THỰC HÀNH ỨNG DỤNG CNSH TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

THỰC HÀNH ỨNG DỤNG
CNSH TRONG NUÔI TRỒNG
THỦY SẢN

GVHD:

TS. Nguyễn Thành Luân

1


MỤC LỤC

BÀI 1: MỘT SỐ NGUYÊN TẮC CƠ BẢN KHI LÀM VIỆC TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM
...........................................................................................................................................
1.1 NỘI QUY, AN TỒN TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM

1

1.2 PHƯƠNG PHÁP CẤP CỨU SƠ BỘ4
1.3 DỤNG CỤ

BÀI 2: ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ VIBRIO TRONG TÔM ẤU TRÙNG VÀ TÔM THƯƠNG
PHẨM..................................................................................................................................
1.1 Lý thuyết 1
1.2 Thực hành 4

BÀI 3: PHÂN LẬP CÁC VI KHUẨN LACTIC ỨNG DỤNG TRONG PHÒNG BỆNH THỦY
SẢN.....................................................................................................................................

1.1 Lý thuyết 1
1.2 Thực hành 4

BÀI 4: ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA VI KHUẨN LACTIC ĐỐI VỚI VI
KHUẨN GÂY BỆNH.................................................................................................................

1.1 Lý thuyết 1
1.2 Thực hành 4

BÀI 5: ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG NÂNG CAO TỶ LỆ SỐNG ĐỘNG VẬT THỦY SẢN CỦA
VI KHUẨN LACTIC BẰNG MƠ HÌNH CẢM NHIỄM VI KHUẨN GÂY BỆNH.......................................

1.3 Lý thuyết 1
1.4 Thực hành 4

BÀI 6: PHÂN TÍCH KẾT QUẢ...................................................................................................

2


BÀI 1: MỘT SỐ NGUYÊN TẮC CƠ BẢN KHI LÀM VIỆC
TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM
1.1. Ngun tắc
Để đảm bảo an tồn trong việc thực hành tại phịng thí nghiệm, sinh viên phải tn thủ nghiêm
túc nội quy phịng thí nghiệm như sau:
1.

Đi thực hành đúng giờ: sáng từ 7g30, chiều từ 12g30, tối từ 17g30, đến trễ sau 15 phút
sinh viên khơng được phép vào phịng thí nghiệm. Sinh viên phải hoàn thành tất cả các

bài thực hành và đạt yêu cầu cơ bản phần thực tập mới được tham gia dự thi.

2.

Khi vào phịng thí nghiệm phải đeo bảng tên và mặc áo blouse. Khơng được làm việc một
mình trong phịng thí nghiệm, khơng được thí nghiệm khi khơng được phép.

3.

Khơng hút thuốc và ăn uống trong phịng thí nghiệm, trong lúc thực hành cũng như
không được dùng dụng cụ thí nghiệm để ăn uống hay đựng thức ăn.

4.

Trong giờ thực hành phải giữ yên lặng, trật tự, không đùa giỡn. Khơng được tự ý ra khỏi
phịng thí nghiệm mà khơng có sự cho phép của giảng viên.

5.

Khi chưa được sự hướng dẫn của giảng viên sinh viên tuyệt đối khơng được sử dụng
dụng cụ điện, máy móc, hóa chất trong phịng thí nghiệm. Đồng thời, phải có ý thức bảo
vệ và giữ gìn tài sản của phịng thí nghiệm, phải hiểu rõ tính chất của các hóa chất để
tránh tai nạn đáng tiếc. Sinh viên nào vi phạm sẽ phải chịu toàn bộ trách nhiệm về các
thiệt hại do mình gây ra.

6.

Có ý thức giữ gìn sạch sẽ phịng thí nghiệm, sắp xếp dụng cụ, hóa chất ngăn nắp, lau dọn
vệ sinh tại nơi thực hành trước khi ra về. Không đổ rác thải, giấy lọc vào bồn rửa tránh
gây tắc cống. Dụng cụ thí nghiệm làm xong phải rửa sạch sẽ trước khi trả lại cho cán bộ

phòng thí nghiệm.

3


7.

Khi thực hành cần có ý tiết kiệm hóa chất thí nghiệm, tránh gây đổ vỡ dụng cụ, hóa chất.
Dụng cụ loại nào dùng cho việc đó. Khi làm hư hỏng dụng cụ, thiết bị, tài sản trong phịng
thí nghiệm sinh viên phải báo cho giảng viên, cán bộ phòng thí nghiệm để có hướng giải
quyết hoặc bồi thường.

8.

Hóa chất phải được đựng trong các chai lọ thủy tinh hoặc nhựa có nhãn ghi: tên hố chất,
cơng thức hóa học, mức độ sạch, khối lượng tịnh, khối lượng phân tử, nơi sản xuất. Sinh
viên cần lưu ý điều kiện bảo quản, các ký hiệu cảnh báo ghi trên nhãn hóa chất (các ký
hiệu cảnh báo được trình bày ở phía dưới) để đảm bảo an tồn trong phịng thí nghiệm.

9.

Tất cả các chai lọ đều phải có nhãn ghi, phải đọc kỹ nhãn hiệu hóa chất trước khi dùng,
dùng xong phải để lại chỗ cũ. Phải làm quen với tính chất vật lý, hóa học của tất cả các hóa
chất sử dụng trong bài thí nghiệm và xếp đặt chúng một cách hợp lý khi lưu trữ theo từng
loại (hữu cơ, vô cơ, muối, acid, base, kim loại...) hay theo một thứ tự mã hóa nào đó để
khi cần dễ tìm.

