TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN PROTEASETRONG VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRUNG TÂM HỖ TRỢ NGHIÊN CỨU CHÂU Á

BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ ĐỀ TÀI

Tên đề tài:

TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN PROTEASE
TRONG VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS

Chủ nhiệm đề tài: PGS. TS. Nguyễn Hoàng Lộc
Đơn vị chủ trì: Viện Tài ngun, Mơi trường và Cơng nghệ sinh học,
Đại học Huế

HUẾ 3/2009


MỤC LỤC
Giải thích các chữ viết tắt ............................................................................................ 4
Danh sách những người tham gia thực hiện đề tài .....................................................5
Danh mục các bảng số liệu .......................................................................................... 6
Danh mục các hình ......................................................................................................7
Tóm tắt các kết quả nghiên cứu chính của đề tài......................................................... 8
Phần 1. Đặt vấn đề .......................................................................................................9
Phần 2. Tổng quan các vấn đề nghiên cứu ................................................................ 11
2.1. Tổng quan về protease ........................................................................................11
2.1.1. Đặc điểm của protease .............................................................................11
2.1.1.1. Giới thiệu chung ...........................................................................11
2.1.1.2. Phân loại protease .........................................................................11
2.1.2. Ứng dụng của protease ............................................................................13

2.1.2.1. Ứng dụng protease trong cơng nghiệ p sản xuất xà phịng ...........14
2.1.2.2. Ứng dụng trong công nghiệp thuộc da .........................................14
2.1.2.3. Ứng dụng trong y học ...................................................................15
2.1.2.4. Các ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm ............................... 15
2.1.2.5. Trong chế biến thủy sản ............................................................... 17
2.2. Tổng quan về vi khuẩn Bacillus subtilis .............................................................18
2.3. Cơng nghệ DNA tái tổ hợp .................................................................................19
2.4. Tình hình nghiên cứu protease trong nước và trên thế giới................................ 21
2.4.1. Các nghiên cứu về tách chiết, đặc điểm và ứng dụng của
enzyme protease ............................................................................................................. 21
2.4.1.1. Protease từ nguồn thực vật ..................................................................... 21
2.4.1.2. Protease từ nguồn động vật .................................................................... 23
2.4.1.3. Protease từ nguồn vi sinh vật ...........................................................24


2.4.2. Các nghiên cứu tạo dòng và biểu hiện gen mã hóa protease........................... 27
Phần 3. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của đề tài.................................................30
3.1. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài...........................................................................30
3.2. Nội dung nghiên cứu của đề tài ..........................................................................30
Phần 4. Địa điểm, thời gian và phương pháp nghiên cứu .........................................31
4.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ......................................................................31
4.2. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................31
4.2.1. Phân lập DNA và khuếch đại gen protease trung tính ở B.
subtilis C10 ........................................................................................................31
4.2.2. Tạo dịng và phân tích trình tự gen protease trung tính...........................32
4.2.3. Biểu hiện của gen protease trung tính .....................................................33
4.2.4. Ảnh hưởng của một số nhân tố lên khả năng sản xuất
enzyme protease trung tính ngoại bào ............................................................... 33
4.2.5. Xác định hoạt tính protease .....................................................................34
4.2.6. Xử lý thống kê .........................................................................................35

Phần 5. Kết quả nghiên cứu ......................................................................................36
5.1. Tạo dòng gen sản xuất protease..........................................................................36
5.1.1. Tách chiết DNA tổng số .........................................................................36
5.1.2. Khuếch đại PCR ......................................................................................36
5.1.3. Tạo dịng sản phẩm PCR .........................................................................37
5.1.4. Xác định trình tự nucleotide của sản phẩm PCR .....................................38
5.2. Biểu hiện gen protease trong vi khuẩn E. coli ....................................................40
5.2.1. Phân tích biểu hiện của gen protease bằng điện di SDS .........................40
5.2.2. Xác định nhanh hoạt tính của protease ....................................................42
5.2.3. Phân tích hoạt độ của protease ................................................................ 43
5.3. Khảo sát ảnh hưởng của một số nhân tố lên khả năng sản xuất protease
trung tính ngoại bào ...................................................................................................44


5.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy............................................................44
5.3.2. Ảnh hưởng của thời gian cảm ứng ..........................................................45
5.3.3. Ảnh hưởng của nồng độ IPTG.................................................................46
5.3.4. Ảnh hưởng của mật độ tế bào lên sản xuất protease ............................... 47
5.3.5. Ảnh hưởng của nồng độ Ca2+ lên sản xuất protease ngoại bào ...............48
Các công bố liên quan đến kết quả của đề tài ...........................................................50
Kết quả đào tạo của đề tài..........................................................................................50
Kết quả ứng dụng của đề tài .....................................................................................50
Thảo luận ...................................................................................................................51
Phần 6. Kết luận và kiến nghị ....................................................................................54
Tài liệu tham khảo .....................................................................................................55
Phụ lục ......................................................................................................................63
Đề cương đề tài nghiên cứu đã được phê duyệt
Phiếu tóm tắt kết quả nghiên cứu bằng tiếng Việt & tiếng Anh
Phiếu đăng ký kết quả nghiên cứu

CHÚ THÍCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
bp

base pairs

BSA

bovine serum albumin

CDS

coding sequence

cs

cộng sự

FLS

full-length sequence

DNA

deoxyribonucleic acid

ĐC

đối chứng

dNTP

deoxyribonucleotide 5’-triphosphate

EDTA

ethylene diamine tetra acetic acid

EtBr

ethidium bromide

His

histidin

Kb

kilobase

kDa

kilodalton

IPTG

Isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside

MCU

milk clotting units

NPR- His

protein dung hợp (tái tổ hợp)

LB

Luria-Bertani

PAGE

polyacrylamide gel electrophoresis

PCR

polymerase chain reaction

SDS

sodium dodecyl sulfate

TAE

tris-acetate-EDTA

TCA

trichloroacetic acid

DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI THAM GIA
THỰC HIỆN ĐỀ TÀI
- Chủ trì: Nguyễn Hồng Lộc
Học hàm, học vị: Phó giáo sư, Tiến sĩ
Cơ quan công tác: Viện Tài nguyên, Môi trường và Công nghệ sinh
học, Đại học Huế
- Thư ký:
- Những người thực hiện.
+ Nguyễn Văn Song, Thạc sĩ
+ Hoàng Tấn Quảng, Thạc sĩ
+ Lê Đức Dũng, Kỹ sư
+ Nguyễn Đức Huy, Kỹ sư
+ Nguyễn Hồng Bách, Cử nhân
Cơ quan cơng tác: Viện Tài nguyên, Môi trường và Công nghệ sinh
học, Đại học Huế
+ Trương Thị Bích Phượng, Tiến sĩ
Cơ quan công tác: Trường đại học Khoa học, Đại học Huế
Viện Tài nguyên, Môi trường và Công nghệ sinh
học, Đại học Huế
+ Đỗ Thị Bích Thủy, Tiến sĩ
Cơ quan cơng tác: Trường đại học Nông-Lâm, Đại học Huế
Viện Tài nguyên, Môi trường và Công nghệ sinh
học, Đại học Huế


DANH MỤC CÁC BẢNG SỐ LIỆU

TT

Tên bảng

Trang

1.

Bảng 4.1. Trình tự nucleotide của hai cặp mồi đ ược thiết kế

31

cho đoạn mã hóa (CDS) và đoạn hồn chỉnh (FLS) của gen
protease trung tính nprE
2.

