Luận văn thạc sĩ ứng dụng chủng komagataeibacter saccharivorans a2 vào quá trình lên men dấm táo mèo bằng phương pháp lên men chìm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Phạm Thị Hậu

ỨNG DỤNG CHỦNG KOMAGATAEIBACTER SACCHARIVORANS A2
VÀO QUÁ TRÌNH LÊN MEN DẤM TÁO MÈO BẰNG PHƢƠNG
PHÁP LÊN MEN CHÌM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2018


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Phạm Thị Hậu

ỨNG DỤNG CHỦNG KOMAGATAEIBACTER SACCHARIVORANS A2
VÀO QUÁ TRÌNH LÊN MEN DẤM TÁO MÈO BẰNG PHƢƠNG
PHÁP LÊN MEN CHÌM

Chuyên ngành
Mã số

: Vi sinh vật học
60420107

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. NGUYỄN THỊ VIỆT ANH
TS. PHẠM ĐỨC NGỌC

Hà Nội - 2018


Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Phạm Thị Hậu
LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến TS. Nguyễn Thị Việt
Anh, người đã thu nhận, hướng dẫn, truyền đạt cho tôi những kiến thức và kinh
nghiệm trong suốt thời gian học tập tại viện nghiên cứu. Cô đã luôn theo sát, chỉ
bảo cho tôi những góp ý q báu để tơi có thể hồn thành tốt công việc.
Tôi cũng rất biết ơn TS. Phạm Đức Ngọc đã chỉ bảo, hướng dẫn tôi kiến thức
kĩ năng mới để tơi hồn thiện được luận văn tốt nghiệp này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Th.S Bùi Thị Thúy Hà, người đã chỉ dạy, hướng
dẫn cho tôi từ những ngày đầu tơi vào làm việc tại phịng, truyền đạt cho tôi những
kinh nghiệm trong công việc cũng như trong cuộc sống.
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến các thầy cô trong Khoa Sinh học Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội nói chung và Bộ
mơn Vi sinh vật nói riêng đã giảng dạy và trang bị cho tôi những kiến thức q giá
trong suốt khóa học.
Tơi xin cảm ơn tất cả các anh chị, các bạn và các em sinh viên đang học tập
và công tác tại bộ môn Công nghệ lên men, đặc biệt là sinh viên Phùng Thị Thanh
Tú đã giúp đỡ và hỗ trợ tôi trong thời gian thực hiện nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân, đã ln ở bên,
động viên cho tơi có thêm nghị lực để vượt qua khó khăn trong suốt thời gian qua.
Hà Nội, tháng 08 năm 2018

Học viên
Phạm Thị Hậu


MỤC LỤC
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU..................................................................... 3
1.1.

Giới thiệu về cây táo mèo.................................................................................. 3

1.2.

Vi khuẩn Axetic Axit Bacteria (AAB) trong lên men dấm...................................5

1.2.1. Quá trình sinh tổng hợp axit axetic trong lên men dấm.............................. 7
1.2.2. Chủng Komagataeibacter saccharivorans_A2......................................... 11
1.3. Quy trình sản xuất............................................................................................ 14
1.3.1. Quy trình lên men rượu............................................................................ 14
1.3.2. Quy trình lên men dấm............................................................................ 15
1.4. Đồ uống chức năng.......................................................................................... 23
1.4.1. Mật ong....................................................................................................... 24
1.4.2. Maltodextrin............................................................................................ 26
CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.........................28
2.1

Vật liệu............................................................................................................ 28

2.1.1. Nguồn nguyên liệu................................................................................... 28
2.1.2. Hóa chất..................................................................................................... 28
2.2. Phương pháp....................................................................................................29

2.2.1. Phương pháp cơng nghệ vi sinh............................................................... 29
2.2.2. Các phương pháp phân tích hóa lý, hóa sinh [6]......................................... 31
2.2.3. Phương pháp vi sinh................................................................................ 34
2.2.4. Phương pháp thanh trùng......................................................................... 36
2.2.5. Phương pháp đánh giá cảm quan............................................................. 37
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................ 38
3.1.

Nghiên cứu quy trình lên men dấm táo mèo từ vi khuẩn K. saccharivorans A2 bằng
phương pháp lên men chìm........................................................................................38
3.1.1.
3.1.2.
3.1.3.
3.1.4.
3.1.5.
3.1.6.
3.1.7.

Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống.................................................. 38
Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cồn ban đầu......................................... 39
Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ bổ sung axid axetic.................................... 40
Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đường saccharose bổ sung...................41
Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men bổ sung..........................42
Khảo sát ảnh hưởng của glycerol............................................................. 43
Khảo sát ảnh hưởng của các thành phần khống...................................... 43

3.1.8.

Nghiên cứu động học q trình lên men axit axetic của chủng K.

3.2.

saccharivorans A2.................................................................................................45
Nghiên cứu tạo sản phẩm đồ uống chức năng dạng bột từ dấm táo mèo.....................46

3.3.

