NGUYỄN THỊ lệ CHIẾT XUẤT, PHÂN lập và xác ĐỊNH cấu TRÚC một số hợp CHẤT từ lá cây ĐINH LĂNG RĂNG THU hái tại THÁI BÌNH KHOÁ LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
----------

NGUYỄN THỊ LỆ
Mã sinh viên: 1601413

CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH
CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ LÁ
CÂY ĐINH LĂNG RĂNG THU HÁI TẠI
THÁI BÌNH
KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. PGS. TS Nguyễn Mạnh Tuyển
2. DS. Lê Hương Giang
Nơi thực hiện:
Bộ môn Dược học cổ truyền

HÀ NỘI - 2021


LỜI CẢM ƠN
Trong q trình thực hiện khóa luận này, em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm,
giúp đỡ, động viên, chỉ bảo tận tình từ gia đình, thầy cơ giáo và bạn bè.
Đầu tiên với lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành
tới PGS.TS Nguyễn Mạnh Tuyển, người đã dìu dắt em từ những ngày đầu làm khóa
luận, tận tình chỉ bảo, tạo điều kiện tốt nhất cho em thực hiện khóa luận này.
Em xin chân thành cảm ơn DS. Lê Hương Giang cùng các thầy cô, các anh chị
kĩ thuật viên đang công tác tại Bộ môn Dược học cổ truyền – Trường Đại học Dược Hà
Nội đã tận tâm hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình làm khóa luận.
Em xin cảm ơn DS. Nguyễn Hồng Thịnh, DS. Sengkham Choumlivong, Trần

Thị Thùy Chi, Trần Thị Lương Linh, Phonevilay Phothisan đã động viên, đồng
hành, truyền động lực cho em để em có thể hồn thành khóa luận.
Em xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo
môi trường học tập, tận tình giảng dạy truyền tải cho em tri thức quý báu trong suốt 5
năm ngồi trên ghế nhà trường.
Cuối cùng em xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn ở bên cạnh động viên, giúp
đỡ, an ủi em để em có thể tiếp tục thực hiện và hồn thành khóa luận.
Do điều kiện chủ quan và khách quan, khóa luận khó tránh khỏi thiếu sót, em rất
mong nhận được ý kiến đóng góp của các thầy cơ và hội đồng để khóa luận được hồn
thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 08 tháng 06 năm 2021
Sinh viên

Nguyễn Thị Lệ


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
ĐẶT VẤN ĐỀ................................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ......................................................................................... 2
1.1. Tổng quan về chi Đinh lăng (Polyscias) ............................................................... 2
1.1.1. Vị trí phân loại ................................................................................................ 2
1.1.2. Đặc điểm thực vật của chi Đinh lăng (Polyscias)........................................... 2
1.1.3. Đa dạng và phân bố của chi Đinh lăng (Polyscias) ........................................ 2
1.1.4. Thành phần hóa học của chi Đinh lăng (Polyscias) ....................................... 2
1.1.5. Tác dụng sinh học của chi Đinh lăng (Polyscias) .......................................... 8
1.2. Tổng quan về loài Polyscias guilfoylei ................................................................. 9

1.2.1. Đặc điểm thực vật của loài Polyscias guilfoylei ............................................. 9
1.2.2. Thành phần hóa học của lồi Polyscias guilfoylei .......................................... 9
1.2.3. Tác dụng sinh học của loài Polyscias guilfoylei ........................................... 12
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 13
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu ................................................................... 13
2.1.1. Nguyên vật liệu nghiên cứu .......................................................................... 13
2.1.2. Thiết bị nghiên cứu ....................................................................................... 13
2.1.2.1 Hóa chất và dụng cụ ................................................................................ 13
2.1.2.2 Phương tiện và máy móc ......................................................................... 13
2.2. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................... 14
2.3. Phương pháp nghiên cứu..................................................................................... 14
2.3.1. Chiết xuất cao toàn phần và các cao phân đoạn ........................................... 14
2.3.2. Phân lập các hợp chất ................................................................................... 15
2.3.3. Xác định cấu trúc các hợp chất ..................................................................... 17
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................. 18


3.1. Chiết xuất cao toàn phần và các cao phân đoạn từ lá cây Đinh lăng răng .......... 18
3.2. Phân lập một số hợp chất từ lá cây Đinh lăng răng ............................................ 18
3.3. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được ................................................... 21
3.4. Bàn luận .............................................................................................................. 27
3.4.1. Về phương pháp chiết xuất cao toàn phần và các cao phân đoạn ................ 27
3.4.2. Về phương pháp phân lập các hợp chất ........................................................ 27
3.4.3. Về các hợp chất phân lập được ..................................................................... 27
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................. 32
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

CC

: Column Chromatography

cv.