Bảng 5.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ cảm ứng lên biểu hiện của

45

protease trung tính ngoại bào
3.

Bảng 5.2. Ảnh hưởng của thời gian cảm ứng l ên biểu hiện

46

của protease trung tính ngoại b ào
4.

Bảng 5.3. Ảnh hưởng của nồng độ IPTG lên biểu hiện của

47

protease trung tính ngoại bào
5.

Bảng 5.4. Ảnh hưởng của mật độ tế bào lên biểu hiện của

48

protease trung tính ngoại bào
6.

Bảng 5.5. Ảnh hưởng của Ca 2+ lên sự ổn định của hoạt độ
trung tính protease ngoại bào

49


DANH MỤC CÁC HÌNH

TT

Tên hình

Trang

1.

Hình 2.1. Sơ đồ phân loại protease

12

2.

Hình 4.1. Sơ đồ cấu trúc đơn giản của gen protease

32

trung tính nprE
3.

Hình 5.1. Điện di DNA tổng số trên agarose 0,8%

36

4.

Hình 5.2. Sản phẩm PCR được khuếch đại bằng hai cặp mồi

37

đặc hiệu NPF và NPC
5.

Hình 5.3. Plasmid tái tổ hợp mang sản phẩm PCR đ ược cắt

38

bằng SacI
6.

Hình 5.4. Trình tự nucleotide của đoạn CDS gen nprC10

40

(1566 bp)
7.

Hình 5.5. Điện di SDS-PAGE protein tổng số từ dịch chiết tế

41

bào E. coli
8.

Hình 5.6. Hoạt động của protease trung tính thể hiện tr ên đĩa

42

thạch chứa casein 0,1%
9.

Hình 5.7. Hoạt độ riêng protease tại các thời điểm nuôi cấy

43

khác nhau sau khi cảm ứng bằng IPTG
10. Hình 5.8. Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn E. coli
BL21(DE3) tái tổ hợp

44


TĨM TẮT CÁC KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CHÍNH CỦA ĐỀ TÀI
- Kết quả về khoa học: Đã tạo dòng và biểu hiện thành cơng gen sản
xuất enzyme protease trung tính ngo ại bào của Bacillus subtilis C10
trong tế bào E. coli BL21 (DE3).
Cơng trình khoa học đã cơng bố
+ Cloning and expression of neutral protease gene from Bacillus
subtilis, Vietnamese Journal of Biotechnology 6(4B) (2008): 963-970.
Cơng trình khoa học sẽ cơng bố
+ Effect of some factors on the production of recombinan t
extracellular neutral protease from Escherichia coli.
- Kết quả phục vụ thực tế: chưa có
- Kết quả đào tạo: Đã và đang đào tạo 2 sinh viên cao học và 2 sinh
viên đại học.
- Kết quả nâng cao tiềm lực khoa học: có 8 cán bộ của đơn vị tham gia
trực tiếp vào đề tài này để nâng cao trình độ và năng lực nghiên cứu.


Phần 1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, các chế
phẩm enzyme được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng trong nhiều lĩnh vực. Hàng năm lượng
enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với giá trị trên 500 triệu USD [15];
protease (proteinase) là một trong ba nhóm lớn của enzyme cơng nghiệp, chiếm khoảng 60% tổng số
enzyme thương mại trên thế giới [40], [54]. Protease là enzyme phân giải protein được sử dụng nhiều
nhất hiện nay trong một số ngành sản xuất như chế biến thực phẩm (đông tụ sữa làm pho mát, làm
mềm thịt, bổ sung để làm tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia, xử lý phế phụ phẩm trong chế
biến thực phẩm…), sản xuất chất tẩy rửa, dệt, thuộc da, y tế, nơng nghiệp…[7]. Protease có thể là chìa
khóa mở ra hướng phát triển mới cho các ngành sản xuất trên.

Protease được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau nh ư động vật, thực vật và vi sinh vật.
Việc gia tăng sử dụng vi sinh vật như là một nguồn cung cấp protease đ ã cải thiện đáng kể hiệu
quả sản xuất và sản phẩm được tạo ra nhiều hơn. Tuy nhiên, giá thành chế phẩm protease cịn khá
cao, do đó cũng hạn chế việc sử dụng rộng r ãi trong sản xuất. Các chế phẩm thu được sau q
trình ni cấy sản xuất enzyme cũng ch ưa có độ tinh sạch cao [15]. Những kết quả đạt được
trong lĩnh vực nghiên cứu về protease từ vi sinh vật bằng con đ ường truyền thống không đáp ứng
được việc mở rộng quy mô sản xuất v à ứng dụng của nhóm enzyme n ày trong đời sống.
Cơng nghệ DNA tái tổ hợp (cịn gọi là kỹ thuật di truyền hay kỹ thuật gen) là một bộ phận
quan trọng và là cơng nghệ chìa khóa của lĩnh vực công nghệ sinh học. Công nghệ DNA tái tổ
hợp được ra đời trên cơ sở các thành tựu của sinh học phân tử và hiện nay đang đóng vai trò cách
mạng đối với sự phát triển của sinh học cũng như cải tạo sinh giới. Các kỹ thuật tái tổ hợp DNA
đã cho phép các nhà công nghệ sinh học phân lập và khuếch đại một gen đơn từ genome của một
sinh vật để có thể nghiên cứu, biến đổi và chuyển nó vào trong một cơ thể sinh vật khác. Cải
thiện hoạt tính và khả năng tổng hợp enzyme bằng kỹ thuật tái tổ hợp DNA hiện đang đ ược ứng
dụng rộng rãi, trong đó có tạo dịng và sản xuất enzyme protease.
Đã có nhiều cơng trình nghiên cứu về tạo dòng và biểu hiện gen protease trong tế bào
Escherichia coli đã được công bố như biểu hiện protease nội bào (PfpI) của Pyrococcus furiosus
(Halio và cs. 1996) [37], cysteine protease từ Streptococcus pyogenes (Gubba và cs. 1998) [35],
endoprotease của Aeromonas caviae T-64 (Nirasawa và cs. 1999) [50], cysteine protease t ừ
Porphyromonas gingivalis (Margetts và cs. 2000) [45], protease ki ềm chịu nhiệt từ Bacillus
stearothermophilus F1 (Fu và cs. 2003) [34], protease trung tính (Bae16) t ừ B. nematocida (Niu
và cs. 2006) [51], và zinc-metalloprotease từ chủng Salinivibrio sp. AF-2004 (Karbalaei-Heidari


và cs. 2008) [41]. Gen mã hóa enzyme protease trung tính c ủa B. subtilis cũng đã được tạo dịng
và biểu hiện trong Lactococcus lacfis spp. lactis JF254 (Riepe và cs. 1994) [61]…
Xuất phát từ cơ sở trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài này nhằm tạo dòng gen sản
xuất protease trung tính từ vi khuẩn B. subtilis C10 và biểu hiện chúng trong tế bào E. coli để sản
xuất enzyme protease tái tổ hợp.

Phần 2. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
2.1. Tổng quan về protease
2.1.1. Đặc điểm của protease
2.1.1.1. Giới thiệu chung
Theo tiêu chuẩn Hiệp hội Hóa sinh và Sinh học phân tử quốc tế, protease là enzyme xúc tác
thủy phân mối liên kết peptide (-CO-NH-) của chuỗi polypeptide [8].
H

H

C

C

N

C

R

O

H

R’

H
+

H 2O

H

C

C

R

O

OH

+

H

N

C

H

R’

Trong những năm gần đây, giá trị thương mại của các enzyme cơng nghiệp tr ên tồn thế
giới đạt trên 500 triệu USD, trong đó chủ yếu là các enzyme thủy phân (chiếm khoảng 75%) và
protease là một trong ba nhóm enzyme lớn nhất sử dụng trong công nghiệp, chiếm khoảng 60%
lượng enzyme được bán trên thế giới (Nguyễn Thị Thảo và cs, 2004) [16].