3.2.1. Phân tích sản phẩm dấm táo mèo................................................................ 46
3.2.2. Mật ong....................................................................................................... 48
3.2.3. Nghiên cứu tạo chế phẩm đồ uống dạng bột................................................ 50
Quy trình sản xuất bột dấm táo mèo mật ong............................................................. 55
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................................................... 58
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................... 59


Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Phạm Thị Hậu
DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1: Chất lượng cảm quan của dấm táo mèo...................................................46
Bảng 3.2: Phân tích chỉ tiêu vi sinh của nguyên liệu dấm táo mèo..........................47
Bảng 3.3: Thành phần hóa học của dấm táo mèo.....................................................47
Bảng 3.4: Chỉ tiêu cảm quan của mật ong...............................................................48
Bảng 3.5: Chỉ tiêu hóa lý của mật ong.....................................................................49
Bảng 3.6 : Phân tích chỉ tiêu vi sinh của mật ong....................................................50
Bảng 3.7: Ảnh hưởng của tỷ lệ chất mang đến chất lượng sản phẩm.......................51
Bảng 3.8: Ảnh hưởng của tỉ lệ mật ong đến chất lượng sản phẩm...........................52
Bảng 3.9: Ảnh hưởng của nồng độ chất khô đến chất lượng sản phẩm...................53

Bảng 3.10: Ảnh hưởng của nhiệt độ đầu vào đến chất lượng sản phẩm...................54
Bảng 3.11: Ảnh hưởng của tốc độ bơm nhập liệu đến chất lượng sản phẩm............55


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Táo mèo.....................................................................................................3
Hình 1.2:Cơ chế lên men axit axetic của Louis Pasteurs[21].....................................8
Hình 1.3: Sơ đồ quá trình chuyển hóa ethanol thành axit axetic bởi AAB[17]..........8
Hình 1.4: Phản ứng ezim xảy ra trong quá trình sinh tổng hợp axit axetic từ ethanol
[17]............................................................................................................................ 9
Hình 1.5: Q trình oxy hóa ethanol và đồng hóa acetate qua màng tế bào chất.....10
Hình 1.6: Vị trí phân loại của chủng K. saccharivorans A2 và một số lồi thuộc chi
Komagataeibacter [3]..............................................................................................12
Hình 1.7: Hình thái khuẩn lạc của chủng K. saccharivorans A2[3].........................13
Hình 1.8: Hình thái tế bào của chủng K. saccharivorans A2[3]..............................13
Hình 1.9: Mơ hình thiết bị lên men axit axetic theo phương pháp chìm[10]............17
Hình 1.10: Sản phẩm mật ong.................................................................................24
Hình 2.1: Máy sấy phun...........................................................................................31
Hình 3.1: Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống tới khả năng sinh axit của chủng K.
saccharivorans A2 (%)............................................................................................38
Hình 3.2: Ảnh hưởng của nồng độ cồn ban đầu tới khả năng sinh axit của chủng K.
saccharivorans A2 (%)............................................................................................39
Hình 3.3: Ảnh hưởng của tỷ lệ bổ sung axit axetic tới khả năng sinh axit của chủng
K. saccharivorans A2(%)........................................................................................40
Hình 3.4: Ảnh hưởng của nồng độ đường saccharose bổ sung tới khả năng sinh axit
của chủng K. saccharivorans A2(%).......................................................................41
Hình 3.5: Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men tới khả năng sinh axit của chủng K.
saccharivorans A2(%).............................................................................................42
Hình 3.6: Ảnh hưởng của nồng độ glycerol tới khả năng sinh axit của chủng K.
saccharivorans A2 (%)............................................................................................43

Hình 3.7: Ảnh hưởng của nồng độ MgSO4.7H2O tới hàm lượng axit tạo thành (%)44
Hình 3.8: Ảnh hưởng của nồng độ KH2PO4 khả năng sinh axit của chủng K.
saccharivorans A2 (%)............................................................................................44
Hình 3.9: Ảnh hưởng của nồng độ (NH4)2HPO4 tới khả năng sinh axit của chủng K.
saccharivorans A2(%).............................................................................................45
Hình 3.10:Thí nghiệm lên men axit axetic với các điều kiện tối ưu.........................46


Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Phạm Thị Hậu

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
AAB

Axetic Axit Bacteria

AcDH

Enzyme aldehyde Dehydrogenase

AHA

Axit alpha hydroxy

AlDH

Enzyme alcohol dehydrogenase

ATP

Adenosine triphosphat

K

Komagataeibacter

PQQ

Pyrroloquinoline quinone

TCVN

Tiêu chuẩn Việt Nam

VSTP

Vệ sinh thực phẩm

YEA

Extract agar


Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Phạm Thị Hậu


Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Phạm Thị Hậu

MỞ ĐẦU
Táo mèo có nguồn gốc ở vùng ơn đới ẩm phía Bắc, khi xuống đến Việt Nam chỉ
thấy phân bố rải rác ở vùng núi giáp biên giới với Trung Quốc, có tên khoa học là
Docynia indica (thuộc chi Docynia). Táo mèo mọc trên những núi đá với độ cao
trên 1000m, mỗi năm chỉ ra quả một mùa, quanh năm hấp thụ sương gió của núi
trời. Táo mèo với những thành phần polyphenol, vitamin (C-B) và kali cao hơn so
với các dạng táo khác, có cơng dụng là điều trị các chứng rối loạn tiêu hóa, kháng
khuẩn, cường tim, làm giãn động mạch vành, chống rối loạn nhịp tim, hạ áp, bảo vệ
tế bào gan, tăng cường miễn dịch, trấn tĩnh an thần, chống co thắt, ức chế quá trình
ngưng tập tiểu cầu, điều chỉnh rối loạn lipit máu, xơ vữa động mạch, huyết áp cao
[3, 4].
Trong số các sản phẩm của ngành cơng nghiệp thực phẩm, dấm ăn thuộc nhóm
sản phẩm hàng đầu về mức tiêu thụ. Dấm làm từ quả táo mèo được khuyến cáo có
tác dụng tốt cho hệ tuần hồn máu, phịng chống bệnh tăng huyết áp, chống viêm
họng, giảm béo, giảm hàm lượng cholesterol, hỗ trợ quá trình tiêu hóa, hỗ trợ an
thần, tạo giấc ngủ tốt ngăn chặn q trình lão hóa, giảm q trình hình thành phát
triển tế bào ung thư. Dấm táo mèo còn có nguồn gốc hữu cơ được lên men bằng
chủng komagataeibacter saccharivorans A2, có khả năng chịu nồng độ ethanol cao,
nồng độ axit cao, chịu nhiệt tới 40oC và có khả năng sinh tổng hợp axit axetic cao.
Mật ong là một sản phẩm tốt được mọi người biết tới từ lâu. Các nghiên cứu cho
thấy mật ong rất có lợi cho sức khỏe bởi nó có nhiều thành phần hữu cơ nên cơ thể
có thể chuyển hóa nó dễ dàng trong khi đường được cung cấp cho cơ thể ảnh hưởng
tiêu cực đến mức độ glucose trong máu. Hiện tại, nó được dùng khá phổ biến trong
các hộ gia đình và cũng được sử dụng nhiều trong các dạng thực phẩm chức năng.
Mật ong được sử dụng rộng rãi trên toàn thế giới, làm thức ăn bổ dưỡng cho người
lớn và trẻ nhỏ, chữa viêm loét dạ dày hành tá tràng, thuốc ho.
Dấm táo và mật ong đều là những sản phẩm thực phẩm có nhiều cơng dụng rất