: cultivar

ESI-MS

: ElectroSpray Ionization Mass Spectroscopy

EtOAc

: ethyl acetat

EtOH

: ethanol

HPLC

: High Performance Liquid Chromatography

MeOH

:

NMR

: nuclear magnetic resonance

P.

: Polyscias

Rha

: L-rhamnopyranose

RP-18

: Reversed Phase C-18

SKLM

: Sắc ký lớp mỏng

TLC

: Thin Layer Chromatography

methanol


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1

So sánh số liệu NMR của hợp chất 1 với tài liệu tham khảo

Tr. 22

Bảng 3.2

So sánh số liệu NMR của hợp chất 2 với tài liệu tham khảo

Tr. 25


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Hình 1.1

Các hợp chất được phân lập từ chi Polyscias

Tr. 8

Hình 1.2

Các hợp chất được phân lập từ lồi Polyscias guilfoylei

Tr. 12

Hình 2.1

Sơ đồ chiết xuất phân đoạn

Tr. 15

Hình 3.1

Sơ đồ quy trình chiết xuất và phân lập lá Polyscias guilfoylei

Tr. 19

Hình 3.2

Sắc ký đồ của phân đoạn LB28 và hợp chất LB1.1 (132)

Tr. 20

Hình 3.3

Sắc ký đồ của phân đoạn LB28-85-2 và hợp chất LB2

Tr. 20

Hình 3.4

Cơng thức cấu tạo của hợp chất 1

Tr. 24

Hình 3.5

Công thức cấu tạo của hợp chất 2

Tr. 26

ĐẶT VẤN ĐỀ
Song song với xu hướng phát triển mạnh mẽ của các thuốc tân dược hiện nay,
các thuốc có nguồn gốc thảo dược cũng đang được đẩy mạnh đầu tư nghiên cứu bởi tính
an tồn, khơng gây độc hoặc ít gây độc, dễ hấp thu và chuyển hóa trong cơ thể. Bên cạnh
đó, các dược liệu cũng chính là nguồn nguyên liệu phong phú trong lĩnh vực bán tổng
hợp các thuốc hóa dược bởi có những hợp chất tổng hợp hóa dược khơng làm được hoặc
khó làm được, nhưng lại dễ dàng chiết xuất từ dược liệu, từ đó tiết kiệm được chi phí,
thời gian và cơng sức trong quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc mới. Vì vậy, việc
triển khai mạnh mẽ nghiên cứu khoa học, ứng dụng kết quả nghiên cứu vào xây dựng
nguồn nguyên liệu và hiện đại hóa y học cổ truyền là yêu cầu tất yếu trong tình hình
hiện nay.
Đinh lăng từ lâu đã được ứng dụng trong các bài thuốc cổ truyền với nhiều công
dụng khác nhau. Được gọi là “nhân sâm của người nghèo” vì có những tác dụng là tăng
cường sức dẻo dai, nâng cao sức đề kháng của cơ thể, giảm mệt mỏi, bổ dưỡng, giúp ăn
ngon, ngủ yên, tăng khả năng lao động và làm việc bằng trí óc, tăng cân và chống
độc….[4], [12]. Loài Đinh lăng răng (Polyscias guilfoylei (W.Bull) L.H.Bailey cv.
quinquefolia) là một trong những loài cây được trồng phổ biến tại huyện Tiền Hải, tỉnh
Thái Bình, được người dân sử dụng làm cây cảnh và làm thuốc chữa bệnh với công dụng
tăng cường sức khỏe, nâng cao sức đề kháng, giảm đau đầu, chống co giật cho trẻ khi
ngủ… Tuy nhiên, cho đến nay trên thế giới có rất ít nghiên cứu về hóa thực vật cũng
như hoạt tính sinh học của lồi này. Một số nghiên cứu về lồi này đã được nhóm nghiên
cứu Trường Đại học Dược Hà Nội thực hiện và có một số cơng bố [5] , [17]. Vì vậy với
mong muốn tiếp tục hoàn thiện cơ sở dữ liệu về thành phần hóa học làm cơ sở cho việc
tiêu chuẩn hóa vị thuốc và tạo tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo, khóa luận “ Chiết
xuất, phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất từ lá cây đinh lăng răng thu
hái tại Thái Bình” được thực hiện với mục tiêu:
Phân lập và xác định cấu trúc 1 -2 hợp chất từ lá cây Đinh lăng răng.

