Nghiên cứu cellulase từ vi khuẩn ruột mối phân lập ở việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

ĐÀO THỊ THANH XUÂN

NGHIÊN CỨU CELLULASE TỪ VI KHUẨN RUỘT MỐI
PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội - 2021


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Đào Thị Thanh Xuân

NGHIÊN CỨU CELLULASE TỪ VI KHUẨN RUỘT MỐI
PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM

Ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 9420201

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. PGS.TS. LÊ THANH HÀ
2. PGS.TS. PHÍ QUYẾT TIẾN

Hà Nội – 2021

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nghiên cứu trong Luận án này là
trung thực và chưa được các tác giả khác công bố.
Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ trong việc hoàn thành Luận án đã được
cảm ơn và các thơng tin trích dẫn trong Luận án đã được ghi rõ nguồn gốc.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong Luận án này.
Hà Nội, ngày

tháng năm 2021

Đào Thị Thanh Xuân
Tập thể GVHD
1. PGS.TS Lê Thanh Hà

2. PGS.TS Phí Quyết Tiến


LỜI CẢM ƠN
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới các Thầy giáo hướng dẫn khoa học là
PGS. TS Lê Thanh Hà và PGS.TS. Phí Quyết Tiến đã tận tình chỉ dẫn, giúp đỡ
và động viên trong suốt thời gian thực hiện luận án.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới quý thầy, cô giáo Bộ môn Công nghệ sinh
học Viện Công nghệ sinh học và Thực phẩm -Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội
cũng như bạn bè, đồng nghiệp tại bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Viện Cơng nghệ
Hóa Sinh và Mơi trường, Trường Đại học Vinh đã hết sức giúp đỡ và hướng dẫn,
chỉ bảo trong suốt thời gian thực hiện luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ nghiên cứu Viện Hàn lâm khoa học
Việt Nam đã hỗ trợ tôi trong các kết quả nghiên cứu về phân tích gen

Nhân dịp này, tơi cũng xin cảm ơn các anh chị, em trong phòng Đào tạo Sau
đại học của Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã luôn ủng hộ tinh thần và giúp đỡ
trong cơng việc tại phịng để tơi có thể hồn thành luận án.
Tôi xin chân thành cám ơn Trung tâm thực hành thí nghiệm - Trường đại học
Vinh, Phịng thí nghiệm bộ môn công nghệ sinh học – Đại học Bách Khoa Hà Nội
cùng các em sinh viên đã giúp đỡ tơi trong các nghiên cứu của mình.
Tơi cũng xin chân thành cảm ơn những người thân trong gia đình, những
người bạn đã động viên và khích lệ cho tơi có được sự chuyên tâm và động lực phấn
đấu thực hiện luận án này.
Hà Nội, ngày tháng năm 2021

Đào Thị Thanh Xuân


DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Tên viết tắt

Tên tiếng Anh

Nghĩa tiếng Việt tƣơng
đƣơng

BgIB

Beta-glucosidase B

Beta-glucosidase B

BgIF

Beta-glucosidase F

Beta-glucosidase F

BgIG

Beta-glucosidase G

Beta-glucosidase G

Blast

Basic Local Alignment Search Tool

Cơng cụ so sánh mức tương
đồng
về
trình
tự
nucleotide/axit amin

Bp

Base pair

Cặp base

BSA

Bovine serum Albumin

Albumin huyết thanh bò

CBD

Carbohydrate binding domain

Vùng liên kết carbohydrate

CD

Catalytic domain

Vùng xúc tác

cDNA

Complementary DNA

DNA được tổng hợp từ
khuôn mRNA nhờ enzym
phiên mã ngược

Cel12A

Endoglucanase glycoside hydrolase Endoglucanase thuộc họ 12
family 12

Cel45A

Endoglucanase glycoside hydrolase Endoglucanase thuộc họ 45
family 45

Cel48A

Endoglucanase glycoside hydrolase Endoglucanase thuộc họ 48
family 48

Cel5A

Endoglucanase glycoside hydrolase Endoglucanase thuộc họ 5A
family 5

CBHI

Cellobiohydrolase I

Cellobiohydrolase thuộc họ I

CBHII

Cellobiohydrolase II

Cellobiohydrolase thuộc họ
II

CMC

Carboxymetyl cellulose

Cơ
chất
cellulose

COG/KOG

Clusters/Eukaryotic of Orthologous Cơ sở dữ liệu protein của
Group
VSV nhân sơ/nhân chuẩn

dCTP

2´-deoxycytidine 5´-triphosphate

2´-deoxycytidine
triphosphate

5´-

dATP

2´-deoxyadenosine 5´-triphosphate

2´-deoxyadenosine

5´-

Carboxymetyl

triphosphate
dGTP

2´-deoxyguanosine 5´-triphosphate

DNA

Deoxyribonucleic acid

EDTA

Ethylene diamin tetra acetic acid

Tween 80

Polysorbate 80

CAZy

Carbohydrate Active Enzyme

BGs

β- glucosidase

EG

Endoglucanase

FPU

Filter paper

αA

α- Amylase

GHs

Glycoside hydrolase

PLs

Polysaccharide lyase

CEs

Carbohydrate esterase

Axit Ethylene diamin tetra
acetic

Enzym hoạt hóa bổ trợ

AAs
GT

2´-deoxyguanosine 5´triphosphate

Glycosyl transferase

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
MỞ ĐẦU ................................................................................................................... 1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN ........................................................................................ 4
1.1 Cellulase .............................................................................................................. 4
1.1.1.Phân loại cellulase ............................................................................................ 4
1.1.2. Nguồn thu nhận cellulase ................................................................................ 6
1.1.3. Sinh tổng hợp cellulase từ vi khuẩn ............................................................... 7
1.1.3.1. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy ............................................................... 7
1.1.3.2 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng ................................................................ 9
1.1.4. Đặc tính của enzyme cellulase từ vi khuẩn .................................................... 10
1.1.4.1. pH tối ưu và nhiệt độ tối ưu của enzym ...................................................... 11
1.1.4.2. Ảnh hưởng của các ion kim loại và các chất phụ gia đến hoạt độ enzym . .12
1.2. Tổng quan về mối ............................................................................................. 13
1.2.1. Phân loại Mối ................................................................................................. 13
1.2.2. Hệ vi sinh vật trong ruột mối .......................................................................... 14
1.2.3 Vi khuẩn sinh cellulase từ ruột mối ................................................................. 16
1.3. Ứng dụng của cellulase trong xử lý lignocellulose ........................................... 19
1.3.1. Thành phần của lignocelluloses...................................................................... 19
1.3.2. Hệ enzym phân giải Lignocellulose ............................................................... 21
1.3.3. Sự phối hợp tác động giữa các enzym ............................................................ 22
1.3.4. Ứng dụng cellulase trong quá trình thủy phân lignocellulose ........................ 24
1.4. Ứng dụng giải trình tự genome phát hiện tiềm năng vi khuẩn sinh tổng hợp

cellulase trong phân giải lignocellulose ................................................................... 26
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .................................................. 28
2.1. Vật liệu .............................................................................................................. 28
2.1.1. Mẫu mối .......................................................................................................... 28
2.1.2. Các chủng vi khuẩn ........................................................................................ 28
2.2. Thiết bị và hóa chất ........................................................................................... 29
2.2.1 Thiết bị ............................................................................................................. 29
2.2.2. Hóa chất .......................................................................................................... 29


