Nghiên cứu chế tạo điện cực biến tính trên cơ sở graphen ứng dụng trong phân tích ure và axít uric

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ
CÔNG NGHỆ
-


Bùi Thị
Phương
Thảo

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO
ĐIỆN CỰC BIẾN TÍNH
TRÊN CƠ SỞ GRAPHEN
ỨNG DỤNG TRONG PHÂN
TÍCH URE VÀ AXIT URIC

LUẬN ÁN
TIẾN SỸ HÓA
HỌC

Hà
Nội,
2021


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ
CÔNG NGHỆ
-

B
ù
i
T
h
ị


Phương
Thảo

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO
ĐIỆN CỰC BIẾN TÍNH
TRÊN CƠ SỞ GRAPHEN
ỨNG DỤNG TRONG PHÂN
TÍCH URE VÀ AXIT URIC

Chun ngành: Hóa Phân tích
Mã sỗ: 9 44 01 18

LUẬN ÁN
TIẾN SỸ HĨA
HỌC

Hà
Nội,
2021


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết
quả nêu trong luận án là trung thực và chưa được ai cơng bố trong bất kỳ cơng trình
nào khác.

Bùi Thị Phương Thảo


LỜI CẢM ƠN
Cơng trình khoa học này được hồn thành là nhờ vào sự nỗ lực của bản than
tôi cùng quá trình đào tạo và chỉ bảo của các thầy cô hướng dẫn, sự hỗ trợ tạo điều
kiện và dành thời gian của đồng nghiệp và gia đình.
Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn tới PGS. TS. Đỗ Phúc Quân, GS. TS. Trần Đại
Lâm đã trực tiếp chỉ bảo và định hướng chuyên môn khoa học đồng thời tạo mọi
điều kiện thuận lợi cho phép tơi hồn thành tốt bản luận án này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến GS.TS Phạm Hùng Việt và ban giám
đốc trung tâm nghiên cứu Công nghệ Môi trường và Phát triển bền vững
(CETASD), trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQG Hà Nội, TS Nguyễn Văn
Chúc, ThS. Nguyễn Hải Bình Viện Khoa học Vật Liệu – Viện Hàn lâm KHCN Việt
Nam đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt q trình thực hiện đề tài.
Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cơ trong Viện Hóa học - Viện
Hàn lâm KHCN Việt Nam đã dạy dỗ, giúp đỡ và bồi dưỡng cho tôi những kiến thức
quý báu trong suốt q trình học tập.
Tơi xin gửi lời cảm ơn đến Học viện Khoa học Công Nghệ - Viện Hàn lâm

Khoa học và Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời
gian học tập và làm luận án.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám hiệu trường Đại học Công
nghiêp Việt trì, ban lãnh đạo khoa Kỹ thuật Phân tích tạo mọi điều kiện tuận lợi cho
tôi trong thời gian làm luận án.
Tôi cũng xin cảm ơn các nhà khoa học đã có những ý kiến phản biện và ý
kiến về chun mơn giúp hồn thành luận án này.
Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, đồng nghiệp những
người luôn ở bên và động viên và khích lệ tơi trong suốt thời gian học tập và nghiên
cứu.
Hà Nội, ngày tháng năm 2021

Bùi Thị Phương Thảo


1
MỞ ĐẦU
Axit uric (UA) và Ure là các thành phần thường có trong dịch sinh học trong
cơ thể người bởi chúng là sản phẩm cuối của q trình chuyển hóa sinh hóa của cơ
thể. Các thơng số về hàm lượng UA và Ure là một trong số những kênh thông tin
quan trọng giúp theo dõi sự hoạt động của gan và thận. Bệnh tăng huyết áp, bệnh
tim mạch và bệnh gút có liên quan khi nồng độ UA trong huyết thanh và nước tiểu
quá cao (khoảng 420 μ M và 4,43 mM) [ 1]. Tuy nhiên khi UA trong huyết thanh và
nước tiểu thấp hơn 120 μ M và 1,48 mM là dấu hiệu của bệnh thối hóa thần kinh
[2]. Việc đánh giá tỷ lệ UA/creatinin trong nước tiểu cho phép theo dõi nhanh bệnh

gút, bệnh thận [3], và tính hữu ích trong điều trị một số bệnh như tăng UA máu, suy
thận và bệnh thận do UA cấp tính [4]. Phương pháp sắc ký để xác định đồng thời
UA và ure hiện đang được tiến hành bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao [5] điện di mao
quản vùng [6], sắc ký lỏng khối phổ [7] và sắc ký điện di mao quản điện động học