1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về chi Đinh lăng (Polyscias)
1.1.1. Vị trí phân loại
Theo nghiên cứu phân loại thực vật, chi Polyscias có vị trí phân loại như sau: [49]
Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)
Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)
Phân lớp Hoa hồng (Rosidae)
Bộ Sơn thù du (Cornales)
Họ Nhân sâm (Araliaceae)
Chi Đinh lăng (Polyscias)
1.1.2. Đặc điểm thực vật của chi Đinh lăng (Polyscias)
Cây gỗ nhỏ hay nhỡ có dáng mảnh và có tán lá đẹp, thường xanh, không gai. Lá
kép lông chân vịt hay lá đơn có thùy chân vịt hoặc lá kép lơng chim với các lá chét có
hình dạng thay đổi; lá kèm khơng có hay hợp lại ở gốc thành một phần phụ nhỏ. Cụm
hoa tán tạo thành chùm hay chùy; cuống hoa có khớp rụng hay hơi có khớp; đài nguyên
hay có 5 răng; cánh hoa 5, tiền khai van. Bộ nhị 5, bao phấn hình trứng hay thn. Bầu
dưới 2 ơ, ít khi 3-4 ơ; vịi nhụy 2-4 rời hay hợp ở gốc. Quả dẹt, ít khi gần hình cầu. Hạt
dẹt. [1]
1.1.3. Đa dạng và phân bố của chi Đinh lăng (Polyscias)
Chi Đinh lăng bao gồm khoảng 116 loài, chủ yếu phân bố ở khu vực Madagascar,
đặc biệt ở một số đảo ở Thái Bình Dương [1], [20], [26], [49]. Ở Việt Nam, các loài
thuộc chi Đinh lăng được trồng ở nhiều nơi để làm cảnh và làm hàng rào, chỉ có vài lồi
được sử dụng làm thuốc , được dùng làm thuốc phổ biến nhất là Polyscias fruticosa (L.)
Harms - đây là lồi có nhiều tác dụng dược lí giống Nhân sâm [3].
1.1.4. Thành phần hóa học của chi Đinh lăng (Polyscias)
Chi Polyscias được báo cáo là có 97 hợp chất thuộc các nhóm hợp chất hóa học
khác nhau đã được phân lập và xác định cấu trúc từ 12 loài thuộc chi này (P. fruticosa,
P. scutellaria, P. dichroostachya, P. nodosa, P. fulva, P. duplicate, P. amplifolia, P.
serrata, P. murrayi, P. australiana, P. balfouriana và P. guilfoylei). Saponin được coi

là thành phần chính được phân lập từ các lồi thuộc chi Polyscias [20].
Cấu trúc hóa học các nhóm hợp chất được phân lập từ các lồi thuộc chi Polyscias:
2


Các hợp chất polyacetylen [32]

(8E)–heptadeca–1,8–dien–4,6–diyn–3,10–diol

(8E) –heptadeca–1,8–dien–4,6–

(1)

diyn–3–ol–10–on (2)

(8Z)–heptadeca–1,8–dien–4,6–diyn–3–ol–10–

falcarinol (4)

on (3)

panaxydol (5)

Các sterol và glycosid của sterol [6],[15], [33]

β–sitosterol (6)

stigmasterol (7)

spinasterol (8)

3–O–β–D–glucopyranosyl β–sitosterol (9)

3


3–O–β–D–glucopyranosyl spinasterol

3–O–β–D–glucopyranosyl stigmasterol

(10)

(11)

Tinh dầu [23]

β–elemen (12a) β–germacren–D (12b) E–γ–bisabolen (13)

α–bergamoten (14)

Các hợp chất phenol [15], [22], [24], [33], [50]

3–O–β–D–glucopyranosyl

3–O–β–D–

quercetin–3,7,3’,4’–

tetramethyl quercetin

galactopyranosylquercetin

tetrametyl ete (17)

(15)

(16)

kaempferol–3,7–di–O–α–

lichexanthon (19)

L–rhamnopyranosid (18)

acid 3–(4–
hydroxyphenyl )
propionyl cholin (20)

4


acid 3–(4–

acid 3–(3,4–

acid 3,4–di–O–3–(4–

hydroxyphenyl)propanoic

dihydroxyphenyl)

hydroxyphenyl)propiony

(21)

propanoic (22)

l–1,5–
dihydroxycyclohexancar
boxylic (23)

acid 3,5–di–O–3–(4–

acid 3,5–dicaffeoyl–muco–quinic (25)

hydroxyphenyl)propionyl–1,4–
dihydroxycyclohexancarboxylic (24)
Các triterpenoid [13], [15], [33]

acid oleanolic (26)

hederagenin (27)

Các saponin có aglycon là acid oleanolic [6], [15], [25], [26],[29], [33], [39], [40],
[41], [43], [51]

R1

R2

(28)

Gal–

H

(29)

Gal–(1→4)–Gal–

H

(30)

Gal–(1→4)–Xyl–

H

(31)

Gal–(1→4)–Ara–

H
5


(32)

Glc–(1→4)–GlA–

H

(33)

Rha–(1→2)–Ara–

H (β–hederin)

(34)

Gal–(1→2)–Glc–

H

(35)

Rha–(1→4)–Glc–

Glc–

(36)

Glc–(1→2)–GlA–

H

(37)

Glc–(1→2)

GlA–

H

GlA–

H

Glc–(1→4)
(38)

Ara–(1→2)
Glc–(1→4)

