Sac ky hieu nang cao

<span class='text_page_counter'>(1)</span>Phần I : Cơ sở lý thuyết HPLC là chữ viết tắt của 04 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( High Performance Liquid Chromatography) ,trước kia gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography) Phương pháp này ra đời từ năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển . Hiện nay phương pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hoá cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích .Hiện nay nó áp dụng rất lớn trong nhiều nghành kiểm nghiệm đặc biệt là ứng dụng cho nghành kiểm nghiệm Thuốc . Và nó hiện là công cụ đắc lực trong phân tích các thuốc đa thành phần cho phép định tính và định lượng ..

<span class='text_page_counter'>(2)</span> Phần I : Cơ sở lý thuyết. 1 - Khái niệm. : Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương. pháp chia tách trong đó pha động là châït lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn ,hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hoá học với các nhóm chức hữu cơ .Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ,phân bố ,trao đổi Ion hay phân loại theo kích cỡ ( Rây phân tử ) .. 2- Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột : Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký và lọai sắc ký . Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có Sắc ký hấp phụ pha thuận hoặc pha đảo . Nếu pha tĩnh là chất trao đổi Ion thì ta có Sắc ký trao đổi ion . Nếu pha tĩnh là chất Lỏng thì ta có Sắc ký phân bố hay sắc ký chiết ..

<span class='text_page_counter'>(3)</span> Phần I : Cơ sở lý thuyết Nếu pha tĩnh là Gel thì ta có Sắc ký Gel hay Rây phân tử . Cùng với pha tĩnh để rửa rải chất phân tích ra khỏi cột ,chúng ta cần có một pha độüng . Như vậy nếu chúng ta nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân tích A,B,C .. Vào cột phân tích ,kết quả các chất A,B,C.. Sẽ được tách ra khỏi nhau sau khi đi qua cột .Quyết định hiệu quả của sự tách sắc Chất ký ở đây là tổng phán tíchhợp A caïc tæång taïc .. F1 Pha ténh. +B+C F3. F2 Pha âäüng.

<span class='text_page_counter'>(4)</span> Phần I : Cơ sở lý thuyết. Tổng của 03 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa rải ra khỏi cột trước tiên khi lực lưu giữ trên cột là nhỏ nhất ( F1) .và ngược lại . Đối với mỗi chất ,sự lưu giữ được qui định bởi 03 lực F1,F2,F3 .Trong đó F1 và F2 giữ vai trò quyết định .còn F3 là yếu tố ảnh hưởng không lớn . Ở đây F1 là lực giữ chất phân tích trên cột .F2 là lực kéo của pha động đối với chất phân tích ra khoíi cäüt . Như vậy với các chất khác nhau thì F1 và F2 là khác nhau ,Kết quả là các chất khác nhau sẽ di chuyển trong cột với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau khi ra khỏi cột . ( như hình dưới đây ).

<span class='text_page_counter'>(5)</span> Phần I : Cơ sở lý thuyết : Phần minh hoạ quá trình tách các chất A và B trong cột tách sắc ký Pha âäüng. Thời gian. A. B.

<span class='text_page_counter'>(6)</span> Phần I : Cơ sở lý thuyết. 3 - Phân loại sắc ký :. Theo cơ chế tách sắc ký người ta phân loaüi như sau : 3.1 Sắc ký hấp phụ : Quá trình sắc ký dựa trên sự hấp phụ mạnh ,yếu khác nhau của pha tĩnh đối với các chất tan và sự rửa giải ( phản hấp phụ ) của pha động để kéo chất tan ra khỏi cột .Sự tách một hỗn hợp phụ thuộc vào tính chất động học của chất hấp phụ . Trong trường loại này có 02 loại hấp phụ : + Sắc ký hấp phụ pha thuận ( NP - HPLC) : Pha tĩnh phân cæûc ,pha âäüng khäng phán cæûc . + Sắc ký hấp phụ pha đảo (RP - HPLC) : Pha tĩnh không phân cæûc ,pha âäüng phán cæûc . Loại sắc ký này được áp dụng rất thành công để tách các hỗn hợp các chất có tính chất gần tương tự nhau và thuộc loại không phân cực,phân cực yếu hay trung bình như các Vitamin,thuốc hạ nhiệt giảm đau .... Hiện nay chúng ta đang sử dụng chỉ có loại sắc ký này mà thäi..