kiểu micelle [8]. Mặc dù các phương pháp này cho độ chính xác và độ nhạy cao,
nhưng chúng khá phức tạp và đòi hỏi phải có thiết bị. Do đó, sự phát triển của một
phương pháp phân tích nhanh UA và ure thay thế các phương pháp trên là cần thiết.
Trong những thập kỷ qua, kỹ thuật điện hóa là phương pháp được ứng dụng
nhiều nhất do tính đơn giản, chi phí thấp, dễ xử lý, thời gian đáp ứng nhanh, tính di
động và tiêu thụ điện năng thấp [9]. Nhưng UA, DA và AA cùng tồn tại trong dịch cơ
thể, cả ba chất chuyển hóa này đều hoạt động điện hóa và do đó chúng thích hợp cho
các phương pháp điện hóa. Ở các điện cực thông thường, cả UA, DA, AA bị oxy hóa,
các đỉnh vơn – ampe thường trùng nhau nên khó xác định chúng một cách chọn lọc
[10]. Do đó, các điện cực biến tính được chế tạo kết hợp với các vật liệu nano tạo thành
nanocompozit được phát triển trong những năm qua để loại bỏ ảnh hưởng của AA. Nhờ
các kĩ thuật biến tính, người ta có thể tạo ra những cảm biến có độ chọn lọc, độ nhạy,
độ ổn định hay bền vững cao. Gần đây, hướng chế tạo nanocompozit polyme dẫn và vật
liệu nanocacbon được đặc biệt quan tâm và thu được các kết quả rất khả quan. Graphen
là vật liệu mới nhất được phát hiện năm 2004 và nhanh chóng thu hút sự quan tâm
mạnh mẽ của các nhà vật lý, hóa học và khoa


2
học vật liệu trong và ngoài nước. Ngay sau khi được phát minh, graphen đã nhanh
chóng được nghiên cứu chế tạo nanocompozit với polyme dẫn và kỳ vọng có được đặc
tính vượt trội nhờ kết hợp các ưu điểm của cả hai vật liệu thành phần. Cho đến nay, một
số điện cực biến tính đã được phát triển để xác định UA, urê bao gồm, các điện cực
paste cacbon [11], ống nano cacbon liên kết [12], Điện cực biến tính đất sét [13], Điện
cực oxi hóa màng kim cương [14], màng sol – gel xêramic kết hợp xanh methylen trên
GCE [15], điện cực biến tính axit ferrocenecarboxylic [16], biến tính β-cyclodextrin
copolyme của axit sulfanilic và N-acetylanilin [17], xử lý điện hóa điện cực bút chì
graphit [18], điện cực GCE biến tính màng polymerized luminol [19], cảm biến điện
hóa graphen pha tạp nitơ [20], graphen/Pt kích thước nano[21], điện cực enzym dựa
trên màng poly (vinyl alcohol) / polyion phức hợp chứa pyruvat oxyaza [22], điện cực

biến tính enzym paste cacbon [23], điện cực biến tính cấu trúc nano NiO [24], điện cực
NiO/Cellulose/CNT để phát hiện ure không enzym [25].
Ở nước ta, trong thời gian gần đây, nghiên cứu chế tạo cảm biến điện hóa và

sinh học để xác định ure và UA đã được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm. Các
nghiên cứu chủ yếu nhằm tìm kiếm các vật liệu biến tính để nâng cao chất lượng về
độ nhạy, độ chọn lọc và độ ổn định của cảm biến xác định UA và ure. Khơng nằm
ngồi xu hướng phát triển của hóa học phân tích hiện đại, đề tài “Nghiên cứu chế
tạo điện cực biến tính trên cơ sở graphen ứng dụng trong phân tích ure và axít uric
” được thực hiện nhằm mục đích chính:
i) Nghiên cứu chế tạo điện cực cảm biến xác định hàm lượng ure, UA với độ

nhạy và độ chọn lọc đáp ứng yêu cầu với mẫu sinh học .
ii) Đánh giá khả năng áp dụng thực tế của cảm biến chế tạo được trên cơ sở

xác định hàm lượng ure, UA trong mẫu sinh học.
Để đạt được mục tiêu nêu trên, các nội dung nghiên cứu khoa học quan trọng
của luận án được thực hiện gồm:
-

Nghiên cứu vật liệu dùng biến tính điện cực để xác định UA bằng phương
pháp điện hóa.

-

Nghiên cứu chế tạo cảm biến sinh học xác định ure theo nguyên tắc đo
điện thế và đo vôn-ampe.


3

-

Khảo sát các điều kiện tối ưu nhất cho các điện cực đã chế tạo.

-

Sử dụng điện cực mới chế tạo, sử dụng qui trình xây dựng được xác định

hàm lượng ure, UA trong mẫu nước tiểu. Đồng thời đánh giá độ tin cậy của qui
trình phân tích qua độ đúng và độ lặp lại. Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn
định lượng của phương pháp phân tích.


4
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Axit uric và ure
1.1.1. Axit uric
1.1.1.1 Giới thiệu chung
UA là một hợp chất hữu cơ dị vịng ngưng tụ chứa các dị tố nitơ, ơxi với
cơng thức C5H4N4O3.