(39)

Gal–(1→2)

GlA–

H

Glc–(1→3)
(40)

Glc–(1→4)–GlA–

(41)

Glc–(1→2)

Glc–
GlA–

Glc–

GlA–

Glc–

GlA–

Glc–

Glc–(1→4)
Ara–(1→2)
(42)
Glc–(1→4)
(43)

Gal–(1→2)
Glc–(1→3)

(44)

Glc–(1→4)–GlA–

(45)

Glc–(1→2)

Rha–(1→3)–Glc–
GlA–

Rha–(1→3)–Glc–

Glc–(1→4)
(46)

GlA–

H

(47)

Glc–(1→3)–GlA–

H

(48)

Glc–(1→3)–GlA–

Glc–

(49)

Glc–(1→4)–Glc–(1→2)–GlA–

H

(50)

Glc–(1→4)–Glc–(1→2)–GlA–

Glc–

(51)

Glc–(1→4)–GlA–

Me

Các saponin có phần aglycon là hederagenin: [22], [28], [33]

6


R1

R2

(52)

Ara–

H

(53)

Rha–(1→2)–Ara–

H (α–hederin)

(54)

Glc–(1→2)–Ara–

H

(55)

Rha–(1→2)–Ara–

Glc–

(56)

Rha–(1→2)–Ara–

Rha–(1→4)–Glc–

(Kalopanax saponin B)

(1→6)–Glc–

Các saponin khác [22], [33], [39], [40], [41], [51]

12–oxo–3–β–16–β–20(S)–

acid 3–O–[α–L–rhamnopyranosyl–

trihydroxydammar–24–en–3–O–α–L–

(12)–α–L–

rhamnopyranosyl–(12)–β–D–

arabinopyranosyl]echynocystic (59)

glucopyranosid (57)

3–O–α–L–arabinopyranosylcollinsogenin

3–O–β–D-

(collinsonin) (58)

glucopyranosyloleanan(60)

7


Các ceramid và cerebrosid [33]

(2S,3S,4R,8E)–2– [(2’R)–2’–

(2S,3S,4R,8E)–1–O–β–D–glucopyranosyl–

hydroxypalmitoylamino]–8–octadecen–

2– [(2’R)–2’–hydroxypalmitoylamino]–8–

1,3,4–triol (61)

octadecen–1,3,4–triol (62)

Hình 1.1. Các hợp chất được phân lập từ chi Polyscias
1.1.5. Tác dụng sinh học của chi Đinh lăng (Polyscias)
Đinh lăng đã được nghiên cứu với nhiều hoạt tính sinh học như hoạt tính gây độc
tế bào, kháng khuẩn, kháng nấm, diệt nhuyễn thể, chống hen suyễn, chống viêm, chữa
lành vết thương,[20] … Được gọi là “nhân sâm của người nghèo” vì có những tác dụng
tương tự Nhân sâm, như tăng cường sức dẻo dai, nâng cao sức đề kháng của cơ thể,
giảm mệt mỏi, bổ dưỡng, giúp ăn ngon, ngủ yên, tăng khả năng lao động và làm việc
bằng trí óc, tăng cân và chống độc….[4], [12] Một số nghiên cứu cụ thể:
Nước sắc rễ của cây Đinh lăng lá xẻ có tác dụng làm tăng sức dẻo dai của cơ thể
trên thí nghiệm cấp tính tương tự như Nhân sâm [12]. Các thí nghiệm trên chuột cho
thấy Đinh lăng lá xẻ có tác dụng lợi tiểu, làm tăng sức đề kháng của chuột đối với các
bức xạ siêu cao tần [7], [12]. Đinh lăng lá xẻ có tác dụng tăng lực, tăng cân, tăng khả
năng chịu đựng của bộ đội và các vận động viên thể thao, lợi tiểu, trị ho [4], [8].
Alexander L.Eaton và cộng sự (2014) đã công bố nghiên cứu dịch chiết ethanol
của rễ cây Polyscias duplicata có hoạt tính chống lại dịng tế bào ung thư buồng trứng
A2780 ở người (IC50 là 6µg/mL) [27].
Năm 2020 một nghiên cứu về các điều kiện chiết xuất tối ưu với nhóm polyphenol
và flavonoid trong rễ P.fruticosa chỉ ra rằng dịch chiết ethanol 90% của rễ P.fruticosa
với tỉ lệ nguyên liệu : ethanol (1:20g/ml), thời gian chiết 3 giờ, ở nhiệt độ 300C có khả
năng thu dọn các gốc tự do DPPH (IC50=96,14µg/mL) và hoạt tính chống oxy hóa ABTS
(IC50=38,76µg/mL) [35].

