Luận văn thạc sĩ nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen bông cỏ gossypium arboreum l phục vụ lập bản đồ gen kháng bệnh xanh lùn

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-------------------------------------

Nguyễn Thanh Quân

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN
GEN BÔNG CỎ (Gossypium arboreum L.) PHỤC VỤ
LẬP BẢN ĐỒ GEN KHÁNG BỆNH XANH LÙN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội, năm 2011

1


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-------------------------------------

Nguyễn Thanh Quân

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN
GEN BÔNG CỎ (Gossypium arboreum L.) PHỤC VỤ
LẬP BẢN ĐỒ GEN KHÁNG BỆNH XANH LÙN
Chuyên ngành : Sinh học Thực nghiệm
Mã số

: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Giảng viên hƣớng dẫn:
TS. NGUYỄN THỊ THANH THỦY

Hà Nội, năm 2011


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU............................................................................................................. 1
1. Tính cấp thiết của đề tài…............................................................................... 1
2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của đề tài..................................................... 2
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................... 4
1.1. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ CÂY BƠNG VẢI Gossyipum L........................4
1.1.1. Vị trí phân loại và nguồn gốc phân bố....................................................... 4
1.1.2. Xuất xứ và sự đa dạng genome cây bơng................................................... 7
1.2. TÌNH HÌNH SẢN XUẤT BƠNG TRONG VÀ NGỒI NƢỚC..................9
1.2.1. Tình hình sản xuất bông trên thế giới......................................................... 9
1.2.2. Hiện trạng ngành sản xuất bông ở Việt Nam............................................. 11
1.3. MỘT SỐ CHỈ THỊ ADN TRONG NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI
TRUYỀN………………………………………..………................................

15

1.3.1. Sự đa dạng ADN........................................................................................ 15
1.3.2. Chỉ thị ADN............................................................................................... 16
1.4. THÀNH TỰU TRONG NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY
BÔNG VẢI BẰNG CHỈ THỊ ADN…………….............................................

20

1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới............................................................ 20
1.4.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam.............................................................. 22
1.5. NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN TÍNH KHÁNG BỆNH XANH LÙN............23
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP................................................25
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU.......................................................................... 25
2.1.1. Vật liệu thực vật........................................................................................ 25
2.1.2. Các cặp mồi SSR....................................................................................... 26
2.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ KỸ THUẬT SỬ DỤNG........26
2.2.1. Phương pháp đánh giá tính kháng bệnh xanh lùn các giống bơng cỏ… 26
2.2.2. Phương pháp đánh giá đặc tính nơng sinh học, tiềm nămg năng suất
của các giống bơng…………….....………………………………..................

27

2.2.3. Phương pháp phân tích đa hình di truyền bằng chỉ thị SSR......................30
2.2.4. Các phương pháp xử lý số liệu chính trong nghiên cứu............................34


Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN........................................................ 35
3.1. THU THẬP CÁC DỊNG, GIỐNG BƠNG TIỀM NĂNG NĂNG SUẤT
35
CAO, CHẤT LƢỢNG TỐT VÀ GIỐNG KHÁNG BỆNH…….....................
3.2. ĐÁNH GIÁ TÍNH KHÁNG CỦA CÁC GIỐNG BÔNG CỎ NHẰM
XÁC ĐỊNH NGUỒN GEN LÀM VẬT LIỆU BAN ĐẦU CHO VIỆC LAI

36

TẠO QUẦN THỂ…………….....…………….....……………..….................
3.3. ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH NƠNG SINH HỌC CÁC GIỐNG BƠNG CỎ
NGHIÊN CỨU…………….....…………….....…………….……..................
3.3.1. Thời gian sinh trưởng và các đặc điểm thực vật học của các giống
bông nghiên cứu.……….........…………….....…………….....……………...

39
39

3.3.2. Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất các giống bông…...............42
3.3.3. Chất lượng xơ của các giống bơng nghiên cứu.........................................44
3.4. PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC GIỐNG BÔNG NGHIÊN
CỨU BẰNG CHỈ THỊ SSR…………….....……………..…..........................
3.4.1. Tách chiết DNA tổng số của các giống bơng phục vụ phân tích SSR…
3.4.2. Kết quả phân tích đa hình DNA các giống bơng bố mẹ bằng chỉ thị
phân tử SSR…….....…………….....…………….....…………….....………...

