ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI THUỐC TRỪ sâu CHLORPYRIFOS của một số CHỦNG VI KHUẨN PHÂN lập từ đất NÔNG NGHIỆP

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC
---------

Nguyễn Tiến Quân

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI THUỐC TRỪ SÂU
CHLORPYRIFOS CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN PHÂN
LẬP TỪ ĐẤT NƠNG NGHIỆP

Khóa luận tốt nghiệp đại học hệ chính quy
Ngành: Cơng nghệ sinh học
Chun ngành: Vi sinh vật học
Khóa: QHT.2017
(Chương trình đào tạo chuẩn)

Hà Nội - 2021


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC
---------

Nguyễn Tiến Quân

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI THUỐC TRỪ SÂU
CHLORPYRIFOS CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN PHÂN
LẬP TỪ ĐẤT NƠNG NGHIỆP

Khóa luận tốt nghiệp đại học hệ chính quy
Ngành: Cơng nghệ sinh học
Chun ngành: Vi sinh vật học
Khóa: QHT.2017
(Chương trình đào tạo chuẩn)
Cán bộ hướng dẫn: TS. Lê Hữu Cường
TS. Phạm Thanh Hiền
Hà Nội - 2021


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Lê Hữu
Cường (cán bộ hướng dẫn chính), TS. Trần Thị Như Hằng, T.S Hoàng Kim
Chi, TS. Trần Thị Hồng Hà cùng toàn thể các bộ phịng Sinh học thực nghiệm Viện hóa học các hợp chất thiên nhiên - Viện hàn lâm khoa học và cơng nghệ Việt
Nam đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo em trong suốt quá trình thực tập, giúp em
hoàn thiện được các kĩ năng và kiến thức chuyên ngành
Em cũng xin được bày tỏ lòng biết ơn đến TS. Phạm Thanh Hiền - Bộ
môn Vi sinh, Khoa Sinh học, Trường đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc
gia Hà Nội đã tận tình quan tâm giúp đỡ và giải đáp những vướng mắc của em
trong suốt q trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
Cuối cùng em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân,bạn
bè. Những người đã định hướng, ủng hộ, tạo động lực trong những lúc khó khăn
nhất để em có thể tiếp tục phấn đấu học tập, theo đuổi đam mê nghiên cứu khoa
học cũng như hồn thiện khóa luận tốt nghiệp này.
Em xin chân thành cảm ơn !

Sinh viên
Nguyễn Tiến Quân

DANH SÁCH HÌNH
Hình 1. Cơng thức cấu tạo của chlorpyrifos .......................................................... 5
Hình 2. Một số sản phẩm thuốc trừ sâu chứa hoạt chất chlorpyrifos được sử dụng
phổ biến .................................................................................................................. 6
Hình 3. Con đường chuyển hóa tổng quát của chlorpyrifos ................................. 9
Hình 4. Q trình chuyển hóa của chlorpyrifos dưới tác động của enzyme vi sinh
vật ......................................................................................................................... 11
Hình 5. Một số địa điểm thu mẫu ........................................................................ 14
Hình 6. Hình ảnh một số chủng vi khuẩn sau khi phân lập từ mẫu đất .............. 20
Hình 7. Đồ thị khảo sát độ hấp thụ của chlorpyrifos tại các bước sóng trong khoảng
210 – 400 nm ........................................................................................................ 21
Hình 8. Đồ thị hàm số tuyến tính giữa nồng độ chất chuẩn chlorpyrifos và giá trị
đo OD tại bước sóng 294 nm ............................................................................... 22
Hình 9. Độ hấp thụ quang tại bước sóng 294nm của chlorpyrifos chiết từ mẫu
dịch nuôi vi khuẩn và mẫu đối chứng qua 15 ngày ni lắc................................ 23
Hình 10. Khả năng phân giải chlorpyrifos của các chủng vi khuẩn phân lập..... 24
Hình 11. Khả năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn C3 trong mơi MSM có bổ
sung 100 μg/mL chlorpyrifos ............................................................................... 25
Hình 12. Ảnh điện di sản phẩm sau khi khuếch đại gen 16S rRNA của vi khuẩn
C3 ......................................................................................................................... 27
Hình 13. Cây phân loại chủng C3 dựa trên trình tự 16S rRNA gene, sử dụng phần
mềm MEGA7, phương pháp Neighbor Joining Tree, giá trị bootstrap 100 ........ 28


DANH SÁCH BẢNG
Bảng 1. Mơ tả hình thái khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn đã được phân lập ... 20
Bảng 2. Dư lượng chlorpyrifos ở mẫu đối chứng và các mẫu thí nghiệm .......... 23
Bảng 3. Hình ảnh khuẩn lạc và tế bào của chủng vi khuẩn C3 ........................... 26
Bảng 4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn C3 ............................... 28
Bảng 5. Giá trị hàm lượng chlorpyrifos cịn lại trong đất sau 15 ngày có bổ sung

chủng C3 được xác định bằng phương pháp GC/MS .......................................... 29


