Đánh giá tỷ lệ huyết thanh có kháng thể đặc hiệu kháng vi rút cúm mùa cúm gia cầm a h5 a h7 và một số yếu tố liên quan ở người buôn bán giết mổ gia cầm tại các chợ ở hà nội năm 2017

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------------------------

PHẠM THỊ HIỀN

ĐÁNH GIÁ TỶ LỆ HUYẾT THANH CÓ KHÁNG THỂ KHÁNG
ĐẶC HIỆU VI RÚT CÚM MÙA, CÚM GIA CẦM (A/H5, A/H7) VÀ
MỘT SỐ YẾU TỐ LIÊN QUAN Ở NGƢỜI BUÔN BÁN, GIẾT MỔ
GIA CẦM TẠI CÁC CHỢ Ở HÀ NỘI NĂM 2017

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2020


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------------------------

PHẠM THỊ HIỀN

ĐÁNH GIÁ TỶ LỆ HUYẾT THANH CÓ KHÁNG THỂ KHÁNG
ĐẶC HIỆU VI RÚT CÚM MÙA, CÚM GIA CẦM (A/H5, A/H7) VÀ
MỘT SỐ YẾU TỐ LIÊN QUAN Ở NGƢỜI BUÔN BÁN, GIẾT MỔ
GIA CẦM TẠI CÁC CHỢ Ở HÀ NỘI NĂM 2017

Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 8420101.07.

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. HOÀNG VŨ MAI PHƢƠNG
PGS.TS. BÙI THỊ VIỆT HÀ

Hà Nội – 2020


LỜI CẢM ƠN
Để hồn thành luận văn này tơi xin trân trọng cảm ơn:
Ban Giám đốc, Ban Chủ nhiệm Khoa Vi rut, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung
Ương.
Ban giám hiệu Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà
Nội đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt q trình học tập và nghiên cứu.
Tơi xin bày tỏ lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới GS.TS. Lê Thị Quỳnh
Mai, Viện phó Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, người đã giúp tơi có định hướng
đúng đắn và phương pháp luận khoa học trong nghiên cứu. Tôi cũng xin được
gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến TS. Hoàng Vũ Mai Phương, Khoa Vi rút,
Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đã tận tình chỉ bảo và dìu dắt tơi tới khi hồn
thiện luận văn, tạo mọi điều kiện thuận lợi để tơi có được kết quả như ngày hôm
nay. Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn đến PGS.TS. Bùi Thị Việt Hà, Trường Đại
học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN đã hướng dẫn tôi kiến thức chun ngành
hữu ích trong suốt q trình học tập và nghiên cứu.
Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô giáo bộ môn Vi sinh Vật học, Khoa
Sinh học đã nhiệt tình giảng dạy, cho tơi những kiến thức bổ ích.
Tơi xin trân trọng cảm ơn TS. Nguyễn Lê Khánh Hằng, ThS. Lê Thị Thanh
và các anh chị đồng nghiệp PTN Cúm, PTN Các Vi rút đặc biệt đã nhiệt tình
giúp đỡ và hỗ trợ tơi trong suốt thời gian thực hiện luận văn.
Tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã giúp đỡ, ủng hộ để tơi hồn thành
khóa học này.
Hà Nội, ngày

tháng 12 năm 2020

PHẠM THỊ HIỀN


LỜI CAM ĐOAN

Là thành viên trong nhóm thực hiện nghiên cứu, được sự đồng ý của
trưởng nhóm nghiên cứu, tơi xin cam đoan các số liệu, kết quả trong luận văn là
trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kì cơng trình nào khác.

HỌC VIÊN

PHẠM THỊ HIỀN


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU.............................................................................................................. 1
CHƢƠNG 1- TỔNG QUAN.............................................................................. 3
1.1. Vi rút cúm................................................................................................... 3
1.1.1. Đặc điểm vi rút cúm.............................................................................. 3
1.1.2. Kháng nguyên và kháng thể.................................................................. 5
1.1.3. Tính đa dạng của vi rút cúm................................................................. 7
1.1.4. Độc lực của vi rút cúm.......................................................................... 7
1.2. Nguồn lây nhiễm......................................................................................... 9
1.3. Đường lây và cơ chế lây truyền................................................................. 10
1.4.Phương pháp phân tíchchuẩn đốn vi rut cúm.............................................11
1.4.1. Phương pháp sinh học phân tử.......................................................... 11

1.4.2. Phương pháp xác định trình tự gen................................................... 11
1.4.3. Phươngpháp phân lập vi rút............................................................... 13
1.4.4. Phươngpháp phát hiện kháng thể..................................................... 13
1.5. Phòng bệnh và điều trị............................................................................... 14
1.6. Các yếu tố liên quan tới nhiễm cúm gia cầm............................................. 15
1.7. Tình hình nhiễm cúm tại Việt Nam và trên thế giới................................... 17
CHƢƠNG 2 - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................................... 20
2.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................... 20
2.1.1. Đối tượng............................................................................................ 20
2.1.2. Địa điểm nghiên cứu........................................................................... 20
2.1.3. Cỡ mẫu và phương pháp chọn mẫu.................................................... 20
2.2. Phương pháp............................................................................................. 21
2.2.1. Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (HAI)....................................... 22
2.2.2. Kỹ thuật trung hòa vi lượng................................................................ 29
2.3. Phân tích số liệu........................................................................................ 36


CHƢƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN..................................................... 37
3.1. Đặc điểm chung quần thể nghiên cứu và tỷ lệ huyết thanh có kháng thể đặc
hiệu kháng vi rút cúm mùa, vi rút cúm gia cầm A/H5 hoặc A/H7....................37
3.1.1. Đặc điểm chung quần thể nghiên cứu................................................. 38
3.1.2. Các hoạt động và kinh nghiệm làm việc của người tham gia nghiên
cứu...................................................................................................... 39
3.1.3. Các hoạt động tiếp xúc và bảo vệ cá nhân với gia cầm ốm, chết........42
3.1.2. Tỉ lệ huyết thanh có kháng thể đặc hiệu kháng vi rút cúm mùa...........45
3.1.3. Tỉ lệ huyết thanh có kháng thể đặc hiệu kháng vi rút cúm gia cầm
A/H5 và A/H7...................................................................................... 48
3.2. Các yếu tố liên quan đến khả năng phơi nhiễm với vi rút cúm gia cầm...........52
KẾT LUẬN........................................................................................................ 56
KIẾN NGHỊ....................................................................................................... 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................. 58
PHỤ LỤC........................................................................................................... 65