10. Chai lọ hóa chất phải có nắp. Trước khi mở chai hóa chất phải lau sạch nắp, cổ chai, tránh
bụi bẩn lọt vào làm hỏng hóa chất đựng trong chai. Khơng dùng hóa chất đã rơi vãi.
11. Dụng cụ dùng để lấy hóa chất phải thật sạch và dùng xong phải rửa ngay, không dùng lẫn

nắp đậy và dụng cụ lấy hóa chất.
12. Các loại hóa chất dễ bị thay đổi ngoài ánh sáng cần phải được giữ trong chai lọ màu vàng
hoặc nâu và bảo quản vào chỗ tối.
13.

Khi hút hóa chất bằng pipet phải sử dụng quả bóp cao su. Khi theo dõi dung dịch đang sơi
hoặc tinh thể đang chảy không được để gần mặt, khi đun một chất lỏng trong ống nghiệm
phải để miệng ống quay về phía khơng có người. Lúc đun khơng được giữ ống nghiệm
đứng yên mà phải lắc đều, đun toàn bộ bề mặt ống nghiệm ở phần chứa chất lỏng. Phải
dùng kính bảo hộ lao động khi thao tác với hóa chất, dung mơi gây nguy hiểm. Làm việc gì
nguy hiểm phải chú ý cả người đứng bên cạnh.

14.

Khi làm việc với chất dễ cháy như các loại dung môi hoặc chất dễ nổ: như nitrate, chlorate
… các phải chú ý cẩn thận, thực hiện đúng quy trình, khơng được để gần nơi dễ bắt lửa
và cần phải biết rõ vị trí bình chữa cháy để kịp thời chữa cháy khi cần thiết.
4


15.

Khơng hút acid hay base khi trong chai cịn q ít. Khi làm việc với acid hay base mạnh, bao
giờ cũng đổ từ từ, cẩn thận acid hay base vào nước khi pha lỗng. Lưu ý KHƠNG được đổ
nước vào acid hay base.

16.

Khi sang chiết hóa chất vào các dụng cụ chứa khác phải dùng phễu (khi rót phải quay nhãn lên
phía trên, chai kia phải để trên bàn, tuyệt đối không cầm trên tay). Không cầm ở phần nắp chai

hóa chất khi di chuyển.

17.

Khi đun sơi phải cho đá bọt hoặc bi thủy tinh ... để điều hòa, tránh để bắn hay trào ra ngoài.

18.

Khi làm việc với thiết bị điện thì tay phải thật khơ, chỗ làm việc cũng phải khơ và thật cẩn thận
khi dùng điện có điện thế cao.

19.

Các thí nghiệm với các chất độc, chất bay hơi phải tiến hành trong tủ hút. Luôn mang găng tay,
khẩu trang khi làm việc với các hóa chất nguy hiểm.

20.

Khơng được nếm bất cứ chất gì trong phịng thí nghiệm, khơng ngửi trực tiếp bất cứ khí hay
chất có mùi.

21.

Trước khi ra về phải tắt đèn, quạt, rút phích cắm tủ sấy, tủ hút, bếp điện … khóa van nước và
khóa cửa cẩn thận.

22.

Sinh viên cũng cần biết rõ nơi để các trang bị dụng cụ chữa cháy, dụng cụ cấp cứu để khi
không may gặp các sự cố thì có cách xử lý một cách nhanh nhất và kịp thời.

23.

Khi xảy ra sự cố về điện, nước phải báo cho giảng viên hoặc cán bộ phịng thí nghiệm biết để
xử lý. Khi có cháy, nổ, chập điện phải nhanh chóng ngắt hết cầu dao điện và tham gia chữa
cháy.

Lưu ý CÁC KÍ HIỆU CẢNH BÁO NGUY HIỂM TRÊN NHÃN HĨA CHẤT:

1.2 Trang thiết bị an tồn trong PTN
1.2.1. Tủ an toàn sinh học
Tủ an toàn sinh học là thiết bị đảm bảo ATSH quan trọng của một PTN vi sinh.
Đối tượng bảo vệ:


Người thao tác thí nghiệm

Tài Liệu Lưu Hành Tại HUTECH - 2019





Mẫu bệnh phẩm
Môi trường xung quanh

Hai yếu tố quan trọng làm nên chức năng của tủ ATSH:



Bộ lọc hiệu suất cao (HEPA filter): Hiệu suất lọc đạt 99.97 % với các hạt 0.3μm theo tiêu
chuẩn quốc gia Mỹ.
Hướng dịng khí (ventilation)

