SOUKANYA SOULINTHONG NGHIÊN cứu CHIẾT XUẤT EMODIN và PHYSCION từ cốt KHÍ củ (RADIX POLYGONI CUSPIDATI) KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

SOUKANYA SOULINTHONG

NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT EMODIN
VÀ PHYSCION TỪ CỐT KHÍ CỦ (RADIX
POLYGONI CUSPIDATI)
KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI- 2021


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

SOUKANYA SOULINTHONG
MÃ SINH VIÊN: 1601671

NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT EMODIN
VÀ PHYSCION TỪ CỐT KHÍ CỦ (RADIX
POLYGONI CUSPIDATI)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn: ThS. Phạm Thái Hà Văn
Nơi thực hiện: Bộ môn Dược học cổ truyền
Trường Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI- 2021


LỜI CẢM ƠN

Trong q trình nghiên cứu và hồn thành khóa luận này, em đã nhận được rất
nhiều sự giúp đỡ quý báu từ thầy cô, bạn bè và gia đình.
Trước hết, em xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới ThS. Phạm Thái Hà Văn,
người thầy đã tận tình hướng dẫn, hết lịng chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ
em trong quá trình học tập, nghiên cứu, hồn thành khóa luận.
Em xin cảm ơn các thầy cô của Bộ môn Dược cổ truyền đã tạo điều kiện thuận
lợi cho em được nghiên cứu thực nghiệm tại bộ mơn.
Em xin cảm ơn các thầy cơ Phịng Đào tạo, Phòng Quản lý sinh viên đã tạo
điều kiện thuận lợi cho em được học tập và nghiên cứu tại trường.
Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô Trường Đại học Dược Hà Nội
đã truyền đạt cho em những kiến thức quý báu giúp em học tập và phát triển bản
thân mình hơn.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến những người thân trong gia đình,
bạn bè đã quan tâm, ủng hộ, động viên trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu
và thực hiện đề tài.
Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn những sự giúp đỡ quý báu đó.
Hà Nội, ngày 31 tháng 5 năm 2021
Sinh viên

Soukanya SOULINTHONG


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ ...................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................... 2

1.1. Tổng quan về Cốt khí củ.......................................................................... 2
1.1.1. Tên khoa học......................................................................................... 2
1.1.2. Đặc điểm thực vật ................................................................................. 2
1.1.3. Phân bố, sinh thái .................................................................................. 3
1.1.4. Cách trồng ............................................................................................. 3
1.1.5. Bộ phận dùng ........................................................................................ 3
1.1.6. Thành phần hóa học .............................................................................. 4
1.1.7. Tác dụng dược lý .................................................................................. 5
1.1.8. Một số bài thuốc có Cốt khí củ ............................................................. 6
1.2. Tổng quan về emodin, physcion.............................................................. 6
1.2.1. Emodin .................................................................................................. 6
1.2.2. Physcion ................................................................................................ 8
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 11
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu ................................................. 11
2.1.1. Nguyên liệu ......................................................................................... 11
2.1.2. Thiết bị và hóa chất............................................................................. 11
2.2. Nội dung nghiên cứu .............................................................................. 12
2.3. Phương pháp nghiên cứu....................................................................... 12
2.3.1. Phân lập emodin và physcion bằng sắc ký lớp mỏng điều chế .......... 12
2.3.2. Phân lập emodin và physcion bằng sắc kí cột .................................... 13
2.3.3. Định lượng emodin và physcion bằng phương pháp TLC - UV ........ 15


2.3.4. Phương pháp xử lý số liệu .................................................................. 17
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN ....................... 18
3.1. Phân lập emodin và physcion bằng sắc ký lớp mỏng điều chế .......... 18
3.2. Chiết xuất Emodin và Physcion bằng sắc kí cột ................................. 22
3.2.1. Chiết hỗn hợp anthranoid từ cốt khí củ .............................................. 22
3.2.2. Phân lập emodin và physcion bằng sắc kí cột .................................... 22
3.3. Định lượng emodin và physcion trong các cắn EtOAc và cắn phân

đoạn Toluen ................................................................................................... 27
3.3.1. Xây dựng phương pháp ...................................................................... 27
3.3.2. Định lượng emodin và physcion trong các mẫu cắn .......................... 35
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................... 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CKC:

Cốt khí củ

DĐVN:

Dược điển Việt Nam

MeOH:

Methanol

EtOH:

Ethanol

EtOAc:

Ethyl acetat

TB:

Trung bình

SD:

Độ lệch chuẩn (Standard Deviation)

RSD:

Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)

UV:

Ultraviolet

HPLC:

High-performance liquid chromatography

SKLM:

Sắc kí lớp mỏng


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1. Khối lượng cao toàn phần thu được từ dịch chiết bột cốt khí củ. ...... 18
Bảng 3.2. Khảo sát tỉ lệ khối lượng cao chiết và dung môi ................................ 18
Bảng 3.3. Các phân đoạn thu được từ sắc kí cột thứ nhất................................... 22
Bảng 3.4. Các phân đoạn thu được từ sắc kí cột thứ hai..................................... 23
Bảng 3.5. Peak hấp thụ của emodin phân lập từ Cốt khí củ ............................... 25
Bảng 3.6. Peak hấp thụ của physcion phân lập từ Cốt khí củ ............................. 25

Bảng 3.7. Kết quả đo độ hấp thụ quang khảo sát khoảng tuyến tính emodin..... 28
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống - emodin ....................... 29
Bảng 3.9. Kết quả đo quang khảo sát khoảng tuyến tính Physcion .................... 32
Bảng 3.10. Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống - physcion ................... 33
Bảng 3.11. Kết quả định lượng emodin trong các mẫu cắn ................................ 35
Bảng 3.12. Kết quả định lượng physcion trong các mẫu cắn ............................. 35