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 3.1. Phân bố người tham gia nghiên cứu theo tuổi và giới (n=202)................38
Bảng 3.2. Công việc của đối tượng nghiên cứu (n=202)......................................... 39
Bảng 3.3. Kinh nghiệm làm việc của đối tượng tham gia nghiên cứu.....................40
Bảng 3.4. Thâm niên và thời gian tiếp xúc với gia cầm (n=202).............................40
Bảng 3.5. Người tham gia nghiên cứu tiếp xúc với gia cầm ốm chết......................42
Bảng 3.6. Các biện pháp bảo vệ cá nhân và tần suất sử dụng khi tiếp xúc với gia
cầm sống (N=202), gia cầm ốm/chết (N=46)............................................. 44
Bảng 3.7. Tỉ lệ người có kháng thể đặc hiệu kháng vi rút cúm mùa........................45
Bảng 3.8. Tỉ lệ người có kháng thể kháng vi rút cúm mùa theo từng phân typ........47
Bảng 3. 9. Phân bố các trường hợp dương tính với kháng thể kháng vi rút cúm A/H5
và A/H7 theo huyện (N=202)..................................................................... 48
Bảng 3.10. Hiệu giá kháng thể đặt hiệu kháng vi rút cúm A/H5 clade 2.3.2.1 và
A/H5 clade 2.3.4.4 bằng phương pháp HI và MN...................................... 48
Bảng 3.11. Số mẫu dương tính với kháng thể kháng vi rút cúm A/H5....................51
Bảng 3.12. Sự phân bố tỉ lệ huyết thanh có kháng thể kháng vi rút cúm A/H5 theo
yếu tố địa điểm,tuổi, giới (N=202)............................................................. 52
Bảng 3.13. Mối liên quan giữa đặc điểm tiếp xúc với gia cầm và tình trạng huyết
thanh có kháng thể kháng vi rút cúm A/H5 (N=202)................................. 54
Bảng 3.14. Mối liên quan giữa loại cơng việc và tình trạng huyết thanh có kháng thể
kháng vi rút cúm A/H5............................................................................... 54
Bảng 3.15. Mối liên quan giữa việc tiếp xúc với gia cầm ốm, chết và tình trạng
huyết thanh có kháng thể kháng vi rút cúm A/H5...................................... 55


DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Mơ hình cấu trúc virion vi rút cúm............................................................. 4
Hình 1.2. Sự lưu hành của phân típ cúm A trên mỗi vật chủ...................................... 9
Hình 1.3. Phân típ cúm A ( HA& NA)..................................................................... 10
Hình 1.4. Vi rút cúm lưu hành theo phân typ tại miền Bắc Việt Nam, 2006-2018...17
Hình 2.1. Qui trình đánh giá tỉ lệ kháng huyết thanh có kháng thể đặc hiệu kháng vi
rút cúm mùa, cúm gia cầm (A/H5, A/H7).................................................. 21
Hình 2.2. Hình ảnh minh hoạ sự ngưng kết và không ngưng kết của hồng cầu ngựa
.....................................................................................................................24
Hình 2.3. Sơ đồ các bước chuẩn độ ngược.............................................................. 27
Hình 2.4 Sơ đồ thực hiện phản ứng trung hịa vi lượng........................................... 32
Hình 3.1. Phân bố người tham gia nghiên cứu theo tuổi và giới..............................39
Hình 3.2. Số ngày tiếp xúc trung bình trên một tháng............................................. 41
Hình 3.3. Tỉ lệ người có kháng thể kháng vi rút cúm mùa theo địa điểm................46


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ARN

Axit ribonucleic

RNP

Phức hợp Ribônucleo-protein

CDC

Centers for Disease Control and Prevention( Trung tâm phịng ngừa
và kiểm sốt bệnh,Mỹ)

KHT

Kháng huyết thanh

HA

Hemaglutination Assay( Phản ứng ngưng kết hồng cầu )

HI

Hemaglutination Inhibition test ( Phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu)

TCYTTG

Tổ chức Y tế Thế giới ( World Health Oganization )

TPCK

L-1- tosyllamido-2- phenylethyl chloromethyl ketone

MDCK

Madin-Darby Canine Kidney Cells ( tế bào thận chó thường trực )


MỞ ĐẦU
Vi rút cúm là tác nhân chính gây ra các vụ dịch cúm hàng năm tại các nước
nhiệt đới và cận nhiệt đới với tỷ lệ mắc và tử vong cao. Lịch sử đã ghi nhận các vụ
đại dịch cúm xảy ra trong thế kỷ XX như đại dịch cúm Tây Ban Nha năm 1918
(A/H1N1), đại dịch cúm châu Á năm 1957 (A/H2N2), đại dịch cúm Hồng Kong