Tủ an tồn Tốc độ khí tại Lưu lượng khí (%)
sinh học
cửa làm việc
Tái tuần
hồn

Thải

Hệthống thải khí

Cấp II A1

0,38 – 0,51

70

30

Thải vào phòng

Cấp II A2

0,51

70

30

Thải vào phòng

Tài Liệu Lưu Hành Tại HUTECH - 2019


Cấp II B1

0,51

30

70

Ống cứng
phịng

ra

bên

ngồi

Cấp II B2

0,51

0

100

Ống cứng
phịng

ra

bên

ngồi

1.2.2. Nồi hấp tiệt trùng
 Thiết bị duy trì hơi nước ở nhiệt độ và áp suất cao để tiệt trùng
Nồi hấp tiệt trùng là buồng áp suất và nhiệt độ cao, cung cấp bởi một nguồn hơi nước bão hịa,
duy trì nhiệt độ từ 121oC trở lên trong thời gian 5-20 phút để tiệt trùng dụng cụ y tế, chất thải
sinh học, dụng cụ thủy tinh và mơi trường ni cấy vi sinh
Tìm hiểu các thông tin kỹ thuật về nguyên lý và cấu tạo của nồi hấp tiệt trùng autoclave giúp sử
dụng nồi hấp tiệt trùng hiểu quả, an toàn trong thao tác.
 Nhiệt độ làm việc của nồi hấp tiệt trùng
Các nồi hấp tiệt trùng có thể đáp ứng nhiệt độ tiệt trùng tại mức 121 oC, 130oC hay 135oC. Với
nhiều vi sinh vật nhất là các vi sinh vật có bào tử bền nhiệt có thể cần nhiệt độ tiệt trùng cao hơn
121oC

1.2.3. Trang bị bảo hộ cá nhân
Phương tiện bảo hộ cá nhân là những dụng cụ, phương tiện được trang bị để bảo vệ con người
khi làm việc hay thực hiện nhiệm vụ trong điều kiện môi trường có các yếu tố nguy hiểm, độc
hại.






Đeo kính bảo hộ khi làm việc trong phịng thí nghiệm, khơng đeo kính sát trịng dù
ban đã đeo kính bảo hộ vì những tai nạn xảy ra khi hóa chất ở dưới kính sát trịng gây
tổn thương nặng hơn.
Đi giầy kín mũi và quần dài hạn chế tổn thương ở phần chăn, không đi sandal hay
quần sooc vào phịng thí nghiệm.
Tóc dài cần cột gọn lại nhất là khi dùng lửa ngồi, khơng phải là trong lị kín.

1.3. Các điểm cần lưu ý khi làm việc trong phịng thí nghiệm
1.3.1 Sử dụng hóa chất
Làm việc trong phịng thí nghiệm là phải thường xun sử dụng hóa chất độc hại. Vì vậy phải
chú ý một số điều sau:

Tài Liệu Lưu Hành Tại HUTECH - 2019








Cần tuân thủ nghiêm các quy định sử dụng hóa chất, chú ý các kí hiệu vật liệu ghi
trên các chai lọ đựng hóa chất.
Các chất, dung mơi dễ cháy không để gần lửa, không đun ngọn lửa trần.
Các chất, dung môi độc khi pha chế và sử dụng tiến hành trong tủ hút và phải cẩn
thận.
Không ngửi trực tiếp các chất dễ cháy, dễ bay hơi…
Các dung môi đã sử dụng nên thu gom riêng vào các can, thùng chứa riêng để xử

lí, tuyệt đối khơng nên xả vào nguồn nước thải.

1.3.2. Sử dụng công cụ thủy tinh
Đa số các dụng cụ trong phịng thí nghiệm đều được làm bằng thủy tinh. Những sự cố xảy ra với
các dụng cụ này là khơng thể tránh khỏi, vì vậy chúng ta cần phải thận trọng khi làm việc với
chúng.






Khi cho ống thủy tinh qua nút phải cẩn thận rất dễ gãy.
Khơng được cho nước nóng, nước sơi vào dụng cụ thủy tinh đang lạnh hoặc ở nhiệt
độ thường rất dễ vỡ.
Nếu bị đứt tay bằng thủy tinh, cho chảy máu vài giây để chất bẩn ra hết rồi dùng cồn
90 độ rửa và băng lại.
Các dụng cụ thủy tinh vỡ nên thu gom riêng với các loại rác thải khác

Tài Liệu Lưu Hành Tại HUTECH - 2019


BÀI 2: ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ VIBRIO TRONG TÔM
ẤU TRÙNG VÀ TÔM THƯƠNG PHẨM
2.1 Lý thuyết
Các bệnh liên quan đến Vibrio trong nuôi trồng thủy hải sản
Các thành viên của chi Vibrio thường được xem là vi khuẩn gây bệnh cơ hội và tiềm ẩn ở các
vùng nước nhiệt đới. Khi có dịch bệnh do Vibrio gây ra (vibriosis), chúng tàn phá và gây thiệt hại
nặng nhất cho các loài cá ni và các lồi thủy sinh khác trên thế giới (Austin & Austin 2007;
Inglis cs 1993). Loài Vibrio gây bệnh chính cho các lồi cá biển là Vibrio alginolyticus, Vibrio

anguillarum, Vibrio carchariae, Vibrio cholerae, Vibrio ordalii, Vibrio vulnificus và Vibrio
parahaemolyticus, trong khi đó Vibrio mimicus và Vibrio cholerae là các lồi Vibrio gây bệnh
chính cho cá nước ngọt (Farkas J, Malik 1986; Tison cs 1999). Dịch bệnh vibriosis phổ biến vào
mùa xuân và mùa hè khi nhiệt độ cao được coi là yếu tố chính cho việc phát triển hầu hết các
loại vibriosis (Noga 2010). Vibrios thường phổ biến hơn ở các vùng địa lý có khí hậu ơn đới hoặc
nhiệt đới (Motes & cs, 1998). Độ mặn, đặc biệt là muối natri (Na +), là yếu tố quan trọng nhất
chi phối sự phân bố môi trường của vibrios (Baumann & cs 1984). Cá nhiễm bệnh vibriosis
thường biểu hiện một số dấu hiệu lâm sàng tương tự như báo cáo của Toranzo và cs 2005 bao
gồm, da tối và tróc vảy, lở loét, xuất hiện các khu vực xuất huyết nhỏ và lớn trên nhiều bộ phận
của cơ thể, đặc biệt là vây lưng, miệng, và vùng bụng. Gan cá, lá lách và thận là những cơ quan
giàu sắt làm cho chúng trở thành địa điểm thuận lợi cho việc cư ngụ của loài Vibrio (Amaro & cs
1990; Guerinot & cs 1994; Noga 2010).
2.1.1. Một số bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra ở tôm
(Bùi Quang Tề, 2006)
Tên bệnh