Hình 1.1: Cơng thức cấu tạo của UA
Tên gọi hóa học: 7,9-dihydro-1H-purin-2,6,8(3H)-trion
Tên gọi khác: 2,6,8 Trioxypurin.
UA là một axit yếu với hệ số phân li (pKa) =5,75-10,3. Trong huyết tương
với pH= 7,4 thì 98% lượng UA tồn tại dưới dạng muối kiềm : monosodium Urat
[26]
UA được tạo thành trong cơ thể do q trình dị hố các base purin (adenin và
guanidin), sau đó chúng được hịa tan trong máu, đưa đến thận và thải ra ngoài qua
nước tiểu. UA trong cơ thể được tạo ra từ hai nguồn sau [27]:

Ngoại sinh: từ thức ăn đưa vào cơ thể có chứa chất purin với hàm lượng từ
100 - 200 mg/ngày;
Nội sinh: do các tế bào chết của cơ thể sinh ra, khoảng 600 mg/ngày.
pH nước tiểu ảnh hưởng lớn đến sự hịa tan UA, bình thường lượng UA thải
qua nước tiểu là trên 800 mg/ngày. pH càng lớn càng thuận lợi cho việc thải UA và
ngươc lại càng khó khăn cho việc đào thải UA.
- pH 5,0: UA bão hòa với nồng độ từ 390-900 μmol/L


5
- pH 7,0: UA bão hòa với nồng độ từ 9480-12000 μmol/L

1.1.1.2. Vai trò của UA trong cơ thể
UA được hấp thụ từ chế độ ăn qua ruột. Phần lớn chúng sau đó sẽ được đào
thải qua thận. Ngồi ra, một lượng đáng kể UA cũng được tái hấp thu bởi cơ quan
này (Hình 1.2). UA được tìm thấy trong các tế bào, mô và cơ quan với các hàm
lượng khác nhau.

Hình 1.2: Sơ đồ chuyển hóa UA trong cơ thể người [28]
Khi nồng độ UA tăng cao quá mức bão hòa trong huyết tương, trong một số
điều kiện vật lý, sẽ xảy ra sự lắng đọng của natri urat ở các khớp trong cơ thể. Sự
lắng đọng này gây tổn thương đến nhiều cơ quan như mạch máu, tim, mắt, màng
não, cơ quan sinh dục. Trong đó điển hình là sự lắng đọng ở khớp gây nên các cơn
gút cấp do quá trình viêm khớp tái phát nhiều lần. Khơng chỉ có vậy, tăng UA cịn là
ngun nhân gây ra nhiều bệnh lý khác. Các tác giả Frederick Mahomed, Alexandre
Haig và Nathan Smith Davis là những người đầu tiên đưa ra giả thuyết tăng UA gây
tăng huyết áp và bệnh thận. Đã có một số cơng trình nghiên cứu đánh giá mối tương
quan giữa hàm lượng UA với các bệnh liên quan đến tim mạch bao gồm tăng huyết
áp, hội chứng chuyển hóa, bệnh mạch vành, bệnh mạch máu não,

6
tiền sản giật và cả bệnh thận [29-34]. Nghiên cứu chỉ ra rằng nếu UA kết tủa và lắng
đọng ở tim mạch thì gây viêm mạch máu, viêm màng ngồi tim; ở vùng đầu gây ra
viêm kết mạc, viêm mống mắt, viêm tuyến mang tai, viêm màng não. Nếu kết tủa ở
vùng sinh dục, các tinh thể uric gây viêm tinh hoàn, viêm tuyến tiền liệt. Ở chiều
ngược lại, nồng độ UA quá thấp có thể dẫn đến các bệnh đa xơ cứng, bệnh
Parkinson, bệnh Alzheimer và viêm thần kinh thị giác.
Nồng độ UA huyết thanh tăng có thể xuất phát từ một số yếu tố, bao gồm cả
nguyên nhân cấp tính và mãn tính. Các nguyên nhân cấp tính của tăng UA máu như
uống nhiều rượu, hội chứng ly giải khối u (một biến chứng của hóa trị ung thư) và
chế độ ăn uống có nhiều purin hoặc protein. Ngồi ra, tăng UA máu mạn tính có thể
xuất phát từ các điều kiện làm giảm mức lọc cầu thận, giảm bài tiết…[34].
1.1.1.3. Các phương pháp phân tích UA
Phương pháp phổ biến để xác định nồng độ UA bao gồm: phương pháp phân
tích sử dụng q trình oxy hóa enzym của UA để tạo ra hydro peroxit, allantoin và
cacbon dioxit [35], các phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao trên các cột pha đảo
cùng; phương pháp phát hiện bằng phương pháp UV kết hợp khối phổ (MS) [36].
Các phương pháp này bao gồm nhiều bước như chuẩn bị huyết thanh và các yêu cầu
của phương pháp quang phổ để xác định sản phẩm hoặc kỹ thuật ghép enzym xác
định gián tiếp nồng độ của chất trung gian H2O2 [37]. Các phương pháp trên địi hỏi
các quy trình vận hành phức tạp, các công cụ đắt tiền và thử nghiệm viên phải được
đào tạo chuyên sâu. Dưới đây là tổng quan những ưu điểm và hạn chế của từng
phương pháp.
* Phương pháp xác định UA sử dụng enzym Uox

Tác giả San V [38] dựa trên phản ứng ghép oxy hóa giữa thuốc thử NCP và
thuốc thử TOOS, trong hệ thống liên quan đến ba enzym: Uox, peroxidaza và
ascorbat oxyaza.

UA

uricase→

allantoin + H2O2

Nồng độ của phức được hình thành bởi sự liên kết oxy hóa của thuốc thử
NCP và TOOS tỷ lệ thuận với nồng độ UA.