2.3. Các môi trường nuôi cấy ................................................................................... 30
2.3.1. Môi trường làm giàu vi khuẩn sinh cellulase ................................................. 30
2.3.2. Môi trường giữ giống, nhân giống và phân lập .............................................. 30
2.3.3. Môi trường sinh tổng hợp enzym ................................................................... 30
2.4. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................... 30
2.4.1. Phương pháp phân lập và tuyển chọn chủng sinh tổng hợp cellulase ............ 31
2.4.1.1. Phân lập vi khuẩn sinh cellulase từ ruột mối ............................................... 31
2.4.1.2. Xác định định tính khả năng sinh cellulase của các chủng vi khuẩn phân lập
.................................................................................................................................. 32
2.4.1.3. Xác định đặc tính sinh lý, hóa sinh của vi khuẩn sinh cellulase ................. 33
2.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy tới khả năng sinh tổng hợp
cellulase .................................................................................................................... 33
2.4.2.1. Lựa chọn môi trường thích hợp cho q trình sinh tổng hợp cellulase của
chủng vi khuẩn tuyển chọn ....................................................................................... 33
2.4.2.2. Ảnh hưởng của các thông số kỹ thuật đến sinh tổng hợp enzym ................ 33
2.4.2.2. Ảnh hưởng của thời gian thu nhận .............................................................. 33
2.4.2.6. Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy ........................ 33
2.4.2.7. Phương pháp qui hoạch thực nghiệm tối ưu môi trường sinh tổng hợp
CMCase cho Bacillus subtilis G4 sử dụng phần mềm Design Expert 7.1 ............... 34
2.4.3. Nghiên cứu thu nhận và xác định đặc tính chế phẩm cellulase thu từ Bacillus

subtilis G4 ................................................................................................................. 35
2.4.3.1. Thu nhân chế phẩm cellulase từ vi khuẩn ................................................... 35
2.4.3.2. Đặc tính của chế phẩm cellulase thu nhận. ................................................ 35
2.4.4. Khảo sát khả năng thủy phân rơm sử dụng cellulase thu nhận từ vi khuẩn ... 36
2.4.4.1. Phương pháp tiền xử lý nguyên liệu giàu cellulose..................................... 36
2.4.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến hiệu suất đường hóa
lignocellulose của rơm sử dụng cellulase từ Cellulosimicrobium cellulans MP1 ... 36
2.4.5. Phương pháp định tên vi khuẩn thơng qua giải trình tự 16S rDNA ............... 37
2.4.6. Phương pháp giải trình tự hệ genom của Cellulosimicrobium cellulans MP1
và dự đoán gen chức năng ........................................................................................ 38
2.4.6.1. Tách chiết DNA hệ gen của vi khuẩn .......................................................... 38
2.4.6.2 Giải trình tự DNA đa hệ gen bằng máy giải trình tự thế hệ mới HiSeq2000
của Illumina .............................................................................................................. 38
2.4.6.3. Lắp ráp de novo hệ gen và đánh giá chất lượng lắp ráp .............................. 39
2.4.6.4. Dự đoán gen và chú giải hệ gen .................................................................. 39
2.5. Các phương pháp phân tich ............................................................................... 40


2.5.1. Xác định hoạt độ các enzym ........................................................................... 40
2.5.2. Xác định hàm lượng protein ........................................................................... 43
2.5.3. Xác định độ ẩm nguyên liệu ........................................................................... 43
2.5.4. Xác định hàm lượng cellulose ........................................................................ 44
2.5.5. Xác định hàm lượng lignin ............................................................................. 44
2.5.6. Phương pháp xác định lượng đường trong mẫu thủy phân bằng sắc ký lỏng
cao áp (HPLC- High Performance Liquid Chromatography) .................................. 46
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN......................................................... 47
3.1. Phân lập vi khuẩn từ ruột mối và tuyển chọn chủng có hoạt tính cellulase cao 47
3.2. Đặc điểm hình thái và đặc tính sinh lý, sinh hóa của các chủng lựa chọn ........ 51
3.2.1. Đặc điểm hình thái và đặc tính sinh lý, sinh hóa ............................................ 51
3.2.2. Định tên các vi khuẩn ruột mối ...................................................................... 54

3.3. Nghiên cứu thu nhận cellulase từ vi khuẩn Bacillus subtilis G4....................... 56
3.3.1. Nghiên cứu lựa chọn mơi trường và điều kiện thích hợp cho q trình sinh
tổng hợp cellulase ..................................................................................................... 56
3.3.1.1. Lựa chọn môi trường sinh tổng hợp cellulase ............................................. 56
3.3.1.2 Ảnh hưởng của các thông số lên men đến hoạt độ CMCase ........................ 57
3.3.1.3. Ảnh hưởng các nguồn dinh dưỡng đến quá trình sinh tổng hợp cellulase .. 59
3.3.3. Thu nhận cellulase kỹ thuật từ B. subtilis G4 và xác định đặc tính của chế
phẩm……. ................................................................................................................ 62
3.3.3.1. Thu nhận chế phẩm cellulase kỹ thuật từ B. subtilis G4 ............................. 62
3.3.3.2. Đặc tính của chế phẩm cellulase từ vi khuẩn B. subtilis G4 ....................... 63
3.3.4. Khảo sát khả năng thủy phân của cellulase từ vi khuẩn G4 đối với các vật liệu
giàu cellulose. ........................................................................................................... 66
3.4. Nghiên cứu cellulase từ vi khuẩn Cellulosimicrobium MP1 ............................ 67
3.4.1. Nghiên cứu lựa chọn môi trường và điều kiện sinh tổng hợp cellulase từ MP1
.................................................................................................................................. 67
3.4.1.1. Lựa chọn môi trường sinh tổng hợp cellulase ............................................. 67
3.4.1.2. Ảnh hưởng của các thông số kỹ thuật nuôi cấy tới sinh tổng hợp CMCase từ
vi khuẩn MP1............................................................................................................ 68
3.4.2. Ảnh hưởng các nguồn dinh dưỡng tới quá trình sinh tổng hợp CMCase ...... 70
3.4.2.1. Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng nitơ ............................................................. 70
3.4.2.2. Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng cacbon ........................................................ 71
3.4.2.3. Ảnh hưởng của hàm lượng bột đậu tương tới quá trình sinh cellusae ........ 71
3.4.2. Xác đl "_Toc77151043" ợng bột đậu tương tới quá trình sinh cellusaeC...... 72
3.4.2.1. Thu nhận chế phẩm cellulase bằng kết tủa bởi ethanol ............................... 72