Giai đoạn tôm

Tài Liệu Lưu Hành Tại HUTECH - 2019

Vi khuẩn gây bệnh

Tác hại


Bệnh phát sáng

ấu trùng, giống

Bệnh đỏ dọc thân

Bệnh đỏ thân
Bệnh vỏ hay ăn mịn
kitin, đen mang

Ấu trùng, giống
Tơm thịt
ở các giai đoạn của
tôm cua

Nhiễm khuẩn ở cá

Cá nuôi ao, lồng

V.parahaemolyticus
V.harveyi
V.alginolyticus
Vibrio spp.
Vibrio spp.,
Pseudomonas spp.,
Proteus sp.
Vibrio spp.

Gây chết hàng
loạt
Gây chết rải rác
Gây chết rải rác
chết rải rác,
hàng loạt
chết rải rác

Tổng số vụ ngộ độc thực phẩm ghi nhận từ 2002 đến 2006 là 81.852 trường hợp. Các vi khuẩn
được xác định là Salmonella (31.635 trường hợp), Campylobacter (27.253), Shigella (13.941),
Cryptosporidium (3.806), STEC O157 (2.111), STEC không O157 (355), E. coli O57 (355) 817),
Vibrio (610), Listeria (632) và Cyclospora (179). Trong đó, tỷ lệ nhiễm Vibrio đã tăng lên mức
cao nhất. Những bệnh nhiễm khuẩn này thường liên quan đến việc tiêu thụ hải sản sống, đặc biệt
là hàu. Trong số 95% phân lập Vibrio mà loài này được xác định, 64% là V. parahaemolyticus và
12% là V. vulnificus (CDC, 2008). Đối với thủy hải sản, hầu hết các bệnh ngộ độc do vi khuẩn
gây ra là do Vibrio parahaemolyticus với 75% các trường hợp bệnh do vi khuẩn. Các vi sinh vật
liên quan tới mang cá, ruột cá và chất nhờn.
Bài thực hành này giúp các bạn sinh viên tiếp cận phương pháp phân lập, mô tả đánh giá sự hiện
diện của các lồi Vibrio spp trong các loại thực phẩm tơm/cá khác nhau.
2.1.2. Nguyên tắc định lượng Vibrio spp.
Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose (TCBS) Agar là môi trường được sử dụng để phân lập và
chọn lọc Vibrio cholerae và các Vibrios gây bệnh đường ruột khác.
 Cách thức chọn lọc của môi trường TCBS
Nồng độ thiosulfate và citrate cao và độ kiềm mạnh của mơi trường này có thể ức chế sự phát
triển của Enterobacteriaceae. Muối mật và cholate ức chế chủ yếu enterococci. Các chủng dương

Tài Liệu Lưu Hành Tại HUTECH - 2019


tính với sucrose có thể phát triển để hình thành các khuẩn lạc màu vàng do sự hiện diện của chất
chỉ thị thymolblue-bromothymol màu xanh thay đổi thành màu vàng, khi axit được hình thành,
ngay cả trong mơi trường kiềm mạnh này.
 Thành phần môi trường thạch TCBS (g / lít)
Peptone from casein 5.0; peptone from meat 5.0; yeast extract 5.0; sodium citrate 10.0; sodium
thiosulfate 10.0; ox bile 5.0; sodium cholate 3.0; sucrose 20.0; sodium chloride 10.0; iron(III)
citrate 1.0; thymol blue 0.04; bromothymol blue 0.04; agar-agar 14.0.
 Cách tiến hành:
Cân 88 g TCBS hịa tan trong 1 lít nước cất, đun sôi và đổ đĩa.

Không hấp.
pH: 8,6 ± 0,2 ở 25 ° C.
Mơi trường TCBS có màu xanh (green).
2.1.3. Phương pháp đếm đĩa (SPC)
Phương pháp đếm đĩa là một trong những phương pháp phổ biến nhất để xác định số lượng vi
khuẩn trong một mẫu. Một mẫu được pha loãng trong dãy các dịch pha lỗng trắng (Hình 1).

Tài Liệu Lưu Hành Tại HUTECH - 2019


Hình 1: Phuong pháp pha lỗng mẫu
Các mẫu được pha lỗng sau đó được trang lên mơi trường và số lượng khuẩn lạc được đếm sau
khi ủ trong 24 đến 48 giờ. Các tế bào vi khuẩn được pha loãng đến điểm cuối nơi một tế bào đơn
lẻ phân chia, tạo ra một khuẩn lạc có thể nhìn thấy trên một đĩa. Số lượng vi khuẩn trong mẫu
ban đầu được xác định bằng cách nhân số lượng khuẩn lạc với hệ số pha lỗng.

