đồng thời với sự nhân đôi. Trong nhiều trƣờng hợp, sự chuyển vị làm di chuyển
TGE từ vị trí này tới vị trí khác. Tuy nhiên, cũng có những trƣờng hợp sự chuyển vị
xảy ra đồng thời với sự nhân đôi của TGE, 1 bản sao vẫn ở lại vị trí cũ còn bản sao
kia sẽ đƣợc chuyển đến vị trí mới.
2.1.3.2 Các loại yếu tố di truyền có khả năng chuyển vị
Các trình tự chèn (IS_insertion sequence)
Các trình tự chèn là các TGE không chứa gene nào khác ngoài các gene cần
thiết cho sự chuyển vị. Về cách đặt tên, các trình tự chèn đƣợc kí hiệu là IS, kèm
theo 1 con số. Ví dụ IS1.
Về cấu trúc, IS là 1 đoạn DNA thẳng, ở hai đầu có chứa các trình tự lặp lại, ở
giữa có các gene liên quan đến sự chuyển vị và các trình tự kiểm soát sự biểu hiện
gene, ngoài ra không có bất kì 1 gene không thiết yếu nào khác hiện diện.




Tầm quan trọng của các trình tự chèn đƣợc thể hiện trong các lĩnh vực sau:

Đột biến: đƣa 1 trình tự chèn vào 1 gene của vi khuẩn sẽ làm bất hoạt gene.

12


IS IS Resistance Gene(s)
IS IS Resistance Gene(s)
Hình 2.7: Cấu trúc transposon (Mayer, 2007).
Chèn plasmid vào NST: các vị trí mà plasmid chèn vào NST vi khuẩn là
ngay tại trình tự chèn trên NST hay gần đó .
Sự biến đổi phase: kháng nguyên lông là một trong những kháng nguyên
chính kích thích đáp ứng miễn dịch chống lại sự xâm nhiễm vi khuẩn. Salmonella
có 2 gene mã hóa cho 2 loại kháng nguyên lông khác nhau. Sự biểu hiện của các
gene này đƣợc điều hòa bởi 1 trình tự chèn. Điều hòa theo hƣớng này thì gene này
biểu hiện, theo hƣớng kia thì gene kia biểu hiện. Do đó, Salmonella có thể thay đổi
kháng nguyên lông của chúng để đáp ứng với sự tấn công của hệ thống miễn dịch.
Sự biến đổi phase cũng xảy ra ở những kháng nguyên bề mặt khác của vi khuẩn.
Transposons (Tn)
Transposon là các yếu tố di truyền có khả năng chuyển vị có chứa 1 hay
nhiều gene khác ngoài các gene cần thiết cho sự chuyển vị. Về cách đặt tên,
transposon đƣợc kí hiệu là Tn kèm theo 1 con số. Ví dụ Tn5.
Về cấu trúc, cấu trúc của 1 transposon tƣơng tự nhƣ 1 trình tự chèn. Các gene
có thêm nằm ở giữa, 2 đầu là các trình tự lặp lại. Trong một số trƣờng hợp (các
transposon ghép) các trình tự lặp lại ở hai đầu chính là các trình tự chèn.

Tầm quan trọng: nhiều gene kháng kháng sinh nằm trên transposon. Vì
transposon có thể nhảy từ phân tử DNA này tới phân tử DNA khác nên các
transposon này là 1 yếu tố chính trong sự phát tán plasmid, đem đến tính kháng
nhiều loại thuốc cho các vi khuẩn có chứa plasmid nhƣ vậy. Những plasmid kháng
nhiều loại thuốc đang là 1 vấn đề y học lớn vì việc sử dụng bừa bãi thuốc kháng

13


sinh có thể đem đến 1 sự chọn lọc thuận lợi cho các loài vi khuẩn có chứa những
plasmid này.
Các transposon vi khuẩn phân biệt với nhau bằng mức độ hội nhập
(intergration). Các phần tử Tn7, Tn9, IS4, IS5 có mức độ hội nhập cao. Các phần tử
Tn10, IS1, IS2 có mức độ hội nhập trung bình. Các phần tử Tn2, Tn4, Tn5 và DNA
phage Mu nói chung gắn vào các chỗ ngẫu nhiên của bộ gen. Tần số chuyển vị của
các transposon vi khuẩn cũng biến đổi trong phạm vi rộng từ 10
-7
– 10
-4
, ở các điều
kiện khác nhau thì nó phụ thuộc vào độ dài của transposon.
2.2 Plasmid
Plasmid là những phân tử DNA dạng vòng có khả năng sao chép và tồn tại
độc lập trong tế bào vi khuẩn. Hầu hết plasmid có chứa 1 hoặc nhiều gene mà
những gene này thƣờng không thiết yếu cho sự sống của tế bào chủ nhƣng quy định
cho những đặc điểm hữu ích, ví dụ nhƣ khả năng kháng kháng sinh. Ngƣời ta
thƣờng dựa vào khả năng kháng kháng sinh nhƣ một marker chọn lọc để chắc rằng
vi khuẩn nuôi cấy có chứa một plasmid cụ thể nào đó (Brown, 1995).
Tất cả plasmid đều có chứa ít nhất một trình tự DNA đóng vai trò nhƣ một
điểm khởi đầu sao chép, cho phép plasmid nhân lên độc lập với nhiễm sắc thể của tế