49
49
49

3.4.3. Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền của các giống bông...................54
3.5. CHỌN CẶP LAI TRIỂN VỌNG TẠO QUẦN THỂ F1 PHỤC VỤ LẬP
BẢN ĐỒ GEN KHÁNG BỆNH XANH LÙN……………………................

58

Chƣơng 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.......................................................60
4.1. KẾT LUẬN..................................................................................................60
4.2. KIẾN NGHỊ.................................................................................................60

TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................61
Tiếng Việt............................................................................................................61
Tiếng Anh...........................................................................................................62
Tài liệu từ Internet…...........................................................................................64
PHỤ LỤC….......................................................................................................65
DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1. Các nƣớc có diện tích bơng lớn nhất thế giới năm 2009-2010..............10


Bảng 1.2. Các nƣớc có sản lƣợng bơng cao nhất thế giới năm 2009-2010...........11
Bảng 1.3. Tình hình sản suất bơng vải tại Việt Nam năm 2000-2010....................13
Bảng 2.1. Mã số tập đồn, tên và nguồn gốc của 30 giống bơng cỏ thu thập.........25
Bảng 2.2. Các nhóm mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu......................................26
Bảng 2.3. Bảng số liệu đánh giá chiều cao cây......................................................28
Bảng 2.4. Thành phần đệm chiết............................................................................31
Bảng 2.5. Thành phần đệm rửa I (wash buffer I)...................................................31
Bảng 2.6. Thành phần đệm rửa II (Wash buffer II)................................................31
Bảng 2.7. Chƣơng trình chạy phản ứng PCR........................................................32
Bảng 3.1. Kết quả đánh giá khả năng kháng bệnh xanh lùn các giống bông..........37
Bảng 3.2. Kết quả chọn lọc các dòng kháng bệnh xanh lùn của cỏ Nghệ An…
Bảng 3.3. Thời gian sinh trƣởng và các đặc điểm thực vật học chính của các
giống bơng cỏ trong nghiên cứu.........................................................................
Bảng 3.4. Các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của các giống bông….

38
40
43

Bảng 3.5. Một số chỉ tiêu chính về chất lƣợng xơ của các giống bơng cỏ.............45
Bảng 3.6. Một số dịng/giống bơng tiềm năng năng suất cao và chất lƣợng tốt

Bảng 3.7. Các chỉ tiêu về alen, chỉ số đa dạng PIC của các locus SSR nhận
biết trên 31 giống bông nghiên cứu....................................................................
Bảng 3.8. Một số kết quả phân tích đa dạng di truyền SSR trên cây bông đã
đƣợc công bố.......................................................................................................

48
52
53

Bảng 3.9. Mối quan hệ di truyền giữa 31 giống bông cỏ trong nghiên cứu............56
Bảng 3.10. Danh sách các giống bố mẹ dùng cho lai tạo quần thể F1....................59
Phụ lục 1. Danh sách 50 cặp mồi SSR đã sử dụng trong nghiên cứu đa hình
các giống bơng cỏ...............................................................................................

3

65


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Lồi bơng cỏ châu Á (Gossypium arboreum L.)…………………. 4
Hình 1.2. Các lồi bơng thu thập đƣợc……………….................................... 7
Hình 1.3. Phân bố tự nhiên của các lồi bơng nhị bội………………............. 8
Hình 1.4. Đa hình ADN SSR giữa hai cá thể có motif (AT)n............................... 19
Hình 2.1. Các cấp bệnh xanh lùn đánh giá trong phịng thí nghiệm....................27
Hình 2.2. Chiều dài xơ đo bằng thiết bị HVI.......................................................30
Hình 3.1. Gieo trồng ngồi đồng.........................................................................35
Hình 3.2. Cây bơng nhiễm và kháng bệnh xanh lùn…........................................38
Hình 3.3. Ruộng đánh giá các đặc tính nơng sinh học của các giống bơng….....39
Hình 3.4. Biểu đồ đánh giá một số đặc tính nơng sinh học chính của các