Hình 2 Phương pháp trang đĩa đếm tế bào
Chỉ các đĩa có số khuẩn lạc đơn từ 30 đến 300 CFU được coi là hợp lệ. Nếu CFU lớn hơn 300,
có khả năng q đơng trên đĩa có thể đã ức chế một số tế bào phát triển. Nếu số khuẩn lạc ít hơn
30 CFU có thể liên quan đến lỗi lấy mẫu và ước lượng thấp các con số.

Tài Liệu Lưu Hành Tại HUTECH - 2019


2.2 Thực hành
Định lượng tổng số Vibrio trong tôm ấu trùng và tơm thương phẩm.
2.2.1. Đồng nhất và pha lỗng mẫu

- Mẫu tôm được nghiền nhuyễn trong điều kiện vô trùng cho tới khi được thể đồng nhất.
- Cân chính xác 10g thực phẩm đã được chuẩn bị (hoặc hút 10ml thực phẩm lỏng) cho vào bình

nón có chứa 90 ml đệm pepton, lắc đều 2-3 phút thu được dung dịch mẫu thử 10-1.
- Hút chính xác 1ml dung dịch mẫu thử 10-1 cho sang ống nghiệm có chứa sẵn 9ml đệm pepton,
đều 2-3 phút thu được dung dịch mẫu thử 10-2. Tiếp tục làm tương tự để có dung dịch pha loãng
tiếp theo.
2.2.2 Cấy trang và ủ ấm
Để xác định số lượng Vibrio tổng có trong mẫu tơm/cá thực phẩm, phương pháp đếm đĩa tiêu
chuẩn (SPC) được sử dụng.
Quy trình này bao gồm pha lỗng các sinh vật với nhiều nồng độ pha loãng khác nhau trong
dung dịch 0,85% NaCl, như được minh họa trong hình 1.
Các ống pha loãng (0,1 mL dịch vi khuẩn pha loãng) được được sử dụng để kiểm tra số lượng
Vibrio trên các đĩa mơi trường thạch TCBS.
Mẫu sau khi được pha lỗng sẽ được phân bố đều trên bề mặt agar bằng cách kỹ thuật cấy trang
(lặp lại 2 đĩa). Nếu vi sinh vật trong mẫu được pha loãng tốt, vi khuẩn sẽ hình thành các khuẩn
lạc riêng rẽ. Sau đó tiến hành đếm số lượng khuẩn lạc và tính tốn số lượng trong mẫu.
- Dùng pipet vô trùng hút 100ul mẫu đã pha lỗng và cho vào 2 đĩa mơi trường TCBS.
Lặp lại q trình này ở các dịch pha lỗng tiếp theo.

Tài Liệu Lưu Hành Tại HUTECH - 2019


- Trang đều dịch nuôi cấy trên môi trường thạch bằng que cấy trang cho đến khi bề mặt
đĩa khô.
- Lật ngược đĩa và ủ ấm ở 30oC, thời gian 24-48 giờ.
- Thời gian bắt đầu pha loãng đến khi rót mơi trường vào đĩa khơng được q 30 phút.
2.2.3 Đếm khuẩn lạc
- Sau 48 giờ đếm toàn bộ số khuẩn lạc đã mọc và ghi nhận kết quả.
- Sự phân bố các khuẩn lạc trên các đĩa petri phải hợp lý. Độ pha lỗng càng cao thì số khuẩn lạc
càng ít. Nếu kết quả khơng hợp lý phải tiến hành lại các bước ni cấy
- Các đĩa có từ 30 đến 300 khuẩn lạc được chọn để đếm. Từ số đếm, số lượng trong 1 mL môi
trường ban đầu được tính tốn.

2.2.4 Tính tốn và đánh giá kết quả
Ghi nhận và đánh giá sự nhiễm Vibrio tổng trong mẫu khảo sát theo ví dụ trong bảng bên dưới.

Tài Liệu Lưu Hành Tại HUTECH - 2019


BÀI 3 KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA CỦA VI
KHUẨN VIBRIO
3.1 Lý thuyết
Đặc điểm chung của các vi khuẩn Vibrio: Gram âm, hình que thẳng hoặc hơi cong, kích thước
0,3-0,5 µm x 1,4-2,6 µm, khơng hình thành bào tử và chuyển động nhờ một tiêm mao hoặc nhiều
tiêm mao mảnh, tất cả chúng đều yếm khí tùy tiện và hầu hết là oxy hóa và lên men trong mơi
trường O/F Glucose. Thiosulphate citrate bile salt agar (TCBS) là môi trường chọn lọc của
Vibrio. Hầu hết các loài đều phát triển trong mơi trường nước biển cơ bản, Na+ kích thích cho sự
phát triển của tất cả các loài Vibrio, chúng không phát triển trong môi trường không muối NaCl,
chúng không sinh H2S, mẫn cảm với Vibriostat 2.4 diamino-6,7 diisopropyl pteridine phosphat
(O/129,150 μg) là hợp chất giúp phân biệt vi khuẩn Vibrio và Aeromonas. Cơ bản chúng sống
trong môi trường nước biển và cửa sơng (vùng nước lợ).
Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Vibrionacea