tốt. Dấm táo rất chua nên khó uống, khi kết hợp với những giọt mật ong, nó sẽ có vị

10


hài hịa hơn và kết hợp được nhiều cơng dụng của chúng với nhau. Hiện nay sản
phẩm chế biến từ táo mèo trên thị trường chủ yếu là dạng lỏng. Bột dấm táo mèo
mật ong được nghiên cứu dựa trên mục đích kéo dài thời gian bảo quản, tăng tính
tiện dụng, tạo ra một dạng sản phẩm chức năng mang tính tiện dụng hỗ trợ việc
phịng và chữa bệnh, tạo ra một sản phẩm có lợi cho sức khỏe cộng đồng từ nguyên
liệu sẵn có trong nước.
Luận văn này là một phần nội dung nghiên cứu thuộc Dự án cấp Nhà nước:
“Hồn thiện cơng nghệ sản xuất một số sản phẩm đồ uống từ quả táo mèo” và đã
thu được các kết quả như sau:
- Xác định các điều kiện kỹ thuật thích hợp cho q trình lên men dấm táo mèo từ
chủng K. saccharivorans A2
- Xây dựng quy trình sản xuất dấm táo mèo dạng lỏng theo phương pháp lên men
chìm.
- Xây dựng quy trình cơng nghệ sản xuất bột dấm táo mèo mật ong.


CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Giới thiệu về cây táo mèo

Táo mèo có tên khoa học là Docynia indica (thuộc chi Docynia). Theo ghi nhận
trên thế giới có tới 280 lồi cây thuộc chi này.

Hình 1.1: Táo mèo

Táo mèo là loại cây gỗ nhỏ, cao 5-6m hoặc hơn, cây non hoặc cây chồi có gai,
phân cành nhiều. Cây ưa sáng, ưa khí hậu ẩm mát của vùng ơn đới, nhiệt độ trung
bình năm từ 15-18oC, lượng mưa từ 1500-3800 mm/năm (Sapa). Hàng năm vào
tháng ba là mùa ra hoa, hoa màu trắng có ba đến bốn cánh; tháng 7-11 là mùa quả,
hình cầu, kích thước đa dạng 3-4 cm gọi là táo bi và 6-7cm gọi là táo to, khi chín có
màu hồng phấn hoặc vàng trong, mùi thơm và ăn có vị chua chat [7].
Thành phần hóa học có trong táo mèo bao gồm: các axit hữu cơ, vitamin C, B,
hydratcacbon, chất xơ, tannin, polyphenol, chất khoáng…
Phân bố:
Việt Nam: Điện Biên (Tuần Giáo, đèo Pha Đin), Lai Châu (Sìn Hồ), Lào Cai (Sa
Pa), Hà Giang (Đồng Văn, Quản Bạ, Mèo Vạc); Yên Bái (Mù Cang Chải).
Thế giới: Trung Quốc, Ấn Độ, Myanma.
Công dụng của táo mèo:
Hiện nay các thông tin về công dụng của dấm táo mèo liên quan đến sức khỏe
con người được người dân tìm hiểu trên sách báo, internet,…đã đánh giá dấm táo
mèo có nhiều cơng dụng cho sức khỏe con người.


Theo y học cổ truyền, táo mèo có vị chua ngọt, tính ấm đi vào gan, vị, tỳ, có tác
dụng tốt đối với hệ tiêu hóa do tăng tiết axit mật và men tiêu hóa. Với trẻ em hay bị
ợ sữa, trớ sữa do ăn sữa không tiêu dùng táo mèo giúp trẻ tiêu hóa tốt. Những người
có thói quen ăn nhiều mỡ mắc bệnh rối loạn tiêu hóa có thể sử dụng táo mèo kích
thích tiêu hóa rất tốt [4].
Qua nghiên cứu trong phịng thí nghiệm dịch chất táo mèo có thể ức chế trực
khuẩn ecoli, trực trùng lị, bạch cầu, thương hàn và nhiều loại vi khuẩn khác. Để hấp
thụ độc tố của vi khuẩn trong đường ruột ta có thể sao đen táo mèo, sau đó nghiền
mịn và uống.
Theo nghiên cứu hiện đại cho thấy táo mèo có tác dụng làm giãn động mạch
vành, khỏe tim, chống rối loạn nhịp tim, bảo vệ tế bào gan, tăng cường miễn dịch
cho cơ thể, chống đau thắt ngực, nhồi máu cơ tim, béo phi, xơ vữa động mạch, điều