Protease cần thiết cho các sinh vật sống, phân bố rất rộng r ãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật
(vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa, sung vả...) và động vật (gan, dạ dày...).

2.1.1.2. Phân loại protease
Hội Hóa sinh quốc tế (The International Union of Biochemistry) đ ã thành lập Tiểu ban
Enzyme (The Enzyme Commission) vi ết tắt là EC, tiểu ban này đã đưa ra cách phân loại thống
nhất dựa trên các loại phản ứng. Theo cách phân loại n ày thì enzyme được chia ra làm sáu lớp lớn
đánh số từ 1 đến 6, các số thứ tự n ày cố định cho mỗi lớp. Mỗi enzyme trong hệ thống đ ã được
phân loại và đặt tên theo mã bốn chữ số biểu thị phản ứng x úc tác, trong đó con số đầu chỉ lớp, số
thứ hai chỉ lớp phụ, số thứ ba chỉ phân lớp phụ v à số thứ tư chỉ rõ số bậc thứ tự của enzyme [7].
Theo cách phân loại của Tiểu ban enzyme th ì protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của
lớp thứ 3 (E.C.3.4) [3].


Peptidase (Protease)
(E.C.3.4)

Exopeptidase
(E.C. 3.4.11-17)

Endopeptidase
(E.C. 3.4.21-99)
Serine proteinase

Aminopeptidase
Cystein proteinase

Aspartic proteinase

Carboxypeptidase

Metallo proteinase
Hình 2.1.
Sơ đồ phân loại protease

Sơ đồ trên cho thấy protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và
exopeptidase.

* Exopeptidase: dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chia
thành hai loại:
+ Aminopeptidase: xúc tác th ủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi
polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide.
+ Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide v à
giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide.
* Endopeptidase: dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase đ ược chia thành bốn
nhóm:
+ Serine: là những enzyme chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và
có vai trị đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme. Nhóm n ày bao gồm hai
nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin. Nhóm chymotrypsin bao g ồm các enzyme động vật nh ư


chymotrypsin, trypsin và elastase. Nhóm subtilisin bao g ồm hai loại enzyme là như subtilisin
Carlsberg và subtilisin BPN. Các serine protease thư ờng hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể
hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng.
+ Cysteine: là các protease chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động. Cystein protease
bao gồm các protease thực vật nh ư papain, bromelin, một vài protease động vật và protease ký
sinh trùng. Các cystein protease thư ờng hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đ ặc hiệu cơ chất
rộng.
+ Aspartic: hầu hết các aspartic protease thuộc nhóm pepsin. Nhóm pepsin bao gồm các
enzyme tiêu hóa như pepsin, chymosin, cathepsin và renin. Các aspartic protease có ch ứa nhóm

carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính.
+ Metallo: là nhóm protease được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng nh ư các vi sinh vật
bậc cao hơn. Các metallo protease thư ờng hoạt động ở vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh
dưới tác dụng của EDTA.
Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:
- Protease acid hoạt động ở pH 2-4.
- Protease trung tính hoạt động ở pH 7-8.
- Protease kiềm hoạt động ở pH 9-11 [16].

2.1.2. Ứng dụng của protease
Công nghệ enzyme là một trong bốn bộ phận cơ sở của công nghệ sinh học. Sự h ình
thành và phát triển của ngành cơng nghệ enzyme ở nhiều nước thường được bắt đầu từ các
enzyme thủy phân, đặc biệt là các enzyme xúc tác cho ph ản ứng thủy phân protein (protease) v à
các enzyme phân giải polysaccharide kiểu tinh bột (amylase). L ượng protease được sử dụng trong
thực tế chiếm tỷ lệ khá lớn, khoảng 50% to àn bộ chế phẩm enzyme được sử dụng. Các loại
carbohydrase chỉ chiếm 28%, còn lại là các enzyme khác [3].
Protease được ứng dụng một cách rộng rãi chủ yếu trong sản xuất xà phòng và trong công
nghiệp thực phẩm. Xu hướng gần đây là tập trung phát triển các kỹ thuật có lợi cho mơi tr ường, vì
vậy protease được dự kiến có ứng dụng rộng rãi để xử lý da (thuộc da) và trong một vài quá trình
sinh học khác. Hơn nữa, nhu cầu enzyme trên thế giới đối với các ứng dụng đặc thù thay đổi một
cách đáng kể; các protease còn được ứng dụng một cách rộng rãi trong y tế, công nghiệp dược
phẩm để sản xuất thuốc...


2.1.2.1. Ứng dụng protease trong công nghiệp sản xuất x à phịng
Trong cơng nghiệp sản xuất xà phịng, kem mỹ phẩm, thuốc đánh răng, bổ sung vào sản
phẩm có tác dụng làm da mịn, làm sạch răng, tẩy mồ hôi, vết bẩn [10]. V ào những năm 60, một
nửa số loại bột giặt ở châu Âu, châu Mỹ đều có chứa protease [4]. Việc sử dụng protease trong
bột giặt chiếm khoảng 25% l ượng enzyme sử dụng trên thế giới. Tất cả protease để sản xuất bột
giặt được sử dụng hiện nay trên thị trường là serine protease được sản xuất bởi các chủng Bacillus.

Một protease kiềm tính được tìm thấy ở Conidiobolus coronatus phù hợp với bột giặt thương mại
sử dụng ở Ấn Độ [29].

2.1.2.2. Ứng dụng trong công nghiệp thuộc da
Quá trình xử lý da qua các bước như sau: ngâm nước, tẩy lông, làm mềm và tẩy các loại
vơi, nhuộm da. Hợp phần chính của da v à lơng là protein. Các phương pháp thích h ợp trong q
trình xử lý da có liên quan đến các hóa chất nguy hiểm như Na2SO3 gây ơ nhiễm mơi trường nước.
Việc sử dụng enzyme thay thế hóa chất để loại bỏ lông v à làm mềm da không những hạn chế ơ
nhiễm mơi trường mà cịn tiết kiệm được năng lượng. Hiện nay, trypsin được sử dụng kết hợp với
các protease của Bacillus và Aspergillus để làm mềm da [17].

2.1.2.3. Ứng dụng trong y học
Protease làm thuốc chống tắc nghẽn tim mạch, ti êu mủ vết thương, làm thông đường hơ
hấp, chống viêm làm tăng tiêu hóa protein, thành ph ần của các loại thuốc dùng trong da liễu và
mỹ phẩm [7].

2.1.2.4. Các ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm
Việc sử dụng các protease trong công nghiệp thực phẩm đ ã có từ lâu đời. Chúng được sử
dụng một cách bình thường trong nhiều mục đích khác nhau nh ư sản xuất pho mát, làm bánh
nướng, sản xuất bia, chế biến cá, sản xuất dịch thủy phân đậu v à làm mềm thịt [4].