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Từ viết tắt
OP

Tên tiếng Anh
Organo phosphate

BVTV

Tên tiếng Việt
Thuốc trừ sâu nhóm phospho
hữu cơ
Thuốc bảo vệ thực vật

UV

UltraViolet

Tia cực tím / tia tử ngoại

LD50

Lethal concentration 50

Liều lượng gây chết 50%

WHO

World Health Organization

Tổ chức Y tế Thế giới

ADI

Acceptable Daily Intake

Lượng ăn vào hàng ngày có thể
chấp nhận được tính theo mg/kg
khối lượng cơ thể

EC

Emulsifiable Concentrate

Dạng nhũ tương đậm đặc

US.EPA

United States Environmental
Protection Agency

Cục bảo vệ môi trường Hoa kỳ

GC-MS

Gas Chromatography-Mass

Spectrometry

Sắc ký khí ghép khối phổ

OD

Optical Density

Mật độ quang


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ................................................................................ 2
1.1. Giới thiệu về thuốc trừ sâu phospho hữu cơ .............................................. 2
1.2. Các phương pháp xử lý ô nhiễm thuốc trừ sâu phospho hữu cơ hiện nay
................................................................................................................................ 2
1.3. Giới thiệu về hoạt chất thuốc trừ sâu chlorpyrifos .................................... 4
1.3.1. Lịch sử ra đời của hoạt chất chlorpyrifos ................................................. 4
1.3.2. Đặc điểm & tính chất của chlorpyrifos ..................................................... 5
1.3.3. Tình hình sử dụng thuốc trừ sâu chlorpyrifos........................................... 6
1.3.4. Tác động của chlorpyrifos đến môi trường và sức khỏe con người ......... 7
1.3.4.1. Ảnh hưởng của chlorpyrifos đối với môi trường................................ 7
1.3.4.2. Ảnh hưởng của chlorpyrifos đến sức khỏe con người........................ 8
1.3.5. Sự phân hủy và chuyển hóa của chlorpyrifos trong đất............................ 8
1.4. Một số kết quả nghiên cứu về các loài vi khuẩn có khả năng phân hủy
chlorpyrifos và tiềm năng ứng dụng trong xử lý ô nhiễm thuốc trừ sâu ...... 10
1.4.1. Các nghiên cứu trên thế giới ................................................................... 10
1.4.2. Các nghiên cứu tại Việt Nam .................................................................. 10
1.5. Enzyme phân giải chlorpyrifos của vi khuẩn ........................................... 11

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 13
2.1. Đối tượng nghiên cứu.................................................................................. 13
2.2. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất sử dụng trong thí nghiệm ......................... 13
2.2.1. Dụng cụ ................................................................................................... 13
2.2.2. Thiết bị .................................................................................................... 13


2.2.3. Hóa chất .................................................................................................. 13
2.3. Phương pháp nghiên cứu............................................................................ 14
2.3.1. Thu mẫu đất ............................................................................................ 14
2.3.2. Phân lập vi khuẩn có khả năng phân giải chlorpyrifos từ mẫu đất thu thập
........................................................................................................................... 14
2.3.3. Đánh giá khả năng phân hủy chlorpyrifos của vi khuẩn trong mơi trường
khống tối thiểu ................................................................................................. 15
2.3.4. Đánh giá khả năng sinh trưởng của vi khuẩn C3 trong môi trường MSM
có bổ sung chlorpyrifos ..................................................................................... 16
2.3.5. Phân loại và định danh vi khuẩn dựa trên đặc điểm hình thái và so sánh
trình tự gen 16S rRNA ...................................................................................... 17
2.3.5.1. Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc chủng vi khuẩn phân lập..... 17
2.3.5.2. Khảo sát đặc tính sinh lý sinh hóa của chủng vi khuẩn phân lập ..... 17
2.3.5.3. Định danh vi khuẩn dựa trên trình tự gen mã hóa 16S rRNA .......... 17
2.3.6. Đánh giá khả năng khả năng phân giải chlorpyrifos của vi khuẩn trong đất
........................................................................................................................... 19
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................... 20
3.1. Kết quả phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn từ mẫu đất ô nhiễm
chlorpyrifos ......................................................................................................... 20
3.2. Kết quả khả năng phân hủy chlorpyrifos của các chủng vi khuẩn trong
mơi trường khống tối thiểu.............................................................................. 21
3.3. Kết quả khả năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn trong môi trường
MSM chứa chlorpyrifos ..................................................................................... 24

3.4. Phân loại và định danh chủng vi khuẩn C3.............................................. 26
3.4.1. Đặc điểm hình thái của chủng vi khuẩn C3 ............................................ 26


3.4.2. Định danh chủng vi khuẩn C3 dựa trên trình tự gen 16S rRNA ............ 27
3.4.3. Một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn C3 .................... 28
3.5. Hiệu quả phân giải chlorpyrifos của chủng vi khuẩn C3 trong đất....... 29
KẾT LUẬN ......................................................................................................... 31
KIẾN NGHỊ ........................................................................................................ 31
PHỤ LỤC ............................................................................................................ 32
TÀI LIỆU THAM KHẢO: ................................................................................ 34


MỞ ĐẦU
Các hóa chất thuốc BVTV là một trong những nhân tố khơng thể thiếu trong
q trình sản xuất nơng nghiệp nhằm ổn định năng suất, nâng cao chất lượng cây
trồng. Tại Việt Nam, theo thông tư của Bộ NN&PTNT, năm 2016, đã có 165/775
loại thuốc BVTV đã đăng ký chứa thành phần chứa hoạt chất chlorpyrifos. Do giá
thành rẻ, phổ tác dụng rộng nên các sản phẩm chứa chlorpyrifos được sử dụng
rộng rãi nhằm tiêu diệt côn trùng gây hại trong ngành nông nghiệp và phi nông
nghiệp. Hậu quả của việc sử dụng liên tục và quá mức đã dẫn đến tình trạng tồn
dư hóa chất chlorpyrifos trong đất, nước cũng như trên các sản phẩm nông nghiệp,
đe dọa nghiêm trọng tới môi trường, hệ sinh vật và sức khỏe con người.
Việc loại bỏ tồn dư của chlorpyrifos khỏi các khu vực ô nghiễm là điều cần
thiết hiện nay. Trong số các phương pháp đã được nghiên cứu để khắc phục tình
trạng ơ nhiễm này, xử lý sinh học sử dụng vi sinh vật có khả năng phân giải
chlorpyrifos được cho là một cách tiếp cận đầy hứa hẹn, chi phí thấp và thân thiện
với mơi trường. Một số vi khuẩn như Bacillus licheniformis Zhu1 [28],
Pseudomonas syringae CM-Z6 [29], Achromobacter xylosoxidans JCp4…[1] đã
được nghiên cứu cho thấy hiệu quả cao, làm giảm đến 99% dư lượng chlorpyrifos

trong đất chứng tỏ tiềm năng của vi khuẩn trong xử lý ô nhiễm thuốc trừ sâu
chlorpyrifos.
Do đó, đề tài “Đánh giá khả năng phân giải thuốc trừ sâu chlorpyrifos
của một số chủng vi khuẩn phân lập từ đất nông nghiệp” được thực hiện với
mục tiêu:
➢ Phân lập chủng vi khuẩn phân hủy thuốc trừ sâu chứa hoạt chất chlorpyrifos
từ đất canh tác nơng nghiệp tại một số tỉnh thành: Thái Bình, Hải Dương,
Thái Nguyên, Hải Phòng
➢ Đánh giá hiệu quả phân giải thuốc trừ sâu chlorpyrifos của chủng vi khuẩn
phân lập

