Tài liệu Các phương pháp chẩn đoán bệnh cúm gia cầm ppt

Các phương pháp chẩn đoán bệnh cúm
Các phương pháp chẩn đoán bệnh cúm
gia cầm
gia cầm
Chẩn đoán huyết thanh học
Chẩn đoán huyết thanh học
•
Phản ứng ngưng kết hồng cầu gà (HA)
Phản ứng ngưng kết hồng cầu gà (HA)
•
Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà(HI)
Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà(HI)
Chẩn đoán virus học
Chẩn đoán virus học
•
Phưong pháp phân lập virus trên phôi trứng
Phưong pháp phân lập virus trên phôi trứng
•
Giám định virus bằng kỹ thuật PCR
Giám định virus bằng kỹ thuật PCR

Chẩn đoán virus học
Chẩn đoán virus học
Lấy mẫu và bảo quản bệnh phẩm
Lấy mẫu và bảo quản bệnh phẩm


•
Lấy mẫu ổ nhớp: Dịch ở nhớp được lấy bằng tăm
Lấy mẫu ổ nhớp: Dịch ở nhớp được lấy bằng tăm

bông tại lỗ huyệt , sau đó được đặt vào trong
bông tại lỗ huyệt , sau đó được đặt vào trong
ống nhựa đã khử trùng chứa 1-2 ml dung dịch
ống nhựa đã khử trùng chứa 1-2 ml dung dịch
bảo quản có kháng sinh liều cao để hạn chế sự
bảo quản có kháng sinh liều cao để hạn chế sự
phát triển của vi khuẩn .
phát triển của vi khuẩn .
•
Mẫu được giữ ở 40C và phải tiến hành phân lập
Mẫu được giữ ở 40C và phải tiến hành phân lập
virus trong phạm vi 48 giờ kể từ khi lấy mẫu ,
virus trong phạm vi 48 giờ kể từ khi lấy mẫu ,
nếu cần bảo quản trong thời gian dài hơn thì
nếu cần bảo quản trong thời gian dài hơn thì
phải giữ ở nhiệt độ -700 C
phải giữ ở nhiệt độ -700 C

Lấy mẫu và bảo quản bệnh phẩm
Lấy mẫu và bảo quản bệnh phẩm


•
Mẫu bệnh phẩm được pha trong PBS(pH 7,2)
Mẫu bệnh phẩm được pha trong PBS(pH 7,2)
thành huyễn dịch 10%
thành huyễn dịch 10%
•
Ly tâm huyễn dịch 1000vòng/phút thu dịch nổi
Ly tâm huyễn dịch 1000vòng/phút thu dịch nổi

•
Bổ sung kháng sinh 10 X (đặc 10 lần) gồm
Bổ sung kháng sinh 10 X (đặc 10 lần) gồm
Kanamycin, Penicilin, Steptomycin theo tỷ lệ
Kanamycin, Penicilin, Steptomycin theo tỷ lệ
1/10 vào huyễn dịch bệnh phẩm trên, để trong
1/10 vào huyễn dịch bệnh phẩm trên, để trong
tủ lạnh 40 C ít nhất trong vòng 2 giờ để kháng
tủ lạnh 40 C ít nhất trong vòng 2 giờ để kháng
sinh tác dụng. Các huyễn dịch bệnh phẩm nếu
sinh tác dụng. Các huyễn dịch bệnh phẩm nếu
không được xử lý kháng sinh thì có thể lọc qua
không được xử lý kháng sinh thì có thể lọc qua
màng lọc 0,45μm hoặc 0,22μm.
màng lọc 0,45μm hoặc 0,22μm.

Phân lập virus trên phôi gà
Phân lập virus trên phôi gà


•
Phân lập virus từ bệnh phẩm bằng cách tiêm
Phân lập virus từ bệnh phẩm bằng cách tiêm
vào túi niệu phôi gà 9-11 ngày tuổi
vào túi niệu phôi gà 9-11 ngày tuổi
•
Tiêm truyền trên phôi gà
Tiêm truyền trên phôi gà
•
Đặt trứng lên khay, xoay buồng hơi lên phía trên

Đặt trứng lên khay, xoay buồng hơi lên phía trên
•
Sát trùng vỏ trứng và đục một lỗ trên buồng hơi
Sát trùng vỏ trứng và đục một lỗ trên buồng hơi
•
Dùng syringen tiêm truyền bệnh phẩm theo lỗ
Dùng syringen tiêm truyền bệnh phẩm theo lỗ
đã đục vào túi niệu lượng 0,1-0,2 ml huyễn
đã đục vào túi niệu lượng 0,1-0,2 ml huyễn
dịch/trứng . Mỗi bệnh phẩm tiêm 3 trứng.
dịch/trứng . Mỗi bệnh phẩm tiêm 3 trứng.
•
Gắn lỗ tiêm bằng keo gắn vỏ trứng hoặc parafin
Gắn lỗ tiêm bằng keo gắn vỏ trứng hoặc parafin

Phân lập virus trên phôi gà
Phân lập virus trên phôi gà


•
Ấp trứng ở 370 C trong 7 ngày
Ấp trứng ở 370 C trong 7 ngày
•
Thu hoạch nước trứng
Thu hoạch nước trứng
•
Cất trứng vào tủ lạnh 40 C trong 4 giờ hoặc để trong tủ
Cất trứng vào tủ lạnh 40 C trong 4 giờ hoặc để trong tủ
ấm -200 C trong 30 phút .
ấm -200 C trong 30 phút .