bào chủ. Về kích thƣớc, plasmid thay đổi từ nhỏ nhất là 1 kb đến lớn nhất là 250 kb,
nhƣng chỉ những plasmid có kích thƣớc nhỏ hơn 10 kb mới thích hợp để sử dụng
trong cloning.
Về số bản sao, plasmid đƣợc chia thành nhóm plasmid có nhiều bản sao và
nhóm có ít bản sao. Đối với plasmid có nhiều bản sao, có thể tìm thấy 20 đến 50
plasmid trong 1 tế bào. Loại plasmid này có 1 đặc điểm hữu ích là vẫn có thể nhân
lên khi sự tổng hợp protein của tế bào ngừng lại. Đặc tính này đƣợc ứng dụng để
tăng số lƣợng plasmid mà không cần tăng lƣợng tế bào chủ tạo thuận lợi cho quá
trình ly trích plasmid. Khi canh khuẩn đạt đến nồng độ tế bào thích hợp, một tác
nhân ức chế tổng hợp protein (ví dụ nhƣ chloramphenicol) đƣợc thêm vào, và canh
khuẩn đƣợc ủ tiếp khoảng 12 tiếng nữa. Trong thời gian này, plasmid tiếp tục nhân

14


lên trong khi sự sao chép nhiễm sắc thể của tế bào chủ và sự phân chia tế bào bị
khóa lại. Kết quả là số bản sao của plasmid có thể đạt đến hàng ngàn bản sao. Đối
với plasmid có ít bản sao, sự sao chép xảy ra cùng lúc với sự sao chép nhiễm sắc thể
vi khuẩn. Trong tế bào vi khuẩn có từ 1 – 3 bản sao plasmid nhƣ vậy. Kích thƣớc tối
thiểu của nó 20 – 30 kb, còn tối đa thì lớn hơn một bậc. Khi ly trích plasmid có ít
bản sao, muốn gia tăng lƣợng plasmid thì phải gia tăng lƣợng tế bào chủ.
Plasmid đƣợc chia thành 2 nhóm: tiếp hợp và không tiếp hợp. Plasmid tiếp
hợp có khả năng phát động sự tiếp hợp giới tính giữa các tế bào vi khuẩn, quá trình
này dẫn đến kết quả là plasmid tiếp hợp đƣợc lan truyền từ 1 tế bào tới tất cả các tế
bào khác trong canh khuẩn. Sự tiếp hợp và chuyển plasmid đƣợc kiểm soát bởi hệ
thống chuyển hay các gene tra, mà chỉ có trong những plasmid tiếp hợp. Tuy nhiên,
1 plasmid không tiếp hợp, dƣới một số điều kiện thích hợp, có thể đƣợc truyền đi
cùng với plasmid tiếp hợp khi cả hai cùng hiện diện trong 1 tế bào.
Nhiều loại plasmid có thể đƣợc tìm thấy trong cùng 1 tế bào. Trên thực tế,
những tế bào E.coli đƣợc biết là có thể chứa đến 7 loại plasmid khác nhau cùng lúc.

Theo Mølbak (2003) để có thể cùng tồn tại trong 1 tế bào, những plasmid khác nhau
phải liên kết với nhau. Nếu 2 plasmid không có khả năng liên kết với nhau thì khi
đó 1 trong 2 sẽ nhanh chóng bị mất đi khỏi tế bào.
Việc phân loại plasmid thông thƣờng dựa trên những đặc điểm chính đƣợc
quy định bởi các gene của plasmid (Brown, 1995). Theo cách này, plasmid đƣợc
chia thành 5 loại: (i) Fertility hay “F” plasmid: chỉ chứa các gene tra và không có
đặc điểm gì ngoại trừ khả năng phát động sự truyền tiếp hợp của plasmid. Ví dụ nhƣ
F plasmid của E.coli. (ii) Resistance hay “R” plasmid: có chứa những gene đem đến
cho tế bào chủ tính kháng với 1 hoặc nhiều tác nhân kháng khuẩn, nhƣ là
chloramphenicol, ampicillin và thủy ngân. R plasmid rất quan trọng trong vi sinh
vật học lâm sàng bởi vì sự phát tán của chúng ra các quần thể tự nhiên có thể dẫn
đến hậu quả nghiêm trọng trong việc chữa trị các bệnh nhiễm vi khuẩn. Ví dụ: RP4,
thông thƣờng tìm thấy ở Pseudomonas, nhƣng cũng có thể xuất hiện ở nhiều loài vi

15


Hình 2.8: Cơ chế phƣơng pháp tiếp hợp 3 thành phần (Cameron, 2007).
khuẩn khác. (iii) Col plasmid: mã hóa cho các colicin_là những protein có thể gây
độc cho vi khuẩn khác. Ví dụ: ColE1 ở E.coli. (iv) Degradative plasmid: cho phép
tế bào chủ tổng hợp những phân tử đặc biệt nhƣ toluene và acid salicylic. Ví dụ:
TOL ở Pseudomonas putida. Và cuối cùng là Virulence plasmid: đem đến đặc tính
gây bệnh cho tế bào chủ. Ví dụ: Ti plasmid ở Agrobacterium tumefaciens, gây bƣớu
ở cây 2 lá mầm.
2.3 Các phƣơng pháp thƣờng dùng để chuyển DNA plasmid
2.3.1 Phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần (triparental mating)
Là phƣơng pháp chuyển gene từ thể cho sang thể nhận qua sự tiếp xúc trực
tiếp giữa các tế bào và có sự trợ giúp của dòng vi khuẩn có plasmid hỗ trợ.