chỉnh rối loạn lipit, chống nghẽn mạch, cải thiện việc tuần hồn, giúp giảm
cholesterol, chống được việc hình thành các cục máu đông trong mạch máu [4].
Các nghiên cứu trong nƣớc
Do nhu cầu của thị trường về các sản phẩm từ táo mèo ngày càng tăng cao chính
vì thế việc nghiên cứu về táo mèo ngày càng nhiều.
Để hạn chế việc khai thác, chặt phá rừng tràn lan các tỉnh Lào Cai, Sơn La đã có
kế hoạch triển khai xây dựng có trọng điểm vùng nguyên liệu táo mèo. Đề tài:
“Nghiên cứu chọn giống và trồng thâm canh cây đa mục đích (táo mèo- docynia
india) của tỉnh Lào Cai” đã được triển khai từ năm 2011 với nội dung lựa chọn được
giống cây táo mèo có nhiều tiềm năng, phù hợp với Lào Cai cũng như khoanh vùng
trồng thâm canh cây táo mèo đã được lựa chọn tại khu vực này .
Năm 1998, tỉnh Sơn La đã triển khai đề tài: “Ứng dụng tiến bộ khoa học kĩ thuật
vào sản xuất rượu vang từ quả Sơn Tra”. Sản phẩm tạo ra đạt tiêu chuẩn chất lượng,
an toàn VSTP, được thị trường chấp nhận.


1.2.

Vi khuẩn Axetic Axit Bacteria (AAB) trong lên men dấm.

Trong tự nhiên, một số vi sinh vật có khả năng sinh axit axetic từ q trình oxy
hóa ethanol trong điều kiện hiếu khí bắt buộc gọi là vi khuẩn axetic. Đó là loại vi
khuẩn Gram âm, hiếu khí bắt buộc, có khả năng di động hoặc khơng, hình elip đến
que, ở dạng đơn mỗi tế bào hoặc dạng cặp đôi hoặc dạng chuỗi gồm nhiều tế bào
nối lại với nhau. Q trình chuyển hóa ethanol thành axit axetic bởi nhóm vi khuẩn
này gọi là quá trình lên men axetic và được ứng dụng trong sản xuất dấm. Cùng tạo
ra sản phẩm axit axetic nhưng q trình lên men axetic có bản chất khác với lên
men axetat. Quá trình lên men axetic là q trình chuyển hóa hiếu khí, vi khuẩn
axetic sử dụng trực tiếp các điện tử từ ethanol và oxi là chất nhận điện tử cuối cùng.
Vi khuẩn axetic thuộc họ Acetobacteraceae xếp vào hạng Rhodospirillales, là

một bộ phận của Alphaproteobacteria. Dựa vào các phương pháp phân loại truyền
thống và phương pháp di truyền hiện đại, một số nhà khoa học trên thế giới đã đưa
ra các quan điểm phân loại AAB. Đến nay họ AAB được chia thành các chi chính
sau:

Acetobacter,

Gluconobacter,

Axit

omonas,

Granulibacter,

Ameyamaea,

Asaia,

Komagataeibacter,

Gluconacetobacter,

Kozakia,

Neoasaia,

Saccharibacter, Swaminathania và Tanticharoenia. Tuy nhiên trong tương lai sẽ có
các lồi mới được tìm thấy và bổ sung vào hệ thống cây phân loại AAB [3].
Trong sản xuất mỗi phương pháp khác nhau cần phải chọn những chủng vi

khuẩn có đặc tính thích hợp để q trình lên men đạt hiệu quả cao nhất. Các chủng
vi khuẩn axetic được lựa chọn phải thỏa mãn một số yêu cầu:
- Phải oxi hóa rượu tốt nhất và oxi hóa dấm thấp nhất.
- Phải tạo ra dấm có chất lượng tốt (thơm, có nồng độ axit axetic cao).
- Chịu được nồng độ cồn, axit cao và chịu được nhiệt độ cao.
- Các tính chất ban đầu của chúng phải giữ ngun trong suốt q trình.
- Điều kiện ni cấy, phân lập và bảo quản giống đơn giản, không tốn kém.


Trong số các vi khuẩn axetic họ Acetobacteraceae, chỉ một số loài thuộc chi
Acetobacter (A.), Gluconacetobacter (Ga.) và Komagataeibacter (K.) có khả năng
sinh tổng hợp axit axetic cao, được ứng dụng phổ biến trong lên men dấm
Đặc điểm trao đổi chất [2]:
Một trong những đặc điểm chính của AAB là khả năng oxi hóa nhiều nguồn cơ
chất và tích lũy sản phẩm trao đổi chất trong môi trường mà không gây độc cho sự
tồn tại và phát triển của vi khuẩn. Khả năng này là do hoạt động của enzyme
dehydrogenase trong màng tế bào.
Sự chuyển hóa ethanol: sự oxi hóa ethanol thành axit axetic là một đặc điểm
chính của AAB. Sự oxi hóa ethanol bởi AAB xảy ra qua 2 giai đoạn:
Giai đoạn 1: Ethanol bị oxi hóa thành acetaldehyde.
Giai đoạn 2: Acetaldehyde bị hydrat hóa thành axit axetic. Hai enzyme đóng vai
trị quan trọng trong q trình oxi hóa là enzyme của màng tế bào chất: alcohol
dehydrogenase và aldehyde dehydrogenase.
Chuyển hóa rượu đa chức: Đa số các AAB có khả năng oxi hóa rượu ethanol
thành đường, manitol thành fructose, sorbitol thành sorbose và eritritol thành
eritrolose. Một khả năng rất quan trọng của chúng là sử dụng glycerol như nguồn C
và chuyển hóa chúng thành dihydroxyacetone, một lượng nhỏ được sử dụng để tổng
hợp năng lượng. Enzyme xúc tác cho tất cả các phản ứng tồn tại trong màng tế bào
và cảm ứng cho sự tích lũy nồng độ cao cơ chất trong môi trường, điều này giúp
cho AAB trở thành một chủng vi sinh công nghiệp - công nghệ sinh học.