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Công thức một số anthraquinon và naphthoquinon trong rễ Cốt khí củ
............................................................................................................................... 4
Hình 1.2. Cơng thức cấu tạo một số stilben trong rễ Cốt khí củ........................... 5
Hình 1.3. Cơng thức cấu tạo của emodin .............................................................. 6
Hình 1.4. Cơng thức cấu tạo của physcion............................................................ 8
Hình 2.1. Hình ảnh dược liệu Cốt khí củ ............................................................ 11
Hình 3.1. Sắc kí đồ khảo sát tỉ lệ cao:dung mơi.................................................. 19
Hình 3.2. Sắc kí đồ của cao tồn phần cốt khí củ (366nm) ................................ 20
Hình 3.3. Phổ hấp thụ UV của emodin phân lập từ cốt khí củ bằng sắc ký lớp
mỏng .................................................................................................................... 20
Hình 3.4. Phổ hấp thụ UV của physcion phân lập từ cốt khí củ bằng sắc ký lớp
mỏng .................................................................................................................... 20
Hình 3.5. Sơ đồ quy trình phân lập emodin và physcion từ cốt khí củ bằng sắc ký
lớp mỏng.............................................................................................................. 21
Hình 3.6. Sắc kí đồ (366nm) kiểm tra các phân đoạn từ sắc kí cột thứ nhất ...... 22
Hình 3.7. Sắc kí đồ (366nm) kiểm tra các phân đoạn từ sắc kí cột thứ hai ........ 24
Hình 3.8. Sắc kí đồ (HPLC) của emodin phân lập từ Cốt khí củ........................ 25
Hình 3.9. Sắc kí đồ (HPLC) của physcion phân lập từ Cốt khí củ ..................... 25
Hình 3.10. Sơ đồ quy trình chiết xuất emodin và physcion từ Cốt khí củ bằng sắc
kí cột theo hai phương pháp ................................................................................ 26
Hình 3.11. Sắc kí đồ khảo sát khoảng tuyến tính của Emodin ........................... 27

Hình 3.12. Đồ thị sự phụ thuộc độ hấp thụ quang theo nồng độ emodin ........... 28
Hình 3.13. Sắc kí đồ khảo sát tính phù hợp của hệ thống – emodin................... 30
Hình 3.14. Sắc kí đồ khảo sát khoảng tuyến tính của Physcion ......................... 31
Hình 3.15. Đồ thị sự phụ thuộc độ hấp thụ quang theo nồng độ physcion ......... 32
Hình 3.16. Sắc kí đồ khảo sát tính phù hợp của hệ thống – Emodin .................. 34
Hình 3.17. Sắc kí đồ định lượng emodin và physcion trong các mẫu cắn.......... 36


ĐẶT VẤN ĐỀ
Hợp chất anthranoid là nằm trong nhóm lớn hydroxyquinon, trong đó dẫn chất
1,8-dihydroxyquinon có nhiều hoạt tính sinh học mạnh như nhuận tẩy, thơng mật,
kích thích miễn dịch, chống ung thư….Các tác dụng này phụ thuộc nhiều vào hàm
lượng và liều dùng. Lượng nhỏ hỗ trợ tiêu hóa, lượng trung bình tác dụng nhuận,
lượng cao gây xổ, vậy nên việc xác định hàm lượng các chất này trong dược liệu
là cần thiết. Để phục vụ việc nghiên cứu, đánh giá các chất nhóm anthranoid trong
dược liệu cần thiết phải có các chất đối chiếu tương ứng, chúng có thể được điều
chế hay phân lập từ những nguồn dược liệu có chứa hàm lượng cao các chất này.
Các hợp chất này thường gặp trong các họ thực vật như Polygonaceae,
Saesalpiniaceae, Rhamnaceae, ngồi ra cịn có nấm và địa y. Tại Việt Nam có
Polygona cuspidatum tên thường gọi là Cốt khí củ thuộc họ Rau răm
(Polygonaceae) là loại cây mọc hoang và được trồng ở nhiều nơi, đây là một
nguồn nguyên liệu rất giàu các hợp chất anthranoid, trong đó nổi bật là emodin và
physcion ở cả dạng tự do và dạng glycosid. Phương pháp chiết xuất các anthranoid
thì khá đơn giản tuy nhiên để tách riêng các dẫn chất lại khơng dễ dàng. Có thể
sử dụng độ hịa tan khác nhau trong môi trường kiềm khác nhau, nhưng sự phân
chia khơng được tách bạch mà thường cịn lẫn chất này với một ít chất khác. Hơn
nữa emodin và physcion có các tính chất giống nhau rất nhiều, pKa cũng xấp xỉ
nhau nên việc điều chế riêng từng chất tinh khiết với lượng lớn vẫn đang được
nghiên cứu. Xuất phát từ điều đó, nhóm nghiên cứu đề xuất đề tài “Nghiên cứu
chiết xuất emodin và physcion từ cốt khí củ (Radix Polygoni cuspidati)” với

mục tiêu:
1. Chiết xuất, phân lập được emodin và physcion từ cốt khí củ.
2. Định lượng được emodin và physcion bằng phương pháp TLC-UV.