1


Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về thuốc trừ sâu phospho hữu cơ
Thuốc trừ sâu phospho hữu cơ hay organo phosphate (OP) được ra đời từ
những năm đầu thế kỷ 19. Chúng là dẫn xuất của các ester trung tính hay amid
của phosphoric acid có chứa gốc (P-O) hay thiophosphoryl (P-S). Thuốc trừ sâu
gốc phospho hữu cơ là một trong số các loại thuốc trừ sâu hóa học được sử dụng
phổ biến trên thế giới trong cả lĩnh vực nông nghiệp, phi nông nghiệp. Với khả
năng tiêu diệt nhanh và hiệu quả với hầu hết các loại côn trùng gây bệnh cho cây
trồng, nhóm thuốc trừ sâu gốc phospho hữu cơ là yếu tố chính góp phần nâng cao
sản lượng lương thực trong q trình sản xuất nơng nghiệp. [14]
Do cơ chế hoạt động của chúng là gây độc thần kinh, ức chế enzyme
acetylcholinesterase tham gia kiểm sốt các tín hiệu thần kinh. Vì thế các thuốc
trừ sâu OP được tổ chức WHO phân vào nhóm độc loại II, loại Ib. Việc sử dụng
thuốc trừ sâu OP không hợp lý sẽ gây những tác động có hại đến nhiều lồi thiên
địch, các lồi sinh vật khơng thuộc đối tượng phịng trừ, dẫn đến mất cân bằng

sinh thái trong tự nhiên. Ở người, khi nhiễm độc thuốc trừ sâu OP có thể dẫn đến
nguy cơ mắc các bệnh về hệ thần kinh (rối loạn trí nhớ, giảm chỉ số IQ), gây ra
các di tật bẩm sinh ở trẻ nhỏ, các cơ quan bài tiết trong cơ thể như gan, thận bị
nhiễm độc dễ dẫn đến khả năng gây ung thư [14]
1.2. Các phương pháp xử lý ô nhiễm thuốc trừ sâu phospho hữu cơ hiện nay
Để hạn chế những rủi ro tác động của thuốc trừ sâu OP tới môi trường và
sức khỏe con người thì việc nghiên cứu các phương pháp làm giảm nồng độ, độc
tính của dư lượng thuốc trừ sâu OP là vô cùng cần thiết. Các phương pháp đã được
nghiên cứu gồm có:
Phương pháp Ozon hóa kết hợp với chiếu tia UV: là phương pháp giúp phân
hủy các chất thải hữu cơ (trong đó có thuốc trừ sâu phospho hữu cơ) trong dung
dịch hoặc dung môi. [11]

2


 Ưu điểm: sử dụng các thiết bị gọn nhẹ với giá cả vận hành thấp, chất thải ra môi
trường sau khi xử lý thường ít độc và có thời gian phân hủy ngắn.
 Nhược điểm: chỉ có khả năng xử lý chất thải tại pha lỏng, khí. Nếu áp dụng để
xử lý ơ nhiễm đất thì lớp đất trực tiếp được tia UV chiếu khơng dày hơn 5mm
do đó không đem hiệu quả xử lý dư lượng thuốc trừ sâu OP trong đất.
Phương pháp sử dụng sóng Plassma: là phương pháp được tiến hành trong
thiết bị cấu tạo đặc biệt, thuốc trừ sâu OP được dẫn qua ống phản ứng là Detector
Plasma sinh ra sóng phát xạ electron cực ngắn (vi sóng). Sóng phát xạ electron tác
dụng vào các phân tử hữu cơ tạo ra nhóm gốc tự do và sau đó hình thành các phản
ứng tạo SO2 , CO2 , HPO32-, Cl2, Br2... (sản phẩm tạo ra phụ thuộc vào bản chất
của hoạt chất trong thuốc trừ sâu OP). [11]
 Ưu điểm: hiệu suất xử lý cao, thiết bị gọn nhẹ, khí thải sau khi được xử lý an
tồn với mơi trường.
 Nhược điểm: chi phí cho một quy trình xử lý là rất tốn kém, xử lý hiệu quả dư

lượng thuốc trừ sâu trong pha lỏng và pha khí.
Phương pháp cơ lập đất ơ nhiễm thuốc trừ sâu kết hợp phân hủy hóa học: là
phương pháp sử dụng các loại vật liệu có độ chống thấm, độ bền cao để ngăn chặn
sự lan tỏa của chất gây ô nhiễm ra môi trường xung quanh đồng thời bổ sung các
hóa chất thích hợp (vật liệu hấp phụ bentonite) để phân hủy hoá chất BVTV và đất
nhiễm đã cách ly. [11]
 Ưu điểm: các phản ứng hóa học quá trình phân hủy thuốc trừ sâu xảy ra trong
điều kiện kín khơng phát tán ra mơi trường khơng khí xung quanh, đồng thời
khơng là rị rỉ chất ơ nhiễm vào các lớp đất sâu hay mạch nước ngầm.
 Nhược điểm: Thời gian phân hủy đất ô nhiễm thuốc trừ sâu sau khi mang đi
chôn lấp là rất lâu.
Phương pháp phân giải thuốc trừ sâu OP dưới tác động của vi sinh vật: là
phương pháp tận dụng khả năng chuyển hóa, khống hóa các hợp chất thuốc trừ
sâu phospho hữu cơ của các vi sinh vật trong tự nhiên bằng cách tiết ra các enzyme
xúc tác quá trình thủy phân cắt đứt liên kết P-O, P-N, P-S,..của các hợp chất OP.
3