* Công nghiệp sữa
Ứng dụng chủ yếu của protease trong công nghiệp sữa l à sản xuất pho mát. Yếu tố c ơ bản
của quá trình sản xuất pho mát là đông tụ sữa. Sữa được chuyển thành cấu trúc gel thông qua hoạt
động của các enzyme gây đông tụ (coagulating enzymes) (gọi tắt l à coagulant).
Các enzyme gây đông t ụ thương mại được sử dụng trong sản xuất pho mát bao gồm
rennet động vật và các enzyme gây đông t ụ vi sinh vật. Rennet động vật thu nhận từ dạ dày của


động vật non, thường là của bê. Rennet động vật là một hỗn hợp của chymosin v à pepsin, chủ yếu

là chymosin, là một enzyme tương đối đắt và không đáp ứng đủ cho nhu cầu sản xuất pho mát
ngày càng tăng trên thế giới. Vì vậy, tăng cường tìm kiếm các chất gây đông tụ sữa từ vi sinh vật
có giá thành rẻ hơn để thay thế enzyme có nguồn gốc từ động vật [17].

* Ứng dụng protease trong quá tr ình sản xuất bia
Việc ứng dụng các chế phẩm protease trong sản xuất bia giúp cho n gười sản xuất có thể
sử dụng tồn bộ protein đại mạch do các enzyme n ày chuyển protein thành trạng thái hòa tan ổn
định vào dịch đường và bia, cho phép nâng cao giá tr ị sinh học của bia [7].
Trong q trình đường hóa, người ta thường bổ sung protease nhằm thủy phân nửa vời
các protein phân tử lớn tạo nên các protein trung gian. Sản phẩm thủy phân nửa vời n ày sẽ có tác
dụng làm bền bọt bia. Các protease đ ược sử dụng rộng rãi nhất từ trước đến nay là chế phẩm của
vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens [17].

* Công nghiệp sản xuất bánh nướng
Bột mỳ là thành phần chính của q trình chế biến bánh nướng, nó chứa protein khơng
hịa tan (gọi là gluten) quyết định tính chất của khối bột nh ào làm bánh nướng. Gluten có khả
năng giữ khí trong khối bột nhào tạo nên hình dạng ổn định của bánh nướng. Chính vì vậy, chất
lượng và hàm lượng protein là các thông số quan trọng của bột mỳ. Dựa v ào loại protease được
sử dụng, sự bổ sung enzyme có thể dẫn đến những biến đổi chủ yếu nh ư tăng tính đàn hồi của
khối bột nhào, hoặc thủy phân gluten làm mất tính đàn hồi. Endopetidase và exopetidase từ
Aspergillus oryzae được sử dụng để cải thiện gluten bột mỳ bằng cách thủy phân nửa vời.
Ngồi tác dụng làm thay đổi các tính chất lưu biến và vật lý của bột nhào, một vài
protease cịn có tác dụng hồn thiện màu và mùi cho sản phẩm. Các amino acid, sản phẩm cuối
cùng của quá trình thủy phân gluten dưới tác dụng của protease l à cấu phần chất thơm cho sản
phẩm, các peptide tăng vị cho sản phẩm. H ơn nữa, các amino acid có thể tham gia phản ứn g
Maillard với đường tạo hương thơm và màu sắc cho sản phẩm. Để có được yêu cầu đó, người ta
thường bổ sung kết hợp các protease (th ường là protease của B. subtilis) với các chất khử như Lcysteine, muối metabisulfite. Các protease sẽ phân cắt các mối li ên kết peptide, còn các chất khử sẽ
phân cắt các mối liên kết disulfite [17].

* Trong chế biến thịt

Q trình làm mềm thịt có thể được tác động bởi protease nội sinh, đặc biệt l à enzyme
cathepsin và bởi các protease trung tính được tìm thấy trong hoặc gần protein sợi cơ trong quá


trình thịt chín [68]. Q trình chín bình thường của xác súc vật hoặc của từng miếng thịt khoảng
10 ngày ở 1-20C. Q trình chín xảy ra chậm có ưu điểm là tạo ra thịt rất mềm nhưng cũng có
nhược điểm là làm mất nước trong thịt và làm cho miếng thịt co lại.
Khác với quá trình làm mềm thịt gây ra bởi enzyme nội sinh, các enzyme ngoại sinh hoạt
động trên các protein của mô liên kết elastin và collagen, cũng như trên các protein của các sợi
cơ. Các protease thực vật và vi sinh vật có hoạt động làm mềm thịt khác nhau. Các protease thực
vật có tác động đáng kể l ên mô liên kết, chủ yếu là lên collagen và elastin, ít th ể hiện lên các
protein sợi cơ. Các enzyme thủy phân protein của vi sinh vật kể cả vi khuẩn v à nấm mốc tác động
đáng kể lên các sợi cơ nhưng chỉ tác động nhẹ lên các sợi collagen và không tác động lên elastin.
Chính vì vậy, cần kết hợp cả enzyme thực vật v à enyme vi sinh vật để làm mềm thịt [17].
Các chế phẩm protease cịn có thể được sử dụng để làm tăng giá trị của các sản phẩm thịt,
chẳng hạn như tạo hương được sử dụng để tăng nhanh q tr ình chín của xúc xích lên men [22].

* Sản xuất các sản phẩm đậu
Đậu nành là nguồn thực phẩm giàu dinh dưỡng do chứa hàm lượng protein chất lượng
cao và là sản phẩm phụ lớn của ngành công nghiệp chế biến hạt dầu. Tuy nhi ên, giá trị dinh
dưỡng của bột đậu nành bị hạn chế do các yếu tố phản dinh d ưỡng như chất ức chế trypsin và
lectin, các chất này có tác dụng âm tính đến sự tiêu hóa protein [67].
Để làm tăng giá trị dinh dưỡng của bột đậu nành, người ta đã xử lý nhiệt như rang, ép
đùn. Sau khi xử lý nhiệt, các yếu tố phản dinh d ưỡng như chất ức chế trypsin bị bất hoạt (Van der
Poel và cs, 1993) [65], và protein s ẽ bị phân cắt đến một mức độ nhất định l àm cho enzyme dễ
dàng thủy phân hơn [17].

2.1.2.5. Trong chế biến thủy sản
Ngày nay, người ta đã sử dụng các chế phẩm protease trong c ơng nghiệp chế biến cá với
nhiều mục đích khác nhau, chẳng hạn nh ư loại bỏ da cá, sản xuất dịch thủy phân protein của cá.

Dịch cá sau khi thủy phân đ ược cô đặc và sấy phun. Sản phẩm này sử dụng thích hợp đối với xúp
và các thực phẩm khác. Chế phẩm protease đ ược sử dụng trong sản xuất bột cá giúp dễ d àng tách
thịt khỏi xương, da, bột mịn, rút ngắn thời gian sản xuất v à tăng hiệu quả kinh tế. Trong sản xuất
nước mắm, protease giúp rút ngắn thời gian chế biến 3 -6 lần, tăng thể tích nước mắm cốt thu
được đồng thời làm tăng hương vị cho sản phẩm [4]. Các enzyme thực vật nh ư bromelain, ficin
và papain đã thủy phân mô cá trong thời gian ngắn, v à các protease của nấm làm tăng tốc độ thủy
phân protein ban đầu [17].