1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về Cốt khí củ
1.1.1. Tên khoa học
Cốt khí củ có tên khoa học là Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc., họ Rau
răm (Polygonaceae) và có tên khoa học đồng nghĩa khác là Reynoutria japonica
Houtt., Polygonum reynoutria Mak., Reynoutria elata Nak.
Một số tên gọi khác của Cốt khí củ ở Việt Nam như điền thất, hổ trượng căn,
phù linh, nam hoàng cầm, co hớ hườn (Thái), mèng kẻng (Tày), hồng lìu (Dao)
[2], [4].
Theo phân loại thực vật học [31] Cốt khí củ thuộc
Giới Thực vật
Ngành Magnoliophyta
Lớp Magnoliopsida
Bộ Polygonales
Họ Polygonaceae
Phân họ Polygonoideae
Chi Reynoutria.
1.1.2. Đặc điểm thực vật
Cây nhỏ, sống lâu năm. Rễ phình thành củ cứng, mọc bị nghiêng dưới đất, vỏ
ngồi màu nâu đen, ruột màu vàng. Thân hình trụ, nhẵn, mọc thẳng đứng, cao 0,5
– 1m, thường có những đốm màu tím hồng. Lá mọc so le, cuống ngắn, hình trứng,
đầu tù, hơi nhọn, mép nguyên, dài 5 – 12cm, rộng 3,5 – 8 cm, mặt trên màu lục
sẫm, có khi nâu đen; bẹ chìa ngắn [2], [4].

Cụm hoa ngắn hơn lá, mọc thành chùm ở kẽ lá; hoa nhỏ màu trắng, hoa đực và
hoa cái riêng; bao hoa có 5 phiến; hoa đực có 8 nhị; hoa cái có bầu ba góc [2], [4].
Quả 3 cạnh, màu nâu đỏ [2], [4].
Mùa hoa quả: tháng 10 – 11 [2], [4].
Cây dễ nhầm lẫn:
Nhiều cây cũng mang tên “cốt khí” như cốt khí muồng hay cốt khí hạt (Cassia
occidentalis L.) thuộc họ Vang (Caesalpiniaceae), cốt khí thân tím (T. purpurea
2


Pers.), cốt khí thân trắng (Tephrosia candida DC.) họ Đậu (Fabaceae) và cốt khí
dây (Sabia olacifolia Stapf )họ Thanh phong (Sabiaceae).
1.1.3. Phân bố, sinh thái
Cốt khí củ có nguồn gốc ở vùng Đông Nam Á, sau lan xuống khắp vùng cận
nhiệt đới và nhiệt đới, bao gồm Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản, Việt Nam,
Lào và một vài nơi khác. Ở Việt Nam, cây mọc hoang dại ở vùng núi cao, từ 1000
– 1600 m và được trồng rải rác trong nhân dân ở vùng trung du và đồng bằng Bắc
Bộ [2], [4].
Cốt khí củ ưa sáng, ưa ẩm thường mọc thành khóm trong các thung lũng, nơi
gần nguồn nước (Sa Pa). Cây rụng lá vào mùa đông; ra hoa quả nhiều hàng năm,
có khả năng mọc chồi từ thân rễ. Do hiếm gặp trong tự nhiên, nên có tác giả đã
đưa cốt khí củ vào Sách Đỏ Việt Nam, 1996 đê lưu ý bảo vệ [2].
1.1.4. Cách trồng
Cốt khí củ thường được trồng trong vườn, trên bờ ao hoặc quanh nhà ở trung
du và đồng bằng. Cây ưa đất ẩm nhưng ráo nước. Úng ngập dễ bị thối củ.
Cốt khí củ được nhân giống bằng đoạn rễ mang mầm. Khi thu hoạch, những rễ
bên được tách ra, giâm trong cát ẩm, đến mùa xuân thì đem ra trồng. Đất sau khi
chuẩn bị, làm sạch cỏ, được đánh thành luống cao 25 – 30 cm, rộng 60 – 70 cm.
Cây con được trồng với khoảng cách 20 – 30 cm, phủ một lớp đất sâu 2 – 3cm.
Rễ cây ăn nơng, vì vậy phải thường xun vun gốc, kết hợp làm cỏ.

Cây sinh trưởng mạnh từ mùa xuân đến mùa thu, bắt đầu cho thu hoạch củ từ
tháng 9 trở đi. Tốt nhất nên thu vào những ngày nắng ráo trong mùa đông, khi
phần thân lá bắt đầu héo. Sau khi cắt bỏ thân lá, dùng cuốc, xẻng đào lấy rễ củ,
rửa sạch, thái lát và phơi khơ. Cũng có thể thu hoạch vào đầu mùa xuân, trước khi
cây tái sinh. Thời điểm này vừa thuận lợi cho việc thu hoạch vừa không mất công
bảo quản giống.
1.1.5. Bộ phận dùng
Rễ cốt khí củ thu hái quanh năm, tốt nhất vào mùa thu – đông, rửa sạch đất cát,
cắt bỏ rễ con, thái thành miếng nhỏ dày chừng 1 – 2cm, phơi hoặc sấy khơ. Dược
liệu có mặt ngồi nâu xám, sần sùi nhăn nheo theo chiều dọc, có các mấu đốt và
3


gióng, mặt cắt ngang màu vàng bẩn, lõi gần như rỗng, phần khơng rỗng có màu
nâu sẫm. Chất nhẹ, hơi cứng, mùi không rõ, vị hơi đắng .
Y học cổ truyền dùng cốt khí củ thay hồng cầm với tên hồng cầm nam.
1.1.6. Thành phần hóa học
1.1.6.1. Nhóm chất quinon
Cốt khí củ được nghiên cứu đầu tiên vào những năm 1950. Thời điểm đó, các
quinon và các dẫn xuất của nó đã được phân lập và xác định cấu trúc hóa học.
Trong rễ Cốt khí củ, các quinon bao gồm nhóm anthraquinon (hàm lượng lớn)
và nhóm naphthoquinon [19], [24], [26], [28], [32], [40]. Các anthraquinon có cấu
trúc khung emodin như physcion, emodin, chrysaphanol, rhein,

falacinol,

citreorosein, questin, questinol, anthraglycosid A – B, anthraquinones polyganin
A – B. Ba naphthoquinon là 2-methoxy-6-acetyl-7-methyljuglon, cuspidatumin A
và 7-acetyl-2-methoxy-6-methyl-8-hydroxyl-4-naphthoquinon cũng đã được
phân lập từ rễ Cốt khí củ.