7

Sử dụng phương pháp này UA có thể được xác định ở nồng độ tối đa lên tới
1,428 mmol/L. Nghiên cứu cho thấy sử dụng thuốc thử NCP có độ nhạy hơn khi xác
định UA so với 4-AA. Độ nhạy của phương pháp này khi xác định UA là 0,71 đơn
vị độ hấp thụ trên mỗi mmol/L của UA; giới hạn phát hiện là LOD = 0,0035
mmol/L và giới hạn định lượng là LOQ = 0,015 mmol/L UA.
Một số phương pháp cố định enzym UOx dựa trên cảm biến sinh học và
phương pháp quang phổ để xác định UA đã được cơng bố [37-40]. Ngồi ra, đã có
nghiên cứu sử dụng phương pháp quang phổ đơn giản để phát hiện UA trong nước
tiểu bình thường và mẫu nước tiểu của bệnh nhân gút dựa trên phản ứng của hydro
peroxide (H2O2) với màu vàng của muối 4-Aminodiphenylamin Diazonium Sulfat
(variamin blue)(RT) để thu được dung dịch màu vàng lục nhạt. Độ hấp thụ của các
sản phẩm là đầu ra của phản ứng enzym và muối RT màu xanh lam được phát hiện
bằng máy quang phổ UV với độ hấp thụ tối đa ở 269 nm. Thời gian đáp ứng của
phương pháp là 20 phút. Hoạt tính pH tối ưu trên các phản ứng muối RT của enzym
và variamin màu xanh da trời là pH 9. Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của phương
pháp này rất tốt ở mức 0,7%. Biểu đồ hiệu chuẩn nồng độ UA khác nhau được tìm
thấy trong khoảng 0,5-13 mM với giới hạn phát hiện là 0,58 mM [41].
Galban và cộng sự đã đưa ra một phương pháp xác định UA trong huyết

thanh bằng phản ứng với UOx. Quy trình này dựa trên những thay đổi trong huỳnh


8
quang diễn ra trong phản ứng enzym của UOx với UA khi dung dịch được kích
thích ở bước sóng 287 nm và phát xạ được đo ở bước sóng 330 nm. Kết quả cho
thấy dải nồng độ làm việc là 3.10

−5

– 6.10

−4

M và độ tái lập 4% ứng với n = 7 [42].

* Xác định axit uric bằng phương pháp HPLC

Kovarik và đồng nghiệp đã sử dụng các phép đo HPLC trên 300 mẫu huyết
thanh được so sánh với phương pháp enzym. Các mẫu huyết thanh được khử protein
bằng axit perchloric và được phân tích bằng HPLC với cột pha đảo MAG 1; 4.6 x
150 mm, Biospher PSI 200 C18, 5µm, pha động bao gồm 5% metanol trong 25
mmol/L natri dihydrogenphosphat pH 4,75. Kết quả cho thấy sai khác giữa các xét
nghiệm và phân tích dưới 5%. Độ thu hồi từ 90,0-103,4%, giới hạn định lượng đạt
được 10,0 μmol/L (3,3 pmol/lần tiêm). Kết quả thu được bằng phương pháp sắc ký
có sự phù hợp tương đối tốt so với phương pháp enzym, nhưng cho giá trị trung
bình cao hơn [43].
Hai Fang Li và đồng nghiệp sử dụng phương pháp HPLC pha đảo (RP-HPLC)
detector cực tím (UV) để xác định đồng thời các chất: Creatinin, UA, hypoxanthin và
xanthin trong nước tiểu. Các mẫu được xử lý bằng cách pha loãng, ly tâm và lọc, thành

phần trong các mẫu nước tiểu được phân tách bằng cột ODS-BP, sau đó rửa giải bằng
dung dịch đệm metanol/50 mM NaH 2PO4 ở pH 5,26 (5:95). Độ tuyến tính của các diện
tích peak cực đại và nồng độ các dung dịch tiêu chuẩn thu được cho Creatinin, UA,
hypoxanthin và xanthin trong nước tiểu với các hệ số tương quan trong khoảng 0,9957

– 0,9993. Phương pháp phân tích có độ lặp lại tốt (giá trị đối với UA, hypoxanthin
và xanthin lần lượt là 93,49; 97,90% và 95,38%). Giới hạn phát hiện (LOD, S /
N≥3) đối với creatinin, UA, hypoxanthin và xanthin lần lượt là 0,010; 0,025; 0,050
và 0,025 mg / L [44].
* Xác định axit uric bằng phương pháp điện hóa

Các kỹ thuật điện hóa đã được sử dụng để xác định nhiều chất, phổ biến nhất
là các máy đo đường huyết được sử dụng bởi bệnh nhân tiểu đường. Ưu điểm của
phương pháp phân tích điện hoá là thời gian tương đối nhanh khi so sánh với các
phương pháp quang phổ [45]. Cảm biến điện hóa đã thu hút nhiều sự quan tâm của
các nhà nghiên cứu do lợi thế của thời gian phân tích ngắn,