<span class='text_page_counter'>(7)</span> Phần I : Cơ sở lý thuyết Chủ yếu hiện nay chúng ta sử dụng lọai sắc ký hấp phụ pha đảo ( RP ) Trong dược điển USP khi chúng ta tra cứu cột có giá trị tương ứng như sau : L1 : RP 18 Kích thước hạt tương ứng từ 5 - 10 m L7 : RP 8 Kích thước hạt tương ứng từ 5 - 10 m L3 : Si 60 Kích thước hạt tương ứng từ 5 - 10 m Và còn một số loại cột khác như cột Diol , Cột NH2,CN . . vv.

<span class='text_page_counter'>(8)</span> 4 -. Phần I : Cơ sở lý thuyết. Các đại lượng đặc trưng của sắc ký đồ. Kết quả của quá trinh tách các chất được Detector phát hiện ghi thành sắc ký đồ như hình trên.

<span class='text_page_counter'>(9)</span> Phần I : Cơ sở lý thuyết T : Thời gian lưu chết o. tr2. t’r1 : Thời gian lưu thực chất A. tr1. t’r2 : Thời gian lưu thực chất B tr1 : Thời gian lưu chất A. t r1 ’. to. tr2 : Thời gian lưu chất B t’r2.

<span class='text_page_counter'>(10)</span> Phần I : Cơ sở lý thuyết. Từ các thông số của các peak trên đây ,nhiều đại lượng đặc trưng về lý thuyết được đưa ra để đánh giá một quá trình sắc ký .Dưới đây là một số đại lượng thường dùng trong thực tế và cách thay đổi các đại lượng này có lơiü cho quá trình phân tích sắc kyï. 4.1 Thời gian lưu thực t’r : Retention time Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ khi bơm mẫu vào cột cho đến khi chất đó ra khỏi cột âaût giaï trë cæûc âaûi. Thời gian lưu của mỗi chất là hằng định và các chất khác nhau thì thời gian lưu sẽ khác nhau trên cùng một điều kiện sắc ký đã chọn .Vì vậy thời gian lưu là đại lượng để phát hiện định tính các chất. Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố : + Bản chất sắc ký của pha tĩnh. + Bản chất ,thành phần,tốc độ của pha động + Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan + Trong một số trường hợp thời gian lưu còn phụ thuộc vaìo pH cuía pha âäüng ..

<span class='text_page_counter'>(11)</span> Phần I : Cơ sở lý thuyết Trong một phép phân tích nếu tr nhỏ quá thì sự tách kém ,còn nếu tr quá lớn thì peak bị doãng và độ lặp lại của Peak rất kém ,thời gian phân tích rất dài đồng thời kéo theo nhiều vấn đề khác như hao tốn dung môi,hoá chất, độ chính xác của phép phân tích kém. Để thay đổi thời gian lưu chúng ta dựa vào các yếu tố trên âaî trçnh baìy . 4.2 Hệ số dung lượng K’ : Capacity Factor Hệ số dung lượng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó trong hai pha cộng với sức chứa cột tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động ở trong thời điểm cân bằng .. K’ = ( tR - t0)/ t0 Nếu K’ nhỏ thì tR cũng nhỏ và sự tách kém . Nếu K’ lớn thì Peak bị doãng . Trong thực tế K’ từ 1- 5 là tối ưu ..

<span class='text_page_counter'>(12)</span> Phần I : Cơ sở lý thuyết. 4.3 - Âäü choün loüc  : Độ chọn lọc  cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký ,khi 02 chất A ,B có K’A và K’B khác nhau thì mới có khả năng tách .,mức độ tách biểu thị ở Độ chọn lọc  .  = K’B / K’A Với điều kiện K’B > K’A với  càng khác 1 thì khả năng tách càng rõ raìng = 1.02. = 1.16. = 1.20.

<span class='text_page_counter'>(13)</span> Phần I : Cơ sở lý thuyết 4.2 Số đĩa lý thuyết N: Số đĩa lý thuyết là đại lượng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc ký nhất định .Mỗi đĩa lý thuyết trong cột săc ký giống như là một lớp pha tĩnh có chiều cao là H ,Tất nhiên lớp này có tính chất động tức là một khu vực của hệ phân tách mà trong đó một cân bằng nhiệt động học được thiết lập giữa nồìng độ trung bình của chất tan trong pha tĩnh và pha động . Bề dày H phụ thuộc vào nhiều yếu tố : + Đường kính và độ hấp phụ của hạt pha tĩnh + Tốc độ và độ nhớt ( độ phân cực )của pha động + Hệ số khuyếch tán của các chất trong cột . Vì vậy với một điều kiên sắc ký xác định thì chiều cao H cũng hằng định đối với một chất phân tích và số đĩa lý thuyết của cột cũng được xác định..

