Phương pháp PCR

Phương pháp PCR
I. Phương pháp PCR
1. Khái niệm
PCR (Polymerase Chain Reaction) (Phản ứng Trùng Phân, Phản ứng chuỗi
Polymerase, hay phản ứng PCR). Bản chất của PCR là sự tổng hợp nhân tạo nhằm
tạo ra các đoạn ADN mới.
2. Các thành phần chính của PCR
Các thành phần chính của PCR gồm: ADN khuôn, dNTP, Mồi (primer),
enzym polymerase (Taq), MgCl
2
và đệm PCR
Phản ứng được thực hiện trong máy chu kỳ nhiệt, hay còn gọi là máy PCR.
2.1. ADN khuôn
ADN khuôn (DNA template) hay còn gọi là ADN mục tiêu được sử dụng
làm cái khuôn để các mồi PCR gắn vào vị trí bổ sung với nó, sau đó với sự tham
gia của các thành phần cần thiết, phản ứng tổng hợp sẽ diễn ra tạo lên một đoạn
ADN mới giống hệt đoạn ADN nằm giữa hai vị trí gắn mồi. Từ chu kỳ thứ hai trở
đi, ngoài ADN khuôn ban đầu, những đoạn ADN vừa được tổng hợp cũng được sử
dụng làm khuôn cho những chu kỳ tổng hợp tiếp theo.
Lượng ADN khuôn rất nhỏ khoảng từ 20ng đến 100ng. Do lượng ADN cần
thiết nhỏ như vậy, nên khi chuẩn bị ADN khuôn phải hết sức chú ý tránh bị lẫn
ADN từ các nguồn khác và cần phải có ADN khuôn với độ nguyên vẹn cao.
2.2. Mồi PCR
Mồi là một đoạn oligonucleotít ngắn, có chiều dài khoảng từ 6 đến 70
nucleotít.
Những mồi ngẫu nhiên (mồi RAPD) có chiều dài khoảng 10 nucleotít và đa
số các mồi PCR có chiều dài khoảng 20 dến 30 nucleotít.
- Thiết kế mồi
Khi thiết kế mồi, người ta thường quan tâm sao cho không có sự bổ sung
giữa các bazơ trong cùng một mồi và giữa các mồi. Vì phản ứng tổng hợp được bắt
đầu từ đuôi 3’ của mồi; do vậy để nâng cao hiệu quả gắn mồi và tính đặc hiệu của

phản ứng, người ta thường quan tâm đến việc thiết kế sao cho đuôi 3’ của chúng là
các bazơ G hoặc C để tạo ra sự bắt cặp chắc hơn và đặc hiệu hơn so với cặp A và
T.
- Nhiệt độ gắn mồi
1
Trong PCR phải tìm được nhiệt độ thích hợp nhất cho mồi gắn vào ADN
khuôn. Để xác định nhiệt độ gắn mồi tương đối ban đầu, người ta đã dựa trên
những công thức toán khác nhau.
*Đối với những mồi có chiều dài ≤ 20 bazơ thì nhiệt độ gắn mồi được tính
theo công thức sau:
Tm (
o
C) = {2 x (A + T) + 4 x (G + C)}
VD: một mồi có trình tự nucleotide như sau: CAG CAA ATA TCT GTC
CTT AC, nhiệt độ gắn mồi tương đối sẽ là: Tm = 2 x 12 + 4 x 8 = 56
o
C.
*Đối với những mồi có chiều dài từ 20 đến 35 bazơ thì nhiệt độ gắn mồi
được tính theo công thức:
Tm (
o
C) = 22 + 1,46 x {[2 x (C +G) + ( A + T)]}
*Đối với những mồi có chiều dài từ 35 đến 70 bazơ thì nhiệt độ gắn mồi
được tính theo công thức:
Tm (
o
C) = 81,5 + 16.6 log
10
C
+