năm 1968 (A/H3N2) và đặc biệt là đại dịch cúm A/H1N1pdm xuất hiện năm 2009
tại rất nhiều quốc gia và các vùng lãnh thổ. Chim hoang dã và thuỷ cầm (vịt, ngan,
ngỗng) được chứng minh là các vật chủ lây nhiễm tự nhiên của vi rút cúm A. Do
đó, vi rút cúm không gây bệnh hoặc chỉ gây bệnh ở mức nhẹ cho các loài này. Tuy
nhiên, một số biến thể của vi rút cúm gia cầm mang độc lực cao thuộc các phân typ
A/H5 hoặc A/H7 (bộ gen có sự trao đổi và tích hợp) có khả năng thành dịch bệnh.
Trong quần thể gia cầm (gà, vịt, gà tây, chim cút…), vi rút có khả năng nhiễm và
gây chết hồng loạt trên đàn gia cầm, gây thiệt hại lớn cho nông dân. Qua quá trình
tiếp xúc trực tiếp, vận chuyển, giết mổ gia cầm bệnh, con người có khả năng bị lây
bệnh chéo thơng qua hạt khí, chất thải của gia cầm, bề mặt của các dụng cụ (đồ
dùng cho ăn, giết mổ) có chứa vi rút. Do vậy, nguy cơ lây nhiễm vi rút cúm từ động
vật sang người luôn thường trực, đặc biệt qua quá trình tiếp xúc trực tiếp với gia
cầm và thuỷ cầm bị bệnh.
Tại Việt Nam, vi rút cúm A/H5N6 đã được xác định lưu hành trên gia cầm từ
2013-2014, vi rút A/H7N9 hiện tại chưa xuất hiện và cho đến nay, chưa có trường
hợp nhiễm cúm A/H5N6 và A/H7N9 trên người tại Việt Nam. Tuy nhiên, việc giao
thương, buôn bán gia cầm tại biên giới phía Bắc chưa được kiểm sốt chặt chẽ làm
nguy cơ vi rút cúm gia cầm xâm nhập vào Việt Nam từ Trung Quốc là rất cao. Việc
xác định sự xuất hiện của vi rút thông qua đáp ứng kháng thể đã được thực hiện
trong các năm 2011 và 2014 với sự hỗ trợ của Tổ chức Y tế thế giới. Đây là những
nghiên cứu quan trọng và có ý nghĩa trong việc phát triển vacxin cúm mùa và
vacxin cúm gia cầm trên người trong tương lai. Xuất phát từ những lí do trên, chúng
tơi tiến hành thực hiện đề tài nghiên cứu:

10


“Đánh giá tỉ lệ huyết thanh có kháng thể kháng đặc hiệu vi rút cúm mùa, cúm
gia cầm (A/H5, A/H7) và một số yếu tố liên quan ở ngƣời buôn bán, giết mổ gia
cầm tại các chợ ở Hà Nội năm 2017” nhằm phát hiện và đưa ra những thông số

nghiên cứu quan trọng trong công tác điều tra dịch bệnh cúm tại Việt Nam.
Mục tiêu nghiên cứu:
1. Xác định một số đặc điểm của quần thể nghiên cứu, đánh giá tỉ lệ huyết thanh có
kháng thể đặc hiệu kháng vi rút cúm mùa, vi rút cúm gia cầm A/H5 hoặc A/H7.
2. Mô tả một số yếu tố liên quan đến khả năng phơi nhiễm với vi rút cúm gia cầm ở
người buôn bán, giết mổ gia cầm tại các chợ ở Hà Nội năm 2017.


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Vi rút cúm
1.1.1. Đặc điểm vi rút cúm
Vi rút cúm thuộc họ Orthomyxoviridae. Đây là nhóm vi rút có giải phổ vật chủ
rộng, được phân chia thành nhiều phân nhóm khác nhau dựa trên hai loại protein bề
mặt của vi rút là kháng nguyên hemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA). Hai
loại protein này có trên bề mặt capsid của hạt vi rút [41]. Họ Orthomyxoviridae đã
được phát hiện và chia thành 4 nhóm vi rút chính gồm [53]:
• Nhóm vi rút cúm A (Influenza A)
• Nhóm vi rút cúm B (Influenza B)
• Nhóm vi rút cúm C (Influenza C)
• Nhóm Thogoto
Nhóm vi rút cúm A có 18 phân típ (subtype) HA từ H1 đến H18 và 11 phân típ
NA từ N1 đến N11[54] Về mặt lý thuyết, sự tái tổ hợp giữa các phân típ HA và NA
sẽ tạo ra nhiều phân típ khác nhau về độc tính và khả năng gây bệnh. Mặt khác, vi
rút cúm A có đặc tính quan trọng là dễ dàng đột biến trong gen/hệ gen (đặc biệt ở
gen NA và HA), hoặc trao đổi các gen kháng nguyên với nhau, trong quá trình xâm
nhiễm và tồn tại lây truyền giữa các loài vật chủ. Vi rút cúm A là nguyên nhân chính
gây ra các đại dịch cúm trên tồn cầu. Vi rút cúm B được phân loại thành hai dòng
kháng nguyên phân biệt vào những năm 1980, đó là dịng B/Victoria
(B/Victoria/2/87-lineage viruses) và dịng B/Yamagata (B/Yamagata/16/88- lineage
viruses) dựa trên đặc tính kháng nguyên của glycoprotein hemagglutinin bề mặt.

Tương tự vi rút cúm A, cúm B có thể được phân loại thành nhóm và phân nhóm phụ.
Vi rút cúm B thường thay đổi chậm hơn về dặc tính di truyền và kháng nguyên so
với cúm A. Các nhóm vi rút khác nhau bởi các kháng nguyên bề mặt capsid, ở vi rút
cúm A và B là Hemagglutinin (HA), ở vi rút cúm C là Hemagglutinin Esterase
Fusion (HEF), và ở Thogotovirus là Glycoprotein (GP). Vi rút cúm B gây bệnh chủ
yếu trên người và hải cẩu, vi rút cúm C gây bệnh chủ yếu trên con người và một số
loài lợn.
Danh pháp quốc tế qui định cho vi rút cúm A gồm những thông tin sau:A /viết
tắt vật chủ( nếu là động vật)/ nơi phân lập /mã số phịng thí nghiệm phân lập/năm


phân lập( có thể bao gồm thêm thơng tin về phân típ HA và NA của chủng vi rút) ví
dụ: A/swine/Taiwan/1/70 (H3N2)[52].