Hình 1.1. Công thức một số anthraquinon và naphthoquinon trong rễ
Cốt khí củ
1.1.6.2. Nhóm chất stilben
Stilben là một nhóm chất có chung một cấu trúc mạch cacbon là C6-C2-C6.
Stilben thuộc nhóm các hợp chất phenylpropanoids. Một số stilbenoid đã được
tìm thấy trong thực vật và khẳng định về hoạt tính đặc trưng của chúng như
piceatannol có trong rễ của cây vân sam Na Uy. Hay pinosylvin là một độc tố nấm
bảo vệ gỗ khỏi bị nhiễm nấm, được tìm thấy trong cây họ thơng [6].
Trong rễ cây Cốt khí củ, nhiều nghiên cứu trong nước và trên thế giới đã nghiên
cứu và xác định sự có mặt của nhóm stilben. Trong đó hai stilben chính là
4


resveratrol và dẫn xuất của nó là polydatin đã được phân lập và xác định cấu trúc
vào năm 1963 [28]. Đến năm 2004, hai stilben khác là resveratrol 4-O-D-(2’galloyl)-glucopyranoside và resveratrol 4-O-D-(6’-galloyl)-glucopyranoside đã
được xác định từ dịch chiết methanol 70% của rễ Cốt khí củ [15].

Hình 1.2. Cơng thức cấu tạo một số stilben trong rễ Cốt khí củ
1.1.6.3. Các nhóm chất khác
Trong rễ Cốt khí củ có chứa các flavonoid thuộc nhóm flavonol như: quercetin,
dẫn chất của quercetin và dạng glycosid, catechin và dạng glycosid của nó [1],
[23]
Ngồi ra trong rễ Cốt khí củ cịn chứa các hợp chất thuộc nhóm coumarin như
7-hydroxy-4-methoxy-5-methylcoumarin…, [65], các lignan như natri (-)lyoniresinol-2a-sulfat và natri (+)-isolaricireinol-2a-sulfat [59] và các hợp chất
khác như acid gallic, tryptophan, β-sitosterol… .
1.1.7. Tác dụng dược lý
Sự phong phú về thành phần hóa học và các nhóm chất có hoạt tính sinh học
cao làm cho Cốt khí củ có nhiều tác dụng sinh học quý giá. Trên thế giới có rất
nhiều nghiên cứu về tác dụng sinh học của Cốt khí củ với các định hướng sinh

học khác nhau như: tác dụng kháng khuẩn [23]; tác dụng chống viêm [14]; tác
dụng chống oxy hóa [16]; tác dụng hạ lipid [29]; tác dụng kháng u, chống ung thư
[39] và tiềm năng điều trị đái tháo đường [38].

5


1.1.8. Một số bài thuốc có Cốt khí củ
Bài thuốc 1:
Cốt khí củ

15g

Lá bìm bìm

20g

Gối hạc

15g

Mộc thơng

20g

Cơng dụng: điều trị phong thấp, viêm khớp đầu gối, mu bàn chân sưng đau
nhức
Cách dùng: sắc lấy nước uống
Bài thuốc 2:
Cốt khí củ

15g

Chút chít

15g

Lá móng

20g

Cơng dụng: trị viêm gan cấp tính
Cách dùng: sắc lấy nước uống
Bài thuốc 3:
Cốt khí củ

20g

Lá móng

30g

Cơng dụng: dùng chữa thương tích, ứ máu, đau bụng
Cách dùng: sắc cịn 150 ml, pha thêm 20 ml rượu, chia làm 2 lần, uống trong
ngày
1.2. Tổng quan về emodin, physcion
1.2.1. Emodin
1.2.1.1. Tính chất vật lý và hóa học

Hình 1.3. Cơng thức cấu tạo của emodin

- Tên đầy đủ: 1,3,8-trihydroxy-6-methylanthracene-9,10-dion
- Công thức phân tử: C15H10O5
- Khối lượng phân tử: 270,24 g/mol
6


- Các đỉnh hấp thụ đặc trưng trên phổ UV – Vis: 223, 254, 267, 290, 440
(nm).
- Ở điều kiện nhiệt độ phòng, Emodin tồn tại ở trạng thái bột kết tinh hoặc
tinh thể hình kim màu vàng cam. Nhiệt độ nóng chảy khoảng 256 – 257 oC.
Emodin tan tốt trong dung môi hữu cơ như ether, ether dầu hỏa, cloroform,
methanol…, không tan trong nước.
1.2.1.2. Tác dụng dược lý
a. Tác dụng chống ung thư
Jin và cộng sự đã lần đầu tiên chứng minh rằng emodin có khả năng ức chế sự
di căn của tế bào ung thư vú bằng cách ức chế sự hồi phục của các đại thực bào
M2 trong phổi [18]. Trong một nghiên cứu khác, sự kết hợp emodin và curcumin
đã ức chế sự gia tăng và xâm lấn của các tế bào ung thư vú bằng cách tăng sự hiện
diện của miR-34a [11].
Way và cộng sự đã chứng minh rằng emodin đã ức chế đáng kể sự di chuyển
và xâm lấn của tế bào TWIST bằng cách ức chế các con đường tổng hợp βcatechin và Akt [35].
b. Tác dụng chống viêm
Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng emodin có tác dụng chống viêm trên chuột bị hoại
tử bằng cách tăng sinh tế bào mCD14 và ức chế TNF-α, IL-6, IL-1β trong huyết
thanh [27]
Trong một nghiên cứu khác, Gao và cộng sự đã làm sáng tỏ các thành phần
hoạt tính kháng viêm của thuốc bơi sẹo trị liệu Jiashitang, bao gồm saffiomin,
emodin, salvianolic acid, tanshinone và các dẫn chất saponin triterpenoid. Trong
số các chất này, emodin được dự đốn sẽ gây tác dụng ức chế NF-κB thơng qua
các con đường tổng hợp MAPK, PI3K/AKT và NIK – IKK [20]