<span class='text_page_counter'>(14)</span> Phần I : Cơ sở lý thuyết 4.2 Số đĩa lý thuyết N: Số đĩa lý thuyết N được tính theo công thức sau : N = 5,54 ( tR / W0,5)2 Trong âoï : tR : Thời gian lưu của chất phán têch . W0,5 : Độ rộng tại điểm 1/2 của Peak . Trong thực tế N nằm trong khoảng 2500 đến 5500 là vừa đủ ..

<span class='text_page_counter'>(15)</span> Phần I : Cơ sở lý thuyết 4.3 Âäü phán giaíi R : ( Resolution ) Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc ký đã cho. Độ phân giải của 02 Peak cạnh nhau phải được tính theo công thức sau : R= 2( t’RB - t’RA)/ (wa + wB) Trong thực tế nếu các Peak cân đối ( Gass) thì độ phân giải tối thiểu để 02 Peak tách là R =1.0 .Trong phép định lượng R=1,5 là phù hợp + Nếu R nhỏ thì các Peak chưa tách hẳn ,việc tính toán diện tích Peak sẽ không chính xác ,lúc này phải tìm cách tăng R theo 03 caïch sau: * Làm thay đổi K’ bằng cách thay đổi lực rửa giải của pha động ( Thay đổi độ phân cực nếu là RP - HPLC ,thay đôíi cường độ ion nếu là IE - HPLC ....) * Làm tăng số đĩa lý thuyết của cột bằng cách dùng cột dài hơn hoặc cột có kích thước nhỏ hơn ..

<span class='text_page_counter'>(16)</span> Phần I : Cơ sở lý thuyết 4.3 Âäü phán giaíi R : ( Resolution ) * Làm tăng độ chọn lọc  bằng cách dùng cột khác phù hợp hơn với quá trình tách hoặc thay đổi thành phần pha âäüng . + Nếu R lớn quá thì thời gian phân tích sẽ lâu,tốn nhiều pha động ,độ nhạy sẽ kém. Để khắc phục ta có thể thay đổi hệ pha động hay dùng chương trình Gradient dung môi . Tuy nhiên trong quá trình chạy sắc ký dùng chương trình dung môi thì một số pha động có tỷ lệ thay đổi sẽ kéo theo sự thay đổi đường nền làm ảnh hưởng rất lớn đến thời gian lưu và diện tích của các Peak ta phân tích . Trong thực tế nên hạn chế sử dụng chương trình Gradient dung môi mà chủ yếu là chúng ta phải tìm được hệ pha động rửa giải phù hợp, đáp ứng các yêu cầu trong quá trçnh phán têch ..

<span class='text_page_counter'>(17)</span> Phần I : Cơ sở lý thuyết 4.4 Hệ số không đối xứng T : ( Tailing factor) Hệ số không đối xứng T cho biết mức độ không đối xứng của Peak trên sắc ký đồ thu được . T được tính bằng tỷ số độ rộng của 02 nửa Peak tại điểm 1/10 chiều cao Peak :. T = a/b a b Peak dạng đôïi xứng hình Gauss trên thực tế khó đạt được vì vậy phải quan tâm đến hệ số không đối xứng T,.

<span class='text_page_counter'>(18)</span> Phần I : Cơ sở lý thuyết 4.4Hệ số không đối xứng T : ( Tailing factor) * Khi T  2.5 thì phép định lượng được chấp nhận * Khi T > 2.5 thì điểm cuối của Peak rất khó xác định ,vì vậy phép định lượng cần phải thay đổi các điều kiện sắc ký để làm cho Peack cân đối hån theo caïc caïch sau : + Làm giảm thể tích chết tức là đoaün nối từ cäüt âãïn Detector . + Thay đổi thành phần pha động sao cho khả năng rửa giải tăng lên + Giảm bớt lượng mẫu đưa vào cột bằng cách pha loãng mẫu hay giảm thể tích tiêm mẫu ..