3.4.2.2. Xác định đặc tính chế phẩm cellulase thu từ Cellulosimicrobium sp.
MP1 .......................................................................................................................... 73
3.5. So sánh giữa B. subtilis G4 và Cellulosimicrobium sp. MP1 .......................... 75
3.5. Xác định đặc tính di truyền và các gen mã hóa enzym thủy phân cellulose của

chủng C. cellulans MP1 ............................................................................................ 76
3.5.1. Trình tự gen và một số đặc điểm khái quát của chủng C. cellulans MP1 ...... 76
3.5.2. Các cụm gen và chức năng gen của chủng MP1 ............................................ 77
3.5.3. So sánh COG toàn bộ genome và các enzyme liên quan đến chuyển hóa
carbonhydrate ........................................................................................................... 78
3.5.4. Khai thác các enzyme thủy phân sinh khối thực vật từ nguồn gen của chủng
C. cellulans MP1...................................................................................................... .80
3.6. Khảo sát khả năng thủy phân cellulose của rơm sử dụng cellulase thu nhận từ
MP1….. .................................................................................................................... 83
3.6.1. Xác định thành phần nguyên liệu rơm ........................................................... 83
3.6.2. Ảnh hưởng của tiền xử lý cơ chất tới hiệu suất quá trình thủy phân ............. 83
3.6.3. Ảnh hưởng các yếu tố tới hiệu suất thủy phân bởi enzym ............................. 84
KẾT LUẬN ............................................................................................................. 89
TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................... 90

DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CỦA LUẬN ÁN ...... 99
PHỤ LỤC .......................................................................................................... 90100


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Đặc tính enzym cellulase và Xylanase từ C.cellulans ........................... 11
Bảng 1.2 Tính bền nhiệt của cellulase và xylanase từ C.cellulans. ......................... 12
Bảng 1.3 Tính bền pH của cellulose và xylanase từ C.cellulans. ............................ 12
Bảng 1.4. Tổng kết một số loài vi khuẩn sinh tổng hợp cellulase đã được phân lập từ
ruột các loài mối . ..................................................................................................... 18
Bảng 2.1. Thông tin các mẫu mối............................................................................. 28
Bảng 2.2. Giá trị mã hóa và thực nghiệm Design-Expert 7.1 .................................. 34
Bảng 3.1. Thống kê kết quả phân lập vi khuẩn từ ruột mối ..................................... 47
Bảng 3.2 Số lượng các chủng vi khuẩn phân lập được trên các môi trường làm giàu
.................................................................................................................................. 48

Bảng 3.3 Các chủng có tỷ lệ (D/d) cao được chọn lựa ............................................. 49
Bảng 3.4 Hoạt độ cellulase và xylanase của các chủng vi khuẩn lựa chọn.............. 50
Bảng 3.5. Đặc điểm hình thái, sinh lý của 11 chủng vi khuẩn tuyển chọn .............. 52
Bảng 3.6 Kết quả định tên các chủng vi khuẩn lựa chọn từ ruột mối ...................... 54
Bảng 3.7 Phân tích hồi quy (ANOVA) kết quả thí nghiệm ..................................... 60
Bảng 3.8 Kết tủa cellulase bằng ammonium sulfate bão hòa ................................... 62
Bảng 3.9 Kết tủa cellulase bằng acetone .................................................................. 63
Bảng 3.10 Kết quả thủy phân lignocelluloses sử dụng enzym từ vi khuẩn G4 ....... 66
Bảng 3.11 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy tới khả năng sinh enzym .............. 68
Bảng 3.12 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng N tới khả năng sinh enzym của chủng
MP1 .......................................................................................................................... 70
Bảng 3.13 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng Cacbon tới khả năng sinh enzym
chủng MP1 ................................................................................................................ 71
Bảng 3.14 Ảnh hưởng của nồng độ bột đậu tương tới khả năng sinh enzym của
chủng MP1 ................................................................................................................ 71
Bảng 3.15 Kết tủa enzym thô sử dụng cồn tuyệt đối với các nồng độ khác nhau
.................................................................................. Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.16. So sánh giữa enzym từ B. subtilis G4 và Cellulosimicrobium sp.
MP1…… .................................................................................................................. 75
Bảng 3.17 Danh mục các cellulase và hemicellulase dự đoán biểu hiện trên genome
of C. cellulans MP1 .................................................................................................. 81
Bảng 3.18 Một số thành phần hóa học của rơm trước và sau tiền xử lý bằng kiềm(%
chất khô nguyên liệu) ............................................................................................... 83
Bảng 3.19 Ảnh hưởng của tiền xử lý cơ chất tới hiệu suất đường hóa .................... 84
Bảng 3.20 Ảnh hưởng của thời gian tới hiệu suất đường hóa .................................. 84
Bảng 3.21 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu suất đường hóa ................................... 85
Bảng 3.22 Ảnh hưởng của tỷ lệ chất rắn/lỏng tới hiệu suất đường hóa ................... 85
Bảng 3.23 Ảnh hưởng của nồng độ enzym tới hiệu suất đường hóa ...................... 86

Bảng 3.24 Ảnh hưởng của pH tới hiệu suất đường hóa ........................................... 86
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 Q trình phân giải cellulose của cellulase [2] .......................................... 5
Hình 1.2 Cơ chế thủy phân cellulose của hệ cellulose [4] ....................................... 6
Hình 1.3. Hệ vi sinh vật trong ruột mối [39] 16
Hình 1.4 Phân bố các họ vi khuẩn trong ruột mối và côn trùng [41]. ................... 18
Hình 1.5 Cấu trúc khơng gian của phân tử cellulose [9] ......................................... 20
Hình 1.6.Cấu trúc hóa học phân tử cellulose [9] ...................................................... 20
Hình 1.7 Cơng thức hóa học của hemicellulose [29] .............................................. 21
Hình 1.8 Các đơn phân của lignin ........................................................................... 21
Hình 1.9 Hoạt động của các enzym hemicellulose [51] .......................................... 22
Hình 1.10 Hoạt động của các enzym cellulose [51]] .............................................. 23
Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu trong luận án ................................................................ 30
Hình 2.2 Các bước phân lập vi khuẩn sinh cellulase từ ruột mối [25] .................... 32
Hình 3.1. Hình ảnh mẫu mối thu thập ..................................................................... 47
Hình 3.2 Hoạt độ enzym các chủng vi khuẩn từ ruột mối ....................................... 51
Hình 3.3 Hoạt độ CMCase của chủng B. subtlis G4 trên các mơi trường ni cấy. 56
Hình 3.4. Ảnh hưởng của các thông số nuôi cấy đến hoạt độ CMCase của B. subtilis
G4. Tỷ lệ giống (A), tốc độ lắc (B), Nhiệt độ (C) và pH môi trường (D). .............. 57
Hình 3.5 Ảnh hưởng của thời gian ni cấy đến sinh tổng hợp CMCase từ vi
khuẩn G4 .................................................................................................................. 58
Hình 3.6 . Ảnh hưởng của nguồn cacbon (A), nito (B) và bột đậu tương lên hoạt độ
CMCase của B. subtilis G4 ..................................................................................... 59
Hình 3.7 Bề mặt đáp ứng của quá trình sinh tổng hợp CMCase từ Bacillus G4 cho
thấy sự tương tác giữa (a) Hàm lượng bột đậu tương và tinh bột . (b) Hàm lượng
Casein và Tinh bột. (c) Hàm lượng bột đậu tương và casein. ................................. 61
Hình 3.8 Zymogram (A) và vịng thủy phân (B) trên mơi trường cám (1) và mơi
trường tinh bột (3) ................................................................................................... 62
Hình 3.9. Kết quả xác định hoạt độ CMCase và mật độ tế bào trên mơi trườngtrước
và sau tối ưu ............................................................................................................. 62