Sự oxi hóa glucose: sự oxi hóa glucose dừng lại khi đạt được 1,3- 1,4g oxi trong
1g cơ chất được hấp thụ. Trong hơ hấp hiếu khí, CO 2 không được tạo thành trong 515 phút đầu mặc dù sự tiêu thụ oxi vẫn diễn ra. Sản phẩm cuối cùng gồm 0,9-1g
CO2 trong 1g cơ chất. Sự oxi hóa glucose qua 2 giai đoạn và có thể chuyển hóa
nhiều loại cacbonhydrate khác nhau.


Chuyển hóa axit hữu cơ: AAB có khả năng oxi hóa nhiều loại axit hữu cơ.
Chúng oxi hóa các axit của chu trình tricacboxylic thành CO 2 và nước.
Gluconobacter thiếu chức năng thực hiện chu trình tricacboxylic, khơng có khả
năng oxi hóa hầu hết các axit hữu cơ. Các axit axetic, furamic, lactic, citric, malic,
pyruvic và succinic bị oxi hóa hoàn toàn thành CO 2 và nước. Những sự chuyển hóa
này có ý nghĩa rất quan trọng trong cơng nghiệp sản xuất rượu vang vì nó làm giảm
chất lượng của rượu.
Chuyển hóa nguồn nitơ: Mặc dù một số lồi vi khuẩn AAB có thể cố định nitơ
ngồi khơng khí nhưng phần lớn chúng sử dụng ammonium như nguồn cung cấp
nitơ. Những vi khuẩn này có thể tổng hợp nên các amino axit và hợp chất chứa nitơ
từ ammonium. Sự phát triển của chúng có thể được kích thích hoặc bị ức chế tùy
vào sự có mặt của amino axit trong mơi trường. Glutamate, glutamine, proline,
histidine kích thích sự phát triển của AAB, trong khi đó valine, treonine,
homoserine lại gây hiệu quả ức chế sự phát triển của vi khuẩn.
1.2.1. Quá trình sinh tổng hợp axit axetic trong lên men dấm
Quá trình lên men axetic trong sản xuất dấm thực chất là q trình oxy hóa
ethanol thành axit axetic trong điều kiện hiếu khí bởi vi khuẩn axetic. Năm 1861,
Louis Pasteurs là người đầu tiên đã khám phá ra cơ chế của quá trình lên men axetic
bởi chủng Mycoderma aceti [21].
Thực chất của quá trình này bao gồm 3 giai đoạn cơ bản sau:
2CH3CH2OH + O2

2CH3CHO + 2H2O

Ethanol
CH3CHO

Acetaldehyde
+

H2O



CH3CH(OH)2

Hydrat của acetaldehyde
2CH3CH(OH)2

+ O2 

2CH3COOH + 2H2O

Phương trình tổng quát: CH3CH2OH + O2

CH3COOH + H2O + 117Kcal


Hình 1.2:Cơ chế lên men axid axetic của Louis Pasteurs [21]
Đến nay, quá trình lên men sinh tổng hợp axit axetic từ nguồn cơ chất ethanol
bởi vi khuẩn axetic đã được khái quát một cách cụ thể. Thực chất, đó là q trình
oxy hóa khơng hồn tồn ethanol trong điều kiện hiếu khí bắt buộc dưới tác dụng
của hệ enzyme dehydrogenase. Quá trình tổng hợp axit axetic từ ethanol bao gồm
các phản ứng sau:

Hình 1.3: Sơ đồ quá trình chuyển hóa ethanol thành axit axetic bởi AAB [13]
Ethanol từ mơi trường lên men được hấp thụ qua lớp màng ngoài của tế bào vi
khuẩn axetic. Phản ứng đầu tiên là q trình oxi hóa ethanol thành acetaldehyde do
xúc tác của enzyme alcohol dehydrogenase (AlDH). Tiếp theo, enzymealdehyde
dehydrogenase (AcDH) xúc tác cho q trình oxi hóa acetaldehyde thành axit
axetic. Trong đó, có thể xảy ra bước trung gian với sự hình thành hydrat của
acetaldehyde. Oxi được coi là chất nhận điện tử cuối cùng trong q trình chuyển
hóa. Khi q trình chuyển hóa ethanol thành axit axetic đạt đến cân bằng thì hàm
lượng axit axetic tạo thành tỷ lệ với hàm lượng ethanol trong mơi trường ban đầu.
Chỉ có một lượng rất nhỏ cacbon từ ethanol sử dụng cho sự phát triển sinh khối và
chuyển hóa thành một số sản phẩm khác [13].