2.2. Tổng quan về vi khuẩn Bacillus subtilis
Bacillus subtilis thuộc giới Bacterice, ngành Firmicutes, lớp Bacilie, bộ Bacillales, họ
Bacillanceae và giống Bacillus. Loài này được Cohn phát hiện và đặt tên năm 1872 [52].
B. subtilis là trực khuẩn Gram dương, hình que, sinh bào tử, hiếu khí hoặc kị khí khơng bắt
buộc, dễ tìm thấy trong đất và trong các chất hữu cơ bị thối rửa. Lồi này có khả năng sinh tổng
hợp nhiều loại enzyme ngoại b ào như protease, amylase, glucoamylase, glucanase, cellulase và
dextranase [3]. Nhiều nghiên cứu đã lựa chọn B. subtilis làm nguồn vi sinh vật sinh tổng hợp
protease ngoại bào [53, 63, 64].
Năm 1998, Kunst và cs đã dự đốn hệ gen của lồi B. subtilis khoảng 4.225 gen, bao gồm
khoảng 4.100 gen mã hóa protein, trong đó có 192 gen khơng th ể thiếu. Những gen chủ yếu có
liên hệ với một vài vùng của sự chuyển hóa tế bào, khoảng 50% số gen liên quan trong thơng tin
của q trình sống, 20% liên quan đến sự tổng hợp vỏ bọc tế b ào, định rõ hình dáng tế bào, sự
phân chia và 10% liên quan đ ến năng lượng của tế bào [42].
Hầu hết các protease thương mại, chủ yếu là kiềm tính và trung tính, được sản xuất từ vi
sinh vật thuộc chi Bacillus. Trong đó, phổ biến nhất là lồi B. subtilis [53, 64, 69]. Các serine
protease của B. subtilis hoạt động thích hợp ở pH kiềm tính, đặc hiệu ở vị trí amino acid th ơm
hoặc amino acid kỵ nước ở phía nhóm -COOH của liên kết bị thủy phân và bị kìm hãm bởi
disopropyl fluophosphate (DFP). Trong khi đó, các metallo pr otease của lồi này hoạt động thích
hợp ở pH trung tính, đặc hiệu ở vị trí amino acid kỵ n ước, hoặc có kích thước lớn ở phía nhóm NH2 của liên kết bị thủy phân và bị kìm hãm bởi EDTA [20].
Cũng như các protease được tách từ các vi sinh vật khác, các chế phẩm protease của B.
subtilis được sử dụng trong chế biến thực phẩm đ ược nhiều nhà khoa học quan tâm.

2.3. Công nghệ DNA tái tổ hợp
Công nghệ DNA tái tổ hợp được hình thành từ những năm 1970 nhờ sự phát triển các
phương pháp và kỹ thuật dùng trong nghiên cứu các quá trình sinh học ở mức độ phân tử. Từ đó
cho phép phân lập, phân tích và thao tác trên các gen theo nhiều phương thức khác nhau, giúp hiểu
biết sâu sắc các lĩnh vực mới của sinh học nh ư công nghệ sinh học, bào chế các loại thuốc mới, y học
phân tử và liệu pháp gen [11].
Sự khám phá ra các enzyme hạn chế (restriction endonuclease) trong những năm đầu thập
niên 70 là sự phát triển then chốt (key development) khơng chỉ cho khả năng phân tích DNA hiệu
quả hơn, mà còn cung cấp khả năng cắt các phân tử DNA để tạo ra các đoạn DNA tái tổ hợp mới,
một quá trình mà ngày nay được gọi là tạo dòng gen. Phương thức tạo dòng này đã báo hiệu một
kỷ nguyên mới trong thao tác, phân tích v à khai thác các phân tử nucleic acid [11].


Tạo dòng gen đã tạo ra nhiều phát minh quan trọng và cung cấp những hiểu biết giá trị
trong cấu trúc, chức năng và sự điều hòa hoạt động của gen. Từ những ứng dụng đầu ti ên của
chúng, các phương pháp xây d ựng thư viện gen được hình thành và phát triển, hiện nay được xem
như là cơ sở cho nhiều thí nghiệm hóa sinh và sinh học phân tử. Mặc dù phản ứng chuỗi
polymerase (polymerase chain reaction) đ ể khuếch đại gen cho phép phân tích nhanh h ơn nhưng
trong nhiều trường hợp kỹ thuật tạo dòng gen vẫn cịn hữu ích và là một u cầu tuyệt đối [11].
Công nghệ DNA tái tổ hợp là một tập hợp các kỹ thuật phân tử để định vị, phân lập, biến
đổi và nghiên cứu các đoạn DNA. Thuật ngữ tái tổ hợp đ ược dùng thường xuyên do mục tiêu của
nó là phối hợp DNA từ hai nguồn xa nhau. Ví dụ: các gen từ hai nguồn vi k huẩn khác nhau có thể
được liên kết lại, hoặc một gen người có thể được đưa vào nhiễm sắc thể vi khuẩn. Cơng nghệ
DNA tái tổ hợp (cịn gọi là công nghệ di truyền, công nghệ gen hay kỹ thuật gen…) hiện nay bao
gồm một mạng lưới các kỹ thuật phân tử được dùng để phân tích, biến đổi và tái tổ hợp hầu như
mọi trình tự DNA [12].
Mục đích việc tạo dịng và biểu hiện các gen là nhằm tạo ra các sản phẩm đúng như
trong cơ thể với số lượng lớn và có giá trị thương mại. Sự biểu hiện của các gen trong tế bào vi
khuẩn nhiều khi gặp trở ngại, do đó cần phải thiết kế các vector biểu hiện thích hợp cho phép gen

ngoại lai biểu hiện ở mức độ cao.
Ở Việt nam, gần đây cũng có một số th ành tựu nổi bật nghiên cứu về gen như cơng trình
nghiên cứu thiết kế và biểu hiện protein lai GnRH-TBK ở E. coli. Đây là protein lai giữa hormone
kích dục tố và một protein bất hoạt lớp 1 (trichobakin), gen GnRH -TBK lai này đã được mã hóa
có kích thước 813 bp được tạo ra bằng kỹ thuật PCR. Tổ hợp gen này được đưa vào vector biểu
hiện pET200/D-TOPO và được biểu hiện trong chủng E. coli BL21 (DE3). Kết quả điện di SDSPAGE và Western blot cho th ấy gen lai biểu hiện ổn định v à có khối lượng phân tử 30 kDa phù
hợp với tính tốn theo lý thuyết protein lai [14].
Năm 2003, Nguyễn Quỳnh Anh và cộng sự đã thành cơng trong việc tạo dịng và biểu
hiện gen mã hóa cho protein vỏ VP19 của virus WSSV gây hội chứng đốm trắng ở tơm sú tại
Việt Nam. Việc phân tích trình tự gen này cho thấy gen VP19 gồm 366 bp mã hóa cho 122 amino
acid. Gen VP19 của WSSV gây bệnh trên tơm sú tại Việt Nam có độ đồng nhất rất cao ở DNA v à
protein với các gen VP19 khác đã công bố. Gen VP19 được tạo dòng vào vector biểu hiện pEZZ
18 để biểu hiện VP19 trong tế bào chủ E. coli HB101 dưới dạng protein dung hợp A -VP19 được
tiết ra môi trường nuôi cấy. Protein này đang được tinh chế để dùng làm nguyên liệu tạo kháng
nguyên phục vụ việc phát triển kháng thể kháng VP19 và phát triển phương pháp phát hiện nhanh
WSSV trên tơm sú, góp phần trong việc giám sát, phịng ngừa dịch bệnh do WSSV tại Việt Nam
[1].