Hình 3.10 Nhiệt độ tối ưu của CMCase thu nhận từ G4 ......................................... 64
Hình 3.11 Độ bền của enzym bởi nhiệt độ ............................................................. 64
Hình 3.12. pH tối ưu cho hoạt dộ CMCase của chế phẩm cellulase từ B. subtilis G4
……. ......................................................................................................................... 65
Hình 3.13. Độ bền pH của chế phẩm cellulase từ Bacillus G4 .............................. 65
Hình 3.14: Kết quả phân tích sản phẩm thủy phân bằng HPLC ............................ 67
Hình 3.15 Ảnh hưởng các thông số kỹ thuật tới sinh tổng hợp enzym từ MP1 ...... 69


Hình 3.16 Ảnh hưởng của thời gian ni cấy đến hoạt độ CMCase của
Cellulosimicrobium sp MP1 .................................................................................... 70
Hình 3.17. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của enzyme CMCase từ MP1 ............. 73
Hình 3.18. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính CMCase từ MP1 ...................... 74
Hình 3.19. Độ bền pH của chế phẩm cellulase từ MP1 .......................................... 74
Hình 3.20. Độ bền nhiệt chế phẩm cellulase từ MP1 .............................................. 75
Hình 3.21. Thử nghiệm phân giải giấy lọc của MP1 và G4 .................................. 76
Hình 3.22 Sơ đồ genom của C.cellulans MP1 ......................................................... 77
Hình 3.23 Phân loại chức năng gen ......................................................................... 78
Hình 3.25 So sánh genom của MP1 với các chủng C.cellulans .............................. 80
Hình 3.26. Sản phẩm thủy phân rơm sử dụng cellulase từ MP1 bằng HPLC ......... 87


MỞ ĐẦU
Cellulose là thành phần chính của sinh khối thực vật, là nguyên liệu sinh học
dồi dào nhất trên trái đất. Khơng những thế vật liệu cellulose và hemicellulose cịn
là phụ phấm, phế thải của ngành nông nghiệp và nhiều ngành nghề khác. Ở nước ta,
ước tính hàng năm, nguồn nguyên liệu cellulose từ phế phẩm nông nghiệp như rơm,
rạ, lá mía và bã cây mía bỏ phí lên đến 50 triệu tấn. Biện pháp xử lý nguồn phế
phẩm này chủ yếu là đốt đã gây ra những ảnh hưởng tiêu cực đến môi trường sống
và sức khoẻ con người. Việc xử lý nguồn nguyên vật liệu lignocellulose phế phẩm

làm nguyên liệu sản xuất trong các lĩnh vực khác như công nghiệp giấy, sản xuất
ethanol, sản xuất thức ăn gia súc và đặc biệt sản xuất nhiên liệu sinh học đã và
đang là tiềm năng vô cùng to lớn.
Ngày nay để thủy phân lignocellulose hiệu quả, thân thiện với môi trường,
các nhà khoa học đang hướng đến đó là sử dụng hệ enzym thủy phân lignocellulose.
Hệ enzym này có thể được thiết kế bằng cách tổ hợp các loại enzym trong hệ enzym
thủy phân lignocellulose từ các nguồn vi sinh vật khác nhau hoặc khai thác từ một
chủng vi sinh vật nhưng có hệ enzym phong phú có khả năng thủy phân hiệu quả
lignocellulose.
Mối đóng vai trị quan trọng trong việc sử dụng và khống hóa các polymer
sinh học như gỗ, rơm rạ, bã mía, giấy và các vật liệu cellulose khác. Hệ vi sinh vật
trong ruột mối có ý nghĩa quyết định trong q trình phân giải cellulose. Có rất
nhiều vi khuẩn phân giải cellulose đã được phân lập và đã được định tên từ nhiều
loài mối khác nhau.
Việt Nam, cho đến nay, hơn 100 loài mối khác nhau đã được mô tả. Tuy
nhiên, việc phân lập các vi sinh vật có khả năng phân giải lignocellulose với mục
đích khai thác chủng vi sinh vật phân lập từ ruột mối trong phân giải lignocellulose
cũng như khai thác hệ gen của chúng chưa được nghiên cứu.
Chính vì lý do đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu
cellulase từ vi khuẩn ruột mối phân lập ở Việt Nam”
Với mục đích phân lập, tuyển chọn và đánh giá được đa dạng vi khuẩn phân
giải cellulase từ ruột mối. Đồng thời thơng qua giải trình và phân tích hệ gen vi
khuẩn để đánh giá tiềm năng phân giải các vật liệu cellulose của vi khuẩn ruột mối.

1


Mục tiêu của đề tài
- Phân lập và đánh giá được sự đa dạng của vi khuẩn sinh cellulase của các
-

chủng vi khuẩn phân lập từ ruột mối ở Việt Nam
Giải trình tự và phân tích hệ gen vi khuẩn làm cơ sở đánh giá tiềm năng
phân giải cellulase của vi khuẩn ruột mối phân lập được

1. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
Đối tượng là vi khuẩn phân lập từ ruột mối ở Việt Nam
2. Nội dung nghiên cứu
(1) Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng sinh cellulase từ ruột
mối
(2) Định tên một số vi khuẩn phân lập được từ ruột mối
(3) Tối ưu điều kiện sinh tổng hợp cellulase từ hai vi khuẩn lựa chọn
(4) Thu nhận cellulase từ 2 chủng vi khuẩn lựa chọn và xác định đặc
tính CMCase của chế phẩm
(5) Xác định đặc tính di truyền và các gen mã hóa enzym thủy phân
cellulose của một chủng vi khuẩn
(6) Sử dụng dịch enzym thô từ hai vi khuẩn lựa chọn để thủy phân vật liệu
giàu cellulose
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án
Ý nghĩa khoa học
(1) Luận án đã cung cấp số liệu về việc phân lập một số chủng vi khuẩn sinh
cellulase từ ruột mối Việt Nam.
(2) Đã khảo sát được các điều kiện thu nhận cellulase từ 2 chủng vi khuẩn từ
ruột mối
(3) Lần đầu tiên giải trình tự tồn bộ hệ gen của chủng vi khuẩn từ ruột mối
Cellulosimicrobium cellulans và phân tích chi tiết các gen liên quan đến phân
giải lignocellulose từ đó đánh giá được tiềm năng của chủng.
(4) Bước đầu khảo sát được khả năng thủy phân của cellulase từ vi khuẩn ruột
mối trên lignocellulose của rơm
Ý nghĩa thực tiễn