Danh pháp quốc tế qui định cho vi rút cúm B gồm những thơng tin sau:
B/nơi phân lập/mã số phịng thí nghiệm phân lập/năm phân lập (ví dụ:
B/HongKong/330/2001). Do sự thay đổi về kháng nguyên bề mặt của vi rút cúm B
hầu như không quan sát được nên danh pháp quốc tế của vi rút cúm B khơng có sự
tham gia cảu kháng nguyên bề mặt HA và NA như đối với danh pháp quốc tế
được qui định cho vi rút cúm A.
Vi rút cúm là căn nguyên gây ra bệnh cúm, hội chứng cúm là bệnh cấp tính
đường hơ hấp với triệu chứng chủ yếu là sốt cao đột ngột, sổ mũi, nhức đầu, uể oải,
mệt mỏi, đau toàn thân. Bệnh lây lan nhanh và có thể gây thành dịch. Nếu khơng
được kiểm sốt tốt, bệnh cúm có thể lan rộng ra nhiều nước gây đại dịch.
Hình thái, cấu trúc và đặc điểm sinh học phân tử vi rút cúm:
Vi rút cúm có hình cầu hoặc hình khối đa diện, đường kính trung bình từ 80 120 nm, đơi khi cũng có dạng hình sợi kéo dài tới 2000nm. Khối lượng phân tử
khoảng 250 triệu Dalton. Một vi rút chứa khoảng 0,8 - 1,1% RNA; 70 - 75%
protein; 20 - 24% lipid và 5 - 8% \ carbonhydrate.

a

b

Phức hệ
Ribonucleoprotein
Hình 1.1 Mơ hình cấu trúc virion vi rút cúm
Nguồn: [28][20]
Vi rút có cấu tạo gồm: vỏ (capsid), vỏ ngồi (envelope) và lõi là RNA sợi
đơn, âm. Mỗi sợi ARN liên kết với các protein NP, PA, PB1, PB2 để tạo thành phức
hệ ribonucleoprotein (vRNP) (mơ hình a hoặc b hình 1.1) có chức năng sao chép và


phiên mã. Phức hệ này được bao bọc bởi màng protein nền và lớp vỏ ngồi có
nguồn gốc từ màng sinh chất tế bào chủ.
Vỏ vi rút có chức năng bao bọc và bảo vệ vật chất di truyền RNA của vi rút,
bản chất cấu tạo là màng lipid kép, có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm được đặc
hiệu hóa gắn các protein màng của vi rút. Trên bề mặt có khoảng 500 “gai mấu”
nhơ ra và phân bố dày đặc, mỗi gai mấu dài khoảng 10 - 14 nm có đường kính 4 - 6
nm, đó là những kháng nguyên bề mặt vi rút, bản chất cấu tạo là glycoprotein gồm:
Haemaglutinin (HA) và Neuraminidase (NA) [9].
1.1.2. Kháng nguyên và kháng thể
Các kháng nguyên quan trọng của vi rút cúm nằm ở phần lõi và phần vỏ
ngoài. Phần lõi của vi rút cúm chứa một phân tử ARN và protein tương ứng với
kháng nguyên S (Soluble), kháng nguyên S khơng có ý nghĩa với cơ chế miễn dịch
bảo vệ của cơ thể. Phần vỏ ngoài chứa hai kháng nguyên quan trọng là kháng
nguyên hemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA), đây là hai kháng nguyên quan
trọng để phân loại vi rút cúm. Hai kháng nguyên HA và NA mang tính đặc hiệu típ
(HA), thứ típ (NA). Hiện nay đã phát hiện được 18 cấu trúc kháng nguyên H, ký
hiệu từ H1 đến H18 và 11 cấu trúc kháng nguyên N ký hiệu từ N1 đến N11[54].

Kháng nguyên hemagglutinin HA còn gọi là yếu tố ngưng kết hồng cầu
(NKHC). Kháng nguyên này giúp vi rút bám vào tế bào niêm mạc đường hơ hấp,
gây hiện tượng hịa màng, từ đó xâm nhập vào trong tế bào. Nó có thể bám vào
màng hồng cầu một số loài động vật (gà, chuột lang, ngựa...) làm những hồng cầu
này bị dính lại với nhau gây nên hiện tượng ngưng kết hồng cầu mà mắt thường có
thể nhìn thấy rõ ràng, nhờ đó có thể phát hiện sự có mặt của vi rút. Kháng thể tương
ứng với HA có tác dụng bảo vệ cơ thể, đặc hiệu cho từng phân typ cúm. Sự có mặt
của kháng thể đặc hiệu HA làm cho vi rút mất khả năng bám vào tế bào niêm mạc
đường hô hấp, do đó mất hoặc giảm khả năng gây bệnh. Kháng thể tương ứng với
kháng nguyên HA còn gọi là kháng thể ngăn ngưng kết hồng cầu (NNKHC) vì nó
làm cho vi rút mất khả năng bám vào hồng cầu (ức chế hiện tượng NKHC). Dựa
vào đó có thể thực hiện phản ứng NNKHC nhằm xác định sự có mặt của kháng thể
đặc hiệu kháng từng phân typ vi rút cúm hoặc xác định các phân typ vi rút cúm từ


chủng phân lập được trên tế bào. Kháng nguyên neuraminidase NA (kháng ngun
trung hịa) có hoạt tính enzyme làm lỗng chất nhầy ở đường hô hấp, làm vi rút tiếp
xúc dễ dàng hơn với tế bào của niêm mạc, giúp cho vi rút xâm nhập tế bào dễ dàng.
Trong quá trình nhân lên của vi rút, enzyme này giúp cho sự lắp ráp các thành phần
RNA và protein của vi rút thành virion và giúp cho virion thoát ra khỏi tế bào dễ
dàng thơng qua hoạt tính enzyme phân tách HA khỏi các thụ thể trên bề mặt tế bào
niêm mạc. Kháng thể tương ứng với kháng nguyên NA cũng có tác dụng bảo vệ cơ
thể, nhưng tác dụng này không mạnh bằng tác dụng bảo vệ của kháng thể ngăn
NKHC. Nếu cơ thể chỉ có kháng thể kháng N thì vẫn có khả năng mắc bệnh khi
nhiễm vi rút, tuy rằng bệnh có nhẹ đi.
Các phản ứng của kháng thể đối với vi rút cúm đã được nghiên cứu từ lâu
dựa vào việc phân tích kháng thể được tạo ra từ tế bào B đơn của con người [33].
Khi dịch cúm xảy ra lần đầu tiên, hệ thống miễn dịch của con người chưa đáp ứng
được và thành các đợt dịch lớn. Năm 2009, vi rút H1N1 theo mùa đã xuất hiện ở
người nhưng vi rút này có các glycoprotein bề mặt H1 và N1 khác biệt về mặt