8

1.2. Tổng quan về loài Polyscias guilfoylei
1.2.1. Đặc điểm thực vật của loài Polyscias guilfoylei
Năm 2019, Lê Hương Giang và cộng sự đã nghiên cứu đặc điểm thực vật của
Đinh lăng răng gồm cây gỗ nhỏ, cao khoảng 2-3m, rễ cọc ăn sâu xuống đất, có nhiều rễ
phụ. Thân gỗ phân nhánh từ gốc; thân già có màu nâu đường kính 4-6 cm, thân non màu
xanh đậm, đường kính từ 0,8-1,2 cm, có đốm trắng nhỏ; bề mặt thân có nhiều nốt sần;
có sẹo dạng nhẫn là vết tích của bẹ lá sau khi rụng. Lá kép lông chim 2 lần dài 18-36
cm; cuống lá dài 12-20 cm có bẹ lá dài 1,5-2 cm ơm lấy thân, mặt ngồi màu xanh đậm
có nốt sần, mặt trong màu xanh nhạt; ở mấu đầu tiên của lá kép, có 2-5 nhánh. Lá chét
22 đến 32; cuống dài 1-3 cm, đường kính 0,1-0,2 cm, cuống có cánh rộng khoảng 0,10,2 cm mỗi bên; phiến lá màu xanh đậm, hai mặt đều nhẵn, hình dạng đa dạng: hình gần
trịn, hình gốc lệch, ngọn lá chia 2 thùy hoặc xẻ sâu thành 2-3 thùy đều hoặc khơng đều
nhau, kích thước 2-6 cm × 2-6 cm; gốc lá thường trịn hoặc hơi tù; gân lá hình mạng có
2-5 gân chính xuất phát từ gốc, nổi rõ 2 mặt; mép lá có răng thưa cách nhau 0,5 đến 1
cm [5].
1.2.2. Thành phần hóa học của lồi Polyscias guilfoylei
Nguyễn Thị Ánh Tuyết đã công bố nghiên cứu về thành phần hố học của lá lồi
Polyscias guilfoylei gồm các hợp chất sau [16],[36] :

isophytol (63)

acid oleanolic (26)

acid 3–O–β–D–

acid 3–O–β–D–glucopyranosyl–(13)–β–

glucuronopyranosyloleanolic (64)

D–glucuronopyranosyloleanolic (65)

9


acid 3–O–β–D–glucopyranosyl–(14)–

acid 3–O–[β–D–glucopyranosyl–(13),

β–D–glucuronopyranosyloleanolic (66)

β–D–glucopyranosyl–(14)]–β–D–
glucuronopyranosyloleanolic (67)

acid 3–O–[β–D–glucopyranosyl

3–O–β–D–glucopyranosyl–(14)–β–D–

–(12), β–D–glucopyranosyl–(14)] –

glucuronopyranosyloleanolic–28–O–β–D–

β–D–glucuronopyranosyloleanolic (68)

glucopyranosyl este (69)

Ashmawy và cộng sự (2019) đã công bố kết quả nghiên cứu về thành phần hóa
học của lá Polyscias guilfoylei [19] phân lập được 9 hợp chất, cụ thể là:

ent-labda-8(17),13-dien-15,18-diol (70)

Stigmasterol (7)

spinasterol

n-(1,3-dihydroxyoctadecan-2-yl)

(8)

palmitamid (71)
10


panaxydiol

3–O–β–D–glucopyranosylstigmasta–

(72)

5,22–diene–3–β–ol (73)

(8Z)–2–(2–hydroxypentacosanoylamino)
octadeca–8–ene–1,3,4–triol (74)

4–hydroxybenzoic acid (75)

tamarixetin–3,7–di–O–α–L–rhamnopyranosid (76)
Đinh Thị Vân và cộng sự (2019) đã phân lập được 6 hợp chất từ lá của Polyscias
guilfoylei [17], đó là:

methyl 3,5-dicaffeoylquinat (77)

acid chlorogenic (78)

11


kaempferol 3-O-β-D-glucopyranosid (79)

quercetin 3-O-β-glactopyranosid (80)

acid 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-

acid oleanolic (26)

D-glucuronopyranosyloleanolic (81)

Lê Hương Giang và cộng sự (2019) đã phân lập được 2 hợp chất từ thân cây
Polyscias guilfoylei [5], bao gồm:

acid chlorogenic (78)

acid rosmarinic (82)

Hình 1.2. Các hợp chất được phân lập từ loài Polyscias guilfoylei
1.2.3. Tác dụng sinh học của loài Polyscias guilfoylei
Reksi và cộng sự (2015) nghiên cứu cho thấy dịch chiết methanol của lá Polyscias
guilfoylei có hoạt tính chống oxy hố rất có triển vọng [47].
Ashmawy và cộng sự (2018) đã nghiên cứu tinh dầu lá Polyscias guilfoylei cho
thấy hoạt tính gây độc dịng tế bào Caco-2 với IC50 là 70,62 μg/mL [34]. Năm 2019,