c. Tác dụng kháng khuẩn
Emodin có tác dụng kháng khuẩn đáng kể trên các vi khuẩn Gram dương được
thử nghiệm, đặc biệt là Bacillus subtilis và Staphylococcus aureus. Giá trị nồng
độ kháng sinh ức chế vi khuẩn tối thiểu (MIC) của emodin là 28,9 và 14,4 µm [7].
Tuy nhiên, emodin khơng có tác dụng trên hai vi khuẩn Gram âm (Klebsiella
7


pneumoniae và Escherichia coli) ở nồng độ cao nhất (1851,9 µm) đã được thử
nghiệm.
d. Các tác dụng khác
Ngoài ra, emodin cịn được báo cáo có tác dụng giảm đau, kháng virus, ức chế
miễn dịch, tác dụng bảo vệ thần kinh, chống tiểu đường, bảo vệ tế bào gan… [3]
1.2.2. Physcion
1.2.2.1. Tính chất vật lý và hóa học

Hình 1.4. Cơng thức cấu tạo của physcion
- Tên đầy đủ: 1,8-dihydroxy-3-methoxy-6-methylanthracen-9,10-dion
- Công thức phân tử: C16H12O5
- Khối lượng phân tử: 284,26 g/mol
- Các đỉnh hấp thụ đặc trưng trên phổ UV – Vis: 226, 255, 267, 288, 440
(nm).
- Ở nhiệt độ phòng, Physcion có dạng tinh thể hình kim, màu vàng. Nhiệt độ
nóng chảy 203 – 207 oC. Physcion tan trong ethanol sôi, benzen, cloroform,
ether, aceton, acid acetic…; khơng tan trong nước, ít tan trong ethanol lạnh,
rất ít tan trong ether dầu hỏa.
1.2.2.2. Tác dụng dược lý
a. Tác dụng chống ung thư
Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng physcion có khả năng cảm ứng các tế
bào apoptotic đã chết để chống lại các tế bào ung thư khác nhau. Physcion gây ra

quá trình tự chết của các tế bào bệnh bạch cầu nguyên bào lympho cấp tính ở
người một cách có hiệu quả thông qua việc điều chỉnh giảm sự biểu hiện của
HOXA5 [10], thể hiện hiệu ứng gây apoptosis bằng cách tăng các biểu hiện của
poly- (adenosine diphosphate phân cắt ribose) polymerase (PARP) và caspases8


3/8/9 bị phân cắt, và giảm dần biểu hiện của Bcl-2 và Bid trong tế bào ung thư vú
[17], làm tăng đáng kể tỷ lệ apoptosis của tế bào ung thư đại trực tràng ở người
[25].
Physcion còn cho thấy các hoạt động chống ung thư bằng cách làm gián đoạn
chu kỳ tế bào khối u. Gao F và cộng sự [10] báo cáo rằng physcion có hiệu quả
gây ra sự bắt giữ tất cả chu kỳ tế bào trong pha G1 thông qua việc ức chế sự biểu
hiện của HOXA5, nó cũng gây ra sự bắt giữ G1 của tế bào CNE2 thơng qua các
tín hiệu p21 và p27 điều hòa lên và cyclin điều hòa xuống D1 và E.
Physcion có thể làm giảm khả năng di căn của tế bào ung thư cổ tử cung thơng
qua việc kích hoạt AMPK và ngăn chặn các hoạt động của RhoA và Rac1 [13]
Physcion giúp tăng sự nhạy cảm của hóa trị liệu chống lại tế bào khối u thông
qua các cơ chế khác nhau. Nó tăng cường sự nhạy cảm của các tế bào bệnh bạch
cầu nguyên bào tủy mãn tính với adriamycin bằng cách tăng q trình apoptosis
thơng qua việc điều hịa lên tín hiệu miR-146a [33]. Physcion tăng cường rõ rệt
các tác dụng chống tăng sinh và tạo tế bào gốc của paclitaxel, doxorubicin và
cisplatin chống lại các tế bào HCC bằng cách gây ra sự ức chế chuyển hóa
NADPH và oxy hóa thơng qua việc kích hoạt con đường AMPK [12]
Physcion lần đầu tiên được báo cáo là chất ức chế cụ thể của glucose-6phosphate dehydrogenase (G6PD) bởi Ruiting Lin và cộng sự [30]. Nghiên cứu
của họ đã chứng minh rằng physcion có hiệu quả ngăn chặn sự tăng sinh tế bào
và giảm khả năng sống của tế bào đối với các tế bào khối u đa dạng bao gồm
K562, H1299, A549, 212LN, MDA-MB-231 và các tế bào bạch cầu nguyên phát
ở người.
b. Tác dụng kháng khuẩn
Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng physcion thể hiện hoạt động diệt nấm đáng kể.