(1) Góp phần đánh giá sự đa dạng của hệ vi khuẩn sinh cellulase từ ruột mối
cũng như áp dụng phân tích hệ gen trong khai thác tiềm năng phân giải
lignocellulose của vi khuẩn ruột mối
(2) Kết quả nghiên cứu của đề tài là tài liệu tham khảo khoa học đáng tin cậy và
có giá trị, là tài liệu phục vụ cho giảng dạy, nghiên cứu khoa học và cho cả sản
xuất sau này.
2


-

Đóng góp mới của đề tài
Đây là nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu về phân lập và thu
nhận cellulase từ vi khuẩn ruột mối.
Là nghiên cứu đầu tiên ứng dụng kỹ thuật giải trình tự tồn bộ hệ gen của
vi khuẩn Cellulosimicrobium cellulans MP1 phân lập từ ruột mối để phân
tích tiềm năng sinh cellulase và hemicellulase của chủng, thơng qua đó dự
đốn tiềm năng ứng dụng của chủng trong phân hủy lignocellulose

3


Chƣơng 1. TỔNG QUAN
1.1 Cellulase
1.1.1. Phân loại cellulase
Cellulase là một phức hệ enzym thủy phân cellulose thông qua việc thủy
phân liên kết β-1,4 glucoside hay phá vỡ liên kết hydro trong phân tử cellulose.
Cellulase có thể được chia thành 3 enzym chính dựa trên cơ chế hoạt động,
trình tự axit amin và cấu trúc của chúng
Endo-(1,4)-β-D-glucanase (EC 3.2.1.4)

Exo-(1,4)-β-D-glucanase (EC 3.2.1.91)
β-glucosidase (EC 3.2.1.21).
Endoglucanase (EC 3.2.1.4) cịn có tên gọi khác nhau là Endoglucanase,
Endo-1,4-β-D-glucanase, Endo-1,4-glucanase, β-1,4-Endoglucan hydrolase,
cellulase A, cellulosin AP, celludextrinase, carboxymethylcellulase…cơ chế hoạt
động của enzym này là tấn công cellulose một cách ngẫu nhiên tại các vị trí bên
trong phân tử cellulose và phân cắt chuỗi polysaccharid bằng việc chèn các phân tử
nước vào giữa các liên kết β-1,4 glucosid. Kết quả tạo ra các chuỗi glucan có độ dài
khác nhau. Enzym này có thể thủy phân ngẫu nhiên liên kết 1,4-β-D-glucoside giữa
mạch của các cơ chất cellulose, lignin và các β-D-glucan của ngũ cốc [1].
Exoglucanase (EC 3.2.1.91) enzym này còn có tên gọi khác như Exo-β-1,4glucanase, cellobiohydrolase, Exo-cellobiohydrolase, Exo- β-1,4-glucan
cellobiohydrolase, cellobiose, C1 cellulase… bắt đầu bằng việc tấn công vào đầu
khử hoặc khơng khử của chuỗi polysacharid và giải phóng các β-cellobiose.
Exoglucanse có thể hoạt động lên các cellulose dạng tinh thể, lên lớp vỏ bên ngoài
chuỗi cellulose của cấu trúc tinh thể. Đặc điểm hình học có ý nghĩa nhất của phần
xúc tác của CBHs là cấu trúc hình ống được tạo ra hai lớp bề mặt. Cấu trúc hình
ống này có thể tồn bộ hoặc một phần của trung tâm hoạt động. Dạng hình ống của
trung tâm hoạt động có thể là hình dáng duy nhất của exoglucanase. CBHs là
exoglucanse thường gặp nhất. Các CBHs khác nhau được sinh tổng hợp bởi các vi
khuẩn hoặc nấm mốc với các trung tâm xúc tác phụ thuộc vào họ 5,6,7,9,48 và 74.
CBHs nấm mốc thuộc họ 6, 7 và 48, CBHs vi khuẩn hiếu khí thuộc họ 6 và 48,
CBHs của vi khuẩn kỵ khí thuộc họ 9 và họ 48 [1].
β-glucosidase (EC 3.2.1.21) có tên gọi khác như β-1,4-glucosidase hoạt động
đặc biệt lên các cellobiose disaccharid tạo ra sản phẩm cuối glucose. Enzym này
thủy phân gốc β-D-glucosid không khử ở đầu tận cùng để giái phóng glucose. β-Dglucosidase (BGs) là enzym thủy phân các cellodextrin hòa tan và các cellobiose.
Hoạt tính của BGs lên các cellulose khơng hịa tan là không đáng kể, chúng chủ yếu
4


thủy phân cellobiose. Các BG khác nhau được thu nhận từ các vi khuẩn, nấm mốc,

động vật và thực vật khác nhau với trung tâm xúc tác phụ thuộc vào họ 1,3 hoặc 9.
Dựa trên các dữ liệu phân tích cấu trúc tương đồng, cấu trúc lập thể hóa học của họ
1 và 3 BGs thuộc loại duy trì, trong khi họ 9 thuộc loại đảo ngược. BGs có trung
tâm hoạt động dạng túi, nơi chúng được liên kết với các đầu gluocse không khử và
ghim các glucose từ cellobiose và cellodextrin [1].

Hình 1.1 Quá trình phân giải cellulose của cellulase [2]

Trong hầu hết các cách phân loại cơ bản thì thì cellulase thuộc nhóm enzym
đơn chức năng được xác định đó là các cellobiohydrolase (CBHs, exo-β-(1,4)-d
glucanases), endoglucanase (EGs, endo β-(1,4)-glucanase) và β-d-glucosidase.
CBHs là enzym thủy phân cellulose từ đầu chuỗi, trong khi EGs là loại enzym thủy
phân cellulose một cách ngẫu nhiên từ bên trong chuỗi. Cellobiase thủy phân các
cellobiose, sản phẩm cuối cùng của CBHs là glucose do vậy mà ngăn cản được sản
phẩm cuối kìm hãm enzym [3].
EGs có khả năng tạo ra các cellulose chuỗi ngắn hơn để thuận tiện cho quá
trình thủy phân bởi enzym. Sự kết hợp hoạt tính của EG và CBHs giải phóng một
lượng lớn các cellodextrin hịa tan và các cellobiose. β-d-glucosidase thủy phân các
dimer glucose thành glucose
.