Q trình chuyển hóa ethanol của vi khuẩn axetic xảy ra trong điều kiện hiếu khí
bắt buộc và được thực hiện trong tế bào chất, không gian chu chất và màng tế bào
chất. Bên cạnh sản phẩm tạo thành là axit axetic, q trình chuyển hóa cịn giải
phóng ra năng lượng. Tuy nhiên, trường hợp này khơng phải q trình phosphorin
hóa mức độ cơ chất mà là các phản ứng oxi hóa kết hợp với chuỗi hơ hấp giải
phóng ra năng lượng dưới dạng ATP theo con đường vận chuyển điện tử và các
phản ứng oxi hóa phosphorin hóa.
Hai enzyme liên quan trực tiếp đến quá trình lên men axit axetic là AlDH và
AcDH đều có thành phần co-factor là pyrroloquinoline quinone (PQQ) đóng vai trị
là chất nhận điện tử. Sau đó, PQQ dạng khử chuyển các electron trên chuỗi hô hấp
cho oxi và oxi là chất nhận điện tử cuối cùng (hình 1.4):

(oxi hóa)

(khử)

Axit axetic

Hình 1.4: Phản ứng enzyme xảy ra trong quá trình sinh tổng hợp axit axetic từ
ethanol [13]
Enzyme AlDH và AcDH vừa xúc tác cho phản ứng tách H trực tiếp từ cơ chất
vừa có khả năng xúc tác cho phản ứng theo chiều ngược lại vận chuyển H đến cơ
chất. AcDH đóng vai trị chất nhận điện tử đầu tiên trong chuỗi các phản ứng oxi
hóa và đảm nhận vai trị chuyển điện tử tới cytochrom trên chuỗi hô hấp. Các
enzyme này trên màng tế bào chất, hướng vào bên trong chu chất. Vì vậy, các phản
ứng oxi hóa ethanol và acetaldehyde diễn ra chủ yếu ở chu chất. Phần lớn thanol từ


mơi trường được hấp thụ qua lớp màng ngồi tới khơng gian chu chất, được chuyển
hóa thành axit axetic nhờ xúc tác của các enzyme AlDH và AcDH. Sản phẩm axit
axetic sinh ra được khuếch tán ra ngồi mơi trường, một phần nhỏ tích tụ trong tế
bào chất và khơng gian chu chất (hình 1.5) [13].
Ngồi ra, ethanol cũng có thể được hấp thụ qua màng tế bào chất và diễn ra q
trình oxi hóa bên trong tế bào chất bởi các enzym AlDH và AcDH. Ở bên trong tế
bào chất, hai enzyme này đều chứa thành phần co-factor là NAD hoặc NADP + xúc
tác cho q trình oxi hóa ethanol thành acetaldehyde và axit axetic. Tuy nhiên, hoạt
tính của các enzyme có Co-factor là NAD hoặc NADP + nhỏ hơn khoảng 300 lần
hoạt tính của các enzyme chứa Co-factor là PQQ. Đồng thời, pH tối ưu cho quá
trình xúc tác của AlDH và AcDH chứa PQQ là pH=4-5, trong khi đó pH tối ưu của
AlDH và AcDH chứa NAD là pH=7. Vì vậy, q trình chuyển hóa ethanol thành
axit axetic diễn ra trong tế bào chất ít hơn rất nhiều so với ở chu chất.
Axit axetic

Màng ngoài

Axit axetic

Màng tế bào chất
Tế bào chất

Axit axetic

Hình 1.5: Q trình oxi hóa ethanol và đồng hóa acetate qua màng tế bào chất
[11]
Bên cạnh q trình lên men axit axetic, sự có mặt của một số rượu bậc một, rượu
bậc 2, rượu đa chức (propanol, isopropanol, glycerol) trong dịch lên men có thể bị
oxi hóa và chuyển hóa thành các axit, các ketone và các hợp chất hữu cơ khác bởi
hệ enzyme dehydrogenase. Một số hợp chất dễ bay hơi như ethane, acetaldehyte,


ethyl formate, ethyl acetate, isopentyl acetate, butanol, methyl butanol, 3-hydroxy
2-butanol có vai trị quan trọng trong hình thành hương vị, màu sắc và các tính chất
đặc trưng của dấm. Tuy nhiên, thành phần và tỷ lệ các hợp chất hữu cơ đặc biệt này
phụ thuộc nhiều vào nguyên liệu sản xuất dấm [11].
1.2.2. Chủng Komagataeibacter saccharivorans_A2.
Trong số các vi khuẩn axetic họ Acetobacteraceae một số lồi thuộc
Komagataeibacter (K.) có khả năng sinh tổng hợp axit axetic cao, được ứng dụng
phổ biến trong lên men dấm. Các chủng thuộc chi Komagataeibacter là loại vi
khuẩn gram âm, hình que, khơng di động, có kích thước (0,5-0,8) x (1,0-3,0)µm;
khuẩn lạc màu trắng ngà và bóng với mép xù xì. Chúng có khả năng oxy hóa axit
axetic thành CO2 và H2O, một số lồi có khả năng oxi hóa axit lactic; sản xuất ra
axit từ ethanol hoặc từ D-glucose, D-galactose, D-xylose, L-arabinose; phát triển tốt
trên mơi trường chứa 0,35% v/v axit axetic; Komagataeibacter địi hỏi axit axetic
cho sự phát triển trên môi trường ethanol; không tạo hợp chất màu nâu trên môi
trường glucose/cao nấm men/canxi carbonate; một số lồi có khả năng tạo màng
cellulose; tạo dihydroxyacetone từ glycerol, có khả năng sản xuất 2-keto-Dgluconate và 5-keto-D-gluconate nhưng khơng sản xuất 2,5-diketo-D-gluconate từ