Rajani và cộng sự đã cơng bố kết quả hoạt tính gây độc tế bào của tinh dầu lá Polyscias
guilfoylei đối với tế bào ung thư hạch bạch huyết trên cả hai mơ hình in vivo và in vitro
[30].
12


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu
2.1.1. Nguyên vật liệu nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là lá cây Đinh lăng răng thu hái vào tháng 8/2020 tại huyện
Tiền Hải - Thái Bình. Mẫu được thu hái tại vùng trồng đã được quy hoạch và giám định
mẫu từ tháng 3/2019, được giám định tên khoa học là Polyscias guilfoylei (W.Bull)
L.H.Bailey cv. quinquefolia (Phụ lục 1). Tiêu bản thực vật hiện đang được lưu giữ tại
Phịng tiêu bản cây thuốc - Bộ mơn Thực Vật, Trường Đại học Dược Hà Nội (Số hiệu
HNIP/18547/19) (Phụ lục 2). Dược liệu được rửa sạch, cắt nhỏ, để ráo, sấy ở 65oC đến
độ ẩm dưới 10%, cho vào túi PE kín để bảo quản tại nơi thực hiện khóa luận (Bộ mơn
Dược học cổ truyền).
2.1.2. Thiết bị nghiên cứu
2.1.2.1 Hóa chất và dụng cụ
-

Hóa chất: Bản mỏng tráng sẵn pha thường silicagel F254 (Merck), pha đảo RP18
F254s (Merck), chất hấp phụ silica gel pha thường (cỡ hạt 63-200 µm, Merck), pha
đảo RP-18 (30 - 50 µm, Merck). Dung môi công nghiệp n-hexan, ethyl acetat
(EtOAc), n-butanol, dichloromethan (CH2Cl2), methanol (MeOH), ethanol (
EtOH), H2SO4 đặc 98%, HCl đặc 95%, nước cất (H2O).

-

Các hóa chất thuốc thử khác đều đạt tiêu chuẩn phân tích theo quy định của Dược

điển Việt Nam V.

-

Dụng cụ:
Các loại cột dùng cho sắc ký cột có đường kính x chiều cao: 11x64cm,
2x45cm, 1x45cm.
Bình cầu đáy trịn các loại (50 – 2000ml).
Bình gạn (125 – 2000ml).
Ống đong các loại (10 - 2000ml)
Các dụng cụ thí nghiệm thường quy: giấy lọc, phễu lọc, cốc có mỏ, bình nón,
ống nghiệm, pipet, mao quản, bình khai triển sắc ký…

2.1.2.2 Phương tiện và máy móc
-

Sắc ký cột dùng chất hấp phụ là silica gel F254 cỡ hạt 63 - 200 µm (Merck), silica
gel pha đảo RP-18 (30 – 50 µm, Merck).
13


-

Máy đo phổ khối LCMS8045 của Shimadzu, Nhật Bản.

-

Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR,

13

C-NMR) của hãng Bruker

(500MHz), Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam, VAST.
-

Máy cô quay 5 lít và 20 lít của BÜCHI, Thụy Sĩ.

-

Bể siêu âm WiseClean (Hàn Quốc), máy siêu âm Elmasonic S ( Đức).

-

Bếp cách thủy BATHS.

-

Tủ sấy Memmert (Đức).

-

Đèn tử ngoại hai bước sóng 254nm và 365nm (Pháp).

-

Cân kỹ thuật Precisa BJ 610C. Cân phân tích Precisa 262SMA-FR (Precisa, Thụy
Sỹ).

2.2. Nội dung nghiên cứu

-

Chiết xuất cao toàn phần và các cao phân đoạn lần lượt là n-hexan, ethyl acetat,
n-butanol, nước của lá cây Đinh lăng răng.

-

Phân lập một số hợp chất ở phân đoạn n-butanol của lá cây Đinh lăng răng.

-

Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được.

2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Chiết xuất cao toàn phần và các cao phân đoạn
Phương pháp chiết các phân đoạn theo độ phân cực tăng dần của dung môi.
-

Lá cây được tách riêng, cắt nhỏ, sấy khơ và được xay thơ, sau đó được chiết bằng
dung môi EtOH với trợ giúp của siêu âm 30 phút x 3 lần; cất thu hồi dung mơi dưới
áp suất giảm được cao tồn phần, lưu một phần cao tồn phần, sau đó hịa cao vào
nước cất, lần lượt chiết lỏng – lỏng với dung mơi có độ phân cực tăng dần (n-hexan;
ethyl acetat; n-butanol). Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm các phân đoạn thu
được cắn n-hexan (cắn Hexan); cắn ethyl acetat (cắn EtOAc); cắn n-butanol (cắn
BuOH); cắn nước (cắn H2O). (Hình 2.1)

14


Dược liệu

- Chiết với ethanol 96%, 3 lần x 30 phút/ lần
- Thu hồi dung mơi
Cao tồn phần
- Phân tán trong nước
- Lắc với n-hexan (3 lần)
-