kháng nguyên. Do thiếu khả năng miễn dịch quần thể, vi rút mới nổi này lây lan
nhanh chóng trong cộng đồng. Tuy nhiên, trong vài năm, chúng đã trở thành vi rút
cúm theo mùa, sau đó gây dịch bệnh với tỷ lệ tử vong thấp hơn so với đại dịch [17].
Phản ứng kháng thể do lây nhiễm tự nhiên thường rộng hơn và tồn tại lâu hơn phản
ứng kháng thể do tiêm chủng gây nên, tuy nhiên cơ chế này chưa rõ ràng. Do đó,
các nhà nghiên cứu tập trung nghiên cứu cơ chế này, khám phá được cơ chế này sẽ
giúp cải thiện các loại vaccine hiện tại. Theo Florian K, ông đã theo dõi phản ứng
của kháng thể đối với vaccine cúm hiện nay, phản ứng của kháng thể với kháng
nguyên vi rút cúm gia cầm. Từ đó đưa ra sự khác biệt giữa lây nhiễm tự nhiên và
tiêm chủng, khác nhau về phản ứng kháng thể mà chúng tạo ra và cách những phản
ứng này bảo vệ chống lại sự lây nhiễm trong tương lai, phát triển vaccine vi rút cúm
thế hệ tiếp theo [22]. Hiểu rõ hơn về cơ chế phản ứng kháng nguyên- kháng thể của
vi rút cúm sẽ thúc đẩy phát triển các loại vaccine mới kháng vi rút hiệu quả hơn,
nhất là trong tình trạng kháng thuốc nhiều như hiện nay.


1.1.3. Tính đa dạng của vi rút cúm
Một đặc điểm rất quan trọng là các vi rút cúm thuộc típ A có tính đa dạng cao,
khi hiện tượng trơi (drift) và trượt (shift) của kháng nguyên xảy ra, điều này giúp vi
rút cúm A có khả năng thốt khỏi cơ chế bảo vệ của vật chủ [10]. Những thay đổi
dần dần của kháng ngun gọi là đặc tính trơi dạt của kháng nguyên. Nguyên nhân
do các đột biến tích tụ trong quá trình sao chép làm thay đổi khả năng bám dính của
phức hợp polymerae trên kháng ngun, từ đó dẫn đến vô số biến thể mới được tạo
ra, cho phép vi rút thích nghi với những thay đổi của mơi trường [16]. Ngồi ra, sự
trao đổi và tích hợp của vi rút cúm A (reassortant) xảy ra khi có 2 vi rút gây nhiễm
trên cùng một tế bào, kết quả tạo ra vi rút mới- tiềm tàng vi rút đại dịch:
• Năm 1933: lần đầu tiên phân lập được vi rút cúm, sau này được
gọi là vi rút cúm A0, có cơng thức kháng ngun vỏ (H0N1).
• Năm 1947: xuất hiện A(H1N1).
• Năm 1957: xuất hiện A(H2N2).

• Năm 1968: xuất hiện A/ Hồng Kơng (H3N2).
• Năm 2002: xuất hiện A/Asia (H5N1) và mỗi năm đều tiếp tục có
sự thay đổi ít nhiều.
• Năm 2009: xuất hiện A/pandemic H1N1/09
• Năm 2014: các ca nhiễm A/H5N6 tại Trung Quốc, Nhật Bản, Đài
Loan, Hồng Công, Myanmar và Việt Nam.
Đại dịch cúm thường do vi rút cúm típ A khi có những thay đổi lớn kháng
nguyên (antigenic shift) xuất hiện ở kháng nguyên của vi rút cúm A. Vi rút cúm típ
B khơng có những thay đổi lớn kháng nguyên nhưng có thể tiến hóa bởi những thay
đổi nhỏ kháng nguyên (antigenic drift) và không gây nên các vụ đại dịch nghiêm
trọng. Vi rút cúm típ C gây bệnh khơng điển hình và chỉ giới hạn trong quần thể
nhỏ, không gây dịch lan rộng.
1.1.4. Độc lực của vi rút cúm
Đối với các vi rút cúm A gây bệnh trên gia cầm, độc lực của vi rút cúm A được
chia làm hai loại: Loại độc lực cao (HPAI - Highly pathogenic avian influenza), và
loại độc lực thấp (LPAI - Low pathogenic avian influenza), cả hai


loại đều cùng tồn tại trong tự nhiên [21]. HPAI là loại vi rút cúm A có khả năng gây
tổn thương nhiều cơ quan nội tạng trong cơ thể nhiễm, trên gia cầm chúng thường
gây chết 100% số gia cầm bị nhiễm trong vòng 48 h sau nhiễm. Loại này rất nguy
hiểm gây lo ngại cho cộng đồng. Vi rút loại HPAI phát triển tốt trên tế bào phôi gà
và tế bào thận chó trong mơi trường ni cấy khơng có trypsin [7, 40]. Nhóm
nghiên cứu của Abente E. J. và cộng sự đã chứng minh vi rút cúm A H5N1 mang
độc lực cao vẫn là mối quan tâm trong cộng đồng do tỉ lệ tử vong cao. Nghiên cứu
của nhóm đã xác định đặc tính lây nhiễm và khả năng lây truyền của H5N1 có
nguồn gốc từ nhóm độc lực cao và H1N1 pdm09, từ đó nhấn mạnh tầm quan trọng
việc giám sát bệnh cúm trong cộng đồng [6]. LPAI là loại vi rút khi phát triển trong
cơ thể nhiễm, có thể gây bệnh cúm nhẹ khơng có triệu chứng lâm sàng điển hình và
khơng làm chết vật chủ. Đây là loại vi rút lây truyền rộng rãi và tạo nên các ổ bệnh