D-glucose; khơng có khả năng lên men tạo axit từ D-fructose, L- sorbitol, Dmaltose và lactose;…. Một số lồi thuộc chi Komagataeibacter có khả năng chịu
nồng độ axit và sinh tổng hợp axit axetic cao được ứng dụng trong lên men dấm
theo phương pháp lên men chìm với hàm lượng axit axetic đạt khoảng 15-20%. Đặc
biệt, K. europaeus được ứng dụng phổ biến trong lên men dấm ở nồng độ cao ở
Châu Âu [17, 24].
Chủng vi khuẩn K. saccharivorans A2 được phân lập từ dịch dấm gạo thu thập
từ vùng Kansai (Nhật Bản) và được định tên theo phương pháp sinh học phân tử
dựa trên việc giải trình tự gen 16S rDNA và vị trí của chúng trên cây phân loại
thuộc chi Komagataeibacter. Trình tự gene 16S rRNA của các lồi chuẩn được tải
xuống từ ngân hàng gen (). Cây phát sinh chủng loại


được xây dựng trên phần mềm MEGA 5.0 theo phương pháp Neighbor joining sử
dụng phép toán Jukes-Cantor với độ lặp lại 1000 lần [3].

Komagataeibacter saccharivorans LMG 1582 (AB166740)

99

0.01

76

Komagataeibacter saccharivorans A2

Komagataeibacter nataicola LMG 1536 (AB166743)
54

74 Komagataeibacter europaeus (Z21936)

Komagataeibacter swingsii DST GL01 (AY180960)
Komagataeibacter sucrofermentans BPR 2001T (AJ007698)
57

99

Komagataeibacter xylinumNCIB 11664(X75619)
Komagataeibacter rhaeticus DST GL02 (AY180961)

50 Komagataeibacter intermedius (Y14694)
98 Komagataeibacter oboediens DSM 11826 (AB205221)

Komagataeibacter kakiaceti G5-1 (AB607833)
Gluconacetobacter entanii LTH4560 (AJ251110)
99 Komagataeibacter kombuchae RG3 (AY688433)
96
Komagataeibacter hansenii (X75620)
99

Gluconacetobacter johannae CFN-Cf55 (AF111841)
Gluconacetobacter azotocaptans CFN-Ca54(AF192761)
Gluconacetobacter liquefaciens NBRC 12388(X75617)

85

Gluconacetobacter sacchari SRI1794 (AF127407)
Gluconacetobacter diazotrophicus PAl 5 (NR 074284)

83

Gluconacetobacter asukensis K8617-1-1b (AB627120)

55
89

Gluconacetobacter tumulicola K5929-2-1b (AB627116)
Acidocella facilisATCC 35904 (D30774)

Hình 1.6: Vị trí phân loại của chủng K. saccharivorans A2 và một số loài thuộc
chi Komagataeibacter [3]


• Đặc điểm hình thái tế bào và khuẩn lạc:
Sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trường YEA ở nhiệt độ 30 0C khuẩn lạc có màu
nâu nhạt, bề mặt nhẵn và bóng, kích thước khoảng 2mm (hình 1.7). Đến 48h nuôi
cấy trên môi trường YEA ở nhiệt độ 30 0C tế bào bắt màu Gram (-), hình que ngắn,
kích thước (0,49 - 0,69) x(1,08 – 1,32) μm (hình 1.8).

Hình 1.7: Hình thái khuẩn lạc của chủng K. saccharivorans A2 [3]

Hình 1.8: Hình thái tế bào của chủng K. saccharivorans A2 [3]


Đặc điểm sinh lý, sinh hóa:
Bắt màu với Gram (-), phản ứng catalase dương tính (+), có khả năng oxi hóa
axit axetic nhưng khơng có khả năng tạo màng cellulose, có thể phát triển trên mơi
trường khơng có axit axetic.
Chủng vi khuẩn K. saccharivorans A2 được chúng tôi lựa chọn cho sản xuất lên
men dấm táo mèo vì các lợi thế sau: được đánh giá có khả năng chịu nồng độ
ethanol cao (tới 12% Vol.), nồng độ axit cao (tới 10% v/v), chịu nhiệt tới 40 0C và có

khả năng sinh tổng hợp axit axetic cao trên môi trường bổ sung dịch rượu [3].
1.3.

Quy trình sản xuất

1.3.1. Quy trình lên men rượu
Sản xuất dấm táo mèo thông qua 2 giai đoạn: lên men từ đường tạo rượu etylic,
sau đó lên men rượu etylic thành axit axetic. Quá trình lên men tạo rượu từ quả táo
mèo đã được một số tác giả nghiên cứu và ứng dụng trong sản xuất rượu vang từ
quả táo mèo. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là tạo ra được dấm táo mèo có chứa
hàm lượng các chất sinh học cao nhất có thể, cũng như chất lượng cảm quan tốt, do
vậy đối với quá trình lên men rượu, đề tài khơng tập trung nghiên cứu tối ưu quá
trình lên men tạo độ rượu cao nhất như các nghiên cứu sản xuất rượu vang táo mèo.
Quá trình lên men rượu trong nghiên cứu này được xác định để tạo ra dịch rượu vừa
đủ cho quá trình lên men axit axetic, tạo dịch rượu có hương thơm đặc trưng cho
sản phẩm dấm táo mèo. Chúng tôi đã sử dụng công nghệ lên men rượu của bộ môn
Công nghệ lên men thuộc Viện Công nghiệp thực phẩm với các điều kiện lên men
rượu như sau:
-

Tỷ lệ phối trộn giống nấm men: 10%, sử dụng nấm men Saccharomyces cerevisiae
SLS dùng cho sản xuất rượu vang.