2.4. Tình hình nghiên cứu protease trong nước và trên thế giới
2.4.1. Các nghiên cứu về tách chiết, đặc điểm và ứng dụng của protease
2.4.1.1. Protease từ nguồn thực vật
Protease có thể được tìm thấy từ các nguồn khác nhau nh ư thực vật, động vật và đặc biệt
là vi sinh vật. Việc sử dụng thực vật l àm nguồn protease thường bị chi phối bởi nhiều yếu tố nh ư
thổ nhưỡng, khí hậu... Papain, bromelain, keratinase v à ficin là những protease có nguồn gốc thực
vật được biết nhiều nhất.
Bromelain được phân lập đầu tiên từ quả dứa bởi Marcano (Venezuela) năm 1891. Năm
1982, Chittenden và cs đã nghiên cứu đầy đủ về vật chất và đặt tên là bromelain, sau đó nó đư ợc
giới thiệu và được sử dụng như là protease thực vật. Ngày nay, bromelain được dùng làm dược
liệu, được sử dụng chính cho điều trị tổn th ương thực thể cho vận động viên, sử dụng điều trị các

bệnh như tiêu hóa, viêm tĩnh mạch, bệnh viêm xoang, dùng điều trị vết thương sau phẫu thuật,
điều trị chứng viêm khớp, bệnh gút, vết thâm... [27]. Enzyme n ày có tính chất như là một cystein
protease, có biên độ pH hoạt động rộng từ 3 -10 nhưng pH tối thích giữa 5 và 8 tùy cơ chất (5-6
với gelatin và hemoglobin, 7-8 với casein) và nhiệt độ tối thích 50-60oC. Nhiệt độ bất hoạt của
enzyme này là 70 oC, thấp hơn so với papain [5].
Lê Thị Thanh Mai và cs (2007) đã nghiên cứu khả năng làm mềm thịt của bromelain thu
được từ phế liệu dứa của q tr ình sản xuất dứa đóng hộp và chồi ngọn, bromelain thu được dùng
để làm mềm thịt. Kết quả nghiên cứu đã xác định điều kiện tối ưu khi dùng bromelain làm mềm
thịt bị với kích thước miếng thịt bị là 1-1,5 cm×4,0 cm×3,5 cm (cadài×r ộng); dung dịch
enzyme: 19,5-33,2 MCU/ml/cm 2; giữ miếng thịt bò trong dung dịch enzyme trong 5 phút [13].
Phạm Thị Trân Châu và cs (1993) nghiên cứu điều tra các protease ở một số loài rong
biển thuộc ba ngành rong đỏ (Rhodophyta), rong nâu (Phaeophyta) và rong lục (Chlorophyta),
đồng thời, tiến hành xác định hoạt độ thủy phân protein ở các pH 4,5; 6,5 v à 8,1. Kết quả có 30
lồi có hoạt độ phân giải casein ở pH 6, 5 và đã dự đốn rằng ở các lồi rong được nghiên cứu
protease trung tính chiếm ưu thế [4].
Papain là một protease thực vật truyền thống, đ ược sử dụng lâu đời và được tách chiết từ
trái đu đủ (Carica papaya). Papain đặc biệt bền nhiệt, chịu được nhiệt độ 700C ở pH 7 tới 30
phút; dưới dạng bột, chịu được 1000C trong 3 giờ, nhiệt độ tối thích 60-700C và pH tối thích
thường giữa 5 (với gelatin) và 7 (với casein, hemoglobin, albumin trứng) [5]. Dương Thị Hương
Giang và cs (2006) đã nghiên cứu tách chiết, điều chế và khảo sát một số tính chất của papain từ
nhựa đu đủ xanh và sử dụng papain thô từ mủ đu đủ để thủy phân bánh đậu n ành tạo sản phẩm có
giá trị dinh dưỡng cao ứng dụng trong chăn nuôi [6].


Năm 2000, Adam và cs nghiên c ứu hoạt độ protease ở lục lạp của tế bào thực vật, nhóm
nghiên cứu đã xác nhận có nhiều loại protease trong lục lạp. Các enzyme của lục lạp chịu trách
nhiệm cho việc di chuyển các peptide. Sự di chuyển oxy sẽ ảnh h ưởng xấu đến protein, làm giảm
giá trị protein, những protein phức tạp bị m ất một số thành phần hóa học hoặc cấu trúc phân tử.
Do đó, việc điều chỉnh các protease ở lục lạp đáp lại sự thay đổi điều kiện sống. Ng ược lại với
quá trình tạo chuỗi peptide là quá trình phân giải bên trong chuỗi protein, tiến trình này protease

có thể cắt hồn tồn cơ chất protein tồn tại bên trong lục lạp để di chuyển các peptide giảm ảnh
hưởng xấu đến protein. Nhiều protease ở lục lạp đ ã xác nhận và được tạo dòng. Protease tái tổ
hợp được mong chờ thay thế vai trò tương tự protease trong lục lạp [20].
Stepek và cs (2004) nghiên c ứu nhiễm khuẩn đường ruột với giun tròn, bệnh nhiễm
khuẩn này gây hậu quả nghiêm trọng đến sức khỏe của hàng triệu người trên toàn thế giới và gây
thiệt hại kinh tế cho các trang trại chăn ni. Để kiểm sốt bệnh hiện nay ng ười ta dựa rất nhiều
vào thuốc trừ giun. Các enzyme phân giải protein hoạt động làm tiêu lớp cutin giun trịn, có độc
tính thấp đã được sử dụng trong các loại thuốc truyền thống diệt giun tr òn đường ruột trong nhiều
thập kỷ qua. Nhiều loại cysteine protease từ cây trồng, các loại trái cây hoặc nhựa mủ của cây
như đu đủ, dứa và vả đã được tách chiết để điều trị bệnh. Đây đ ược xem như nguồn protease
phong phú thay thế thuốc trừ giun để chữa trị bệnh giun tr òn nhiễm khuẩn đường ruột cho người
và động vật [60].
Từ những nghiên cứu về protease có nguồn gốc thực vật ở tr ên cho thấy các enzyme này
có mặt ở nhiều lồi thực vật và phân bố trong các mơ khác nhau. Cho đến nay, ở Việt Nam các
tác giả chỉ mới tập trung nghi ên cứu tách chiết và khảo sát tính chất của các chế phẩm protease
trên các đối tượng dứa và đu đủ.

2.4.1.2. Protease từ nguồn động vật
Hầu hết các protease động vật l à trypsin dịch tụy, chymotrypsin, pepsin v à rennin đã
được nghiên cứu kỹ tính chất lý hóa, hoạt độ và cấu trúc phân tử [3].
Năm 1993, Phạm Thị Trân Châu và cs đã công bố kết quả nghiên cứu về protease của
đầu tôm biển. Với mục đích phục vụ nơng nghiệp, việc tinh sạch v à nghiên cứu một số tính chất
của protease sâu xanh đã được thực hiện bởi Phạm Thị Trân Châu và Trịnh Hồng Thái (1995)
[17].
Raju và cs (1997) đã nghiên cứu thủy phân thịt phế thải trong công nghiệp thuộc da với
nguồn enzyme thu nhận từ ruột g à [56].
Trần Quốc Hiền, Lê Việt Mẫn (2006) đã nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme từ ruột
cá basa (Pangasius bocourti). Khảo sát quá trình tách chiết và tinh sạch protease để chế biến phụ

phẩm của ngành thủy sản thành những sản phẩm có giá trị gia tăng, mang lại hiệu quả kinh tế cao
cho nhà sản xuất và giảm lượng phế liệu thủy sản gây ô nhiễm môi trường [8].
Năm 2007, Phan Thị Bích Trâm và cs đã nghiên cứu tinh sạch và khảo sát đặc điểm
protease từ trùn quắn (Pheretima posthuma). Kết quả đề tài nghiên cứu cho thấy thời gian thích
hợp cho q trình tự thủy phân để đạt hoạt tính protease cao nhất l à 4 ngày. Nhiệt độ tối ưu là
55oC, pH tối ưu là 8 và 10. Tinh sạch bằng kết tủa acetone, phối hợp với sắc ký trao đổi ion v à
tương tác kỵ nước, phân tích điện di SDS cho thấy th ành phần protease trong trùn quắn khá phức
tạp, có đến 10 phân đoạn enzyme khác nhau với khối lượng phân tử từ 24 kDa đến 58,3 kDa [19].
Do đa số nguồn protease động vật phải thu nhận từ nội tạng, không mang lại hiệu quả
kinh tế cao nên gần đây các nghiên cứu về chúng rất hạn chế so với protease thực vật v à vi sinh
vật.