trong tự nhiên của vi rút cúm A [Error! Reference source not found., Error!
Reference source not found.]. Vi rút cúm gia cầm độc lực thấp LPAI ở các lồi
chim hoang dã rất quan trọng vì chúng có thể tạo cơ sở cho sự phát triển của vi rút
gia cầm độc lực cao HPAI hoặc hình thành các chủng vi rút có khả năng thích nghi
với người với khả năng phát tác thành đại dịch [11]. Vi rút cúm A có thể biến đổi từ
cúm gia cầm độc lực thấp thành vi rút ở gia cầm có độc lực cao gây tử vong. Các vi
rút kháng thuốc gần đây bao gồm hầu hết cúm A H1N1 theo mùa. Từ năm 20082009, cúm A/H1N1 mang đột biên H254Y - đột biến trên gen mã hóa
neuraminidase (NA) gây kháng thuốc oseltamivir (TamifluH) [27]. Nghiên cứu này
đã chứng minh rằng vi rút mới có thể hình thành từ việc pha trộn một số chủng và
thích nghi với các vật chủ mới, do đó ẩn chứa hiểm họa về đại dịch cúm mới.
Để phân loại vi rút cúm, các thí nghiệm thực hiện gây bệnh cho gà 3-6 tuần
tuổi bằng cách tiêm tĩnh mạch. Sau dó đánh giá mức độ bệnh của gà để cho điểm
(chỉ số IVPI). Điểm tối đa là 3 điểm và đó là vi rút có độc lực cao nhất. Theo quy
định của Tổ chức thú y thế giới (OIE), vi rút cúm nào có chỉ số (điểm) IVPI từ 1,2
trở lên là thuộc loại có độc lực cao - HPAI và thấp hơn 1,2 là thuộc loại độc lực
thấp – LPAI [35]. Các vụ dịch lớn đều do vi rút HPAI gây ra. Các loạt vi rút cúm gia
cầm gây ra các vụ dịch lớn ở gia cầm thường là vi rút có kháng nguyên H5, H7


và H9. Riêng với H5 và H7 thường bắt nguồn từ vi rút độc lực thấp, sau quá trình lây
truyền trên gà và chim cút độc lực tăng lên rất nhanh và gây ra các vụ dịch lớn. Đối
với các vi rút cúm thông thường gây bệnh trên người theo mùa, các vi rút có khả năng
gây đột biến trên HA, làm thay đổi khả năng bám dính với thụ thể trên tế bào chủ, gây
tình trạng tăng nặng trên lâm sàng của bệnh nhân.
1.2. Nguồn lây nhiễm
Qua các trường hợp bệnh được ghi nhận, nguồn truyền nhiễm của bệnh cúm
bao gồm: người bị bệnh, người mang mầm bệnh không triệu chứng đối với các vi
rút cúm mùa; các loại gia cầm, thủy cầm, các loại chim di cư đối với các vi rút cúm
gia cầm. Chim hoang dã nhiễm cúm gia cầm nhưng không chết hàng loạt, chúng
mang vi rút cúm gia cầm đi theo đường di cư. Do đó, các nhà khoa học cho rằng các

lồi chim hoang dã là loài phân tán vi rút cúm gia cầm (Hình 1.2).

Hình 1.2. Sự lƣu hành của phân típ cúm A trên mỗi vật chủ
Nguồn: Host-range-of-influenza-A-virus-Notes-The-IAV-HA-subtypes-isolatedfrom-each-host_fig1_316283274[55].
Bệnh cúm gia cầm đã được xác định nguồn lây nhiễm ban đầu là từ các loài
thủy cầm di trú, đây là ổ chứa tự nhiên của vi rút, thường không gây bệnh hoặc chỉ
gây bệnh nhẹ cho chim và thuỷ cầm. Tuy nhiên chúng thường đề kháng với vi rút,
chúng mang vi rút nhưng không bị bệnh, các gia cầm nuôi không đề kháng với vi


rút, do đó tiếp xúc trực tiếp hay gián tiếp với chim di trú là nguyên nhân chính của
dịch cúm. Vi rút cúm gia cầm có thể lây nhiễm trực tiếp cho con người khi tiếp xúc
trực tiếp với gia cầm bị bệnh qua chăn nuôi, vận chuyển, giết mổ, chế biến, ăn gia
cầm và các sản phẩm của gia cầm bệnh chưa được nấu chín hoặc chế biến khơng
hợp vệ sinh [25]. Một số biến thể cường độc (H5, H7) xuất hiện gần đây do khả
năng trao đổi và tích hợp của vi rút cúm A, có thể gây dịch cúm nguy hiểm làm chết
hàng loạt cả ở chim và gia cầm [24].
Các phân typ cúm A đã được xác định các nguồn lây nhiễm cụ thể như: cúm
AH1N1 xuất hiện ở người, gia cầm và lợn; cúm A H3N2 xuất hiện ở người, vịt, lợn,
ngựa, cúm A H5 xuất hiện ở người, gia cầm, lợn (Hình 1.3).