Q trình này có thể dẫn đến sự khử độc một phần hoặc hồn tồn chất ơ nhiễm
và làm giảm tác động của thuốc trừ sâu OP trong đất, trong nước, khắc phục được
nhược điểm của các phương pháp vật lý và hóa học đã nêu trên. Một số nghiên
cứu phân lập vi sinh vật từ đất ô nhiễm thuốc trừ sâu OP, tuyển chọn những chủng
vi khuẩn có hoạt tính enzyme cao giúp phân giải nhanh và hiệu quả các hoạt chất
trong nhóm thuốc trừ sâu OP. Các chủng vi khuẩn đã được nghiên cứu, công bố
liên quan tới khả năng phân giải thuốc trừ sâu OP bao gồm: Pseudomonas
diminuta, Flavobacterium sp. ATCC-27551, Enterobacter sp., Flavobacterium
balustinum,.. [20] Tại Việt Nam, một số chủng vi phân giải thuốc trừ sâu OP gồm:
Achromobacter sp., Demetria terragena, Burkholderia sp.,.. cũng đã được phân
lập và nghiên cứu cho khả năng phân giải hoạt chất thuốc trừ sâu OP lần lượt là
13,96%, 49,72% và 57.71%. [21]

 Ưu điểm: là giải pháp xử lý ô nhiễm thuốc trừ sâu có tiềm năng ứng dụng cao,
thân thiện với mơi trường, chí phí xử lý thấp, xử lý hiệu quả dư lượng thuốc trừ
sâu OP trong cả môi trường lỏng và trong đất. [4]
 Nhược điểm: hiệu quả xử lý phụ thuộc vào các điều kiện môi trường tại nơi
được áp dụng. Sự có mặt của các kim loại nặng hay nhiều thành phần chất ô
nhiễm với nồng độ cao có thể gây ức chế, kìm hãm sự phát triển của các chủng
vi khuẩn đưa vào môi trường hoặc các chủng có sẵn trong tự nhiên, giảm đáng
kể ý nghĩa thực tế của phương pháp xử lý sinh học. [11]
1.3. Giới thiệu về hoạt chất thuốc trừ sâu chlorpyrifos
1.3.1. Lịch sử ra đời của hoạt chất chlorpyrifos
Chlorpyrifos là hợp chất hữu cơ được nghiên cứu và sáng chế lần đầu vào
năm 1965 bởi cơng ty hóa chất Dow, Hoa Kỳ. Đến nay, các sản phẩm thuốc trừ
sâu chứa hoạt chất chlorpyrifos đã có mặt trên thị trường gần 60 năm và được
đăng kí sử dụng tại hơn 100 quốc gia trên thế giới, bao gồm các quốc gia phát
triển như: Hoa Kỳ, Úc, Canada, Pháp, Ý, Nhật Bản, New Zealand, Tây Ban Nha,
Vương quốc Anh,…Do đó chlorpyrifos được xem là một trong số các hoạt chất
thuốc trừ sâu nhóm phospho hữu cơ hoạt chất lâu đời và được sử dụng phổ biến

4


nhất trong lĩnh vực nông nghiệp với tác dụng tiêu diệt nhiều lồi cơn trùng, sâu
bọ gây hại cho cây trồng. [30]
1.3.2. Đặc điểm & tính chất của chlorpyrifos
Chlorpyrifos là hoạt chất thuốc trừ sâu gốc lân hữu cơ hay cịn có tên gọi
khác như Lorsban, Sanpyrifos, Dusban, Chlorpyrifos ethyl,..Tên gọi theo IUPAC
là: O,O-diethyl O-3,5,6-trichloro-2-pyridyl phosphorothiot, cơng thức hóa học
của chlorpyrifos là C₉H₁₁Cl₃NO₃PS, khối lượng phân tử: 350.62 g/mol. [31]

Hình 1. Cơng thức cấu tạo của chlorpyrifos

Chlorpyrifos có dạng tinh thể màu trắng, có mùi thoảng như mùi của các
hợp chất chứa nhóm thiol (-SH), tương tự mùi của các hợp chất lưu huỳnh được
tìm thấy trong trứng thối, tỏi, hành tây thối. Chlorpyrifos có nhiệt độ nóng chảy
từ 42 - 45⁰C, áp suất hơi 1,87 × 10−5 mmHg ở 25⁰C, có độ tan ít trong nước (1,4
mg/L ở 25⁰C) nhưng tan tốt trong các dung môi hữu cơ như: benzen, acetone,
chloroform, dichlormethane, methanol, diethyl ether,.. [16]
Chlorpyrifos được xếp vào nhóm chất độc loại (II) (theo hệ thống phân
chia nhóm độc của Tổ chức Y tế thế giới, WHO). Độ độc cấp tính của chlopyrifos
được nghiên cứu ở chuột với giá trị LD50 peros (xâm nhập qua miệng vào đường
ruột) là 135-163 mg/kg và LD50 dermal (xâm nhập qua da) là 2000 mg/kg ở dạng
lỏng [32]. Ở người lượng ăn vào hàng ngày có thể chấp nhận được tính theo mg/kg
khối lượng cơ thể (ADI) là ÷ 0.01 mg/kg. [15]
Cơ chế tiêu diệt sâu hại của chlorpyrifos được diễn ra theo cơ chế bám cạnh
tranh vào vị trí hoạt động của enzyme acetylcholine esterase (enzyme có nhiệm