9
quy trình thí nghiệm đơn giản, có thể áp dụng cho nhiều mẫu sinh học và yêu cầu
dụng cụ rẻ hơn cùng với độ chọn lọc và độ nhạy cao [46]. Vì UA có thể dễ dàng bị
oxy hóa ở các điện cực thông thường trong các dung dịch nước tạo ra allantoin là
sản phẩm chính, nên phương pháp điện hóa được ưu tiên lựa chọn [47-52]. Tuy
nhiên, UA và AA thường có mặt đồng thời trong các chất lỏng sinh học như máu và
nước tiểu. Pic oxy hóa của UA và AA quá gần nhau, khó tách ra ở các điện cực
thông thường, dẫn đến độ chọn lọc kém [53]. Để xác định chính xác UA khi có mặt
AA, cần phải phát triển một phương pháp chọn lọc để xác định UA một cách thuận
tiện trong xét nghiệm, hạn chế ảnh hưởng sai sót do AA gây ra. Do đó xác định chọn
lọc UA và AA đã nhận được sự quan tâm rất lớn của các nhà nghiên cứu điện hóa
[54 - 57]. Nồng độ cơ bản của UA và AA trong các mẫu sinh học thay đổi tùy theo

-7

-3

tình trạng sức khoẻ, trên phạm vi rộng từ 10 đến 10 mol/L. Để khắc phục sự ảnh
hưởng của AA, xu hướng sử dụng các điện cực biến đổi polyme (PMEs) [58,59] và
các điện cực biến đổi hóa học (CME) [60] để phát hiện chọn lọc UA đang nhận
được sự quan tâm lớn của các nhà khoa học. Việc áp dụng các điện cực biến tính
trong điện phân có nhiều ưu điểm như giảm mức oxi hóa khử quá mức, tăng tốc độ
truyền điện tử, tăng cường độ nhạy phát hiện và cải thiện độ chọn lọc. Các thay đổi
khác nhau của các điện cực, đặc biệt là thay đổi polyme dẫn của các điện cực có thể
khắc phục các trở ngại như sự bão hịa của các vị trí liên kết hoạt động, giới hạn
phạm vi tuyến tính. Phản ứng điện hóa của các cảm biến biến đổi polyme đối với
hầu hết các chất gây nhiễu điện động phổ biến bị ức chế rất nhiều do sự dư thừa
chất tan ở bề mặt điện cực. Để đảm bảo tính tuyến tính của cảm biến, độ nhạy tốt
hơn và giới hạn phát hiện thấp hơn, cấu trúc của polyme sử dụng cần không bị ảnh
hưởng bởi thành phần của dung dịch chất phân tích và độ dày của màng polyme
phải được kiểm sốt và tối ưu hóa chính xác.


10

Hình 1.3: Tín hiệu điện hóa của AA, DA, UA trên điện cực GCEbiến tính bằng
TmPO4 và GO [61]
Tác giả [62] nghiên cứu điện cực hạt nano bis-hydroquinon/TiO 2 biến tính
(BQTMCPE) 2,2 - [1,2 buthanediylbis mơi trường nước sử dụng các kỹ thuật đo
điện áp và đo thời gian. Trong điều kiện tối ưu (pH 8), q trình oxy hóa DA ở bề
mặt của điện cực xảy ra ở khoảng 220 mV thấp hơn so với điện cực cacbon không
biến tính (CPE). Sử dụng DPV có độ chọn lọc và đồng thời DA, UA và axit folic
(FA). Cường độ dòng DPV của DA, UA và FA tăng tuyến tính với nồng độ trong

các phạm vi tương ứng là 1,0-900,0 µM; 200,0-1500,0 µM và 200,0-2700,0 µM các
giới hạn phát hiện cho DA, UA và FA lần lượt là 0,3 μM, 12,0 µM và 32,0 µM.
Tác giả [63] biến tính điện cực GCE bằng nano Au để xác định nồng độ của
UA. Hình thái của nano Au lắng đọng trên bề mặt GCE được đặc trưng bởi SEM
cho thấy các hạt nano có dạng hình cầu phân tán tốt với đường kính trung bình đạt
tới 26,1nm. Một loạt các phép đo CV và DPV cho thấy nano Au làm tăng cường
đáng kể cả cường độ và độ ổn định của dòng đáp ứng do cộng hưởng plasmon bề
mặt (SPR). Phép đo DPV cho thấy sự tuyến tính giữa dịng điện cực đại và nồng độ
UA trong khoảng 2,8 M đến 57,5 M với phương trình I pa (A) = 0,0121c UA (M) +
2

0,323 (R = 0,9987).


11
Bảng 1.1: Tổng hợp kết quả các cơng trình nghiên cứu trên thế giới
STT

Phương pháp biến tính

1

Poly(N-acetylamin)/bcyclodextrin

2

Poly(3-acetyl thiophen)

3

Poly(4-aminopyridin)

4

Poly(N,N-dimethyl
anilin)

5

PEDOT

6

Poly(pyrol)

7

Polyanilin nano-network

8

Caffeic axit polyme

9

Nafion/ruthenium
pyrochlore

10

Poly(glycin)

11

Poly(4-(2-pyridylazo)resorcinol)

12

Poly(fluorescein)

13

MIP polyme

14

Thionin-SWNTs
nanostructure

15

Dodecyl sulfat
poly-N-methyl-pyrrole

16

Bovin
albumin/Glutaraldehyde

12

17 Polypyrrole
/glutaraldehyde/gelatin
18 Eggshell membrane
19 Sol-gel matrix
20 Polystyrene/
polymaleimidostyrene
21 Epoxy resin
22 Polydiallyldimethylamm
onium
(PDDA)/ZnO/MWNTs
23 Polyanilinpolypyrrole/Glutaraldehy
de
24 Β-CD / SPNAani
25 MWCNT-PEDOT
26 Au / rGO
27 Cystein
28 AuNPs-GO
29 TCPP-rGO
30 rGo-ZnO