Hình 1.3. Phân típ cúm A (HA& NA)
Nguồn: Known-hosts-for-different-HA-and-NA-influenza-A-virussubtypes_tbl1_43521028[56].
1.3. Đƣờng lây và cơ chế lây truyền
Vi rút cúm lây truyền nhanh chóng từ cơ thể bệnh sang cơ thể khỏe mạnh
bằng đường hơ hấp thơng qua các hạt aerosol có chứa vi rút trong khơng khí
và/hoặc qua đường tiêu hóa do tiếp xúc trực tiếp với các bề mặt (khơng khí, đất,


nước, phương tiện vận chuyển, dụng cụ chăn nuôi bị ô nhiễm (dịch bài xuất, xác vật

bệnh, chất thải) của cơ thể bệnh [7, 32]. Người chăm sóc, giết mổ, mua bán hoặc
vận chuyển gia cầm là những đối tượng có nguy cơ nhiễm bệnh cao do thường
xuyên tiếp xúc với các chất dịch bài tiết, chất thải của gia cầm, nhất là trong trường
hợp đối tượng khơng có thiết bị phịng hộ, chưa có cảnh báo về dịch của các cơ
quan có thẩm quyền.
Vi rút cúm có tính thích ứng lây nhiễm cao với biểu mô đường hô hấp, gây
bệnh chủ yếu ở đường hơ hấp và cũng có thể tác động gây tổn thương nhiều cơ
quan khác trong cơ thể của các động vật cảm nhiễm. Khả năng gây bệnh của vi rút
cúm A phụ thuộc vào độc lực và tính thích nghi vật chủ của từng vi rút. Các vi rút
cúm gia cầm độc lực thấp không gây bệnh hoặc chỉ gây bệnh nhẹ giới hạn ở
đường hô hấp của chim hoang dã và gia cầm nhiễm, nhưng một số chủng độc lực
cao (H5, H7) có thể gây bệnh nặng ở hầu hết các cơ quan trong cơ thể, gây nên
dịch cúm trên gia cầm, có thể lây sang người [47]. Với hàng rào vật chủ, vi rút cúm
gia cầm chưa thể lây lan mạnh từ gia cầm sang người. Tuy nhiên, khi vi rút cúm gia
cầm lây bệnh và thích nghi trên vật chủ là lợn, nơi tế bào hơ hấp có cả 2 loại thụ thể
α2,3 và α2,6, thì khi ấy khả năng vi rút cúm gia cầm lây lan rộng là có thể xảy ra.
1.4. Phƣơng pháp phân tích chuẩn đốn vi rút cúm
1.4.1. Phương pháp sinh học phân tử
Phản ứng PCR/RT-PCR: Vi rút có vật liệu di truyền là ARN cần enzyme phiên
mã ngược để tổng hợp cADN và ADN polymerase tổng hợp ADN từ cADN. Vi rút có
vật liệu di truyền là ADN cần enzyme ADN polymerase để tổng hợp ADN. Ưu điểm
của phương pháp này là có khả năng xác định nhanh sự nhiễm vi rút thông qua khả
năng phát hiện đoạn ADN/ARN đặc hiệu trong mẫu bệnh phẩm.
Phản ứng Realtime PCR/RT-PCR: sử dụng cặp mồi và chất hóa học phát huỳnh
quang hoặc probe có đánh dấu huỳnh quang cho phép phát hiện chính xác số bản sao
ADN/ARN của vi rút trong mẫu bệnh phẩm theo thời gian thực. Ưu điểm của phương
pháp là theo dõi tiến trình phản ứng và biết được lượng ADN tạo thành ở từng thời
điểm, độ nhạy, độ chính xác, độ đặc hiệu cao, giảm thiểu nguy cơ tạp nhiễm.

1.4.2. Phương pháp xác định trình tự gen
Hiện nay, giải trình tự gen được chia thành 4 thế hệ và liên tục được cập nhật.
Thế hệ 1: Theo phương pháp của Frederick Sanger, dừng ngẫu nhiên phản ứng
tổng hợp chuỗi ADN bằng dideoxynucleotide. Mỗi loại dideoxynucleotide được đánh
dấu bằng một chất huỳnh quang có màu khác nhau. Sự xuất hiện của các
dideoxynucleotide (các nucleotide mất gốc –OH ở vị trí carbon 3’ và được thay bằng
–H, đã được đánh dấu bằng các màu khác nhau) trong quá trình tổng hợp ADN bổ
sung (mẫu gen cần giải trình tự ở dạng ADN sợi đơn) tạo ra những đoạn ADN có độ
dài khác nhau. Những đoạn ADN được điện di qua mao quản từ nhỏ tới lớn và các
dideoxynucleotide được phát hiện bởi đầu đọc laser. Trình tự gen của mẫu chính là
trình tự bổ sung các dideoxynucleotide được phát hiện bởi đầu đọc laser. Phân tích kết
quả: sử dụng phần mềm ADNStar (nối các phân đoạn nucleotide với nhau tạo thành
một đoạn gen hoàn chỉnh, so sánh các đoạn gen của vi sinh vật với các vi sinh vật lưu
hành trong khu vực và trên thế giới) sử dụng phần mềm MEGA (xây dựng cây gia
hệ). Áp dụng giải trình tự gen thế hệ 1, mẫu bệnh phẩm nhiễm cúm cần được thực
hiện khuếch đại qua quá trình phân lập.
Thế hệ 2: Sử dụng các phương pháp như: Pyrosequencing, Ion Semiconductor,
Illumina. Trong đó, hệ thống giải trình tự Illumina là hệ thống xác định trình tự gen
thành cơng và phổ biến nhất hiện nay. Illumina sử dụng kỹ thuật gọi là cầu khuếch đại
nhằm nhân bản các chuỗi ADN đơn được cố định trên bản flow cell. Các trình tự này
sẽ tự đọc thông qua các nucleotide được đánh dấu bằng huỳnh quang, tương tự trong
phương pháp Sanger. Tại Trung tâm Cúm - Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương hiện đã
thực hiện phương pháp này, áp dụng đồng thời cho việc giải trình tự gen vi rút cúm từ
mẫu bệnh phẩm lâm sàng và vi rút cúm đã được nhân lên sau quá trình phân lập.
Thế hệ 3: Giải trình tự dựa trên các kỹ thuật phân tích tín hiệu đơn phân tử, phân
tích tức thời tín hiệu đơn phân tử huỳnh quang gắn vào nucleotide trong phản ứng
tổng hợp 1 chuỗi DNA trong lỗ nano