<span class='text_page_counter'>(19)</span> Phần I : Cơ sở lý thuyết 5 Phân loại sắc ký và ứng dụng : + Theo cơ chế chia tách của sắc ký ,người ta phân ra các loại sau âáy : Sắc ký hấp phụ ( NP - HPLC và RP - HPLC); sắc ký phân bố sắc ký chiết ( LLC); sắc ký trao đổi ion ( IE - HPLC) ; sắc ký rây phân tử - sắc ký gel ( IG - HPLC) .Nhưng thực tế hiên nay chúng ta hiện chỉ đang ứng dụng sắc ký hấp phụ vào phân tích mẫu . 5.1 Sắc ký hấp phụ : * Quá trình sắc ký dựa trên sự hấp phụ mạnh yếu khác nhau của pha tĩnh đối với các chất tan và sự rửa giải (phản hấp phụ) cuả pha động để kéo chất tan ra khỏi cột .Sự tách một hỗn hợp phụ thuộc vào tính chất động học của chất hấp phụ .Trong loại này có 02 kiểu hấp phụ:.

<span class='text_page_counter'>(20)</span> Phần I : Cơ sở lý thuyết + Sắc ký hấp phụ pha thuận (NP-HPLC): Pha ténh phán cæûc ,pha âäüng khäng phán cæûc . + Sắc ký hấp phụ pha đảo ( RP - HPLC): Pha ténh khäng phán cæûc pha âäüng phán cæûc . Loại sắc ký này được áp dụng rất rộng rãi ,thành công để tách các hỗn hợp các chất có tính chất gần tương tự nhau và thuộc loại không phân cực ,phân cực yếu hay trung bình như các Vitamin, các thuốc hạ hiệt giảm đau ........

<span class='text_page_counter'>(21)</span> Phần II : Hệ thống HPLC I- Máy HP:C gồm các bộ phận cơ bản được tóm tắt trên sơ đồ sau : Column. Degasse. Pump. Tiêm mẫu. Detector.

<span class='text_page_counter'>(22)</span> Phần II: Hệ thống HPLC Trong âoï : 1- Bình chứa dung môi pha độüng 2- Bộ phận khử khí 3- Båm cao aïp 4-Bộ phận tiêm mẫu ( bằng tay hay Autosample) 5-Cột sắc ký ( Pha tĩnh ) ( để ngòai môi trường hay trong bộ điều nhiệt ) 6- Detector ( nhận tín hiệu ) 7-Hệ thống máy tính gắn phần mềm nhận,tín hiệu và sử lý dữ liệu và điều khiển hệ thống HPLC. 8- In dữ liệu ..

<span class='text_page_counter'>(23)</span> Phần II: Hệ thống HPLC II.1 - Bçnh âæûng dung mäi - Hiện tại máy HPLC thường có 04 đường dung môi vào đầu bơm cao áp .Cho phép chúng ta sử dụng 04 bình chứa dung môi cùng 1 lần để rưaó giải theo tỷ lệ mong muốn và tổng tỷ lệ dung môi của 04 đường laì 100 % . Tuy nhiên theo kinh nghiệm thì chúng ta ít khi sử dụng 04 đường dung môi cùng một lúc mà chúng ta chi sử dụng tối đa là 03và 02 đường để cho hệ pha động luôn được pha trộn đồng nhất hơn,hệ pha độüng đơn giản hơn để quá trình rửa giải ổn định . Hiện 04 đường dung môi phục vụ chủ.

<span class='text_page_counter'>(24)</span> Phần II: Hệ thống HPLC Lưu ý : - Tất cả các dung môi dùng cho HPLC đều phải là dung môi tinh khiết và có ghi rõ trên nhãn là dùng cho HPLC Hay dung môi tinh khiết phân têch . - Tất cả các hóa chất dùng để pha mẫu và pha hệ đệm phải được sử dụng là hóa chất tinh khiết phân têch . Nhằm mục đích tránh hỏng cột sắc ký hay nhiễu đường nền,tạo ra các Peak taûp trong quaï trçnh phán têch ..

<span class='text_page_counter'>(25)</span> Phần II: Hệ thống HPLC II.2 Bộ khử khí Degasse : Mục đích của bộ khử khí nhằm loại trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi pha âäüng . Nãïu nhæ trong quaï trçnh phán têch maì dung mäi pha âäüng coìn soït caïc boüt khê thç một số hiện tượng sau đây sẽ sảy ra Tỷ lệ pha động của các đường dung môi lấy không đúng sẽ làm cho thời gian lưu của Peak thay đổi . - Trong trường hợp bọt quá nhiều Bộ khử khí không thể loại trừ hết được thì có thể Pump sẽ không hút được dung môi (Bị e) khi đó áp suất không lên và máy sắc ký sẽ.