Nó ức chế hiệu quả sức sống của Rhyzoctonia solani, Botridis cinerea và Candida
albicans với MIC 31,3μg / mL, 62,5μg / mL và 62,5μg / mL [5]; nó cũng cho thấy
các hoạt động diệt nấm mạnh đến trung bình chống lại Phytophthora infestans,
Botridis cinerea, Rhyzoctonia solani và Erysiphe graminis với liều 0,25, 0,5 và 1
g / L [37].
9


Physcion có hoạt tính kháng khuẩn đáng kể chống lại S. aureus, S. epidermidis
và P. aeruginosa [21]. Physcion có thể ức chế sự sản sinh màng sinh học của S.
aureus và E. faecalis, nó cũng tăng cường độ nhạy của beta-lactamase E. colistrain
phổ mở rộng và enterococcus E. faecalis kháng vancomycin với cefotaxime và
vancomycin [34].
c. Tác dụng chống viêm
Physcion có thể làm suy giảm đáng kể NO sản xuất trên các tế bào MH-S được
xử lý bằng lipopolysaccharide (LPS) [22], làm giảm tổng hợp NO và PGE2 thông
qua iNOS và COX-2 giảm dần, và ức chế bài tiết TNF-α bằng cách ức chế protein
hoạt hóa mitogen kinase (MAPK) và kích hoạt NF-κB [1], có thể làm giảm q
trình điều hịa hóa học qua trung gian CXCR4 của tế bào Jurkat E6.1 bằng cách
ức chế con đường MEK / ERK [41], nó cũng làm giảm sự di chuyển của tế bào
HSC-T6
d. Tác dụng khác
Các nghiên cứu còn chỉ ra một số tác dụng khác của physcion như chống oxy
hóa bằng cách dọn 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), ức chế enzzym
tyrosinase, điều hòa lipid, bảo vệ thần kinh, chống tăng đường huyết ở chuột mắc
bệnh tiểu đường, giảm nhãn áp của chuột bị bệnh tăng nhãn áp di truyền, đối
kháng với tác dụng của adrenaline chống lại cơ trơn đường ruột của chuột thông
qua liên kết với thụ thể adrenergic, diệt nhuyễn thể chống lại ốc sên Oncomelania
hupensis và Biomphalaria glabrata…[36].

10


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu
2.1.1. Nguyên liệu
- Nguyên liệu Cốt khí củ được mua tại Cơ sở kinh doanh và chế biến dược
liệu An Bình, xã Nghĩa Trai, huyện Văn Lâm, tỉnh Hưng Yên.

Hình 2.1. Hình ảnh dược liệu Cốt khí củ
2.1.2. Thiết bị và hóa chất
Thiết bị máy móc và dụng cụ thí nghiệm
- Bể siêu âm WiseClean.
- Máy cất cô chân không IKA RV8.
- Máy đo quang phổ HITACHI 1800.
- Máy ly tâm HERMLE Z 207 A.
- Hệ thống máy sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao gồm: Máy phun mẫu bán tự
động CAMAG LINOMAT 5, Bình triển khai sắc ký CAMAG, Máy chụp
ảnh bản mỏng CAMAG TLC VISUALIZER, phần mềm winCATS.
- Bản mỏng HPTLC Silica gel 60 F254 (Merk) TLC.
- Tủ sấy MEMMERT.
- Cân kỹ thuật, độ chính xác 0,01g.
- Cân phân tích, độ chính xác 0,0001g.
- Máy xay bột
- Cồn kế.
11


- Các dụng cụ thủy tinh cần thiết khác (bình nón, bình định mức, ống nghiệm,
cốc có mỏ, ống đong, pipet…)

Hóa chất
-

Ethanol tuyệt đối, Methanol, Ethyl Acetat, Toluen, Acid Acetic băng,

Aceton, Acid Fomic, n – Hexan (Trung Quốc) đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích
(PA). Ethanol 96%, nước cất đạt tiêu chuẩn DĐVN V.
-

Chất đối chiếu: Emodin, Physcion (Trung Quốc, phịng thí nghiệm).

2.2. Nội dung nghiên cứu
- Khảo sát một số phương pháp chiết xuất anthranoid từ Cốt khí củ
- Phân lập emodin và physcion
- Định tính, định lượng emodin và physcion bằng TLC-UV
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phân lập emodin và physcion bằng sắc ký lớp mỏng điều chế
Với phương pháp này, đầu tiên chúng tôi tiến hành chiết cao tồn phần từ dược
liệu cốt khí củ bằng cách: cân khoảng 50g bột dược liệu cho vào bình cầu, thêm
250-300ml cồn 70°, chiết hồi lưu trong 90 phút, quá trình chiết được lặp lại 3 lần.
Các dịch chiết được gộp lại và cô loại dung môi dưới áp suất giảm bằng máy cất
quay chân không đến cắn. Cắn thu được hịa tan trong EtOH hoặc MeOH với tỷ
lệ thích hợp, siêu âm trong 60 phút, ly tâm, gạn lấy dịch trong để tiến hành sắc ký
lớp mỏng.
Bản mỏng Silicagel GF254 (Merck) kích thước 20x10cm hoạt hóa ở 110oC trong
1 giờ. Chấm dịch chiết cao toàn phần lên bản mỏng thành một băng dài. Khai triển
sắc kí với hệ dung môi Toluen: EtOH: Acid aceticbăng (8: 2: 0.5). Để khô tự nhiên
hoặc sấy khô, quan sát dưới ánh sáng trắng, 366nm, 254nm để xác định và khoanh
vùng các vết emodin và physcion. Cạo riêng biệt các vùng có vết đã đánh dấu gộp
bột silicagel đã cạo vào một bình nón, lặp lại nhiều lần tới khi thu được khoảng

10g bột silicagel có chất đã hấp phụ.
Giải hấp phụ bằng 200ml CHCl3, chiết siêu âm trong 30 phút, quá trình chiết
lặp lại 3 lần. Gộp các dịch chiết, cô loại dung môi dưới áp suất giảm bằng máy
cất quay chân không tới cắn. Cạo cắn thu được emodin và physcion tinh khiết.
12