5


vụ giải phóng một phần acetylcholine trong q trình dẫn truyền thần kinh), khi
acetylcholine esterase bị phosphoryl hóa. Acetylcholine khơng được giải phóng
sẽ được tích lũy q mức gây ra các triệu chứng như co giật, tê liệt và cuối cùng
là tử vong. [9]
Chlorpyrifos là hoạt chất thuốc trừ sâu có phổ tác động rộng, có khả năng
tiêu diệt được nhiều loại côn trùng, sâu bệnh như: rệp sáp, rệp muội, mối, sâu đục
thân, sâu đục cành, sâu đục quả, sâu cuốn lá, sâu tơ, sâu khoang, rầy nâu, bọ trĩ,
bọ xít,..trên các cây lương thực, cây cơng nghiệp phổ biến như: lúa, chè,.. Ngoài
ra, các một số thương phẩm có chứa hoạt chất chlorpyrifos cịn được sử dụng để
diệt trừ mối mọt đối với các cơng trình, nhà xưởng sản xuất gỗ. [33]
Một số sản phẩm thương mại có chứa hoạt chất Chlorpyrifos hoặc dạng hỗn
hợp với Cypermethrin, Dimethoat, Diflubenzuron...được kinh doanh & sử dụng

phổ biến trên thị trường như: Palace 600EC, Babsac 750EC, Wavotox 600EC,
Sairifos 585EC, Anboom 48EC, Overagon 695EC, Classico 480EC, Dursban
40EC… [34]

Hình 2. Một số sản phẩm thuốc trừ sâu chứa hoạt chất chlorpyrifos được sử
dụng phổ biến [34]
1.3.3. Tình hình sử dụng thuốc trừ sâu chlorpyrifos
• Trên thế giới:

6


Trong các loại thuốc trừ sâu thuộc nhóm lân hữu cơ, chlorpyrifos được sử
dụng rộng rãi và phổ biến do tính hiệu quả và độ ổn định của thuốc. Theo US
EPA, năm 2002, đã có hơn 400 sản phẩm đăng ký được bán trên thị trường để
phục vụ cho mục đích kiểm sốt dịch hại nơng nghiệp và cơng nghiệp. Số lượng
chlorpyrifos được sử dụng trên toàn cầu từ năm 2002 đến năm 2006 là 25 nghìn
tấn hoạt chất, trong đó 98,5% được sử dụng cho mục đích nơng nghiệp. [7]
• Tại Việt Nam:
Hằng năm nước ta nhập khẩu và sử dụng từ 70.000 đến 100.000 tấn thuốc
bảo vệ thực vật, trong đó riêng thuốc trừ sâu chiếm 20,4%. Thuốc bảo vệ thực vật
nhập vào nước ta chủ yếu từ các nước như: Trung Quốc, Ấn Độ, Nhật Bản,
Đức,...trong đó nhập khẩu từ Trung Quốc với 57.25% tổng kim ngạch nhập khẩu
(tức khoảng 151,6 triệu USD) và Ấn Độ với 5,47% (tức khoảng 14,5 triệu USD).
[35]. Theo thông tư của Bộ NN&PTNT, năm 2016, đã có tới 165 loại chứa hoạt
chất chlorpyrifos trong số 775 loại thuốc BVTV được phép sử dụng tại Việt Nam.
[38] Tuy nhiên ở nước ta hiện chưa có thống kê cụ thể về tình hình sử dụng
chlorpyrifos tại các khu vực canh tác khác nhau. Chlorpyrifos được sử dụng tùy
thuộc vào tình hình sâu bệnh cũng như sự lựa chọn của nông dân về các loại thuốc
cần phòng trị. Đến năm 2019, Bộ NN&PTNT ban hành quyết định số 501/QĐBNN-BVTV về việc loại bỏ hoạt chất chlorpyrifos và fipronil ra khỏi danh mục

thuốc bảo vệ thực vật được phép sử dụng tại Việt Nam. [36]
1.3.4. Tác động của chlorpyrifos đến môi trường và sức khỏe con người
1.3.4.1. Ảnh hưởng của chlorpyrifos đối với môi trường
Thuốc trừ sâu chlorpyrifos sau khi được phun rải, bón trên đối tượng cây
trồng, sẽ bị giữ lại một phần trong đất. Qua thời gian tích lũy, nồng độ chlorpyrifos
trong đất tăng dần theo thời gian sẽ gây ức chế quá trình sinh trưởng, phát triển
và giết chết nhiều sinh vật có lợi trong đất. Ngồi ra, việc tiêu hủy bao bì chai lọ,
sục rửa các dụng cụ chứa thuốc diễn ra tại các kênh rạch trên đồng ruộng gây ô
nhiễm tầng nước mặt tác động trực tiếp đến sự sống của các loài thủy sinh. [15]

7


Do thuốc trừ sâu chlorpyrifos có phổ tác động rộng nên ngoài khả năng tiêu
diệt các đối tượng sâu bệnh gây bệnh trên cây trồng, chúng còn gây ảnh hưởng
tiêu cực đến sự sống của những loài sinh vật khác trong tự nhiên (ong, chim, cơn
trùng,...) từ đó làm giảm số lượng thành phần loài trong tự nhiên, phá vỡ trạng
thái ổn định của hệ sinh thái. [14]
1.3.4.2. Ảnh hưởng của chlorpyrifos đến sức khỏe con người
Theo Cơ quan Bảo vệ Mơi trường Hoa Kỳ (EPA), chlorpyrifos có tính độc
trung bình đối với con người khi tiếp xúc qua đường miệng, da, và đường hô hấp,
ở liều lượng thấp đẫn đến các triệu chứng ngắn hạn bao gồm: nhức đầu, mờ mắt,
buồn nôn, mỏi cơ, tiêu chảy,..Tuy nhiên khi nhiễm độc ở liều lượng cao có thể
dẫn đến tê liệt hô hấp và tử vong. Khi chlorpyrifos xâm nhập vào cơ thể, nó được
chuyển hóa thành một chất có độc tính cao hơn là chlorpyrifos oxon. Do chất này
ức chế AChE (tín hiệu thần kinh), nó có thể, gây ra các tác động có hại đến hệ
thần kinh và sức khỏe con người. [24] Một số ảnh hưởng lâu dài mà chlorpyrifos
tác động đến sức khỏe con người đã được các nhà khoa học nghiên cứu và chỉ ra
gồm: gây rối loạn hormone tuyến nội tiết, tinh trùng phát triển khơng bình thường
gây ảnh hưởng đến hệ thống sinh sản ở nam giới [5], làm giảm hoạt tính enzyme