dịng/giống bơng nghiên cứu………………........……………........................
Hình 3.5. Kết quả kiểm tra DNA của một số giống bơng trên gel agarose
0,8%………………...........................……………...........................................
Hình 3.6. Sản phẩm PCR của các giống bông nghiên cứu với một số cặp
mồi nhóm BNL trên gel agarose 3%………………........……………............
Hình 3.7. Sản phẩm PCR của các giống bông nghiên cứu với một số cặp
mồi nhóm NAU, TM và STV trên gel agarose 3%………………..................
Hình 3.8. Sơ đồ hình cây thể hiện mối quan hệ di truyền của các giống bơng
cỏ trong nghiên cứu………………........……………......................................

47
49
50
51
57

Hình 3.9. Sơ đồ lai tạo tổ hợp lai F1.................................................................... 58
Phụ lục 2. Biểu đồ biểu thị các đặc tính nơng sinh học của các giống bông
cỏ trong nghiên cứu.………………....... …………….....................................

69


BẢNG KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT
ADN

Acid deoxyribonucleic

ARN

Acid ribonucleic

bp

Base pair

CAPS

Cleaved Amplification Polymorphism Sequence

cs

Cộng sƣ ̣

CTAB

Cetyl trimethylammonium bromide

cM

Centimorgan

CV

coefficient of variation

dNTPs

Deoxy nucleotide triphosphates

EthBr

Ethidium bromide

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

EST

Expressed sequence tag

ISSR

Inter-simple sequence repeat

Kb

Kilo base

LSD0,05

Least Significant Difference

MAS

Molecular Assisted Selection

PCR

Polymerase Chain Reaction

PIC

Polymorphism Information Content

SDS

Sodium Dodecyl Sulphate

STS

Sequence- tagged site

TAE

Tris-Acetic acid- EDTA

TBE

Tris-Boric acid-EDTA

TE

Tris-EDTA


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Cây bơng (Gossypium L.) là loại cây trồng lấy sợi tự nhiên hàng đầu và quan

trọng nhất trên thế giới, đƣợc trồng khắp mọi nơi ở điều kiện khí hậu nhiệt đới và
cận nhiệt đới. Bông vải cũng là mặt hàng thƣơng mại quan trọng mang lại lợi nhuận
cho hàng triệu nông dân ở các nƣớc phát triển cũng nhƣ đang phát triển. Sản phẩm
chính xơ bơng đƣợc biết đến nhƣ là nguồn nguyên liệu chủ yếu cho ngành công
nghiệp dệt may. Hiện nay, với sự phát triển của xã hội, con ngƣời ý thức rõ giá trị
của bản thân bằng việc làm đẹp với thời trang, đặc biệt là thời trang quần áo. Con
ngƣời sử dụng quần áo, vải vóc hàng ngày khơng chỉ giữ ấm cơ thể mà cịn coi đó
là một nét văn hóa, thể hiện sự văn minh và đẳng cấp xã hội. Qua những tính năng
vƣợt trội nhƣ hút ẩm, mau khơ, tạo sự thơng thống, mát về mùa hè và ấm vào mùa
đông của vải cotton, cây bơng thực sự là cây trồng hữu ích và quan trọng đối với
cuộc sống của con ngƣời.
Cho đến nay, bông vẫn là nguyên liệu cơ bản của công nghiệp dệt chƣa có gì
thay thế đƣợc. Phát triển nghề trồng bơng vải đã trở thành ngành kinh tế nông
nghiệp trọng điểm ở nhiều quốc gia với sản phẩm bông xơ đem lại giá trị kinh tế
cao. Hàng năm, ngành công nghiệp bơng đã đóng góp vào nền kinh tế thế giới
khoảng 500 tỉ USD với việc sử dụng khoảng 115 triệu kiện bông xơ (Chen & cs.,
2007). Tuy nhiên, sản lƣợng bông vải hàng năm phụ thuộc vào nhiều yếu tố trong
đó yếu tố ngoại cảnh nhƣ sâu bệnh và giống là hai yếu tố quan trọng nhất. Hiện nay
đã có hơn 20 loại bệnh hại bông do virus gây ra đƣợc cơng bố, trong đó bệnh xanh
lùn hay cịn gọi là bệnh xanh lá (cotton blue disease) là loại bệnh xuất hiện từ sớm
và gây hại nghiêm trọng cho sản xuất bông (Correae et al., 2005). Bệnh đã xuất hiện
và làm giảm sản lƣợng bông đáng kể ở khá nhiều nƣớc trên thế giới, và cũng chính
là loại bệnh gây hại lớn nhất cho cây bông ở nƣớc ta hiện nay.
Theo dự kiến của chính phủ đề ra, đến năm 2011, nông nghiệp nƣớc ta phải
đáp ứng đƣợc 20% sản lƣợng bơng xơ, mở rộng diện tích trồng bơng lên 0,5 triệu
ha (Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, 2003). Nhƣng chính vì những hạn chế
do giá bơng khơng ổn định, năng suất, chất lƣợng bông thu hoạch thấp do sâu bệnh,