5


Hình 1.2 Cơ chế thủy phân cellulose của hệ cellulose [4]

1.1.2. Nguồn thu nhận cellulase
Cellulase được sinh tổng hợp trong tự nhiên bởi một số loài vi sinh vật và cả
một số động vật và côn trùng. Các vi sinh vật sinh cellulase có mặt ở nhiều nơi,
những vi sinh vật này đóng vai trị quan trọng trong việc chuyển hóa các

polysacharid phức tạp thành các đường đơn giản mà chúng có thể đồng hóa được.
Các vi sinh vật có khả năng sinh cellulase trong tự nhiên bao gồm cả xạ khuẩn, nấm
mốc và vi khuẩn. Các vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose có cả vi khuẩn hiếu
khí, kỵ khí, cả chủng ưa ấm và chịu nhiệt. Mơi trường mà chúng có mặt rất đa dạng
bao gồm cả những nơi có nhiệt độ, áp suất cao tới những nơi có pH khắc nghiệt [5].
Vi khuẩn sinh cellulase đã từng được phân lập từ rất nhiều nguồn khác nhau
như dạ cỏ ở các động vật nhai lại (Hungater, 1957), đất (Black et al., 1985) phân
(Madden, 1982), chất thải đô thị (Stutzenberger et al., 1970), nước cống (Muray et
al., 1984), suối nước nóng (Sissons et al., 1987) [6]
Cơn trùng là động vật được quan tâm nhiều nhất về nhóm vi sinh vật cộng
sinh trong đường ruột và sự đa dạng sinh học của chúng. Có khoảng hơn 20% cơn
trùng có liên quan tới vi sinh vật cộng sinh. Vai trò của các vi sinh vật cộng sinh
này là khả năng sinh cellulase giúp cho các cơn trùng có thể chuyển hóa các nguồn
thức ăn có nguồn gốc là lignocellulose (Morrison et al,2009) [7].
Từ những năm 1992 Hethener và cộng sự đã nghiên cứu phân lập vi khuẩn
sinh cellulase từ ruột của mối ăn gỗ Nasutitermes lujae. Kết quả đã phân lập được
chủng vi khuẩn yếm khí Clostridium termitidis sp đồng thời nghiên cứu quá trình
sinh trưởng và phát triển của chủng.
Đến nay đã có rất nhiều vi khuẩn từ ruột mối được chứng minh có khả năng
sinh cellulase như chủng MX5T được phân lập từ ruột mối Mastotermes ở Autrialia
được xác định là có khả năng sinh cellulase và xylanase, với kỹ thuật định tên bằng
16S rDNA chủng MX5T được xác định là Cellulosimicrobium variable [8].

6


Các chủng vi khuẩn hiếu và yếm khí có khả năng sinh cellulase cũng đã
được phân lập từ mối Zootermopsis angusticollis được công bố bới Wenzel và cộng
sự 2001 là các chủng thuộc chi Cellulomonas, Bacillus, Pseudomonas, Rhizobium
[9].

Các vi khuẩn phân lập từ loài mối Heterotermes và Odontotermes được xác
định là có tiềm năng sinh cellulase, kết quả định tên cho thấy các chủng phân lập
được thuộc các chi Bacillus, Staphylococus và Enterobacter. Bacillus cereus được
xác định là có tiềm năng sinh cellulase cao nhất với hoạt độ endoglucanase, FPase
và β-glucosidase tương ứng là 5,06 U/mg; 2,52 U/mg và 6,01 U/mg sau khi đã tối
ưu hóa mơi trường ni cấy theo Chen và cộng sự [10].
1.1.3. Sinh tổng hợp cellulase từ vi khuẩn
Sinh tổng hợp cellulase từ vi khuẩn phụ thuộc rất nhiều vào các thông số của
môi trường nuôi cấy như nhiệt độ, nguồn dinh dưỡng, tỷ lệ oxy, thời gian nuôi cấy,
thành phần môi trường, pH của môi trường …
1.1.3.1 Sinh tổng hợp cellulase từ vi khuẩn
Ảnh hưởng nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp enzym của
vi sinh vật cũng như tính chất của enzym được tổng hợp. Sinh trưởng và sinh tổng
hợp enzym thường bị kìm hãm nhanh chóng ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ tối ưu.
Nhiệt độ quá cao gây ra sự biến tính enzym, các protein vận chuyển và các protein
khác, màng tế bào bị tổn thương vì hai lớp lipid bị hịa tan [11]. Tuy nhiên, điều
kiện nhiệt độ rất thấp, màng tế bào có thể bị kết đơng, enzym ngừng hoạt động. Nói
chung, nếu vượt quá nhiệt độ tối ưu của vi sinh vật, chức năng và kết cấu tế bào đều
bị ảnh hưởng. Do ảnh hưởng hai mặt, vừa có lợi vừa có hại của nhiệt độ đối với vi
sinh vật mà có thể xác định các khoảng nhiệt độ cơ bản đối với sự sinh trưởng của
vi sinh vât là nhiệt độ thấp nhất (minimum), nhiệt độ tối ưu (optimum) và nhiệt độ
cao nhất (maximum) đối với sự sinh trưởng [12].
Nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng Micrococus sp là 37oC nhưng nhiệt độ tối ưu
cho quá trình sinh cellulase là 27oC. Nhiệt độ tối ưu cho quá trình sinh cellulase là
30oC đối với các chủng Cellulomonas ASN2 đối với các chủng phân lập từ đất và
khả năng sinh tổng giảm khi nhiệt độ lên 45oC (M. Irfan et al.,2012)[13]
Với vi khuẩn phân lập từ ruột mối đã được báo cáo có nhiệt độ tối ưu cho
quá trình sinh cellulase là 37oC (D.Submitted et al, 2013) [14] và (Apurv et al.,
2014) [15].

7


Ảnh hưởng của pH
Phần lớn vi sinh vật phát triển tốt nhất trong mơi trường thuộc vào dải pH
trung tính 6,5 – 7,5. Nhưng trong quá trình sinh trưởng của vi khuẩn, một số axit
hữu cơ được giải phóng vào môi trường, làm giảm pH của môi trường và do đó gây
trở ngại hoặc ức chế hồn tồn sự phát triển của vi sinh vật. Ion H+ nằm trong thành
phần môi trường tùy theo nồng độ của chúng mà làm tăng hoặc giảm khả năng thẩm
thấu của tế bào đối với những ion nhất định. Ngồi ra, chúng cũng có thể làm ức
chế phần nào các enzym có mặt trên thành tế bào. Vi sinh vật có thể chỉ tồn tại hoặc
thậm chí chết trong mơi trường axit hay kiềm. Đối với vi khuẩn, thuận lợi nhất là
chúng phát triển trong mơi trường trung tính, axit yếu hoặc kiềm yếu [16].
pH trong ruột mối bậc thấp ở khoảng trung tính 6,0-7,6 cịn ở mối bậc cao
thì có pH cao hơn (8-9), thay đổi tùy vào vị trí ruột giữa, ruột trước, ruột sau. Các
loài mối bậc cao được báo cáo có pH trong ruột sau lên đến 12 (Cubitermes severus
và Procubitermes aburiensis) [17].
pH là một trong những yếu tố quan trọng cho quá trình sinh tổng hợp
cellulase. Giá trị pH axit hay bazơ quá cao đều ảnh hưởng tới quá trình sinh tổng
hợp cellulase. pH thích hợp nhất cho q trình sinh enzym là giá trị pH mơi trường
mà tại đó enzym thu nhận được có hoạt tính cao nhất [14].
Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
Thời gian lên men có ảnh hưởng khá mạnh tới sự sinh trưởng và sinh tổng
hợp enzym của chủng. Kéo dài thời gian lên men có thể làm giảm hoạt độ của
enzym do suy giảm các chất dinh dưỡng và tạo ra các sản phẩm phụ trong môi
trường lên men. Thời gian nuôi cấy thích hợp của mỗi loại vi sinh vật được xác định
bằng thời gian cho phép tích tụ lượng enzym tối đa, thời gian đó phụ thuộc chủ yếu
vào chủng vi sinh vật và thành phần môi trường nuôi cấy. Quá trình sinh trưởng của
vi sinh vật trong hệ kín trải qua bốn pha liên tiếp là pha tiềm phát (pha lag), pha lũy