13
1.1.2. Ure
1.1.2.1. Giới thiệu chung
Ure là một hợp chất hữu cơ có thành phần gồm cacbon, nitro, oxy, và hiđro,
với công thức CON2H4 hay (NH2)2CO. Dạng tinh thể hoặc bột màu trắng; phân tử
3

o

lượng: 60,1; khối lượng riêng: 1,34 g/cm ; nhiệt độ nóng chảy: 132-134 C; Ure tan
tốt trong nước, tan rất ít trong cồn < 0,04%; pH (dung dịch 10%): 7,2. Trong dung
dịch nước, ure bị thủy phân dần dần hình thành amoni cacbonat hoặc dung dịch
amoni cacbonat và cacbon dioxit.
Ở trong cơ thể người, ure là sản phẩm chuyển hóa cuối cùng của axit amin.

Khoảng 90% nito trong axit amin thải ra ở gan dưới dạng ure dưới sự điều chỉnh của
N-axetylglutamat, sau đó theo máu đến thận và đào thải ra ngoài qua nước tiểu.
Nồng độ ure trong huyết thanh khoảng 0,15 - 0,45 g/l. Hằng ngày, mỗi người bài tiết
khoảng 15 - 35 gam ure theo nước tiểu. Hàm lượng ure trong máu là 16-54 mg/mL
đối với nam và 12-47 mg/mL đối với nữ [93]
Do ure được sản xuất và bài tiết khỏi cơ thể với một tốc độ gần như không
đổi, nồng độ ure cao trong máu chỉ ra vấn đề bài tiết của cơ thể.

Hình 1.4: Xét nghiệm urê máu để đánh giá khả năng lọc của thận
Nguyên nhân phổ biến của bệnh uremia là các vấn đề về hệ tiết niệu. Cùng
với creatin, chỉ số Ure được sử dụng để chỉ ra các vấn đề trực tiếp liên quan tới thận
hay các vấn đề thứ cấp như chứng giảm hoạt động tuyến giáp.


14
Nồng độ ure cũng có thể tăng trong một số rối loại máu ác tính (ví dụ bệnh
bạch cầu và bệnh Kahler), nồng độ ure cao có thể sinh ra các rối loạn thần kinh
(bệnh não). Thời gian dài bị uremia có thể làm đổi màu da sang màu xám.
1.1.2.2. Các phương pháp phân tích Ure
* Phương pháp so màu

Tác giả [94], [95] định lượng ure trong nước biển bằng phản ứng với chất tạo

phức Diacetyl – monoxim và đo trên máy quang phổ UV - VIS (DAM). Mẫu được
chiết bằng nước cất, ure sẽ phản ứng với hợp chất Diacetyl – monoxim (còn gọi là
2,3- Butadion - Monoxim) trên cơ sở phản ứng oxi hóa khử. Trong mơi trường axit
3+

và đun nóng với sự có mặt của Fe . Ure phản ứng với hợp chất Diacetyl –
monoxim(DAM) tạo ra phức chất mầu hồng, mầu của phức chất càng đậm (đỏ tím)
nồng độ ure càng cao. Hợp chất Thiosemicarbazid (TSC) có tác dụng đệm và giữ
cho phức chất được bền và nhờ liên kết C=S. Urê trong dung dịch mẫu phản ứng
với chất tạo phức được đo ở bước sóng 540nm. Giới hạn phát hiện rất thấp (0,14 μg
và 1,2nmol), độ tái lập cao (độ lệch chuẩn tương đối là 0,29 - 1,09%),
* Phương pháp enzym

Phương pháp áp dụng cho các loại mẫu có hàm lượng ure lớn hơn hoặc bằng
0,070g/l, dùng để xác định ure trong nước tiểu, thức ăn gia súc, rượu.
Hàm lượng ure có trong mẫu được thủy phân bằng enzym ureaza tạo thành
amoniac và cacbon dioxyd, lượng amoniac thu được sau khi chưng cất mẫu được chuẩn
độ bằng dung dịch axit sulfuric. Từ chênh lệch về hàm lượng NH 3 có trong mẫu trước
và sau khi thuỷ phân bằng enzym ureaza tính được hàm lượng ure có trong mẫu.