-

Nhiệt độ nuôi cấy: 28- 30o C.

-

pH môi trường ban đầu: 4,5.

-

Nồng độ đường ban đầu: 8,1 %.

-

Không bổ sung các thành phần vi lượng khác.


-

Thời gian lên men 3- 4 ngày.
Dịch rượu thu nhận từ quy trình sản xuất rượu táo mèo với các thông số của dịch
rượu là: độ cồn 9,8%, lượng đường cịn lại 0,56%, nồng độ axit 0,3%. Dịch rượu có
chất lượng tốt nhất được sử dụng cho lên men tạo axit axetic.
1.3.2. Quy trình lên men dấm
1.3.2.1.

Các phương pháp lên men [9, 20, 24]

Yếu tố quan trọng nhất quyết định năng suất và hiệu suất của một phương pháp
sản xuất dấm đó chính là bề mặt tiếp xúc giữa oxi của khơng khí và hợp chất. Hiện
nay, mặc dù axit axetic đã được sản xuất công nghiệp, nhưng các quy trình sản xuất
vẫn được nghiên cứu cải tiến, hồn thiện các phương pháp cũ, tìm ra các phương
pháp mới để sản xuất dấm có hiệu quả và kinh tế hơn. Dựa trên đặc diểm về cơng
nghệ, có thể chia các phương pháp lên men sản xuất axit axetic thành 2 nhóm chính:
-

Phương pháp lên men truyền thống: lên men bề mặt (Một số tài liệu còn gọi là

phương pháp lên men chậm).

-

Phương pháp lên men chìm, hay cịn gọi là phương pháp lên men nhanh.
Ngồi ra người ta có thể phân loại theo cách thức lên men như phương pháp lên
men gián đoạn, lên men bán liên tục, hoặc lên men liên tục, lên men theo phương
pháp dòng chảy cố định tế bào.
Phương pháp lên men bề mặt.
Đây là phương pháp thủ cơng đã có từ lâu đời, q trình lên men axetic diễn ra ở
bề mặt tiếp xúc pha giữa khối dịch lên men và khơng khí (bề mặt thống) trong
thùng lên men. Sự có mặt hạn chế số lượng vi khuẩn axetic trên bề mặt dịch lên
men dẫn tới khả năng chuyển hóa axit axetic là thấp. Khi lên men, vi khuẩn dấm
phát triển tạo thành màng vi sinh vật trên bề mặt thoáng, khi bị chấn động (do va
chạm hay do quá trình đổ dịch lên men vào và tháo sản phẩm ra) nó sẽ bị phá vỡ,
chìm xuống tiêu thụ cơ chất mà khơng tạo thành axit axetic. Dần dần trên mặt
thống lại hình thành màng vi khuẩn mới và lại diễn ra quá trình lên men tiếp tục.
Phương pháp này còn được gọi là phương pháp tĩnh.


Sản xuất dấm theo phương pháp lên men bề mặt được thực hiện theo từng mẻ
kiểu gián đoạn hoặc bán liên tục. Ngày nay, phương pháp này được áp dụng để sản
xuất những dạng sản phẩm có tính truyền thống, đặc biệt là cần thời gian dài để thu
nhận sản phẩm có hàm lượng axit axetic cao và hương vị tốt. Phương pháp này địi
hỏi phải có q trình tàng trữ tốt. Do vậy sản phẩm của phương pháp lên men
truyền thống có giá thành cao, là dạng sản phẩm đặc biệt.
Phương pháp lên men bề mặt được ứng dụng tại các nước châu Âu trong sản
xuất dấm truyền thống từ rượu vang. Tùy thuộc vào loại dấm đỏ hay trắng mà người
ta lựa chọn loại rượu vang làm nguyên liệu cho lên men dấm theo phương pháp lên
men bề mặt. Ở Việt Nam, sản xuất dấm theo phương pháp lên men bề mặt được áp

dụng phổ biến, với đa số các cơ sở sản xuất dấm trong nước quy mô công nghiệp
đều áp dụng phương pháp này nên năng suất thấp và thời gian len men kéo dài.
Phƣơng pháp lên men theo dòng chảy
Phương pháp này tạo được bề mặt tiếp xúc pha giữa lỏng và khí lớn nhờ bổ sung
vật liệu bám trong thiết bị lên men nên hiệu suất cao hơn.
Người ta thiết kế những thùng lên men rất lớn hình trụ, thường có kích thước
như sau: chiều cao thùng 2,5- 6m, đường kính đáy thùng d =1,2 - 3m, tỷ lệ đường
kính đáy so với chiều cao khoảng 1/2 là thích hợp nhất. Trong thùng được chất đầy
phôi bào hay lõi ngô (bắp). Phôi bào hay lõi ngô được xem như chất mang, giữ vi
sinh vật trong q trình lên men. Nhờ đó mà vi sinh vật khơng đi theo vào sản phẩm
cuối cùng. Ngồi ra, ở đáy thiết bị người ta lắp một hệ thống phân phối khơng khí
đưa từ dưới lên. Mơi trường lên men được đưa từ trên xuống.
Đối với phương pháp này, người ta tưới dịch lên men từ trên xuống qua hệ
thống phân phối lỏng như một vòi hoa sen trong buồng tắm. Môi trường sẽ được
phân phối đều và chảy chậm qua thùng lên men (gọi là generator) bên trong có đổ
đầy vật liệu bám có màng vi khuẩn ở trên bề mặt, cồn sẽ thẩm thấu vào tế bào vi
khuẩn. Cùng lúc đó, khơng khí đi ngược chiều vào từ dưới lên trên và oxi thẩm thấu