chƣa có giống kháng, chi phí sản xuất cao dẫn đến thua lỗ đã khơng khuyến khích

đƣợc việc mở rộng diện tích trồng bơng, cũng nhƣ tăng sản lƣợng bơng trong nƣớc.
Sự lựa chọn tối ƣu nhất cho công tác quản lý bệnh cây và hạn chế ô nhiễm
môi trƣờng do dùng thuốc hóa học hiện nay chính là việc sử dụng giống kháng bệnh.
Nhờ sự tiến bộ của công nghệ sinh học, các nhà khoa học đã dễ dàng chuyển nạp
các gen kháng vào các giống mới cho năng suất chất lƣợng tốt, kháng sâu bệnh,
kháng thuốc diệt cỏ, giảm thiểu chi phí sản xuất và tăng thu nhập cho ngƣời trồng
bơng. Tuy nhiên, hiện nay vẫn chƣa có nhiều cơng trình nghiên cứu về tính kháng
bệnh xanh lùn ở bông.
Xuất phát từ những vấn đề nêu trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:
Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen bông cỏ (Gossypium arboreum L.)
phục vụ lập bản đồ gen kháng bệnh xanh lùn.
2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của đề tài
2.1. Mục tiêu của đề tài
Thu thập các giống bông cỏ địa phƣơng và nhập nội để tiến hành đánh giá
khả năng kháng/nhiễm bệnh xanh lùn qua chỉ tiêu hình thái, đồng thời đánh giá sự
đa dạng di truyền của các giống bông bằng chỉ thị phân tử (SSR), từ đó xác định các
cặp lai phục vụ nghiên cứu lập bản đồ gen kháng bệnh xanh lùn và chọn tạo giống
bông kháng bệnh.
2.2. Nội dung nghiên cứu của đề tài
1. Thu thập một số giống bơng cỏ có tiềm năng năng suất cao, chất lƣợng xơ
tốt và một số dịng bơng kháng bệnh xanh lùn.
2. Đánh giá tính kháng bệnh xanh lùn và một số đặc tính nơng sinh học chính
của các giống bông đã thu thập.
3. Sử dụng chỉ thị phân tử SSR để phân tích mối quan hệ di truyền phân tử
giữa các giống bông cỏ.
4. Xác định cặp giống bông vải kháng bệnh và giống bơng khơng kháng bệnh
nhƣng có nhiều đặc tính ƣu việt về năng suất cũng nhƣ chất lƣợng sợi làm vật liệu
lai tạo quần thể, phục vụ lập bản đồ phân tử gen kháng bệnh xanh lùn.
3. Phạm vi nghiên cứu của đề tài
3.1. Các giống bông nghiên cứu của đề tài

Trong nghiên cứu của đề tài, chúng tôi tiến hành đánh giá 30 giống bông cỏ
trong tập đồn giống bơng của Viện nghiên cứu Bơng và Phát triển Nông nghiệp


Nha Hố, Ninh Thuận.
3.2. Địa bàn nghiên cứu của đề tài
Đề tài nghiên cứu của chúng tôi đƣợc thực hiện tại Viện Di truyền Nông
nghiệp và Viện Nghiên cứu Bông và Phát triển Nông nghiệp Nha Hố.
Đề tài nghiên cứu này nằm trong đề tài khoa học cấp Nhà nƣớc “Chọn tạo
giống bông kháng bệnh xanh lùn bằng chỉ thị phân tử” thuộc chƣơng trình Cơng
nghệ Sinh học Nơng nghiệp do Viện Di truyền Nơng nghiệp chủ trì và Viện Nghiên
cứu Bông và Phát triển Nông nghiệp Nha Hố phối hợp thực hiện.
3.3. Thời gian nghiên cứu của đề tài
Đề tài đƣợc tiến hành từ tháng 01 năm 2009 đến tháng 04 năm 2011.


Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ CÂY BƠNG VẢI (Gossypium L.)
1.1.1. Vị trí phân loại và nguồn gốc phân bố
Theo cơ sở dữ liệu ITIS (Integrated Taxonomic Information System), cây
bông đƣợc phân loại nhƣ sau:
Giới thực vật – Plantae
Ngành hạt kín – Magnoliophyta
Lớp hai lá mầm – Magnoliopsida
Bộ bông – Malvales
Họ bông – Malvaceae
Chi bông – Gossypium
Cây có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Các lồi bơng có thể
cao đến tận 3 mét. Lá có cuống dài, phiến non có lơng về sau khơng lơng, có 3-5
thùy sâu đến một nửa. Hoa to 5-8 cm, vàng vàng, tâm đỏ bầm; lá đài phụ rời nhau

hay dính nhau ít, có khía rất sâu; đài hình chén; ống nhị dài 1,5 cm. Quả nang xoan
(quả bơng), 3-4 mảnh; hạt nhiều, có lơng trắng dễ tróc phủ quanh hạt gọi là sợi bơng.

Hình 1.1. Lồi bông cỏ châu Á (Gossypium arboreum L.)
Theo Jiang (2004), Brubaker và cs. (2002), chi Gossypium có khoảng 50 lồi
và chỉ có bốn lồi có giá trị thƣơng phẩm cao là:
- Gossypium arboreum L. - Bơng cỏ châu Á, có nguồn gốc ở miền nam châu Á.
- Gossypium barbadense L.- Bông hải đảo, có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới Nam Mỹ.
- Gossypium herbaceum L. - Bơng cỏ châu Phi, có nguồn gốc ở miền nam châu Phi.


- Gossypium hirsutum L. - Bơng luồi, có nguồn gốc ở khu vực Trung Mỹ, Caribe và
miền nam Florida, Hoa Kỳ.
Các lồi bơng cịn lại khơng đƣợc trồng do sợi bơng ngắn và có màu nâu
hung đỏ, khơng phù hợp cho việc xe sợi hay xoắn sợi thành các sợi chỉ:
+ Gossypium sturtianum J.H. Willis – Bông Úc hay hồng sa mạc Sturt (Sturt‟s
Desert Rose), có nguồn gốc ở Australia.
+ Gossypium thurberi Tod. – Bơng dại Arizona, có nguồn gốc ở Arizona, New
Mexico và miền bắc Mexico.
+ Gossypium tomentosum Nutt. – Bơng Hawaii, là lồi đặc hữu của khu vực quần
đảo Hawaii….
Cũng theo Brubaker và cs. (2002), chi Gossypium phân bố ở phía Tây và
Nam Mexico khoảng 18 lồi, ở Đơng Bắc châu Phi và Arập khoảng 14 lồi, và ở
Australia khoảng 17 lồi. Trong bốn lồi bơng có giá trị thƣơng phẩm trên, ở Việt
Nam, canh tác phổ biến nhất là ba lồi bơng là: G. hirsutum L., G. arboreum L. và
G. barbadense L.
a) Gossypium hirsutum L.
Loài G. hirsutum thƣờng đƣợc gọi là bơng luồi, là lồi bơng tứ bội (song
lƣỡng bội) khác nguồn A, D có bộ nhiễm sắc thể 2n = 2x = 52 (Jiang, 2004). Bông
luồi có nguồn gốc từ Trung Mỹ, nay đƣợc trồng lan rộng ra khắp nơi trên thế giới,