<span class='text_page_counter'>(26)</span> Phần II: Hệ thống HPLC II.3- Pump Cao aïp : - Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc ký .Pump phải tạo được áp suất cao khoảng 3000-6000 PSI hoặc 250 at đến - 500 at ( 1at =0.98 Bar) và pump phải tạo dòng liên tục .Lưu lượng bơm từ 0.1 đến 9.999 ml/phút .(hiện nay đã có nhiều loại Pump có áp suất rất cao lên đến 1200 bar) - Máy sắc ký lỏng của chúng ta hiện nay thường có áp suất tôïi đa 412 Bar. Tốc độ dòng 0.1-9.999 ml/phuït . - Tốc độ bơm là hằng định theo thông số đã được cài đặt . Hiện tại bơm có 2 Pistone để thay phiên nhau đẩy dung môi liên tục ..

<span class='text_page_counter'>(27)</span> Phần II: Hệ thống HPLC II.4 Bộ phận tiêm mẫu ( injection): ĐêØ đưa mẫu vào cột phân tích theo phương pháp không ngừng dòng chảy . Với dung tích cuía loop laì 5 - 100l . Có 02 cách lấy mẫu vào trong cột : Bằng tiêm mẫu thủ công( tiêm bằng tay ) và tiêm mẫu tæû âäüng( Autosample) . II.5 Cột sắc ký : Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao . - Cột pha tĩnh thông thường làm bằng thép không rỉ ,chiều dài cột khoảng 10 -30cm ,đường kính trong 1-10mm ,hạt chất nhồi cỡ  = 5-10 m.(ngoài ra còn có một số trường hợp đặc biệt về kích thước và kích cỡ hạt....).

<span class='text_page_counter'>(28)</span> Phần II: Hệ thống HPLC -Với chất nhồi cột cỡ  = 1.8 -5 m có thể dùng. cột ngắn ( 3-10 cm ) và nhỏ ( đường kính trong 14.6 mm)loại cột naỳ có hiệu năng tách cao. - Chất nhồi cột tùy theo lọai cột và kiểu sắc ký ( trong các dược điển USP 23 ,24 có tiêu chuẩn hóa caïc loüai cäüt ) - Thông thường chất nhồi cột là Silicagel (pha thuận) hoặc là Silicagel đã được Silan hóa hoặc được bao một lớp mỏng hữu cơ ( pha đảo ) ,ngoài ra người ta coìng duìng cạc loải hảt khạc nhỉ :Nhäm Oxit,Polyme xốp ,chất trao đổi ion. * Đối với một số phương pháp phân tích đòi hỏi phải có nhiệt độ cao hoặc thấp hơn nhiệt độ phòng thì cột được đặt trong bộ phận điều nhiệt (Oven column).

<span class='text_page_counter'>(29)</span> Phần II: Hệ thống HPLC II.6 - Detector : - Là bộ phận Phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên săc ký đồ để có thể định tính và định lượng .Tùy theo tính chất của các chất cần phân tích mà người ta sử dụng loaüi Detector thích hợp và phải thoả mãn điều kiện trong một vùng nồng độ nhất định của chất phân tích A=k.C Trong : A là tín hiệu đo được C Nồng độ chất phân tích k là hằng số thực nghiệm của Detector đã chọn Tín hiệu này có thể là : độ hấp thụ quang ; Cường độ phát xạ ,cường độ điện thế ,độ dẫn điện ;độ dẫn nhiệt ;chiết suất ...

<span class='text_page_counter'>(30)</span> Phần II: Hệ thống HPLC Trên cơ sở đó người ta chế tạo các lọai Detector sau : + Detector quang phổ tử ngoại 200 - 380 nm để phát hiện UV + Detector quang phổ tử ngoại khả kiến ( UV VIS): 190 - 900 nm để phát hiện các chất hấp thụ quang .đây là loại thông dụng nhất +Detector huỳnh quang đêí phát hiện các chất hữu cơ phát huỳnh quang tự nhiên cũng như các dẫn chất có huỳnh quang .Là loại Detector có độ chọn lọc cao nhất . +Loại hiện đại đại hơn có Detector Diod Array ,ELSD (Detector taïn xaû bay håi ) caïc Detector naìy coï khả năng quét chồng phổ để định tính các chất theo độ hấp thu cực đại của các chất ..