Growth

P. shigelloides

A. hydrophila

V.vulnificus

V. parahaemolyticus

V. mimicus

V. metschnikovii

V. harveyi

V. furnisii

V. fluvialis

V. damselae

V.cincinnatiensis

V. choleae

V. carchariae

V. alginolyticuss

V. anguillarum

Bảng 3.1. Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Vibrionacea

in

Y

Y

Y

Y

Y

Y

Y

Y

Y/G

Y

G

G

G

Y

G

TCBS
Oxidase
Growth in: 0%

+
–

+
–

+
–

+
–

+
–

+
–

+
–

+
–

+
–

–
–

+
+

+
–

+
–

+
+

+
+

NaCl
6% NaCl
ONPG
Voges-

+
–
+

+
+
+

+
–

–

–
+
V

+
+
+

V
–
+

+
+
–

+
+
–

+
V
–

+
+
+

–
+
–

+
–
–

+
+
–

+
+
+

–
–
–

Proskauer

Tài Liệu Lưu Hành Tại HUTECH - 2019


Lysine

+

–

+

+

+

V

–

–

+

+

+

+

–

V

+

decarboxylase
Acid from:

–

+

+

–

+

+

+

–

nd

–

–

V

+

+

–

D-cellobiose
a
Y = yellow, G = green, V = variable, nd = not determined, + = positive and - = negative

Kháng sinh có tác dụng ức chế (nồng độ thấp) hoặc tiêu diệt (nồng độ cao) vi khuẩn một cách
đặc hiệu.
Khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn Vibrio spp. phân lập từ hậu ấu trùng tôm sú
(Penaeus monodon) với nhiều loại thuốc kháng sinh thường dùng trong nuôi thủy sản cho thấy
(tham khảo) 100% số dòng vi khuẩn thử nghiệm kháng với ampicilin. Các dòng vi khuẩn phát
sáng thử nghiệm mẫn cảm với chloramphenicol, norfloxacin và nitrofurantoin hơn so với
tetracycline và trimethoprim/sulfamethoxazole. Phần lớn các dòng vi khuẩn thử nghiệm chỉ
kháng với một loại kháng sinh (77%). Có khoảng 15% dòng vi khuẩn kháng với 2 loại kháng
sinh và 4% kháng với 4 loại thuốc được thử. Có 4% số dòng vi khuẩn kháng với cả 6 loại kháng
sinh thử nghiệm. Các chủng vi khuẩn không ngừng biến đổi để thích nghi và tạo ra khả năng đề
kháng kháng sinh với tốc độ rất nhanh. Do đó, việc sử dụng kháng sinh hợp lý để đảm bảo an
toàn và hiệu quả trong điều trị thủy sản, còn hạn chế sự gia tăng các vi khuẩn đề kháng kháng
sinh cũng như sức khỏe của con người.
Nguyên tắc xác định đặc điểm nhạy cảm với kháng sinh
Đối với thuốc kháng khuẩn, phương pháp Kirby-Bauer được sử dụng để xác định độ nhạy hoặc
khả năng kháng thuốc của vi khuẩn. Đây là một quy trình kiểm tra tiêu chuẩn đáng tin cậy, tương
đối đơn giản và mang lại kết quả trong thời gian ngắn nhất có thể. Nó được thực hiện bằng cách
trải đều một chủng sinh vi vật thử nghiệm đã được chuẩn hóa trên mơi trường Mueller-Hinton,
và sau đó các đĩa giấy có chứa nồng độ cụ thể của một loại kháng sinh được đặt trên bề mặt đĩa

Tài Liệu Lưu Hành Tại HUTECH - 2019


thạch. Chất kháng khuẩn khuếch tán từ đĩa vào môi trường thạch, tạo thành một dải nồng độ.
Nếu tác nhân ức chế hoặc giết chết sinh vật thử nghiệm, sẽ có một khu vực xung quanh đĩa nơi
khơng có sự tăng trưởng xảy ra được gọi là vùng ức chế. Tuy nhiên, vịng kháng có thể khác

nhau tùy thuộc vào độ khuếch tán của tác nhân, kích thước của chủng, loại môi trường và các
yếu tố khác. Dựa vào đường kính vùng ức chế và hướng dẫn trong tài liệu chuẩn về kết quả
kháng sinh đồ, mức độ nhạy cảm có thể phân chia thành phân loại S (susceptible - nhạy cảm), I
(intermediate - trung gian), R (resistant - đề kháng) hoặc NS (non-susceptible - không nhạy
cảm).

- Độ đục chuẩn McFarland được sử dụng để hiệu chỉnh độ đục của huyền dịch vi khuẩn sao cho
huyền dịch vi khuẩn sau khi pha sẽ chứa một số lượng vi khuẩn nhất định tương đương với độ
đục chuẩn sử dụng. Độ đục chuẩn được pha chế từ BaCl2 và H2SO4 để được BaSO4 kết tủa tạo

Tài Liệu Lưu Hành Tại HUTECH - 2019


nên độ đục của dung dịch chuẩn. Độ đục chuẩn McFarland 0,5 được pha từ 0,05 ml BaCl2.2H2O
1,175% với 9,95 ml H2SO4 1%. Huyền dịch vi khuẩn có độ đục tương đương với độ đục của
McFarland 0,5 chứa khoảng 1- 2 x 108 CFU/ml đối với E. coli ATCC 25922.
- Vùng ức chế: Là vùng mà khơng nhìn thấy sự phát triển vi khuẩn.
- CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute): Viện Chuẩn thức về Lâm sàng và Xét
nghiệm.
3.2 Thực hành
Tăng sinh chủng Vibrio parahemolyticus (green) và V. vulnificus (yellow) trên môi trường TCBS
ở 28ºC trong 2-5 ngày.
Các khuẩn lạc mọc được trên môi trường chọn lọc TCBS sẽ được tiếp tục đánh giá, kiểm tra hình
thái (hình dạng, nhuộm gram), phản ứng sinh hóa theo các phản ứng như sau:
 Phản ứng oxidase:
Mục đích: phát hiện VSV có hệ enzym oxydase (hệ cytochrome C)
Cytochrome C khử + H+ + O2  Cytochrome C oxi hoá + H2O
Cytochrom C oxi hoá + TMPD khử  TMPD ơxi hố (màu xanh)
Tiến hành:
Các khuẩn lạc được chuyển bằng một que cấy vô trùng lên giấy đã thấm với thuốc thử oxidase