•
Dùng panh kẹp hoặc kéo đầu nhọn mở nắp trứng ở phía
Dùng panh kẹp hoặc kéo đầu nhọn mở nắp trứng ở phía
buồng hơi
buồng hơi
•
Hút nước niệu mô bâừng pipet, cho vào ống nghiệm
Hút nước niệu mô bâừng pipet, cho vào ống nghiệm
10ml.
10ml.
•
Bảo quản nước trứng đã thu hoặch được trong tủ ấm
Bảo quản nước trứng đã thu hoặch được trong tủ ấm
-700 C
-700 C
•
Mẫu đã phân lập được kiểm tra bằng phản ứng HA. Nếu
Mẫu đã phân lập được kiểm tra bằng phản ứng HA. Nếu
âm tính có thể cấy chuyển trên phôi gà thêm 2-3 lần
âm tính có thể cấy chuyển trên phôi gà thêm 2-3 lần

Phản ứng RT-PCR
Phản ứng RT-PCR
Bước1: chiết tách RAN từ bệnh phẩm bằng TRIZOL
Bước1: chiết tách RAN từ bệnh phẩm bằng TRIZOL
•
Cho 750 μl bệnh phẩm vào ống 1,5 ml
Cho 750 μl bệnh phẩm vào ống 1,5 ml
•
Thêm 250 μl TRIZOL.

Thêm 250 μl TRIZOL.
•
Giữ 5 phút ở nhiệt độ phòng .
Giữ 5 phút ở nhiệt độ phòng .
•
Thêm 250 μl chlorofrom, đậy nắp chặt.
Thêm 250 μl chlorofrom, đậy nắp chặt.
•
Lắc ống trên máy lắc trong 15 giây.
Lắc ống trên máy lắc trong 15 giây.
•
Giữ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
Giữ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
•
Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút.
Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút.

Phản ứng RT-PCR
Phản ứng RT-PCR
Bước1: chiết tách RNA từ bệnh phẩm bằng TRIZOL
Bước1: chiết tách RNA từ bệnh phẩm bằng TRIZOL
•
Hút 450-500 μl sang một ống mới.
Hút 450-500 μl sang một ống mới.
•
Thêm 500 μl iso propanol, trộn bằng pipet rồi
Thêm 500 μl iso propanol, trộn bằng pipet rồi
giữ ở nhiệt độ phòng 10 phút.
giữ ở nhiệt độ phòng 10 phút.
•

Ly tâm với tốc độ 13000 vòng/ phút trong thời
Ly tâm với tốc độ 13000 vòng/ phút trong thời
gian 5 phút.
gian 5 phút.
•
Thêm 1ml ethanol 75% rồi ly tâm với tốc độ
Thêm 1ml ethanol 75% rồi ly tâm với tốc độ
10000 vòng/ phút trong thời gian 5 phút.
10000 vòng/ phút trong thời gian 5 phút.
•
Để khô ở nhiệt độ phòng .
Để khô ở nhiệt độ phòng .
•
Cho thêm 20 -60 μl nước.
Cho thêm 20 -60 μl nước.

Bước 2:Tiến hành RT-PCR ( 1 b ư ớc
Bước 2:Tiến hành RT-PCR ( 1 b ư ớc
)
)
Nguyên liệu
Nguyên liệu
:
:
•
Kit QIAGen Onestep RT-PCR (catalog #210212)
Kit QIAGen Onestep RT-PCR (catalog #210212)
gồm:
gồm:
•

Hỗn hợp enzyme QIAGen Onestep RT-PCR (chứa
Hỗn hợp enzyme QIAGen Onestep RT-PCR (chứa
Omn iscript TMRT, Sesicript TMRT và HotstarTaq
Omn iscript TMRT, Sesicript TMRT và HotstarTaq
TM DNA polymerase)
TM DNA polymerase)
•
Dung d ịch QIAGen Onestep RT-PCR, 5X.
Dung d ịch QIAGen Onestep RT-PCR, 5X.
•
Dung d ịch Q-solution- 5X.
Dung d ịch Q-solution- 5X.