2.4.1.3. Protease từ nguồn vi sinh vật
Các protease vi sinh vật có thể được thu nhận từ vi khuẩn và nấm (Rahman và cs, 2003)
[54]. Hầu hết các protease thương mại, chủ yếu là kiềm tính và trung tính, được sản xuất từ vi
sinh vật thuộc chi Bacillus [52]. Trong đó, phổ biến nhất là các lồi Bacillus subtilis [31, 48, 53,
64, 69], Bacillus stearothermophilus [63]; Bacillus thuringiensis [9]... đã được nghiên cứu tính
chất lý hóa, tạo dịng và biểu hiện gen protease.
Năm 1971 đánh dấu bước mở đầu quan trọng cho những nghi ên cứu về protease kiềm ở
Bacillus. Horikoshi là người đầu tiên công bố thu nhận và Markland đã tìm hiểu cấu trúc cơ bản
và tính chất lý hóa của protease kiềm từ Bacillus (Horikoshi, 1971) [38]. Năm 1972, Cohn đã
phát hiện và đặt tên vi khuẩn B. subtilis [52]; người ta đã nghiên cứu và đưa vào sản xuất trên quy
mô lớn các protease kiềm ở một v ài loài Bacillus. Đến thập kỷ 80, những nghi ên cứu về protease
kiềm của Bacillus tiếp tục được mở rộng và đã tạo ra hàng loạt các sản phẩm thương mại. Các vi
khuẩn Bacillus ưa kiềm trở thành “một thế giới vi sinh vật mới” theo “quan điểm công nghiệp ”
[39]. Năm 1989, Takami và cs đ ã phân lập một loài Bacillus AH 101 từ 200 mẫu đất, tạo sản
phẩm protease chịu nhiệt, sản phẩm thu đ ược đạt tới 1500 unit/ml sau 24 giờ nuôi cấy trong môi
trường kiềm (pH 9.5). Enzyme hoạt động mạnh nhất với casein ở pH 12 -13 và ổn định 10 phút ủ
600C, pH 5-13. Ion Ca ++ có hiệu quả trong việc giúp ổn định enzyme ở nhiệt độ cao. Nhiệt độ tối ưu
và thuận lợi nhất là 800C và thấp tương ứng vào khoảng 700C với sự có mặt 5 mM Ca ++. Enzyme bị bất

hoạt hồn tồn bởi phenylmethane sulphonyl fluoride (PMSF), nh ưng ít bị ảnh hưởng bởi EDTA, urea,
muối doecylbenzenesulphonate và SDS [62]. Năm 2001, Nguyễn Liêu Ba và cs đã thu nhận và tinh
sạch protease kiềm từ dịch nuôi cấy B. brevis B1 phân lập tại Hà Nội [2]. Đỗ Thị Bích Thủy
(2006) đã nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy vi khuẩn B. subtilis, các đặc điểm sinh lý, sinh hóa


và thu chế phẩm protease có hoạt tính cao d ùng để thủy phân các phế phụ phẩm trong chế biến
thủy sản [17].
Năm 1998, Nguyễn Thế Trang và cs nghiên cứu thu nhận chế phẩm protease thô từ nấm
Aspergillus oryzae bằng phương pháp nuôi cấy bề mặt [18].
Năm 2001, Brindist và cs sau khi s ử dụng các enzyme thương mại gồm protease và lipase
để thủy phân dịch sữa đã chứng minh được rằng lượng amino acid và acid béo tự do đạt cực đại
khi ủ ở 300C [28]. Các amino acid có chức năng như là tiền chất của các hợp chất tạo h ương được
tổng hợp bởi hệ thống enzyme chuyển hóa của vi khuẩn. Nh ư vậy, các enzyme gây đơng tụ đóng
vai trị quan trọng trong cơ chế chín của pho mát [17].
Một vài protease trung tính thuộc loại metallo protease cần kim loại hóa trị hai cho hoạt
động của chúng, trong khi đó một số khác thuộc loại serin protease v à không bị ảnh hưởng bởi
các hợp chất càng cua. Khi nghiên cứu metallo protease, Park và cs (2004) đã thấy rằng enzyme
của nhiều lồi vi khuẩn được tổng hợp có tiền thân l à dạng khơng hoạt động, để ngăn chặn sự
thối hóa khơng mong mu ốn và để có thể thay đổi khơng gian v à thời gian thích hợp cho hoạt
tính thủy phân. Những nghiên cứu hóa sinh về cơ cấu hoạt hóa của protease đ ã cung cấp những
hiểu biết sâu sắc về chức năng sinh lý của chúng. Mỗi protease ngoại b ào của B. subtilis được
tổng hợp là một tiền enzyme trong tế bào chất, chúng được chế biến thành enzyme trưởng thành
trong môi trường ngoại bào. Hoạt độ của protease từ B. subtilis đã được nghiên cứu và cấu tạo
enzyme subtilisin được thay đổi để trở thành dạng hoạt động theo cách tự động chế biến nội phân
tử trong môi trường ngoại bào. Hầu hết những protease ngoại bào của B. subtilis đều được hoạt hóa
theo phương thức tự động. Tuy nhiên, metallo protease không thể tự hoạt hóa, metallo protease có cơ
chất đặc trưng cao, việc nhận biết một glutamic acid nh ư là vị trí bị chẻ ra của metallo protease, sự
thay đổi glutamic acid có khả năng biến đổi q tr ình hóa học của metallo protease thành dạng hoạt
động. Tuy nhiên, quá trình tự chế biến glutamic acid bên trong chuỗi peptide không có ranh giới rõ

ràng [53].
Các nhà khoa học Pháp đã nghiên cứu một chủng Geobacillus caldoxylosilyticus kiềm
IRDO được phân lập từ một ao trong đảo san hô Tikehau, quần đảo Polynesian (Pháp). Những
chủng này có thể sinh trưởng dễ dàng và sản xuất ra protease kiềm với sự có mặt của một gram
cám lúa mì hoặc cây gạo mà khơng bổ sung thêm gì cả. Sự phát triển của G. caldoxylosilyticus
trong hệ lên men, sử dụng cám gạo hoặc thân lúa nh ư là nguồn carbon và nguồn nitơ để sản xuất
có thể đánh giá được hoạt độ protease kiềm theo thứ tự l à 1890 unit/mg và 300 unit/ mg. Tối ưu
hóa q trình sản xuất sản phẩm enzyme cũng đ ã được nghiên cứu. Dịch chiết nuôi cấy đóng vai
trị có ý nghĩa trong hoạt hóa và ổn định một phần protease kiềm tinh chế. Hoạt tính thủy phân
của protease kiềm hướng tới cải thiện cơ chất tự nhiên khác nhau với sự có mặt 0,005% dịch