thừa, pha cân bằng, pha suy vong [7].
Trong một nghiên cứu thu nhận và xác định tính chất của cellulase và
xylanase từ C.cellulans, các tác giả nhận thấy cellulase được tạo ra nhiều nhất sau
24 giờ nuôi cấy và duy trì lượng tương đối ổn định trong khoảng thời gian khoảng
70 giờ tiếp theo [18]. Tuy nhiên thời gian sinh tổng hợp cũng phụ thuộc nhiều vào
thành phần môi trường và bản chất của cơ chất sử dụng [18].
Quá trình sinh tổng hợp cellulase từ nấm mốc thường kéo dài hơn so với từ
vi khuẩn. Theo Gupta et al (2015) các chủng Asperillus sinh cellulase tốt nhất sau
72 giờ ni cấy. Với Trichoderma thì q trình sinh tổng hợp tốt nhất sau 5 ngày
nuôi cấy. Với cellulase thu nhận từ vi khuẩn có hoạt tính cao nhất sau 24-72 giờ
8


nuôi cấy. Thời gian thu nhận cellulase từ vi khuẩn thường 48- 72 giờ đối với các
chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus, Pseudomonas, Cellulomonas… .
Ảnh hưởng của tốc độ lắc
Chế độ lắc trong lên men là một trong những yếu tố thúc đẩy nhanh quá trình
lên men. Tốc độ lắc phù hợp giúp rút ngắn thời gian và làm tăng hiệu quả quá trình
lên men đối với các vi sinh vật hiếu khí. Lượng oxy ảnh hưởng tới q trình trao đổi
chất và tích lũy các sản phẩm sinh tổng hợp của vi sinh vật [19].
Theo công bố của Liu và cộng sự, khi ni cấy Cellulosimicrobium thì việc
sục khí và khuấy trộn là hết sức cần thiết. Oxy là yếu tố cơ bản ảnh hưởng đến sự
sinh trưởng phát triển và quá trình trao đổi chất của tế bào. Trong một số nghiên
cứu với các chủng thuộc chi Cellulosimicrobium, tốc độ lắc sử dụng nằm trong
khoảng từ 150 vòng/phút - 180 vòng/phút [12].
1.1.3.2 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng
Nguồn dinh dưỡng cacbon
Hầu hết các nghiên cứu nuôi cấy vi khuẩn sinh cellulase đều cung cấp nguồn
cacbon trong môi trường bằng cách sử dụng các loại đường khác nhau. Các nguồn
đường được sử dụng rất đa dạng tùy thuộc vào từng chủng và mục đích ni cấy

như glucose, galactose, sucrose, maltose, mannose, tinh bột, cellulose và các chất có
chứa nguyên tử C. Trong một so sánh về các loài trong chi Cellulosimicrobium, các
tác giả nhận thấy loại đường chính trong cấu tạo thành tế bào vi khuẩn là galactose
[8]. Thay đổi các điều kiện nuôi cấy như thêm 0,5% các nguồn cacbon (tinh bột,
maltose, glucose, surose, bột cellulose cho thấy Cellulomonas có khả năng sử dụng
nhiều nguồn cacbon khác nhau, với nguồn cacbon glucose làm tăng hoạt tính
cellulase đạt 0,475±0,019IU/ml/min [16].
Nghiên cứu của Jaradat và cộng sự cho thấy khi sử dụng các nguồn cacbon
khác nhau trong môi trường nuôi cấy, cũng đã xác định glucose là nguồn cacbon
thích hợp nhất cho quá trình sinh tổng hợp cellulase của chủng Streptomyces sp
[20].
Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng cacbon của vi khuẩn sinh cellulase
từ ruột mối phân lập được bởi Bholay và cộng sự cho thấy glucose, fructose, xylose
và tinh bột làm tăng khả năng sinh cellulase với các chủng Pseudomonas phân lập
được từ ruột mối [15].
Nguồn dinh dưỡng nitơ
Nguồn Nitơ là nguồn dinh dưỡng có chứa nitơ là thành phần xây dựng
protein và protoplasm. Với các nguồn nitơ sử dụng trong nghiên cứu cho quá trình
sinh tổng hợp cellulase thường là các amino axit như alanine, glutamic acid, cystine,
9


lysine, tyrosine, các nguồn nitơ vô cơ (NH4)2SO4, KNO3, amonium citratat, NH4Cl,
NaNO3 hay các nguồn nitơ hữu cơ như peptone, trytone, yeast extract và ure.
Nghiên cứu trên các chủng ASN2 cho thấy NH4Cl và pepton cho hoạt tính
cellulase cao nhất là 0,45 và 0,47 U/ml/min ở 35oC trong 48h. (báo cáo của Jaradat
et al) [20]
Theo nghiên cứu của Vyas et al thì (NH4)2SO4 và pepton là nguồn nitơ thích
hợp nhất cho với q trình sinh endocellulase và exocellulase khi ni cấy chủng vi
khuẩn thuộc chi B.subtilis trên môi trường lỏng [21].

Các chủng Pseudomonas sp phân lập từ ruột mối bởi Bholay và cộng sự thì
Amoni nitrat và Kali nitrat làm tăng khả năng sinh tổng hợp cellulase (Bholay et al,
2014) [15]. Amino acid cũng ảnh hưởng tới quá trình sinh tổng hợp cellulase và
theo báo cáo của Sharma et al thì alanine, L-asparagin cũng cho thấy làm tăng quá
trình sinh tổng hợp cellulase với chi thuộc Bacillus và Pseudomonas [22].
Nguồn cơ chất
Trong quá trình sinh tổng hợp cellulase thì việc sử dụng CMC, giấy lọc và
một số nguồn cellulose khác như là nguồn dinh dưỡng đồng thời là chất cảm ứng
quá trình sinh tổng hợp cellulase. Nồng độ cơ chất cellulose cũng đóng vai trị quan
trọng cho q trình sinh tổng hợp cellulase. Các nghiên cứu thường sử dụng các
nồng độ từ 0,5% - 5% cơ chất để khảo sát nồng độ tối ưu cho quá trình sinh tổng
hợp. (Nisha, 2015) [16]. Theo báo cáo của Das et al, lại cho thấy sử dụng CMC là
cơ chất cho quá trình sinh tổng hợp nhưng cũng nguồn cacbon duy nhất lại là tốt
nhất cho qúa trình sinh tổng hợp cellulase với chủng Bacillus sp (3,028µm/mg/min)
[23].
Các chất thải nơng nghiệp chi phí thấp như bã mía, lõi ngơ, vỏ khoai tây, vỏ
đậu,… được xác định là nguồn cơ chất tốt đối với sinh trưởng và sinh tổng hợp từ
C. cellulans [12]. Trong nghiên cứu của Jian-Min Song và cộng sự, bã mía được sử
dụng như nguồn cacbon chính trong mơi trường khống cơ bản M9 cũng cho hoạt
độ cellulase và xylanase tương đối cao [18].
Ngồi vai trị là nguồn dinh dưỡng đối với vi sinh vật, việc sử dụng các cơ
chất rắn còn trực tiếp thể hiện tiềm năng phân hủy sinh khối lignocellulose, góp
phần tận dụng hiệu quả nguồn thải từ các ngành nơng nghiệp [24].
1.1.4. Đặc tính của enzym cellulase từ vi khuẩn
Các đặc tính của cellulase rất đa dạng tùy thuộc vào nguồn thu nhận. Enzym
thu nhận từ các nguồn khác nhau thì các thơng số như pH tối ưu, nhiệt độ tối ưu,
khả năng chịu pH, nhiệt độ hay ảnh hưởng của các yếu tố hóa học, vật lý lên hoạt
độ enzym cũng khác nhau [25].
10