+ 0,41 (% của G + C) – 600/L.
C
+
là nồng độ của cation hoá trị một (Na
+
), tính theo nồng độ của phân tử; L
là chiều dài mồi.
Trong thực tế nhiệt độ gắn mồi có thể dao động từ 3
0
C đến 15
0
C so với nhiệt
độ tính toán được từ các công thức. Các công thức nêu trên chỉ để tham khảo; nhiệt
độ gắn mồi tối ưu được rút ra qua thí nghiệm cụ thể.
+ Nồng độ mồi
Nồng độ mồi có thể được sử dụng vào khoảng 100 đến 500 nM. Tuy nhiên
nồng độ cụ thể phụ thuộc vào từng thí nghiệm và mục đích nghiên cứu. Nếu nồng
độ mồi quá thấp sẽ không đủ cho phản ứng và nồng quá cao có thể dẫn tới sai lệch
kết quả.
+ Thời gian gắn mồi
Thời gian gắn mồi vào khuôn thường dao động trong khoảng 30 đến 60 giây.
Nếu thời gian gắn mồi lâu sẽ gây ra sai lệch kết quả phản ứng do sự gắn mồi không
đặc hiệu, hơn nữa sẽ kéo dài thời gian phản ứng làm suy giảm sự hoạt động của
enzym Taq.
2.3. dNTP
dNTP (A, T, G, C là những “viên gạch” để xây dựng lên sợi ADN mới trong
phản ứng chuỗi. Nồng độ của dNTP thường sử dụng cho mỗi phản ứng là 200µM.
Nếu nồng độ dNTP quá cao nó sẽ liên kết với Mg
2+
, một ion rất cần cho sự hoạt

động của enzym tổng hợp, vì vậy mà sẽ ảnh hửng tới phản ứng tổng hợp. dNTP
rất nhậy cảm với sự thay đổi nhiệt độ, cứ sau 35 chu kỳ của PCR thì dNTP hầu như
2
đã bị suy giảm; trong một môi trường axít nó sẽ chuyển hoá nhanh thành dNDP và
dNMP. Do vậy mà dNTP là chất không bền, đặc biệt sử dụng cho PCR.
2.4. Enzym tổng hợp ADN.
Là một thành phần quan trọng của phản ứng PCR. Trong điều kiện thích hợp
cùng với các thành phần cần thiết khác, enzym hoạt động tổng hợp nên ADN mới.
Nồng độ sử dụng enzym phụ thuộc vào mỗi loại enzym và thuộc tính của nó; có
thể sử dụng từ 1 đến 2 đơn vị enzym sẽ cho hiệu quả tốt nhất với PCR có thể tích
25µl. Nếu quá nhiều enzym có thể sẽ làm tăng nồng độ glycerol trong dung dịch
phản ứng, dẫn tới quá trình tổng hợp không đồng đều giữa các vị trí và tạo ra hình
ảnh điện di không rõ nét. Ngược lại, nếu quá ít sẽ thiếu enzym và kết quả nhận
được là sản phẩn tổng hợp không đầy đủ.
2.5. Dung dịch đệm PCR
Dung dịch đệm chung nhất của PCR bao gồm các thành phần KCl, MgCl
2
và
Tris. Muối KCl góp phần làm tăng hiệu quả của phản ứng, thông thường những
mồi cho sản phẩm PCR với kích thước lớn hơn thì hoạt động tốt hơn trong môi
trường có nồng độ muối thấp hơn và ngựơc lại những đôi mồi cho sản phẩm PCR
ngắn hơn sẽ hoạt động tốt hơn trong môi trường có nồng độ muối cao hơn. MgCl
2
là nhân tố cần thiết để enzym Taq hoạt động, nếu nồng độ MgCl
2
thấp, sẽ ức chế sự
hoạt động của enzym Taq, tuy nhiên nếu nồng độ quá cao sẽ cho kết quả PCR
không đặc hiệu. Tris có vai trò giữ cho pH dung dịch ổn định, sự thay đổi nồng độ
của Tris không ảnh hưởng nhiều đến kết quả phản ứng PCR.
2.6. Thể tích phản ứng:

Thể tích không ảnh hưởng tới kết qủa của phản ứng, nếu chúng ta sử dụng
ống PCR nhỏ có thành mỏng và sử dụng loại máy PCR không cần dầu để chống
bay hơi dung dịch. Thể tích phản ứng có thể được điều chỉnh từ 5µl đến 100µl, tuy
nhiên nếu với cùng lượng ADN khuôn, thể tích PCR nhỏ sẽ cho nồng độ sản phẩm
lớn hơn so với thể tích PCR lớn.
2.7. Chu kỳ phản ứng:
Các thí nghiệm cho thấy số chu kỳ cần áp dụng cho một phản ứng từ 25 đến
45 là vừa đủ. Nếu tiếp tục tăng số chu kỳ, thậm trí lên tới 60 chu kỳ thì sản phẩm
PCR có tăng lên nhưng không đáng kể.
3
3. Nguyên lý phản ứng và chu kỳ nhiệt của PCR (xem file powerpoint)
Khi chúng ta chuẩn bị một dung dịch phản ứng gồm các thành phần cơ bản
như: ADN khuôn, dNTP, Mồi (primer), enzym polymerase (Taq), MgCl
2
và đệm
PCR.v.v. Dung dịch phản ứng trong ông PCR được đặt trong máy PCR và hoạt
động theo sơ đồ nguyên lý sau:
II. Các kỹ thuật PCR
4
ADN khuôn
5’
3’
ADN khuôn
biến tính
(94
o
C-95
o
C)
5’