Thu hồi dung môi
Phân đoạn nước

Phân đoạn

- Lắc với ethyl acetat (3 lần)

n-hexan

- Thu hồi dung môi
Phân đoạn
ethyl acetat

Phân đoạn nước
- Lắc với n-butanol (3 lần)
- Thu hồi dung mơi
Phân đoạn
Phân đoạn nước
n-butanol

Hình 2.1 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn

2.3.2. Phân lập các hợp chất

Phân đoạn n-butanol được phân lập bằng sắc ký cột silica gel pha thường (Merck),
sắc ký cột silica gel pha đảo RP-18. Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng
tráng sẵn 60 GF254 (Merck), RP-18 (Merck). Sắc ký lớp mỏng dùng để theo dõi vết các
chất từ các phân đoạn. Sắc ký đồ được quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm
và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong EtOH.
a) Sắc ký cột (CC)
Nguyên tắc: Sắc ký cột hấp phụ dựa trên sự phân bố khác nhau của các thành
phần trong mẫu với hai pha khơng trộn lẫn, trong đó pha động là chất rửa giải, pha tĩnh
là chất hấp phụ dạng bột mịn được nhồi trong cột thủy tinh, lựa chọn pha tĩnh phụ thuộc
vào độ phân cực của mẫu cần tách. Có thể triển khai liên tục với các hệ dung mơi khác
nhau có độ phân cực tăng dần. Chất nhồi cột là silica gel pha thường hoặc silica gel pha
đảo.
Các bước tiến hành: Silica gel pha thường
15


 Chuẩn bị cột: Chọn cột thủy tinh có đường kính thích hợp, chiều dài cột gấp 3
lần thể tích silica gel cần thiết cho quá trình phân lập. Cột được rửa sạch, tráng
bằng MeOH, để khơ tự nhiên. Lót bông ở đáy cột và cố định chắc chắn lên giá
theo phương thẳng đứng.
 Nhồi cột: Cân lượng silica gel phù hợp cho vào cốc có mỏ, thêm dung mơi rửa
giải, khuấy đều cho đến khi hết bọt. Cho hỗn dịch trên vào cột đã chuẩn bị. Mở
khóa cột, rót tiếp dung mơi để dội sạch silica gel dính trên thành cột và để ổn
định. Giữ lại một ít dung mơi để cột khơng bị khơ trước khi khóa cột và chuẩn bị
đưa mẫu lên cột.
 Chuẩn bị mẫu: Mẫu được hịa tan với một lượng dung mơi tối thiểu đến khi tan
hồn tồn, sau đó trộn đều với một lượng silica gel tối thiểu, loại dung môi đến
khi thu được bột khô và tơi, nghiền bằng chày cối cho mịn.
 Nạp mẫu: Xả bớt lượng dung mơi cịn lại trên cột sau đó đưa từ từ mẫu lên cột
tránh vón thành cục và xuất hiện nhiều bọt khí.

 Rửa giải: Cho hệ dung mơi thích hợp vào cột đã được nạp mẫu. Trong quá trình
rửa giải liên tục bổ sung dung môi để đảm bảo cột không bị khô.
 Thu dịch: hứng dịch rửa giải vào các lọ thủy tinh, ống nghiệm với thể tích phù
hợp. Theo dõi quá trình rửa giải bằng sắc kí lớp mỏng để gộp các lọ, ống nghiệm
có cùng sắc kí đồ. Loại bỏ dung môi thu được cắn.
 Kiểm tra độ tinh khiết: Các hợp chất phân lập được kiểm tra sơ bộ bằng sắc kí
lớp mỏng và đo HPLC.
Các bước tiến hành: Silica gel RP-18
 Chuẩn bị cột: Cột thủy tinh có khóa, đường kính 1cm (2cm), chiều cao 45cm, rửa
sạch, tráng bằng MeOH, để khô tự nhiên, cố định trên giá theo phương thẳng
đứng, lót bơng vào đáy cột.
 Nhồi cột: Cân lượng silica gel pha đảo phù hợp cho vào cốc có mỏ, tạo hỗn dịch
với dung mơi là MeOH, rót lên cột, mở van cho dung mơi chảy xuống, để lắng,
tưới thành cột bằng MeOH, để ổn định cột. Giữ lại ít dung mơi trên cột tránh khơ
cột.
 Trước khi tiến hành nạp mẫu, luyện cột với dung môi rửa giải thích hợp với thể
tích dung mơi gấp 2 lần chiều cao silica gel trên cột.
16