Bước 2:Tiến hành RT-PCR ( 1 b ư ớc
Bước 2:Tiến hành RT-PCR ( 1 b ư ớc
)
)
•
Hỗn hợp dNTP,10mM mỗi loại .
Hỗn hợp dNTP,10mM mỗi loại .
•
Nước RNAse- Free.
Nước RNAse- Free.
•
Chất ức chế RNAse( 40U/ μl).
Chất ức chế RNAse( 40U/ μl).
•
Ông ly tâm nhỏ vô tr ùng 0,5ml.
Ông ly tâm nhỏ vô tr ùng 0,5ml.
•

Pipet và đầu tip các cỡ 10,20 và 100 μl.
Pipet và đầu tip các cỡ 10,20 và 100 μl.
•
Máy ly tâm ống nhỏ tốc độ 13000 vòng/ phút
Máy ly tâm ống nhỏ tốc độ 13000 vòng/ phút

Bước 2:Tiến hành RT-PCR ( 1 b ư ớc
Bước 2:Tiến hành RT-PCR ( 1 b ư ớc
)
)
•
Máy lắc vortex.
Máy lắc vortex.
•
Máy nhân gen .
Máy nhân gen .
•
RNA của virus kiểm tra .
RNA của virus kiểm tra .
•
RNA đối chứng dương tính .
RNA đối chứng dương tính .
•
Primer forward và primer reverse .
Primer forward và primer reverse .
•
Primer đặc hiệu H5N1: H5N1F và H5N1R.
Primer đặc hiệu H5N1: H5N1F và H5N1R.

Các bước tiến hành phản ứng PCR (1 bước )

Các bước tiến hành phản ứng PCR (1 bước )
•
đánh dấu c ác ống ly tâm nhỏ 0,5 ml A, B, C riêng rẽ.
đánh dấu c ác ống ly tâm nhỏ 0,5 ml A, B, C riêng rẽ.
•
Chuẩn bị hỗn hợp PCR như sau :
Chuẩn bị hỗn hợp PCR như sau :
•
Dung dịch 5XRT- PCR 10 μl.
Dung dịch 5XRT- PCR 10 μl.
•


10mM dNTPs 2 μl.
10mM dNTPs 2 μl.
•
Enzym hỗn hợp 2 μl.
Enzym hỗn hợp 2 μl.
•
Chất ức chế RNAse 0,25 μl.
Chất ức chế RNAse 0,25 μl.
•
Nước RNAse- free 31,75 μl.
Nước RNAse- free 31,75 μl.
•
Nhỏ 46 μl hỗn hợp PCR vào mỗi ống PCR
Nhỏ 46 μl hỗn hợp PCR vào mỗi ống PCR
•
Th êm 1 μl. Primer H5N1F v à H5N1R vào các ống A, B,C.
Th êm 1 μl. Primer H5N1F v à H5N1R vào các ống A, B,C.

•
Th êm 2 μl RAN ki ểm tra v ào c ác ống A
Th êm 2 μl RAN ki ểm tra v ào c ác ống A
•


2 μl RNA đối chứng H5N1 vào ống B
2 μl RNA đối chứng H5N1 vào ống B
•


2 μl nước RNAse – Free vào ống C
2 μl nước RNAse – Free vào ống C
•
Ly tâm nhẹ để dịch tập trung xuống đáy ống .
Ly tâm nhẹ để dịch tập trung xuống đáy ống .

Các bước tiến hành phản ứng PCR (1bước )
Các bước tiến hành phản ứng PCR (1bước )
•
Đặt các ống trong máy nhân gen , đặt chương trình để
Đặt các ống trong máy nhân gen , đặt chương trình để
nhân gen .
nhân gen .
–
60
60
o
o
C trong 1 phút

C trong 1 phút
–
42
42
o
o
C trong 0,5 phút
C trong 0,5 phút
–
42
42
o
o
C trong 10 phút
C trong 10 phút
–
50
50
0
0
C trong 30 phút
C trong 30 phút
–
95
95
0
0
C trong 15 phút
C trong 15 phút
–

94
94
0
0
C trong 30 giây (tách sợi )
C trong 30 giây (tách sợi )
–
50
50
0
0
C trong 30 giây (gắn primer)
C trong 30 giây (gắn primer)
–
72
72
0
0
C trong 1 phút
C trong 1 phút
–
Quay lại bước sáu 34 lần
Quay lại bước sáu 34 lần
–
72
72
0
0
C trong 10 phút
C trong 10 phút

•
4
4
0
0
C
C



Bước3: Chạy điện di sản phẩm PCR
Bước3: Chạy điện di sản phẩm PCR
Nguyên liệu
Nguyên liệu
.
.
•
Khay đổ khuôn thạch và buồng điện di
Khay đổ khuôn thạch và buồng điện di
•
Nguồn điện và điện cực
Nguồn điện và điện cực
•
Đèn cực tím cầm tay(302 nm) hoặc hộp đèn cực tím
Đèn cực tím cầm tay(302 nm) hoặc hộp đèn cực tím
•
Máy ảnh và phim
Máy ảnh và phim
•
Pipette và đầu tip 10 μl.