<span class='text_page_counter'>(31)</span> Phần II: Hệ thống HPLC -. Ngoài ra còn có một số loại Detector khác là. : + Detector điện hóa : Đo dòng ,cực phổ ,độ dẫn ,điện lượng ..) + DetectorChiết suất vi sai : Detector khúc xạ ( thông thường dùng cho đo các chất đường ) + Detector đo độ dẫn nhiệt ,hiệu ứng nhiệt .. II.6 - Bộ phận ghi tín hiệu - Để ghi tín hiệu phát hiện do Detector truyền sang . + Trong các máy thế hệ cũ thì sử dụng máy ghi đơn giản có thể vẽ sắc ký đồ,thời gian lưu,diện tích của Peak ,chiều cao ...

<span class='text_page_counter'>(32)</span> Phần II: Hệ thống HPLC + Các máy thế hệ mới đều dùng phần mềm chạy trên máy tính nó có thể lưu tất cả các thông số,phổ đồ và các thông số của Peak như tính đối xứng,hệ số phân giải .... trong quá trình phân tích đồng thời sử lý ,tính toán các thông số theo yêu cầu của người sử dụng như : Nồng âäü,RSD, ... II.7 In kết quả : + Sau khi đã phân tích xong các mẫu ta sẽ in kết quả do phần mềm tính toán ra giấy để hoàn thiện hồ sơ ..

<span class='text_page_counter'>(33)</span> Phần III :. CHỌN ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ. Muốn có một kết quả táh tốt nhất ta phải tìm được các điều kiện sắc ký tốt nhất cho một hỗn hợp mẫu ; Các điều kiện đó bao gồm : Pha ténh : - Loải pha ténh - Kích thước cột Pha âäüng : Thành phần và tỷ lệ ,pH , tốc độ dòng, nhiệt độ ... Nếu là chương trình rửa giải Isocratic Thành phần và tỷ lệ ,pH , tốc độ dòng, nhiệt độ và chương trình dung môi ... Nếu là chương trình rửa giải Gradient..

<span class='text_page_counter'>(34)</span> Phần III : Chọn Điều kiện sắc ký Hệ thống trang bị: - Loải Detector: - Van tiêm mẫu,thể tích tiêm - Hệ đường dẫn. Các yếu tố khác : nhiệt độ ,độ nhạy của detector bước sóng phân tích.

<span class='text_page_counter'>(35)</span> Phần III : Chọn Điều kiện sắc ký III.1 : Læûa choün pha ténh - Dựa vào các tài liệu ,Dược điển ,thành phần và tính chất của các chất có trong mẫu phân tích .....ta lựa chọn cột sắc ký phù hợp có thể là cột pha thuận, cột pha âaío hay cạc loải cäüt khạc nhau ... Chúng ta thông thường dùng 02 loại cột pha thuận ( NP) và cột pha đảo ( RP) Ngoài ra ta có thể dùng một số loại cäüt khaïc nhæ cäüt CN ,cäüt NH2 ,.....

<span class='text_page_counter'>(36)</span> Phần III : Chọn Điều kiện sắc ký Cột pha thuận ( NP): Silicagel trung tính Pha tĩnh :Cột này là loại cột dùng để tách các chất không phân cực hay ít phân cực .Trên bề mặt hoạt động của nó có chứa các nhóm OH phân cực ưa nước . Ví dụ cột Lichrosorb Si 40,Si 60... Cấu taûo cäüt nhæ sau : OH. OH. OH. - O - Si - O - Si - O - Si - O OH. OH. OH. Pha âäüng : duìng cho loaüi naìy laì caïc dung mäi.

<span class='text_page_counter'>(37)</span> Phần III : Chọn Điều kiện sắc ký III.1 : Læûa choün pha ténh Cäüt pha âaío ( RP) : ( Silicagel âaî Alkyl hoïa ) Dùng để tách các chất không phân cực ,ít phân cực ,các chất phân cực có thể tạo cặp Ion .Trên bề mặt hoạt động các nhóm OH đã bị Alkyl hóa tức là thay thế nguyên tử H bằng các mạch Carbon thẳng ( C8 hay C18 tæång âæång RP 8 hay RP 18) hay caïc maûch Carbon voìng( Phenyl- tæång âæång cäüt Phenyl ) vì thế nó ít phân cực hay phân cực rất ít . Vê duû nhæ cäüt Lichrosor -Lichrospher RP 8 .......