sản lƣợng xơ bông Luồi chiếm trên 90% sản lƣợng tồn thế giới. Bơng luồi đƣợc
trồng nhiều nhất là ở Mỹ, trên 95% (Jiang, 2004), sau đó là Nga, Ấn Độ, Trung
Quốc, Braxin, Achentina, Nam Phi và châu Úc.
Ở Việt Nam, bông luồi du nhập vào nƣớc ta khoảng cuối thế kỷ XIX đầu thế
Kỷ XX. Phần lớn các giống thuộc loài này do ngƣời Pháp đƣa vào nhằm mục đích
khai thác và sản xuất bơng hàng hóa. Về sau, lồi này đƣợc du nhập vào bằng nhiều
con đƣờng khác nhau, chủ yếu thông qua các chƣơng trình viện trợ của các tổ chức
quốc tế. Qua q trình thực nghiệm cho thấy lồi này có khả năng thích ứng rộng,
phù hợp với điều kiện thời tiết ở nƣớc ta. Với tiềm năng cho năng suất cao và chất
lƣợng xơ tốt, các giống bông này dần dần thay thế các giống bơng cỏ trƣớc đó (Lê
Quang Quyến, 2004). Bơng luồi có nhiều lồi phụ nhƣ: G. hirsutum ssp.


Mexicanum, G. hirsutum ssp. Punctatum (Achum và Thonn), G. hirsutum ssp.
Panicultum (Balanco)…
b) Gossypium barbadense L.
Loài G. barbadense thƣờng đƣợc gọi là bông hải đảo, cũng giống nhƣ bông
luồi, bông hải đảo là lồi bơng tứ bội (song lƣỡng bội) khác nguồn A, D có bộ
nhiễm sắc thể 2n = 2x = 52. Bơng hải đảo có nguồn gốc từ Nam Mỹ, nay đƣợc trồng
nhiều ở Nga, Mỹ, Ai Cập và một số nƣớc khác. Bông hải đảo cung cấp khoảng 10%
sản lƣợng xơ bông trên thế giới và hiện nay diện tích trồng bơng hải đảo đang đƣợc
mở rộng do phẩm chất xơ đặc biệt tốt.
Ở Việt Nam, chƣa tìm thấy tài liệu nào nói về lồi bơng hải đảo đƣợc trồng
phổ biến trong sản suất và bắt nguồn từ đâu. Loài này thƣờng gặp dƣới dạng cây lâu
năm ở trong các vƣờn hoang và bờ giậu. Đến năm 1941-1945 mới du nhập một số
giống nhƣ Ghiza, Pima vào miền Nam, các giống Trƣờng Nhung, Menufi, Tiến Vọt
vào miền Bắc năm 1955-1956 qua chƣơng trình hợp tác và trao đổi giống. Qua quá
trình nghiên cứu và thử nghiệm, cho thấy lồi bơng hải đảo thích hợp trong vụ khơ
có tƣới, không hợp với điều kiện mƣa nhiều và độ ẩm cao.
Bơng hải đảo có nhiều lồi phụ nhƣ: G. barbadense ssp. Darwwinii (Watt)

Mauner, G. barbadense ssp. Redurale Mauner, G. barbadense ssp. Ventifolum
(Lam) và G. barbadense ssp. Eubarbadense Mauner.
c) Gossypium arboreum L.
Lồi G. arboreum thƣờng đƣợc gọi là bơng cỏ, là lồi bơng lƣỡng bội
genome A (2n=2x=26). Lồi này có lẽ đƣợc trồng lâu đời nhất, có nguồn gốc từ Tây
Nam Ấn Độ, lan truyền sang vùng Đông Nam Á, vùng có gió mùa khí hậu ẩm ƣớt.
Bơng cỏ thƣờng đƣợc trồng ở vùng đồng bằng nhƣng cũng có trồng ở vùng núi cao
1500-2000 mét. Vùng sản suất chính là Ấn Độ, Trung Quốc, Việt Nam, Myanmar,
Lào. Trƣớc đây, sản lƣợng bông cỏ chiếm 20% tổng sản lƣợng bông trên thế giới
mỗi năm. Hiện nay, diện tích trồng bơng cỏ ngày càng thu hẹp do chất lƣợng xơ
cũng nhƣ năng suất của bông cỏ không bằng bông luồi và bông hải đảo.
Ở Việt Nam khoảng thế kỷ XIII-XIV, lồi bơng này đƣợc trồng phổ biến
khắp mọi miền đất nƣớc, từ đồng bằng đến vùng Trung du và Miền núi. Đến năm
1955, lồi bơng cỏ vẫn cịn phổ biến trên các vùng trồng bông ở Bắc bộ và một số