cholinesterase trong máu, chậm phát triển thể chất và trí tuệ ở trẻ nhỏ, làm giảm
trọng lượng thai nhi sau khi sinh, tiềm ẩn nguy cơ gây ung thư phổi. [13,18].
1.3.5. Sự phân hủy và chuyển hóa của chlorpyrifos trong đất
Do được sử dụng thường xuyên và rộng rãi cho kiểm soát côn trùng gây
hại, chlorpyrifos xâm nhập vào môi trường đất nơi nó có thể di chuyển theo nhiều
cách khác nhau như hấp phụ vào đất, bay hơi vào khơng khí, hấp thụ vào cây trồng
hoặc bị rửa trôi. Cách chlorpyrifos di chuyển phần lớn được xác định bởi các đặc
tính lý hóa của nó, cũng như khoảng thời gian nó tồn tại sau khi sử dụng. Các điều
kiện cụ thể của khu vực tiếp nhận như loại đất và thời tiết, cùng với dạng thuốc
trừ sâu được sử dụng (dạng lỏng hay dạng hạt), cách thức áp dụng (phun trên
không hay tưới trên mặt đất) cũng là các yếu tố then chốt quyết định số phận của
chlorpyrifos trong môi trường.
8


Chlorpyrifos ít tan trong nước và liên kết mạnh với các hạt đất, do đó hạn
chế khả năng di chuyển của nó. Chlorpyrifos tương đối bất động trong đất, ít bị
ngấm vào nước ngầm, tuy nhiên, có khả năng nó bị rửa trơi cùng với lớp đất mặt
hoặc bị xói mịn cùng lớp trầm tích, xâm nhập vào lớp nước mặt.
Trong đất, chlorpyrifos chủ yếu bị phân hủy bởi vi sinh vật. Thời gian bán
hủy của nó có thể từ 60 đến 100 ngày. Trong mơi trường nước, chlorpyrifos có
thể bị thủy phân phi sinh học, phân hủy sinh học, hoặc quang phân. Trong mơi
trường khơng khí và trên bề mặt lá, q trình oxy hóa và quang phân là những cơ
chế phân hủy chính. [23]
Con đường phân hủy, chuyển hóa tổng qt của chlorpyrifos ethyl trong
mơi trường đã được nghiên cứu bởi Racke (1993). Trong đó, một số hệ vi sinh vật
được cho là nhân tố quan trọng trong việc đẩy nhanh quá trình thủy phân
chloryrifos diễn ra trong đất. Con đường chuyển hóa chính của chlorpyrifos là sự
phân hủy tạo thành sản phẩm thứ cấp 3,5,6 trichloro-2 pyridinol (TCP) và sau đó
chuyển đổi thành 3,5,6 trichloro-2-methoxypiridyne (TMP) và CO2. [16]

Hình 3. Con đường chuyển hóa tổng qt của chlorpyrifos [9]

9


1.4. Một số kết quả nghiên cứu về các loài vi khuẩn có khả năng phân hủy
chlorpyrifos và tiềm năng ứng dụng trong xử lý ô nhiễm thuốc trừ sâu
1.4.1. Các nghiên cứu trên thế giới
Hiện nay các nghiên cứu được công bố trên thế giới đã chỉ ra tác động của
một số loài vi khuẩn sử dụng chlorpyrifos như nguồn carbon duy nhất trong một
số điều kiện cụ thể làm suy giảm đáng kể hoạt tính của hoạt chất chlorpyrifos
trong mơi trường. Các lồi vi khuẩn đã được nghiên cứu và công bố bao gồm:
Paracoccus sp. TRP, Bacillus pumilus C2A1, Pseudomonas diminuta,
Enterobacter sp., Flavobacterium sp. ATCC2755,... [2, 16,26]. Hầu hết các chủng
vi khuẩn trên tiết ra enzyme OPH (organophosphorus hydrolase) là enzyme thủy
phân cắt đứt liên kết P-O trong cấu trúc hóa học của chlorpyrifos tạo thành sản
phẩm thủy phân kém bền hoặc ít độc hơn là: 3,5,6-Trichloro-2-pyridinol và
diethyl dithiophosphoric acid.
1.4.2. Các nghiên cứu tại Việt Nam
Qua khảo sát khả năng phân hủy chlorpyrifos của các chủng vi khuẩn phân
lập từ đất trồng lúa tại Đồng bằng sông Cửu Long, tác giả Trương Quốc Tất và
cộng sự đã phân lập tuyển chọn ra 2 chủng vi khuẩn lần lượt là Achromobacter
sp. C3.1 và Demetria terragena phân giải 13,96% và 49,72% hàm lượng
chlorpyrifos (20 μg/mL) sau sau 30 ngày nuôi cấy.
Tác giả Châu và các cộng sự (2017) đã nghiên cứu sử dụng đệm hỗn hợp
sinh học (gồm đất mặt, rơm, than bùn) để thủy phân chlorpyrifos. Hỗn hợp đệm
sử dụng VSV tự nhiên phân giải chlorpyrifos nồng độ thấp (10 μg/mL ) tới 96,62%
sau 30 ngày trộn ủ. [3]
Trong cùng năm 2017, tác giả Thắm cùng với các cộng sự đã phân lập được

107 chủng vi khuẩn từ 50 mẫu đất trồng lúa, rau màu và cây ăn quả ở Việt Nam,
trong đó có 20 chủng phát triển tốt trong môi trường chứa chlorpyrifos ở nồng độ
cao (300ppm). Các vi khuẩn này thuộc các chi Pseudomonas (5 chủng),
Burkholderia (5 chủng) và Bacillus (3 chủng). Trong đó, chủng Burkholderia sp.
16.3 giảm lượng chlorpyrifos tới 63% chứng tỏ được hiệu quả phân giải

10


chlorpyrifos cao và khả năng thích ứng với cơ chất tại nồng độ cao (300ppm) của
chủng vi khuẩn phân lập. [21] Gần đây, tác giả Thắm và cs (2020) đã tuyển chọn
3 chủng vi khuẩn là Acinebacter calcoaceticus, Bacillus megaterium và
Sphingomonas pseudosanguims có khả năng phân giải CP từ 66-78% CP (20ppm)
sau 14 ngày nuôi cấy. [22]
1.5. Enzyme phân giải chlorpyrifos của vi khuẩn
Hầu hết các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải thuốc trừ sâu chlorpyrifos
đều dựa trên cơ chế tiết ra enzyme thủy phân cắt đứt liên kết P-O trong cấu trúc
hóa học của chlorpyrifos tạo thành một số sản phẩm ít độc và kém bền hơn như:
3,5,6-Trichloro-2-pyridinol và diethyl dithiophosphoric acid.