 Nạp mẫu: Mẫu được hòa tan vào lượng tối thiểu MeOH (siêu âm), xả hết dung
môi trên cột, đưa mẫu lên cột bằng pipet pasteur (khóa van).
 Rửa giải: Mở van cho chảy xuống hết bề mặt, cho hệ dung mơi rửa giải thích hợp
vào cột đã được nạp mẫu. Trong quá trình rửa giải liên tục bổ sung dung môi để
đảm bảo cột không bị khô.
 Thu dịch: Hứng dịch rửa giải vào các lọ thủy tinh hoặc ống nghiệm với thể tích
phù hợp. Theo dõi q trình rửa giải bằng sắc ký lớp mỏng để gộp các lọ, ống
nghiệm có cùng sắc ký đồ. Loại bỏ dung môi thu được cắn.
 Kiểm tra độ tinh khiết: Các hợp chất phân lập được kiểm tra sơ bộ bằng sắc kí
lớp mỏng và đo HPLC.

b) Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Được sử dụng để thăm dị hệ dung mơi tách và theo dõi quá trình rửa giải.
Nguyên tắc: dựa trên cơ chế hấp phụ. Chất phân tích sau khi chấm lên bản mỏng
sẽ di chuyển trên một lớp chất hấp phụ mịn, theo một chiều nhất định. Quá trình chạy
sắc ký phụ thuộc vào hệ dung môi pha động và khả năng hấp phụ của thành phần trong
chất phân tích sẽ tạo ra các vết sắc ký ở các vị trí khác nhau.
Bản mỏng: sắc ký TLC được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn pha thường silica
gel F254 (Merck), pha đảo RP18 F254s (Merck).
Hiện màu bản mỏng: sắc ký đồ được quan sát dưới ánh sáng đèn tử ngoại ở hai
bước sóng 254 và 365 nm hoặc bản mỏng được phun dung dịch acid sulfuric 10% trong
EtOH sau đó sấy nóng bản mỏng ở 110 độ C trong khoảng 5 - 10 phút.
2.3.3. Xác định cấu trúc các hợp chất
Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được dựa vào các tính chất hóa lý (trạng
thái, màu sắc, ...) và dữ liệu phổ khối (ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR,
13

C-NMR) và so sánh các dữ liệu thu được từ thực nghiệm với các tài liệu đã công bố.

17


CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Chiết xuất cao toàn phần và các cao phân đoạn từ lá cây Đinh lăng răng
Lá cây Đinh lăng răng (4,1 kg) được rửa sạch, cắt nhỏ, sấy khô ở nhiệt độ 650C
đến độ ẩm dưới 10%, chia vào 3 bình thủy tinh (dung tích 10 lít) tiến hành ngâm với
ethanol 96% (8 lít/bình x 3 lần) ở nhiệt độ thường (24 giờ). Sau đó tiếp tục ngâm ở 450C
(24 giờ). Siêu âm 3 lần x 30 phút (khoảng cách mỗi lần siêu âm là 30 phút) rồi được
chiết nóng. Lọc, gộp dịch lọc, và loại bỏ dung môi dưới áp suất giảm thu được cao toàn
phần (1128,54 g). Cao toàn phần được chia làm 3 phần, hòa tan mỗi phần vào 1 lít nước
cất, sau đó mỗi phần chiết lần lượt với dung mơi n-hexan (0,5 lít × 3 lần), EtOAc (0,5

lít × 3 lần), và n-butanol (0,5 lít × 3 lần). Tiến hành thu hồi dung môi dưới áp suất giảm
theo từng phân đoạn. Thu được các cao phân đoạn n-hexan (282,66 g), EtOAc (126,07
g) và n-butanol (150,54 g). (Hình 3.1)
3.2. Phân lập một số hợp chất từ lá cây Đinh lăng răng
Phân đoạn n-butanol (150,54 g) được chạy qua cột sắc ký (11 x 64 cm) pha tĩnh
là silica gel, rửa giải bằng hệ dung môi dichloromethan:methanol (50:1, 20:1, 10:1, 5:1,
1:1 v:v), thu được 59 phân đoạn (LB1 – LB59). Phân đoạn LB28 (5,60 g) cho qua cột
pha đảo RP-18 (2 x 45 cm), pha động là methanol:nước (1:3, 1:2, 1:1,5, 1:1, 2:1, 3:1,
3,5:1 v:v) cho 148 phân đoạn (LB28-1 – LB28-148), trong đó phân đoạn LB28-132 thu
được hợp chất 1 (ký hiệu LB1.1) (79,5mg). Phân đoạn LB28-85 (0,8 g) được tiếp tục
cho qua cột pha đảo RP-18 (2 x 45 cm), rửa giải với hệ methanol:nước = 1:2 (v:v) thu
được 8 phân đoạn (LB28-85-1 – LB28-85-8). Phân đoạn LB28-85-2 (39,2 mg) cho qua
cột pha đảo RP-18 (1 x 45 cm), rửa giải với hệ methanol:nước (1:3, 1:2,5, 1:2, 1:1 v:v)
thu được hợp chất 2 (ký hiệu LB2) (26,9 mg). (Hình 3.1)

18