<span class='text_page_counter'>(38)</span> Phần III : Chọn Điều kiện sắc ký Pha Âäüng : Pha âäüng duìng trong loải naìy laì caïc dung mäi coï phán cæûc nhæ :Methanol ,Acetonitril,,nước hay các loại dung dịch đệm ,hỗn hợp của các dung môi-đệm . Sự tách của chất nhồi loại cột này có độ lặp lại cao và nó được ứng dụng chủ yếu trong phân tích Dược phẩm . Hiện nay chúng ta chỉ sử dụng loại này là chủ yếu . Hiện nay pha tĩnh trên nền Silicagel đã có hàng trăm chất khác nhau tùy thuộc vào nhóm thế của nguyên tử H ,ngoài ra còn có các lọai pha tĩnh trên nền Oxid Nhôm,trên nền chất hữu cơ cao phân tử,trên nền mạch các bon.......

<span class='text_page_counter'>(39)</span> Phần III : Chọn Điều kiện sắc ký III.2 : Læûa choün pha âäüng - Dựa vào các tài liệu ,Dược điển ,thành phần và tính chất của các chất có trong mẫu phân tích .....ta lựa chọn pha động phù hợp để cho quá trình rửa giải tách hoàn toàn các chất có trong mẫu đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn của peak đã trình bày đồng thời phải có thời gian phân tiïch phù hợp nhằm tiết kiệm được dung môi,hóa chất,thời gian phân tích mẫu, giảm thiểu sự hoạt động của thiết bị . - Pha động có thể làm thay đổi :.

<span class='text_page_counter'>(40)</span> Phần III : Chọn Điều kiện sắc ký - Pha động có thể làm thay đổi : + Hiệu năng tách của cột + Âäü phán giaíi + Tính đối xứng của Peak Do đó ,Trong một pha tĩnh đã chọn nếu ta chọn được pha động có thành phần phù hợp thì ta sẽ có hiệu suất tách sắc ký tốt nhất đối với hỗn hợp các chất cần phân tích . Chính vì vậy pha động cần có cầu yêu cầu sau : + Pha động phải trơ với pha tĩnh đã có .Không được làm cho pha tĩnh bị biến đổi hóa.

<span class='text_page_counter'>(41)</span> Phần III : Chọn Điều kiện sắc ký +Pha động phải hòa tan được các chất phân tích thì mới rửa giải được chúng.( đặc biệt phải chú ý khi thay đổi pha động phải rửa cột bằng dung môi phù hợp để không làm tủa các chất có trong cột ,hay pha động có sẵn trong cột vd : đệm phosphat rưả ngay bằng ACN hay MeOH sẽ bị kết tủa trên column) + Pha động phải bền vững theo thời gian : càng bền lâu càng tốt nhưng ít nhất là chuïng laì pha âäüng khäng bë phán huíy trong suốt thời gia phân tích mẫu ). + Phải có độ tinh khiết cao : dung môi cho HPLC, hoá chất tinh khiết phân tích ..

<span class='text_page_counter'>(42)</span> Phần III : Chọn Điều kiện sắc ký + Phải phù hợp với loại Detector : vd UV VIS thì dung môi không được hấp thụ quang (vd acid acetic ở bước sáng thấp < 220 nm) . Detector huỳnh quang thì dung môi không được phát quang. + Phải kinh tế ,không quá hiếm và đắt Trong hệ sắc ký hấp phụ pha đảo ( RP - HPLC) pha âäüng laì dung mäi phán cæûc laì : Nước,ACN,MeOH ,acid hay Base hữu cơ và một vaìi Amin hay Aminoacid .. + Do sự thêm nước vào dung môi hữu cơ tạo thành một pha động phân cực hơn chất hữu cơ nguyên một mình nó .Vd thêm nước vào ACN hay MeOH .. Sẽ tạo được pha động.

<span class='text_page_counter'>(43)</span> Phần III : Chọn Điều kiện sắc ký + Ngoìai caïc dung mäi chênh thç trong thành phần pha động trong rất nhiều trường hợp tách RP- HPLC còn có thêm hỗn hợp đệm pH để ổn định pH.Chất tạo phức,tạo cặp ion để tạo ra sự rửa giải tốt nhất . + Khi chọn dung môi ta thường dựa vào lực rửa rải E của dung môi theo bảng sau: BẢNG ĐỘ PHÂN CỰC CỦA MỘT SỐ DUNG MÄI 01- n Hexan Methanol 5.11. 0.1. 02-Tetra Chloro Carbon 1.6. 04 05- Actenitril.