chiết. Enzyme này có khả năng thủy phân keratin nh ư tóc và móng tay người, xóa những vết máu
làm tăng phạm vi ứng dụng sử dụng của dịch chiết (Esawy v à cs, 2007) [33].
Nấm tạo ra nhiều loại enzyme h ơn so với vi khuẩn, ví dụ như Aspergillus oryzae sinh ra
các protease trung tính, ki ềm tính và acid. Các protease của nấm hoạt động trong vùng pH khá
rộng (pH 4-11) và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất cao. Tuy nhiên, chúng có tốc độ phản ứng thấp
hơn và mức độ chịu nhiệt kém hơn so với các enzyme của vi khuẩn. Các protease acid của nấm
hoạt động ở pH thích hợp từ 4 -4,5 và ổn định ở pH từ 2,5 đến 6,0. Các protease trung tính của
nấm là những metallo protease có pH thích hợp l à 7 và bị bất hoạt bởi các hợp chất c àng cua [22,
58].
Sarmantar và cs (1999) đã nghiên cứu sản phẩm protease kiềm của chủng A. oryzae
U1521 ni trong mơi trư ờng lỏng chỉ có đậu nành đã loại dầu thì chủng A. oryzae cho sản lượng
protease là 584.000 unit/g. Nhưng khi cung c ấp thêm nguồn carbon, sản phẩm enzyme được gia
tăng một cách đáng kể, đặc biệt l à nguồn lactose. Bổ sung casitone hoặc casein l àm tăng khả năng
sản xuất của chủng giống, nh ưng khơng tăng nhanh. Cơng th ức trung bình là đậu nành đã loại dầu
10 g/l, lactose 5 g/l, casitone 1 g/l, và KH 2PO4 5 g/l, sản phẩm protease kiềm tăng th êm của chủng
A. oryzae là 1521 unit/g và tối đa là 1.410.000 unit/g đậu nành đã loại dầu. Thí nghiệm sản xuất
với 40 g cơ chất trong 5 lít dịch lên men, hoạt độ enzyme tối đa ở pH 8 -9 và nhiệt độ là 450C
[58]. Chìa khóa hấp dẫn nhất cho việc thương mại hóa sản phẩm enzyme ở vi khuẩn v à nấm là

chúng sử dụng nguồn carbon và nitơ cho quá trình sản xuất protease là rẻ hơn so với sản xuất
từ động vật và thực vật (Esawy và cs, 2007) [33]. Do đó, trong cơng nghiệp sản xuất enzyme
người ta ưu tiên sử dụng vi sinh vật để sản xuất protease.
Nổi tiếng nhất trong các protease kiềm tính l à subtilisin. Có hai loại subtilisin là subtilisin
Carlberg và subtilisin BPN. Ngoài ra, cịn có các protease được sinh ra từ Bacillus ưa kiềm. Hơn
20 năm qua subtilisin được xem như là một loại protease tẩy rửa và đã được sản xuất ở qui mô
công nghiệp (Maurer và cs, 2004) [46].
Từ những nghiên cứu về protease có nguồn gốc động vật, thực vật v à vi sinh vật cho thấy
protease có mặt ở nhiều lồi và phân bố trong các mơ khác nhau. Cho đ ến nay, ở Việt Nam các
tác giả chỉ mới tập trung nghi ên cứu tách chiết và khảo sát tính chất của các chế phẩm protease
trên một số đối tượng. Nghiên cứu thăm dò khả năng tạo dòng và biểu hiện gen protease ở các
loài phổ biến ở Việt Nam, đặc biệt là ở vi khuẩn, sẽ góp phần tăng tiềm năng ứng dụng của chúng
ở qui mô công nghiệp.


2.4.2. Các nghiên cứu tạo dòng và biểu hiện gen mã hóa protease
Cũng như các gen khác, người ta đã thành cơng trong tạo dịng phân tử, phân tích trình tự
nucleotide và biểu hiện gen mã hóa protease kiềm từ nhiều loài Bacillus [32, 39]. Các chủng vi
sinh vật chủ được sử dụng để biểu hiện gen m ã hóa subtilisin: Escherichia coli (BL21, C600, HB
101, JM 109), Bacillus subtilis (I-168, DB110), nấm (Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus
oryzae, Streptococcus cremoris, Streptomyces lividans ). Trong đó, các chủng B. subtilis được sử
dụng nhiều nhất vì đã được nghiên cứu tương đối đầy đủ về đặc điểm sinh lý, hóa sinh và di
truyền với toàn bộ genome đã được xác định [42]. So với E. coli, B. subtilis có ưu điểm là vi
khuẩn Gram dương không gây bệnh và không chứa độc tố. Tuy nhiên chúng có nhược điểm là
plasmid tái tổ hợp chứa DNA ngoại lai thiếu bền vững. Do đó, để khảo sát đặc tính một enzyme
mới người ta thường lựa chọn biểu hiện trên E. coli trước. Sau đó, khi sản xuất protein l ượng lớn
mới chuyển sang hệ thống biểu hiện của B. subtilis.
Gần đây, các gen mã hóa protease ki ềm từ nhiều lồi Bacillus đã được tạo dịng, phân
tích trình tự nucleotide và biểu hiện thành cơng. Các vector biểu hiện thường dùng để biểu hiện
gen mã hóa subtilisin là: pET22b (+), pBS42, pUB110, pHY300PLK, pS1, pUC118, pUC119...

Yang và cs (1984) đã tạo dịng, xác định trình tự nucleotide gen protease trung tính của
Bacillus, gen này được sử dụng để tạo dạng đột biến mất đoạn và thay thế cho gen hoang dại. Với
đột biến mất đoạn này, kết hợp với việc loại bỏ protease kiềm, dẫn đến protease ho àn tồn khơng
được tổng hợp. Sự thiếu vắng enzyme protease khơng có ảnh h ưởng lên sự sinh trưởng, hình thái và
hình thành bào tử của vi khuẩn B. subtilis [69].
Năm 1993, Harcum và cs đã nghiên cứu tạo dịng, định lượng và phân tích trình tự của các
gen protease tái tổ hợp trong E. coli. Kết quả điện di dịch chiết tế b ào thô trên polyacrylamide gel
với sự có mặt của SDS và một cơ chất không đặc hiệu được sử dụng là gelatin hoặc casein. Sau
khi điện di gel được nhuộm với Coomassie brilliant blue, SDS đ ược rửa bằng 2,5% (v/v) triton X 100 và hoạt tính protease biểu hiện r õ trên vùng gel nhuộm do protease phân giải cơ chất [40].
Lee và cs (1998) đã thành công trong biểu gen protease chịu nhiệt trung tính của
Thermoactinomyces E79 trong E. coli và nghiên cứu những điều kiện để tách chiết v à tinh sạch
protease tái tổ hợp hoàn chỉnh [43]
Ramalho-Ortigao và cs (2003) đã tạo dịng và xác định trình tự gen protease trypsin và
chymotrypsin từ dạ dày của ruồi cát là động vật truyền bệnh Phlebotomus papatasi. Những
protease trypsin và chymotrypsin có kh ả năng ngăn chặn sự phát triển ký sinh tr ùng trong dạ dày
ruồi và việc tạo ra protease tái tổ hợp l à nhằm ngăn chặn bệnh truyền nhiễm n ày [55].