(N,N,N′,N′-tetramethyl-p-phenylenediamine (TMPD) or N,N-dimethyl-p-phenylenediamine
(DMPD)).
Phản ứng (+): Sự xuất hiện nhanh chóng của một màu xanh tím sẫm trong vịng vài giây được
coi là một phản ứng dương tính.
Phản ứng (-): sinh khối vẫn màu trắng

Tài Liệu Lưu Hành Tại HUTECH - 2019


 Phát triển trong môi trường NaCl
Các chủng phân lập được thử nuôi cấy trong môi trường 1% tryptone lỏng (Oxoid Ltd.,
Basingstoke, Anh) có và khơng có bổ sung NaCl (6% Wt / Vol) để xác định khà năng sửa dụng
Na+. Môi trường được cấy và ủ ở 37oC trong 18 - 24 giờ trong bể ổn nhiệt lắc. Kết quả dương
tính được xác định bởi độ đục của mội trường.
 Voges-Proskauer (VP):
Mục đích:
Methyl red (MR vàng pH > 6.0; đỏ pH < 4.4): xác định vi sinh vật sản xuất và duy trì các acid
bền trong quá trình lên men glucose.
MR (+) – càng kéo dài thời gian nuôi cấy – môi trường càng acid
MR (-) – càng kéo dài thời gian ni cấy – các chất có tính acid bị chuyển hóa – mơi trường dần
trung tính. Thời gian 2 – 5 ngày, 37o C
VP: phát hiện vi sinh vật tạo sản phẩm trung tính (acetoin) trong quá trình lên men glucose.
Acetoin được tạo ra trong điều kiện yếm khí hồn tồn: 2 pyruvate  acetoin + 2 CO2
Tiến hành:
Cấy vi sinh vật trong môi trường MR – VP
Ủ 24 – 48 giờ, 37oC
Bổ sung thuốc thử (alpha-napthol, KOH 40%) vào môi trường, lắc nhẹ
Đọc kết quả sau 20 phút
(+): màu đỏ trên môi trường

Tài Liệu Lưu Hành Tại HUTECH - 2019


(-): mặt môi trường không đổi màu
 Phản ứng Lysine decarboxylase (LDC):
Mục đích: xác định khả năng tạo enzyme decarboxylase xúc tác phân cắt nhóm carboxyl ở một
số acid amin. Các sản phẩm tạo ra làm tăng pH môi trường  đổi màu chất chỉ thị bromocresol
purple (5,2 – 6,8)
Tiến hành:
Khuẩn lạc (sau 24 giờ) được cấy vào môi trường LDC lỏng và ủ ở 37 oC trong 24 - 48 giờ. Phản
ứng dương tính được chỉ định bởi một màu tím đậm trong suốt mơi trường, trong khi đó phản
ứng âm tính được chỉ ra bởi màu vàng trong suốt môi trường (Choopun et al., 2002).
 Phản ứng ONPG (O-nitrophenyl-betaD-galactosidase):
Mục đích: phát hiện các vi sinh vật có hệ enzyme ß-galactosidase – enzyme cảm ứng.
ONPG (khơng màu)  o-nitrophenol (màu vàng)
Tiến hành:
Khuẩn lạc (sau 24 giờ nuôi trong môi trường có lactose) được cấy vào ống nghiệm chứa nước
muối sinh lý. Sau đó, cho đĩa giấy ONPG vào ống nghiệm trên và ủ ở 37 oC trong 24 giờ. Phản
ứng được cho là dương tính khi có chỉ thị màu vàng.
 Catalase (+)
Mục đích: Catalase là một enzyme, được sản xuất bởi các vi sinh vật sống trong môi trường oxy
để trung hịa các dạng chuyển hóa oxy độc hại; H2O2. Enzyme catalase trung hòa tác dụng diệt
khuẩn của hydro peroxide và bảo vệ chúng.

Tài Liệu Lưu Hành Tại HUTECH - 2019


Thực hiện
◦ VSV lấy từ môi trường nuôi cấy (lỏng, rắn)
◦ Đặt VSV lên lam kính sạch

◦ Nhỏ H2O2 30%
◦ Quan sát sau 1-2 giây
Phản ứng (+): có bọt khí xuất hiện
Phản ứng (-): khơng có bọt khí xuất hiện
 Sự di động (+)
Mục đích: Kỹ thuật xác đinh tính chất di động được sử dụng để phát hiện vi khuẩn có lơng roi
(flagella), biểu hiện bằng việc vi khuẩn phát triển vượt ra ngoài đường cấy ban đầu trong môi
trường thạch mềm.
Tiến hành:
Cấy đâm sâu chủng vi sinh vật vào môi trường thạch mềm (0,5% agar)
Vi sinh vật di động sẽ làm môi trường đục, phát triển lan ra khỏi vết cấy
Vi sinh vật không di động sẽ phát triển quanh vết cấy, môi trường không bị đục.