<span class='text_page_counter'>(44)</span> Phần III : Chọn Điều kiện sắc ký - Việc lựa chọn điều kiện sắc ký là công việc hết sức cần thiết trong quá trình xây dựng chương trình sắc ký . Chỉ khi lựa chọn điều kiên sắc ký tốt,phù hợp thì chúng ta mới có thể định tính,định lượng được các lọai thuốc đa thành phần một cách nhanh chóng và hiệu quả cao . - Tất nhiên phần lý thuyết nói rất nhiều về các phương pháp chọn điều kiện sắc ký tuy nhiên để chọn được chương trình sắc ký tốt đồi hỏi phải có thời gian ,tài liệu và một phần kinh nghiệm của những người làm sắc kyï.

<span class='text_page_counter'>(45)</span> Phần IV : Tiến hành sắc ký - IV -1 Chuẩn bị dụng cụ và máy móc : + Máy HPLC phải được kiểm chứng theo định kỳ để bảo đảm máy họat động tốt cho kết quả phân tích có độ đúng,độ lặp lại,tuyến tính,tỷ lệ dung môi ,tốc đô dòng,năng lượng đèn ü ....đúng theo yêu cầu thông số của máy do nhà sản xuất đặt ra . + Đặc biệt cột sắc ký phải được kiểm tra về số đĩa lý thuyết theo định kỳ hay khi có nghi ngờ về khả năng tách ,và rửa đúng qui định sau mỗi lần chạy sắc ký : vd : Với sắc ký pha thuận NP-HPLC : rửa bằng MeOH Không rưẳ bằng Nước.

<span class='text_page_counter'>(46)</span> Phần IV : Tiến hành sắc ký -Tỷ lệ ACN hay MeOH : Nước ( 50 : 50 ) cho sạch hết các chất còn đọng lại trong cột đồng thời để bảo vệ cột không bị Mốc khi để lâu . Tuyệt đối tình trạng chỉ rửa bằng nước 100% sau đoú để cột một thời gian không sử dụng chắc chắn cột sẽ bị mốc ,hỏng không thể dùng được . Xin lưu ý nếu rưẳ cột không tốt thì kết quả chạy sắc ký sẽ không thể đáp ứng được các yêu cầu phán têch . 4.2 - Chuẩn bị dung môi pha động : Các dung môi dùng cho sắc ký là loại tinh khiết HPLC Các hóa chất dùng phải là loạûi PA.

<span class='text_page_counter'>(47)</span> Phần VI : Kỹ Thuật tiến hành sắc ký -4.3 Chuẩn bị mẫu đo HPLC : + Mẫu Thử : Sử lý mẫu thử theo đúng chuyên luận ,qui trình theo nguyên tắc : - Dung môi hòa tan hoạt chất phải hòa tan trong pha động ,trong nhiều trường hợp dùng dung môi pha động để hòa tan mẫu Phải loại bỏ các chất không tan trong pha động hoặc không rưẳ giải được bằng cách lọc hay chiết .. -Phải lọc và ly tâm ,lọc mẫu qua màng loüc 0.2 - 0.45 m - Nồng độ mẫu ở mức vừa phải,không.

<span class='text_page_counter'>(48)</span> Phần VI : Kỹ Thuật tiến hành sắc ký -Mẫu chuẩn : Pha dung dịch chuẩn có thành phần giống như mẫu thử trong cùng dung môi ,riêng về nồng độ các thành phần giôïng như mẫu thử là tốt nhất ,ngoài ra có thể dùng nồng độ khác nhưng phải nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát của từng thành phần. 4.4 Caïch âo HPLC : Mỗi máy có cách vận hành khác nhau tùy thuôcü vào hãng sản xuất ,phần mền sắc ký . Tuy nhiên cách vận hành luôn phải theo nguyãn tàïc sau :.

<span class='text_page_counter'>(49)</span> Phần VI : Kỹ Thuật tiến hành sắc ký + Đặt đầy đủ các điều kiện sắc ký như : * Cấu hình máy * Tỷ lệ các dung môi pha âäüng * Bước sóng,thành phần mẫu, các thông số của quá trình phân tích yêu cầu ..

<span class='text_page_counter'>(50)</span> Phần V. Hệ thống sắc ký Merck - Hitachi và phần mềm điều khiển D7000 – Multi HSM manager (Sẽ bổ sung sau). Người viết KS Phan Hiền Lương Mail :

<span class='text_page_counter'>(51)</span>