Thế hệ 4: Giải trình tự tức thời dựa trên tín hiệu điện phân tử. Phương pháp này

sử dụng dịng điện để vận chuyển một mẫu chưa biết qua một lỗ đường kính chỉ 1nm.
Một protein nanopore được gắn lên một màng polymer không dẫn điện. Hệ thống này
luôn chứa một dung dịch điện ly – khi đặt vào một điện trường khơng đổi, một dịng
điện có thể xuất hiện trong hệ thống. Độ lớn của cường độ dòng điện qua bề mặt lỗ
nano phụ thuộc vào kích thước của lỗ nano cũng như thành phần của ADN/ARN trong
lỗ nano đó. Khi đủ gần lỗ, các mẫu làm thay đổi đặc trưng về cường độ dòng điện qua
bề mặt lỗ. Tổng điện tích qua lỗ bằng tích phân mặt của cường độ dòng điện chảy qua
bề mặt lỗ giữa khoảng thời gian T1 và T2
1.4.3. Phương pháp phân lập vi rút
Phương pháp phân lập vi rút được coi là “tiêu chuẩn vàng” trong giám sát vi rút
nói chung. Mẫu bệnh phẩm lâm sàng lý tưởng là mẫu được lấy trong khoảng 5 ngày
đầu từ khi khởi phát bệnh. Chủng vi rút phân lập trong vụ dịch được nghiên cứu về
các đặc điểm vi rút học, sự biến đổi vật liệu di truyền và tính kháng ngun để có thể
dự báo sự lan truyền của một chủng vi rút mới có độc lực cao trong giai đoạn tiếp theo
và cho phép lựa chọn thành phần một số vacxin. Việc phân lập vi rút trên tế bào là đơn
giản, thuận tiện, tuy nhiên thời gian phân lập kéo dài (thường là 3 tuần). Đối với vi rút
cúm, phân lập trên trứng vẫn là lựa chọn tối ưu cho các nhà sản xuất vacxin trên thế
giới vì nó có khả năng khuếch đại một lượng lớn vi rút với hiệu giá cao đối với sản
xuất vacxin cúm.
1.4.4. Phương pháp phát hiện kháng thể
Đây là phương pháp phát hiện kháng thể kháng đặc hiệu vi rút trong huyết thanh
bệnh nhân. Có ba phương pháp cơ bản được sử dụng là: phản ứng ức chế ngưng kết
hồng cầu (HI) và phản ứng trung hòa vi lượng (MN). Kết quả được xác định dựa vào
việc phát hiện kháng thể kháng đặc hiệu vi rút hoặc sự biến động kháng thể giữa hai
mẫu huyết thanh.
Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (HI): kháng thể (KT) kháng vi rút khi kết
hợp với kháng nguyên chuẩn (vi rút chuẩn) có khả năng ức chế ngưng kết hồng cầu.


Phản ứng HI tương đối đơn giản, kinh tế, có thể đánh giá kháng thể IgG lưu hành

trong quần thể hay đáp ứng miễn dịch sau khi tiêm vacxin với một số lượng mẫu lớn.
Đối với vi rút cúm, phần lớn KT kháng HA đều được phát hiện bằng phản ứng HI, do
đó đây là phản ứng đặc hiệu phân typ đối với chẩn đoán huyết thanh học cúm. Tuy
nhiên, theo một số nghiên cứu gần đây cho thấy phản ứng HI có độ đặc hiệu thấp hơn
so với phản ứng trung hòa vi lượng (MN).
Phản ứng trung hòa vi lượng (MN): vi rút được ủ cùng với huyết thanh (pha
loãng bậc 2) ở 37°C trong 1 giờ tạo điều kiện cho kháng thể trung hịa (nếu có) trong
huyết thanh sẽ trung hòa vi rút. Sau thời gian ủ, hỗn dịch vi rút- huyết thanh được ủ
với tế bào cảm thụ phù hợp. Lượng vi rút cịn lại khơng bị trung hòa bởi kháng thể
trong huyết thanh sẽ gây nhiễm tế bào và tạo ra các tế bào hoại tử. Dựa vào sự xuất
hiện của các đám hoại tử để xác định hiệu giá kháng thể trung hòa của mẫu huyết
thanh.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng 2 phương pháp để phát hiện và định
lượng vi rút cúm có trong mẫu bệnh phẩm. Đây là những phương pháp nhạy và đặc
hiệu, có khả năng phát hiện kháng thể trung hịa kháng đặc hiệu và đem lại kết quả
chính xác cho nghiên cứu.
1.5. Phòng bệnh và điều trị
Để điều trị và phịng ngừa một số loại cúm thơng thường như cúm AH1N1,
cúm AH3N2, các phòng nghiên cứu đã nghiên cứu ra một số loại thuốc điều trị cúm
như: amantadine, rimantadine, oselramivira, zanamivir [8]. Hiện nay, amantadine
và rimantadine khơng cịn được sử dụng để điều trị bệnh cúm do tỷ lệ kháng thuốc
cao. Oseltamivira và zanamivir là hợp chất ức chế neuraminidase bằng cách cạnh
tranh với vị trí enzyme hoạt động của vi rút, các neuraminidase giúp giải phóng
virus khỏi tế bào bị nhiễm sau khi nhân lên. Các hợp chất này đã được chứng minh
là có hiệu quả đối với bệnh dịch theo mùa và đại dịch. Thuốc oseltamavir đã được
sử dụng rộng rãi đề điều trị bệnh cúm năm 2009 [15]. Ngoài ra, tiêm vaccine cúm là
cách bảo vệ hiệu quả nhất giúp phòng ngừa bệnh cúm mùa. Theo tổ chức Y tế thế
giới WHO, tiêm phòng vaccine làm giảm tỷ lệ tử vong do cúm đến 70-80% và hiệu

lực bảo vệ lên tới 80-90%. Hiệu quả của vaccine cúm bắt đầu suy yếu sau khoảng 6