2.3.2. Phân lập emodin và physcion bằng sắc kí cột
2.3.2.1. Chiết hỗn hợp anthranoid từ Cốt khí củ
Tiến hành chiết xuất hỗn hợp anthranoid từ bột dược liệu cốt khí củ theo 2
phương pháp sau:
Phương pháp 1: Cân 100g bột cốt khí củ cho vào bình nón, thêm 700-800ml
EtOH 96%, siêu âm trong 60 phút, quá trình chiết lặp lại 3 lần. Gộp các dịch chiết,
cô loại dung môi dưới áp suất giảm bằng máy cất quay chân không đến cắn.
Chuyển cắn này vào bình nón với 700-800ml HCl 20%, chiết hồi lưu cách thủy
trong 5 giờ. Lọc lấy cắn và sấy khô. Tiếp tục chiết cắn này với 700-800ml EtOAc.
Lọc lấy bã dược liệu, rửa bằng nước cất, sau đó sấy khơ (60°C). Bã này được chiết
với 700-800ml EtOAc, siêu âm 60 phút, lọc lấy dịch và cô loại dung môi dưới áp
suất giảm bằng máy cất quay chân không đến cắn (Cắn 1).
Phương pháp 2: Cân 100g bột cốt khí củ cho vào bình nón, thêm 700-800ml
HCl 20% chiết hồi lưu cách thủy trong 5 giờ. Lọc lấy bã dược liệu, rửa bằng nước
cất, sau đó sấy khơ (60°C). Bã này được chiết với 700-800ml EtOAc, siêu âm 60
phút, lọc lấy dịch và cô loại dung môi dưới áp suất giảm bằng máy cất quay chân
không đến cắn (Cắn 2).
2.3.2.2. Phân lập emodin và physcion từ hỗn hợp
Sử dụng cắn EtOAc thu được từ 2 phương pháp trên rễ để tiến hành phân lập
bằng sắc kí cột.
- Cột thứ nhất:
Chuẩn bị cột chạy sắc ký: cột thủy tinh có khóa, đường kính 3.5cm, chiều dài
45cm, rửa sạch, sấy khô, cố định cột trên giá theo chiều thẳng đứng. Chất nhồi

cột: 30g silicagel (Merck, cỡ hạt 60µm) được hoạt hóa ở 110oC trong 1h. Nhồi
cột theo phương pháp nhồi cột ướt.
Dung môi rửa giải: Toluen : EtOH (8:2)
Tiến hành:
+ Nhồi cột: cho 1 lượng vừa đủ hỗn hợp dung mơi rửa giải vào silicagel đã hoạt
hóa, phân tán đều silicagel trong bình nón, loại hết bọt khí rồi đổ thành dòng từ
từ vào thành cột, vừa đổ vừa gõ nhẹ cột. Rửa thành cột bằng dung môi rửa giải.
13


Ổn định cột bằng cách vừa mở khóa cột cho dung môi chảy cho đến khi lượng
silicagel trên cột nén xuống ở mức không đổi. Cho lượng dịch chảy đến khi cách
bề mặt silicagel khoảng 3mm, khóa cột và nhồi cắn.
+ Đưa cắn lên cột: hòa tan cắn EtOAc bằng một lượng tối thiểu dung mơi rửa
giải, cho một ít silicagel đã được hoạt hóa vào trộn đều, bốc hơi hết dung môi đến
khi bột cắn đều, khô mịn và tơi. Nhồi cắn lên cột và chèn thêm một lớp bông lên
trên để cắn không bị xáo trộn khi cho dung môi.
+ Rửa giải: Dung dịch rửa giải được hứng vào các bình hứng 50ml và kiểm tra
bằng sắc ký lớp mỏng, khai triển với bản mỏng silicagel GF254 với hệ dung môi
Toluen: EtOH: Acid aceticbăng. Gộp các dịch rửa giải có sắc kí đồ giống nhau. Cơ
đến cắn.
- Cột thứ hai:
Từ các sản phẩm thu được sau khi chạy ở cột thứ nhất, lấy cắn phân đoạn
Toluen chứa 2 vết tương ứng với emodin và physcion (Cắn 3) để chạy tiếp cột thứ
hai.
Chuẩn bị cột chạy sắc ký: cột thủy tinh có khóa, đường kính 2.5cm, chiều dài
85cm, rửa sạch, sấy khô, cố định cột trên giá theo chiều thẳng đứng. Chất nhồi
cột: 30g silicagel (Merck, cỡ hạt 60µm) được hoạt hóa ở 110oC trong 1h. Nhồi
cột theo phương pháp nhồi cột ướt.
Dung môi rửa giải: N-hexan : EtOAc (98:2)

Tiến hành:
+ Nhồi cột: cho 1 lượng vừa đủ hỗn hợp dung mơi rửa giải vào silicagel đã hoạt
hóa, phân tán đều silicagel trong bình nón, loại hết bọt khí rồi đổ thành dòng từ
từ vào thành cột, vừa đổ vừa gõ nhẹ cột. Rửa thành cột bằng dung môi rửa giải.
Ổn định cột bằng cách vừa mở khóa cột cho dung môi chảy cho đến khi lượng
silicagel trên cột nén xuống ở mức không đổi. Cho lượng dịch chảy đến khi cách
bề mặt silicagel khoảng 3mm, khóa cột và nhồi cắn.
+ Đưa cắn lên cột: hòa tan cắn Toluen bằng một lượng tối thiểu dung môi rửa
giải, cho một ít silicagel đã được hoạt hóa vào trộn đều, bốc hơi hết dung môi đến