Pipette và đầu tip 10 μl.
•
Thạch agarose 0,8% pha trong dung dịch TBE 1X( Invitrogen)
Thạch agarose 0,8% pha trong dung dịch TBE 1X( Invitrogen)
•
Dung d ịch TBE 1X
Dung d ịch TBE 1X
•
Ethidium bromide ( 10μg/ μl.)
Ethidium bromide ( 10μg/ μl.)
•
Dung dịch nạp thạch (GLB: 30% glycogen; 0,25% BPB v à 0,25%
Dung dịch nạp thạch (GLB: 30% glycogen; 0,25% BPB v à 0,25%
XC)
XC)
•
M arker trọng lượng phân tử ( thang DNA 100bp) (invitrogen)
M arker trọng lượng phân tử ( thang DNA 100bp) (invitrogen)
•
Ống microtube chứa sản phẩm PCR
Ống microtube chứa sản phẩm PCR
•
DNA đối chứng dương tính
DNA đối chứng dương tính

Các bước tiến hành
Các bước tiến hành
•
Lấy một miếng thạch 0,8% từ khuôn ra đặt vào
Lấy một miếng thạch 0,8% từ khuôn ra đặt vào

buồng điện di, đổ dung dịch TBE 1X che phủ lớp
buồng điện di, đổ dung dịch TBE 1X che phủ lớp
thạch
thạch
•
Đánh dấu các ống ly tâm nhỏ 0,5 ml a, b, c
Đánh dấu các ống ly tâm nhỏ 0,5 ml a, b, c
•
Lấy 5 μl các sản phẩm PCR từ các ống phản ứng
Lấy 5 μl các sản phẩm PCR từ các ống phản ứng
vào các ống ly tâm nhỏ tương ứng , trộn với 2μl
vào các ống ly tâm nhỏ tương ứng , trộn với 2μl
dung dịch nạp(GLB)
dung dịch nạp(GLB)
•
Cho 5μl marker trọng lượng phân tử vào giếng
Cho 5μl marker trọng lượng phân tử vào giếng
thứ nhất của miếng thạch 1,5%
thứ nhất của miếng thạch 1,5%

Các bước tiến hành
Các bước tiến hành
•
Cho 7μl sản phẩm PCR/GLB từ các ống ly tâm
Cho 7μl sản phẩm PCR/GLB từ các ống ly tâm
nhỏ vào các giếng 2, 3, 4, …10 của miếng thạch
nhỏ vào các giếng 2, 3, 4, …10 của miếng thạch
theo thứ tự từ a đến c
theo thứ tự từ a đến c
•

Đóng nắp buồng điện di và cực nối điện , chạy
Đóng nắp buồng điện di và cực nối điện , chạy
điện di ở điện thế 120V trong 30- 40 phút
điện di ở điện thế 120V trong 30- 40 phút
•
Đọc kết quả của marker và vạch của sản phẩm
Đọc kết quả của marker và vạch của sản phẩm
PCR với đèn cực tím cầm tay với ánh sáng cực
PCR với đèn cực tím cầm tay với ánh sáng cực
tím có bước sóng 302nm
tím có bước sóng 302nm
•
Ghi lại hình bằng máy ảnh
Ghi lại hình bằng máy ảnh

Các hoá chất sử dụng trong xét nghiệm phân
Các hoá chất sử dụng trong xét nghiệm phân
tử
tử
•
Thạch agarose 0,8% : 0,8 g thạch agarose trong
Thạch agarose 0,8% : 0,8 g thạch agarose trong
100ml dung dịch TBE 1X , đun nóng bằng water
100ml dung dịch TBE 1X , đun nóng bằng water
bath hoặc lò vi sóng đến khi hoà tan
bath hoặc lò vi sóng đến khi hoà tan
•
Ethidium Bromide (EB): sử dụng dung dịch gốc
Ethidium Bromide (EB): sử dụng dung dịch gốc
10μg/μl đổ vào thạch agarose để có hàm lượng

10μg/μl đổ vào thạch agarose để có hàm lượng
cuối cùng là 0,5μg/ml
cuối cùng là 0,5μg/ml
•
Bromophenol Blue(BPB): BPB là một thành phần
Bromophenol Blue(BPB): BPB là một thành phần
của dung dịch nạp (GLB), BPB được sử dụng
của dung dịch nạp (GLB), BPB được sử dụng
rộng rãi như một chất thuốc nhuộm điện di cho
rộng rãi như một chất thuốc nhuộm điện di cho
axit
axit