Hình 4. Q trình chuyển hóa của chlorpyrifos dưới tác động của enzyme vi sinh
vật [8]
Các enzyme của vi sinh vật phân giải chlorpyrifos đã được nghiên cứu trên
thế giới như: OP acid anhydrolase (OPAA), OP hydrolase enzyme (OPH),
phosphotriesterase (PTE), glycerophosphodiesterase (GPD) và tất cả đều thuộc
nhóm metalloenzymes, các enzyme này có cofactor là các cation hóa trị (II). [19]
Trong số tất cả các enzyme trên, OPH là enzyme được nghiên cứu nhiều nhất trên
một số chủng vi khuẩn phân giải chlopyrifos đã được phân lập. Cụ thể, OPH có
khối lượng phân tử là 72kDa được phân lập từ một số chủng vi khuẩn phân giải
chlorpyrifos như: Pseudomonas diminuta, Flavobacterium sp. ATCC 2755 [20].

Gene oph mã hóa enzyme OPH từ Pseudomonas diminuta thơng qua giải trình tự
và biểu hiện ở E.coli, được sử dụng để cố định lên một số vật liệu sinh học với
mục đích tinh sạch và tăng hiệu quả sử dụng enzyme. [10] Kỹ thuật di truyền hiện
nay cũng được áp dụng để biểu hiện gen oph với các mục tiêu khác nhau như cải

11


biến gen, gắn các trình tự gene nhằm tăng khả năng tiết hoặc tăng tính tan của
enzyme,.v.v..

12


Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Các mẫu đất được thu thập tại một số khu vực đất nơng nghiệp ở Thái Bình,
Hải Dương, Hải Phòng, Thái Nguyên nơi người dân thường sử dụng các loại thuốc
trừ sâu có chứa hoạt chlorpyrifos trong việc phịng chống sâu bệnh cho cây trồng.
2.2. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất sử dụng trong thí nghiệm
2.2.1. Dụng cụ
- Xẻng, túi đựng mẫu, nhãn dán, bút ghi ký hiệu, thiết bị chụp ảnh dùng trong
thí nghiệm thu mẫu đất
- Bình tam giác, ống nghiệm, đĩa petri, que cấy vi sinh, đèn cồn, pipetman,
đầu tip các loại, ống eppendorf, đĩa 96 giếng, lamen, lam kính
2.2.2. Thiết bị
-

Tủ lạnh thường, tủ lạnh sâu -80⁰C

Tủ cấy vi sinh, máy lắc tròn, tủ ấm
Nồi hấp tiệt trùng, tủ sấy, máy khuấy từ, máy vortex, máy ly tâm
Hệ thống đọc quang phổ đa chức năng SPARK (Tecan)
Kính hiển vi quang học Kern
Máy PCR, bộ điện di ngang

2.2.3. Hóa chất
- Chất chuẩn chlorpyrifos (độ tinh khiết 99%) của hãng Sigma-Aldrich
- Dung môi dichlormethane dùng để hịa tan cơ chất chlorpyrifos
- Các hóa chất nhuộm Gram: dung dịch Gentian, dung dịch Lugol, dung dịch
tẩy rửa, dung dịch đỏ Fuchsin Phụ lục 1
- Môi trường nuôi cấy: mơi trường khống tối thiểu MSM (Mineral Salts
Medium), mơi trường giàu dinh dưỡng LB (Luria Broth) Phụ lục 2)

13


2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Thu mẫu đất
11 mẫu đất nông nghiệp được thu thập tại một số tỉnh thành trồng lúa, trồng
chè phía Bắc. Trong đó 3 mẫu được thu thập tại Quỳnh Phụ - Thái Bình; 2 mẫu
được thu thập tại An Dương - Hải Phòng và 3 mẫu được thu thập tại Cẩm Giàng Hải Dương, và 3 mẫu được thu thập tại Đại Từ - Tỉnh Thái Nguyên. Mẫu đất được
lấy ở độ sâu 10-15 cm so với bề mặt và được lưu trữ trong túi đựng mẫu đã khử
trùng. Mẫu sau khi thu thập sẽ được bảo quản ở nhiệt độ 4⁰C cho đến khi tiến hành
phân lập theo tiêu chuẩn TCVN 7538-6:2010 hay ISO 10381-6:2009 [25]

Quỳnh Hồng - Quỳnh Phụ
-Thái Bình

An Hưng - An Dương

- Hải Phịng

Lai Cách - Cẩm Giàng
- Hải Dương

Hình 5. Một số địa điểm thu mẫu
2.3.2. Phân lập vi khuẩn có khả năng phân giải chlorpyrifos từ mẫu đất thu thập
Phương pháp làm giàu và phân lập vi khuẩn phân giải chlorpyrifos từ đất
nông nghiệp được tham khảo theo phương pháp đã được công bố bởi M. Rani và
cộng sự vào năm 2008 [17]
Quá trình là giàu bắt đầu khi 10 g của mỗi mẫu đất được bổ sung vào mơi
trường muối khống tối thiểu MSM lỏng (Phụ lục 2) có chứa chlorpyrifos với nồng
độ 50 μg/mL như nguồn carbon duy nhất. Các bình ni cấy được lắc với tốc độ
120 vòng/phút, tại nhiệt độ phòng 28 – 30 ⁰C, tránh ánh sáng [31]. Sau 5 ngày, 1
mL dịch nuôi cấy được hút chuyển sang mơi trường MSM mới có 50 μg/mL
chlorpyrifos. Tiếp tục nuôi lắc ở điều kiện như trên trong 5 ngày. Q trình làm
giàu vi khuẩn có khả năng phân giải chlorpyrifos hoàn thành sau 3 chu trình ni
lắc. Mẫu đối chứng trong thí nghiệm là mơi trường MSM chứa 50 μg/mL
chlorpyrifos, không bổ sung 10 g mẫu đất.
14