14


khi bột cắn đều, khô mịn và tơi. Nhồi cắn lên cột và chèn thêm một lớp bông lên
trên để cắn không bị xáo trộn khi cho dung môi.
+ Rửa giải: Dung dịch rửa giải được hứng vào các bình hứng 50ml và kiểm tra
bằng sắc ký lớp mỏng, khai triển với bản mỏng silicagel GF254 với hệ dung môi
Toluen: EtOH: Acid aceticbăng. Gộp các dịch rửa giải có sắc kí đồ giống nhau. Cơ
đến cắn.
2.3.2.3. Kiểm tra độ tinh khiết của emodin và physcion phân lập được
Từ các phân đoạn thu được từ sắc kí cột thứ hai, xác định các phân đoạn chứa
emodin và physcion riêng biệt, thu lấy bột kết tinh của hai chất này và hòa tan
1mg bằng MeOH trong bình định mức 10ml để được dung dịch có nồng độ
0.1mg/ml. Tiến hành phân tích bằng HPLC với điều kiện:
Pha động: MeOH:dung dịch acid phosphoric 0.1% (80:20)
Thời gian sắc ký: 20 phút
Thể tích tiêm: 10µl
2.3.3. Định lượng emodin và physcion bằng phương pháp TLC - UV
2.3.3.1. Xây dựng phương pháp
a) Chuẩn bị mẫu

Mẫu thử:
- Cắn EtOAc từ phương pháp 1 (Cắn 1): hòa tan 50mg cắn trong 10ml MeOH
được dung dịch có nồng độ C₀=5mg/ml (hay 5µg/µl)
- Cắn EtOAc từ phương pháp 2 (Cắn 2): hịa tan 50mg cắn trong 10ml MeOH
được dung dịch có nồng độ C₀=5mg/ml (hay 5µg/µl)
- Cắn phân đoạn Toluen (Cắn 3): hịa tan 30mg cắn trong 5ml MeOH được
dung dịch có nồng độ C₀=6mg/ml (hay 6µg/µl)
Mẫu đối chiếu:
- emodin: hịa tan 20mg emodin 98.25% bằng EtOH trong bình định mức 5ml
được dung dịch có nồng độ C₀=3.93mg/ml (hay 3.93µg/µl)
- physcion: hịa tan 5mg physcion 98.12% bằng EtOH trong bình định mức
5ml được dung dịch có nồng độ C₀=0.98mg/ml (hay 0.98µg/µl)
b) Khảo sát khoảng tuyến tính
15


Bản mỏng Silicagel GF254 (20cm x 10cm) hoạt hóa ở 110oC trong 1 giờ được
chia thành 5 băng. Chấm lần lượt mỗi băng theo thứ tự thể tích tăng dần 15µl,
25µl, 50µl, 75µl, 100µl, chấm thành vạch dài 32mm.
Hệ dung môi: Toluen: EtOHtđ: Acid Aceticbăng (8: 2: 0,5)
Tiến hành triển khai sắc ký, khi dung môi đi được khoảng 8cm thì lấy bản mỏng
ra, để khơ ngồi khơng khí, quan sát dưới đèn UV 366nm, khoanh vết để xác định
các vết emodin và physcion.
Cạo riêng biệt các vùng có vết đã đánh dấu, cho mỗi mẫu bột silicagel vào bình
định mức 5ml, bổ sung MeOH đến vạch, siêu âm 30 phút. Ly tâm, gạn lấy dịch
trong, pha loãng 3 lần đối với emodin, tiến hành đo quang ở bước sóng 250nm.
Lập đường tuyến tính của độ hấp thụ theo nồng độ đối với mỗi dung dịch chất
đối chiếu.
c) Thẩm định tính phù hợp của hệ thống
Bản mỏng Silicagel GF254 (20cm x 10cm) hoạt hóa ở 110oC trong 1 giờ được

chia thành 6 băng. Chấm lần lượt mỗi băng 50µl dung dịch chất đối chiếu, chấm
thành vạch dài 24mm.
Hệ dung môi: Toluen: EtOHtđ: Acid Aceticbăng (8: 2: 0,5)
Tiến hành triển khai sắc ký, khi dung mơi đi được khoảng 8cm thì lấy bản mỏng
ra, để khơ ngồi khơng khí, quan sát dưới đèn UV 366nm, khoanh vết để xác định
các vết emodin và physcion.
Cạo riêng biệt các vùng có vết đã đánh dấu, cho mỗi mẫu bột silicagel vào bình
định mức 5ml, bổ sung MeOH đến vạch, siêu âm 30 phút. Ly tâm, gạn lấy dịch
trong, pha loãng 3 lần đối với emodin, tiến hành đo quang ở bước sóng 250nm.
Xử lý số liệu, kiểm tra độ lệch chuẩn tương đối của các mẫu.
2.3.3.2. Định lượng emodin và physcion trong các mẫu cắn
Bản mỏng Silicagel GF254 (20cm x 10cm) hoạt hóa ở 110oC trong 1 giờ chia
thành các băng. Chấm riêng biệt lên bản mỏng một thể tích phù hợp các dung dịch
thử tương ứng các mẫu.
Hệ dung môi: Toluen: EtOHtđ: Acid Aceticbăng (8: 2: 0,5)

16


Tiến hành triển khai sắc ký, khi dung môi đi được khoảng 8cm thì lấy bản mỏng
ra, để khơ ngồi khơng khí, quan sát dưới đèn UV 366nm, khoanh vết để xác định
các vết tương ứng với các chất cần định lượng.
Cạo riêng biệt các vùng có vết đã đánh dấu, cho mỗi mẫu bột silicagel vào bình
định mức 5ml, bổ sung MeOH đến vạch, siêu âm 30 phút. Ly tâm, gạn lấy dịch
trong, tiến hành đo quang ở bước sóng 250nm.
2.3.4. Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu thu được được xử lý bằng Microsoft Excel.
Giá trị trung bình TB: Hàm AVERAGE.
Độ lệch chuẩn SD: Hàm STDEV.
Độ lệch chuẩn tương đối: RSD(%) =

SD
TB

* 100

Xây dựng đường tuyến tính bằng tính năng Charts trong Excel, kết quả đo độ
hấp thụ quang áp dụng vào phương trình tuyến tính để tính nồng độ các chất.

17