Tài Liệu Lưu Hành Tại HUTECH - 2019


 Xác định đặc điểm nhạy cảm với kháng sinh
Chuẩn bị:


1 đĩa petri của Mueller-Hinton II agar



nuôi cấy nước canh dinh dưỡng (bằng tăm bông) của V. parahaemolyticus, V. vulnificus



Đĩa kháng sinh (BBL hoặc Difco)



Kẹp và đèn cồn



Biểu đồ giải thích vùng (Difco hoặc BBL)



Thước cm

Tiến hành:
1. Tăng sinh các sinh vật cần khảo sát.

Tài Liệu Lưu Hành Tại HUTECH - 2019


2. Đánh dấu nhãn tên của sinh vật khảo sát chuẩn bị mật độ huyền phù ~ Mc Fc 0.5
3. Cấy chủng vi khuẩn lên bề mặt của môi trường bằng tăm bông. Phủ đều bề mặt thạch bằng
cách quét theo ba hướng.
4. Để đĩa khô từ 3 đến 5 phút trước khi gắn đĩa kháng sinh.
5. Phân phối đĩa kháng sinh theo Phuong pháp như sau:
Dùng kẹp được khử trùng chúng trước bằng cách đốt lửa trước khi lấy đĩa. Giữ mỗi đĩa ít nhất 15
mm từ mép của đĩa. Đặt không quá không quá 5 đĩa kháng sinh trên đĩa môi trường 100 mm. Áp
dụng áp lực nhẹ lên từng đĩa trên môi trường thạch bằng đầu kẹp vơ trùng cố định nó vào mơi
trường thạch.

6. Đảo ngược và ủ đĩa trong 16 đến 18 giờ ở 37 C.
7. Ghi nhận kết quả

Sau khi nuôi cấy qua đêm (16-18 giờ), kiểm tra đĩa thạch và chỉ đọc kết quả khi vi khuẩn thử
nghiệm mọc đồng đều trên mặt thạch, các khuẩn lạc (khóm) mọc dày sát cạnh nhau nhưng không
chồng lên nhau thành thảm dày hoặc không quá thưa có các khe giữa các khuẩn lạc (khóm).
Vùng ức chế tạo ra có hình trịn đều. Dùng thước kẻ có chia vạch đến mm hoặc thước kẹp đặt lên
mặt đáy của đĩa thạch, không mở nắp đĩa thạch, đo đường kính vùng ức chế hồn tồn (bao gồm
cả đường kính của khoanh giấy kháng sinh) tính theo mm. Khi đó, nên đặt đĩa cách nền đen

Tài Liệu Lưu Hành Tại HUTECH - 2019


khoảng vài cm và dưới ánh sáng rọi. Dùng thước đo đường kính vịng kháng và so sánh kết quả
với tiêu chuẩn quy định của CLSI.

3.3 Diễn giải kết quả và báo cáo
- Trình bày kết quả sinh hóa, kháng sinh đồ của hai chủng V. parahaemolyticus và V. vulnificus
- Giải thích kết quả

Tài Liệu Lưu Hành Tại HUTECH - 2019


BÀI 4: ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA VI
KHUẨN LACTIC ĐỐI VỚI VI KHUẨN GÂY BỆNH
4.1 Lý thuyết
 Giới thiệu về vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic bao gồm một số giống: Carnobacterim, Enterococcus, Lactpbacillus,
Lactococcus,

Lactosphaera,

Leuconostoc,

Melissococcus,

Oenococcus,

Pediococcus,

Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus và Weissella thuộc ngành Fermicute (Ercolini et al.,
2001; Jay, 2000; Holzapfel et al., 2001).
Vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn Gram dương (Fooks et al., 1999) và lên men carbohydrate khi
có hoặc khơng có oxy và tạo ra sản phẩm cuối cùng là acid lactic (Jay, 2000). Nhóm vi khuẩn
này cịn sản xuất các hợp chất hữu cơ tạo ra mùi thơm và hương vị cho các sản phẩm được lên
men (Caplice và Fitzgerald, 1999). Vi khuẩn lactic được phân lập đầu tiên trong sữa (Carr et al.,
2002; Metchnikoff, 1908; Sandine et al., 1972) và gần đây chúng được phân lập từ các sản phẩm
lên men như: thịt, các sản phẩm từ sữa, rau quả, nước uống và bánh mì lên men, hệ tiêu hóa các
lồi động vật thủy sản.
 Thành phần kháng khuẩn được sinh ra từ vi khuẩn lactic
Tác động kháng lại vi sinh vật của vi khuẩn lactic chủ yếu là do acid lactic và các sản phẩm acid
hữu cơ. Chúng làm giảm pH của môi trường sinh sống của vi sinh vật khác (Caplice và
Fitzgerald, 1999; Kuipers et al., 2000). Ở pH thấp thì các acid hữu cơ sẽ chuyển thành lipid hòa
tan và khuếch tán qua màng tế bào chất (Gottschalk, 1988).
Nghiên cứu của Galindo (2004) cho thấy các loài vi khuẩn thuộc giống Lactobacillus được phân
lập từ dạ dày – ruột của một số loài cá nước ngọt có khả năng ức chế mạnh một số lồi vi khuẩn

Tài Liệu Lưu Hành Tại HUTECH - 2019