Dịch làm giàu vi khuẩn được pha loãng 10 lần theo dải nồng độ đến 10−6 .
Sau đó, 50 μL dịch pha loãng tại nồng độ 10−5 và 10−6 được cấy trải trên đĩa
thạch MSM có chứa 50 μg/mL chlorpyrifos. Các đĩa phân lập được nuôi trong tủ
ấm ở 37 ⁰C trong thời gian 24h.
Các khuẩn lạc đơn lẻ, có hình thái, màu sắc khác nhau được lựa chọn và
tinh sạch trên đĩa thạch MSM chứa 50 μg/mL chlorpyrifos để thu nhận chủng
thuần. Các chủng thuần khiết được lưu trữ tại nhiệt độ -80 ⁰C trong môi trường
LB lỏng với 15% glycerol. [6]

2.3.3. Đánh giá khả năng phân hủy chlorpyrifos của vi khuẩn trong mơi trường
khống tối thiểu
+ Khảo sát độ hấp thụ của chlorpyrifos tại các bước sóng UV
Chất chuẩn chlorpyrifos được hịa tan trong dung mơi dichlormethane và
được pha loãng tại các nồng độ tỉ lệ với nhau từ 0 μg/mL đến 300 μg/mL. Khảo
sát độ hấp thụ quang phổ UV của cơ chất chlorpyrifos chuẩn trong mẫu pha lỗng
tại các bước sóng trong khoảng 210nm - 400nm theo phương pháp đã công bố của
Makino và Sakai (2009). [12] Hệ thống đọc quang phổ đa chức năng SPARK
(hãng Tecan) được sử dụng nhằm xây dựng đường chuẩn giữa kết quả đo OD và
nồng độ chlorpyrifos tại bước sóng hấp thụ chlorpyrifos cao nhất.
+ Đánh giá khả năng phân hủy chlorpyrifos của vi khuẩn trong mơi trường khống
tối thiểu
Dịch huyền phù của các chủng vi khuẩn sau khi nhân sinh khối được bổ
sung với tỉ lệ (1:100) vào 100 mL môi trường MSM lỏng chứa 100 μg/mL
chlorpyrifos, đối chứng là môi trường MSM chứa 100 μg/mL chlorpyrifos. Dịch
nuôi cấy và đối chứng được nuôi lắc với tốc độ 120 vòng/phút ở nhiệt độ phòng
(28-30 ⁰C), tránh ánh sáng.
Tiến hành thu 3 mL các mẫu dịch nuôi tế bào vi khuẩn và mẫu đối chứng
sau mỗi 24h. Sử dụng dung môi dichlormethane để chiết dư lượng chlorpyrifos
trong các mẫu với tỉ lệ thể tích (V dung mơi : V dịch thu = 1:1). Nồng độ

15


chlorpyrifos được định lượng bằng phương pháp đo độ hấp thụ quang phổ UV ở
bước sóng 294nm. Các giá trị OD294 được quy đổi thành nồng độ (µg/mL) bằng
phương trình hàm số tuyến tính giữa giá trị OD294 và nồng độ chất chuẩn
chlopyrifos.
2.3.4. Đánh giá khả năng sinh trưởng của vi khuẩn trong mơi trường MSM có bổ
sung chlorpyrifos

Các chủng vi khuẩn được nhân sinh khối trong 50 mL môi trường LB lỏng
ở điều kiện nhiệt độ phòng (28-30 ⁰C) trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút. Sự
tăng sinh của tế bào vi khuẩn trong dịch nuôi được theo dõi bằng phương pháp đo
độ đục tại bước sóng 600 nm. Sau 2 ngày ni lắc, tồn bộ sinh khối tế bào được
thu nhận bằng cách ly tâm dịch nuôi cấy ở 6000 vòng/ phút trong 5 phút. Phần
cặn sau khi ly tâm được rửa ba lần bằng môi trường MSM để loại bỏ hồn tồn
nguồn carbon cịn sót lại từ môi trường LB. Dịch huyền phù tế bào vi khuẩn được
điều chỉnh về giá trị OD600 = 0,5 bằng nước cất đã tiệt trùng và được lưu giữ, bảo
quản lạnh (4 ⁰C) để phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo.
Thí nghiệm đánh giá khả năng sinh trưởng của vi khuẩn được tiến hành
bằng cách bổ sung 1 mL dịch huyền phù vi khuẩn vào 100 mL môi trường MSM
lỏng chứa 100 μg/mL chlorpyrifos, mẫu đối chứng dương là 100 mL mơi trường
MSM lỏng có bổ sung 1 mL dịch huyền phù vi khuẩn, mẫu đối chứng âm là 100
mL mơi trường MSM chứa 100 μg/mL chlorpyrifos. Q trình nuôi lắc diễn ra
liên tục trong 4 ngày với tốc độ 120 vòng/ phút ở điều kiện nhiệt độ phòng (2830 ⁰C)
Mẫu thí nghiệm và các mẫu đối chứng được thu sau mỗi 24h nuôi lắc kể từ
lúc bổ sung dịch huyền phù vi khuẩn vào môi trường MSM cho đến sau 6 ngày
ni cấy. Mật độ vi khuẩn có trong dịch nuôi tại các thời điểm thu mẫu được xác
định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc và phương pháp đo độ đục được thực hiện
trên đĩa 96 giếng, mỗi giếng chứa 200 μL dịch nuôi vi khuẩn được đo bằng máy
quang phổ SPARK (hãng Tecan) tại bước sóng 600 nm. Đồ thị giá trị OD600 đo
từ các mẫu dịch nuôi được xây dựng nhằm đánh giá khả năng sinh trưởng của vi

16