1.1.4.1. pH tối ưu và nhiệt độ tối ưu của enzym
Hầu hết cellulase được nghiên cứu có sự giống nhau về pH tối ưu, độ hòa
tan và thành phần amino acid nhưng độ bền nhiệt và độ đặc hiệu cơ chất có thể thay
đổi. Tuy nhiên, một điều đáng lưu ý là các enzym nghiên cứu cịn có thể có các hoạt
tính khác ngồi hoạt tính cellulase và đặc điểm này có thể ảnh hưởng đến chế phẩm
sản xuất. Các chế phẩm cellulase hoạt động hiệu quả trong khoảng pH 3-7, pH tối
ưu thường nằm trong khoảng 5-6, nhiệt độ tối ưu từ 40-50°C [26].
Hoạt độ của cellulase tạo thành từ vi sinh vật chịu sự ảnh hưởng của rất
nhiều yếu tố. Các nghiên cứu được tiến hành đã xác định ảnh hưởng của nồng độ cơ
chất, thời gian phản ứng enzym, tác động của các ion kim loại và chất hóa học,…
đến hoạt độ enzym. Tuy nhiên, pH, nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt, bền pH của
enzym là một trong các đặc tính quan trọng có tính ứng dụng cao nên đa số các
nghiên cứu tập trung xác định các yếu tố này [27].
pH và nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến hoạt độ và độ bền của enzym cellulase.
Trong nghiên cứu về tính chất của cellulase và xylanase sinh tổng hợp bởi
Cellulosimicrobium cellulans trên môi trường M9 có bổ sung bã sắn của Jian-Min
Song và Dong-Zhi Wei, cellulase tạo thành có pH tối ưu là 5, giữ được hoạt tính sau
8h ở nhiệt độ 30°C và 64% hoạt tính sau 1h ở 45°C. Các enzym bền nhiệt được chia
thành 3 nhóm tùy thuộc vào khoảng nhiệt độ bền của enzym: enzym có độ chịu
nhiệt vừa phải (moderately thermostable) (45-65°C), enzym bền nhiệt
(thermostable) (65-85°C) và enzym bền nhiệt cao (extremely thermostable)
(>85°C). Do đó, cellulase và xylanase tạo bởi C.cellulans có thể được phân loại
thuộc nhóm chịu nhiệt vừa phải. Về pH, nghiên cứu chỉ ra, cellulase tạo thành giữ
được hoạt tính tốt nhất ở pH 5 và hoạt tính suy giảm mạnh ở pH axit <3,4 [18].
Bảng 1.1: Đặc tính của cellulose và Xylanase từ C.cellulans [18]

Đặc điểm

Cellulase

Xylanase

pH tối ưu

5,0

5,6

Nhiệt độ tối ưu (ºC)

50

50

Hoạt độ (IU/ml)

0,03 ±0,001

0,7±0,02

11


Bảng 1.2 Tính bền nhiệt của cellulase và xylanase từ C.cellulans [18].

Thời gian

Họat độ cellulse, xylanase tương đối còn lại (%)
30 ºC

40 ºC

50ºC

1 giờ

94,91

64,87

25,13

6 giờ

80,92

55,68

10,13

Bảng 1.3 Tính bền pH của cellulase và xylanase từ C.cellulans [18].

Thời gian

Họat độ cellulse, xylanase tương đối còn lại (%)
pH 3,4

pH 5,0

pH 7,0

1 giờ

22,22

50,65

40,46

6 giờ

18,18

34,39

26,26

Yếu tố pH ngoài ảnh hưởng đến sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym của vi
sinh vật, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra pH kiềm yếu có vai trị nhất định trong xử lý
lignocellulose. Cụ thể, pH kiềm giúp nới lỏng thành tế bào của nguyên liệu
lignocellulose, làm tăng phần diện tích bề mặt bên trong mà enzyme có khả năng
tiếp cận, giảm sự polyme hóa, tinh thể hóa và làm tách các liên kết giữa lignin với
phần carbohydrat bên trong. Do đó, điều kiện pH kiềm yếu có thể cải thiện hiệu quả
quá trình phân hủy sinh khối lignocellulose [12].
1.1.4.2. Ảnh hưởng của các ion kim loại và các chất phụ gia đến hoạt độ enzym.
Cellulase bị ức chế bởi các sản phẩm phản ứng của nó như glucose,
cellobiose và bị ức chế hoàn toàn bởi Hg. Ngoài ra cellulase còn bị ức chế bởi các
ion kim loại khác như Mn, Ag, Zn nhưng ở mức độ nhẹ. Trọng lượng của enzym
cellulase thay đổi từ 30-110 KDa (beguin, 1990) [28].

Các ion kim loại có thể kìm hãm hoặc hoạt hóa sự hoạt động của các enzym.
Các ion kim loại nặng ở nồng độ nhất định có thể gây biến tính và kìm hãm khơng
thuận nghịch enzym. Theo Sharma và cộng sự nhận thấy, ion Ca2+ làm tăng hoạt
tính của cellulase từ Bacillus sp lên 40% so với đối chứng, còn Mg2+ làm giảm nhẹ
(hoạt tính cịn lại 92%) và Zn2+ ức chế hoạt tính của enzym này (hoạt tính cịn lại
bằng 37% so với đối chứng [22]. Với báo cáo của Nikky và cộng sự 201,
endoglucanase từ Pseudomonas bị kìm hãm khi có mặt Zn2+, Cu2+ và Fe2+ trong khi
Mn2+ làm tăng hoạt độ enzym [22].
Ngồi ra các dung mơi hữu cơ, các chất tẩy rửa cũng ảnh hưởng mạnh mẽ
đến hoạt tính của enzym. Tùy thuộc vào bản chất của các chất trên cũng như bản
chất của enzym mà tính chất và mức độ ảnh hưởng tới hoạt động của enzym là khác

12