3’
5’3’
5’ 3’
5’
3’
Mồi gắn v o à
ADN khuôn
(35oC - 65
o
C)
Tổng hợp
ADN (72
o
C)
3’ 5’
3’5’
5’
3’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
Một số kỹ thuật đang được ứng dụng phổ biến trong lĩnh vực công nghệ gen
thực vật gồm: (1) Kỹ thuật RT-PCR; (2) Kỹ thuật RAPD; (3) Kỹ thuật AFLP; (4)
Kỹ thuật STS; (5) Kỹ thuật CAPS; (6) Kỹ thuật SSR (xem file powerpoint)
1. Kỹ thuật RT-PCR

RT-PCR (reverse transcription PCR) là kỹ thuật dùng để tổng hợp cADN từ
mARN. Kỹ thuật này được tiến hành như sau: trước tiên, người ta tách ARN thông
tin từ tế bào, sau đó tiến hành phản ứng PCR để phiên mã ngược từ ARN thành
cADN, ở giai đoạn này các thành phần tham gia phản ứng vẫn tương tự như PCR
thông thường, chỉ trừ enzym tổng hợp người ta phải sử dụng loại sao mã ngược
(reverse transcriptase) để tổng hợp ra sợi cDNA, quá trình tổng hợp được thực hiện
ở 37
0
C. Sau khi có sợi cADN, sợi này sẽ được làm khuôn để nhân bội nhiều bản
sao qua một qui trình PCR thông thường. Thường người ta tiến hành hai quá trình
phiên mã ngược và nhân bội cùng nhau bằng cách bố trí một phản ứng với hai loại
enzym và hai loại mồi PCR (một loại để sao mã ngược và một loại để nhân bội),
còn các thành phần khác vẫn không đổi.

2. Kỹ thuật RAPD
RAPD là viết tắt của cụm từ tiếng Anh: Randomly Amplified Polymorphic
DNA (Đa hình ADN dược nhân bản ngẫu nhiên). Nó là kỹ thuật được xây dựng
dựa trên nguyên lý PCR, với những mồi được thiết kế ngẫu nhiên có chiều dài
khoảng 10 nucleotide. Trong phản ứng, các mồi RAPD gắn ngẫu nhiên vào ADN
khuôn ở bất kỳ vị trí nào mà có trình tự bổ sung với nó. Phản ứng sau đó xảy ra với
sự tham gia của enzym Taq, dNTP và các thành phần khác. Kỹ thuật này chỉ sử
dụng một lượng nhỏ ADN khuôn (khoảng 25ng). Sản phẩm PCR được điện di
trong gel agarose và phát hiện bằng cách nhuộm với dung dịch ethidium bromide,
kích thước sản phẩm có chiều dài từ 200bp đến 2000 bp. Về cơ bản, chỉ thỉ RAPD
là một chỉ một chỉ thị trội, nghĩa là chỉ thị này không phân biệt được giữa những cá
thể đồng hợp tử và dị hợp tử trong quần thể F
2
.
RAPD là một kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện, không mất nhiều thời gian, ít
tốn kém. Kỹ thuật này rất phù hợp cho phân tích đa dạng di truyền và lập bản đồ

gen sử dụng quần thể RIL (Recombinant Inbred Line). Hạn chế lớn nhất của kỹ
thuật RAPD đó là nó rất nhậy cảm với nhiều yếu tố như: các thành phần tham gia
phản ứng và đặc biệt là nhiệt độ gắn mồi, vì yếu tố gắn mồi mà có thể có hai kết
quả khác nhau với cùng một thí nghiệm sử dụng hai máy PCR khác nhau. Để hạn
chế nhược điểm này, cần phải tuân thủ nghiêm ngặt các điều kiện thí nghiệm và
phải tiến hành đồng bộ giữa các lần thí nghiệm.
Qui trình và ví dụ minh họa
- Các thành phần PCR
5