Phương pháp nhanh và đơn giản nhưng cịn nhiều hạn chế do quá trình sử
dụng và bảo quản enzym cịn khó khăn, phương pháp khơng nhạy nên giới hạn phát
hiện cao, sai số lớn.
Chu và cộng sự [96] phát triển một bộ cảm biến sinh học điện hóa dựa trên
uricaza cố định polypyrrol để phát hiện UA. Tác giả [97] sử dụng phương pháp
enzym trực tiếp cho máy phân tích ly tâm (E, 4I.4MsAEc) để đo ure trong huyết
tương.
* Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

15
Phương pháp HPLC để xác định ure kết hợp với xanthydrol (9H-xanthen-9ol). Khác với phản ứng xanthydrol cổ điển để xác định ure, liên quan đến sự kết tủa
của dixanthylurea (N, N'-di-9H-xanthen-9-ylurea), quy trình khử màu được sử dụng
trong phương pháp này tạo ra N-9H-xanthen-9- ylurea, dư trong dung dịch và có thể
được định lượng bằng phát hiện huỳnh quang (lambda (ex) = 213 nm; lambda (em)
= 308 nm) sau khi tách sắc ký khỏi nhiễu. Giới hạn phát hiện của ure là 5.10

-8

M

-1

(0,003 mg L ). [98].
Zuo [99] phát triển phương pháp HPLC sử dụng pha đảo thân thiện với môi
trường để xác định đồng thời creatinin và UA trong các mẫu nước tiểu của người,
được xử lý trước bằng cách pha loãng, kết tủa protein, ly tâm và lọc, sau đó tách
HPLC bằng cột C18 pha đảo đệm phosphat. Phương pháp đơn giản, nhanh chóng
cho các mẫu trong 10 phút với detector UV ở bước sóng 205nm. Giới hạn phát hiện
cho creatinin và UA là 0,045 và 0,062 mg mL

-1

. Phương pháp này được áp dụng để

xác định creatinin và UA trong nước tiểu người.
Tsutomu [100] xác định urê trong kem urê bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao sử
dụng gel trao đổi cation có tính axit mạnh. Quá trình rửa giải được thực hiện với
đệm phosphat 0,05 M (pH 3,4) ở 40 độ C, kết quả được xác định bằng máy đo phổ
UV ở bước sóng 200 nm.

* Phương pháp điện hóa

Tác giả [101] xác định ure bằng điện cực biến tính nanocompozit PPY (oxit
polypyrrol-graphen biến tính), phạm vi nồng độ ure trong khoảng 0,5 µM đến 3,0
µM, giới hạn phát hiện 0,27 µM. Tác giả [102] chế tạo cảm biến điện hóa xác định
ure bằng cách biến tính điện cực GCE bằng Ag-N-SWCNTs và một lớp Nafion (Nf)
có giới hạn phát hiện thấp hơn (4,7 nM), giới hạn phát hiện ure trong khoảng từ 66
2

nM đến 20,6 mM (R = 0,966). Tác giả [103] sử dụng màng tế bào oxit 170
perchlorat (O17) - ethyl cellulose (EC) trong việc chế tạo màng cảm ứng ure. Màng
cảm ứng ure là một lớp kép bao gồm màng O17-EC và một lớp enzym ureaza được
gắn vào EC. Màng cảm biến ure bằng phương pháp đo tỷ lệ được sử dụng để đo
nồng độ ure trong khoảng 0,01M đến 0,1 M với giới hạn phát hiện 0,027 mM và 0,1
- 1.0 M với LOD là 0,224 mM. Điện cực cho thấy thời gian đáp


16
ứng nhanh, độ ổn định lâu dài trong phạm vi nồng độ này. Tỷ lệ thu hồi nồng độ urê
của màng cảm ứng ure đối với hai loại dung dịch nước tiểu sinh học (BU1, BU2)
khoảng 85 - 118%.
1.2. Cảm biến sinh học
1.2.1. Cấu tạo cảm biến sinh học
Cảm biến sinh học là thiết bị sử dụng các thành phần sinh học đặc trưng kết
hợp với bộ chuyển đổi tín hiệu để phát hiện, đo đạc hoặc phân tích các yếu tố hóa
sinh. Cảm biến sinh học bao gồm bốn bộ phận chính: i) Đầu thu sinh học: có tác
dụng bắt cặp và phát hiện sự có mặt của các tác nhân sinh học cần phân tích; ii) Tác
nhân cố định: giúp gắn kết các đầu thu lên trên điện cực; iii) Bộ phận chuyển đổi tín
hiệu giúp chuyển các biến đổi sinh học thành các tín hiệu có thể đo đạc được; iv) Bộ
phận xử lý và hiển thị tín hiệu ra (bộ phận này có tác dụng chuyển thành các tín hiệu

điện để máy tính và các thiết bị khác có thể xử lý) [104]. Cảm biến sinh học được
xem như một thiết bị đầy tiềm năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như: sinh học,
dược phẩm, nông nghiệp, vệ sinh an tồn thực phẩm, bảo vệ mơi trường và an tồn
trong cơng nghiệp.v.v.

Hình 1.5: Cấu tạo và các thành phần của cảm biến sinh học [105]
- Tác nhân cần phát hiện [106]

Tác nhân cần phát hiện được phân loại theo cấu tạo như sau:


17
a) Các vi khuẩn: các vi khuẩn thường được phát hiện bởi các cảm biến sinh

học là vi khuẩn Ecoli, vi khuẩn Candida, vi khuẩn bệnh than …
b) Các phân tử nhỏ: các phân tử nhỏ mà cảm biến sinh học có thể phát

hiện được là CO, CO2, phân tử gluco, phân tử rượu, ure, thuốc trừ sâu, amino axit,
paracetamol, aspirin, penicilin, TNT, các tác nhân thần kinh khác, …
c) Các phân tử sinh học có kích thước lớn: những phân tử này có thể là các

phân tử ADN, RNA, protein, enzym, các hocmon, …
- Đầu thu sinh học [106]
Nhiều cảm biến sinh học sử dụng các kết hợp đã được phát triển rất cụ thể
cho các ứng dụng. Đầu thu sinh học (Biological Receptor) là những đầu thu phản
ứng trực tiếp với các tác nhân cần phát hiện và có nguồn gốc từ các thành phần sinh
học. Dựa vào các tác nhân sinh học sử dụng người ta chia ra thành một số loại đầu
thu như sau:
- Đầu thu làm từ enzym: Đầu thu sinh học làm từ enzym là dạng đầu thu phổ

biến nhất. Đó là các đầu thu làm từ các enzym ureaza, đường glucô, ...
- Đầu thu làm từ các kháng thể/kháng nguyên: Các đầu thu dạng này có đặc

điểm là tính chọn lọc rất cao đồng thời các liên kết được tạo thành khá mạnh.
- Đầu thu làm từ protein: Rất nhiều cảm biến có đầu thu sinh học làm từ các

protein như cảm biến phát hiện hocmơn, xác định các chất kích thích thần kinh, ...
Các đầu thu này có đặc điểm là có tính chọn lọc rất cao. Tuy nhiên, chúng có nhược
điểm là rất khó cách ly.
- Đầu thu làm từ các axit nucleic: Các axit nucleic như ADN, ARN có thể sử

dụng làm đầu thu sinh học. Các cảm biến có đầu thu dạng này thường được sử dụng
để phát hiện đột biến và các sai lệch trong cấu trúc di truyền.

Hình 1.6: Một số phần tử sinh học được sử dụng làm đầu thu sinh học


18
- Đầu thu kết hợp: Với các đầu thu dạng này, người ta sử dụng đồng thời hai

hay nhiều các phân tử dạng (enzym, kháng thể, protein, ...) trên một đế. Việc kết
hợp này mở rộng khả năng làm việc của các cảm biến sinh học. Một số cảm biến
dạng này là cảm biến xác định thuốc nổ TNT, cảm biến xác định vi khuẩn bệnh than
và cảm biến thử thai.
- Đầu thu làm từ tế bào: Các đầu thu sinh học không chỉ được làm từ các

phân tử, nguyên tử mà nó cịn có thể được làm từ các tế bào. Một số tế bào biến đổi
gen của vi khuẩn đã được sử dụng làm đầu thu sinh học. Khi có mặt các phân tử
chất độc, các tế bào này sẽ phát sáng, thơng qua đó chúng ta xác định được sự xuất
hiện của các phân tử chất độc

- Tác nhân cố định

Các tác nhân cố định là một phần rất quan trọng trong cảm biến sinh học.
Các tác nhân này có nhiệm vụ gắn kết các đầu thu sinh học lên trên đế. Nói một
cách khác đây là bộ phận trung gian có tác dụng liên kết các thành phần sinh học
(có nguồn gốc từ cơ thể sống) với thành phần vô cơ. Như vậy việc lựa chọn những
tác nhân cố định thích hợp cũng là một cơng việc quan trọng. Những tác nhân này
vừa phải đảm bảo gắn kết, cố định về mặt cơ học, vừa phải đảm bảo liên kết về mặt
tín hiệu giữa bộ phận sinh học và bộ phận chuyển đổi. Cách bắt giữ thành phần sinh
học theo phương pháp vật lý và gắn kết hóa học được trình bày trong hình 1.7.

Hình 1.7: Các dạng bắt giữ đầu thu sinh học bằng phương
pháp vật lý và gắn kết hoá học.


19
Bộ phận chuyển đổi
Đây là bộ phận quan trọng trong cảm biến sinh học. Có nhiều dạng chuyển
đổi như chuyển đổi điện hoá, chuyển đổi quang, chuyển đổi nhiệt, chuyển đổi bằng
tinh thể áp điện hoặc chuyển đổi bằng các hệ vi cơ.
-

Chuyển đổi điện hoá bao gồm chuyển đổi dựa trên điện thế

(potentiometric), dòng điện (amperometric) và độ dẫn (conductometric).
- Chuyển đổi quang là chuyển đổi hoạt động dựa trên các hiệu ứng như: hấp

thụ ánh sáng nhìn thấy và tia UV; phát xạ huỳnh quang và lân quang; luminisxen
sinh họ và hóa học

Hình 1.8: Cảm biến sinh học trên cơ sở bộ chuyển đổi quang
(http://www/bsse.ethz.ch)
- Chuyển đổi nhiệt hoạt động dựa trên hiện tượng thay đổi entanpi khi hình

thành hoặc phá vỡ các liên kết hóa học trong các phản ứng của enzym. Bộ chuyển
đổi này có ưu điểm hoạt động tốt với tất cả các phản ứng. Tuy nhiên, dạng chuyển
đổi này có tính chọn lọc thấp.
- Chuyển đổi bằng tinh thể áp điện (piezoelectric) hoạt động dựa trên

nguyên lý: tinh thể sẽ thay đổi tần số dao động khi lực tác dụng lên nó thay đổi, sự
thay đổi này tuân theo phương trình Sauerbrey:
6 2

∆ f = - 2,3.10 .f . ∆ m/A

(1-1)