vùng thuộc Bắc Trung bộ; trong lúc đó ở các vùng bông ở Nam và Trung bộ đang
dần thay thế bằng các giống bơng luồi.
Các giống bơng cỏ hiện có ở Việt Nam thuộc hai loài phụ: G. arboreum ssp.
Neglectum và G. arboreum ssp. Nanking, kể cả hai dạng bông lâu năm và hàng năm
(Lê Quang Quyến, 2004).

(a)

(b)

(c)

Hình 1.2. Các lồi bơng thu thập đƣợc: (a) bơng luồi, (b) hải đảo, (c) bông cỏ
1.1.2. Xuất xứ và sự đa dạng genome cây bông

Cây bông (Gossypium L.) bao gồm khoảng 45 loài nhị bội và 5 loài tứ bội
với cách thức di truyền phức tạp. Nhóm bơng nhị bội đƣợc chia làm 8 nhóm
genome từ A đến G và K (Fryxell, 1992). Cho đến nay, các lồi bơng nhị bội có 3
nhóm bơng chính: nhóm bơng châu Phi có kiểu genome A, B, E, và F có xuất xứ từ
châu Phi và châu Á; nhóm bơng có kiểu genome D có nguồn gốc xuất xứ từ các
nƣớc châu Mỹ; nhóm bơng thứ 3 có kiểu genome C, G và K đƣợc tìm thấy ở châu
Úc (Wendel & Cronn, 2003).
Tất cả 50 lồi bơng, kể cả hai lồi bơng tứ bội tự nhiên Gossypium hirsutum
và Gossypium barbadense, đều có nguồn gốc từ các lồi bơng tổ tiên châu Phi A
genome và các lồi bơng D genome.
Tổ tiên của các lồi bơng tứ bội cịn tồn tại cho đến nay là các lồi bông nhị
bội Gossypium herbaceum (A1) và Gossypium arboreum (A2), và Gossypium
raimondii (D5) Ulbrich (Brubaker & cs., 1999). Quá trình tứ bội hóa xảy ra khoảng
1 đến 2 triệu năm trƣớc đây (Wendel & Cronn, 2003) đã tạo ra 5 loài bơng tứ bội.
Trong các lồi bơng, chỉ có 4 lồi bông đƣợc trồng lấy sợi bao gồm hai dạng
nhị bội genome A (2n=2x=26) là G. herbaceum (A1); G. arboreum (A2) và hai


dạng tứ bội (song lƣỡng bội) khác nguồn A, D (2n=2x=52) là G. hirsutum và
G.barbadense.

Hình 1.3. Phân bố tự nhiên của các lồi bơng nhị bội.
Hiện nay, các giống bơng trồng phổ biến trong sản xuất đều là bông tứ bội có
nguồn gốc lai giữa hai nhóm genome A và D. Trong khi đó, chỉ có các lồi bơng
thuộc nhóm genome A cho bơng lấy sợi cịn nhóm genome D thì khơng (Chen & cs.,
2007). Vì thế, nghiên cứu genome, lập bản đồ di truyền cây bông nhị bội A và D là
định hƣớng cơ bản giúp tìm hiểu sự hình thành, mối tƣơng quan và biểu hiện gen ở
cây bơng thƣơng mại tứ bội, giúp cải thiện các tính trạng quan trọng ở cây bông
(Jiang & cs., 1998; Saha & cs., 2006; Yang & cs., 2006).
Kích thƣớc genome của cây bơng biến động tùy lồi: Kích thƣớc đơn bội

genome nhỏ nhất đƣợc ghi nhận ở loài G. raimondii Ulbrich, đạt khoảng 880Mb.
Genome đơn bội của G. arboreum có kích thƣớc khoảng 1,75 Gb và G. hirsutum có
kích thƣớc 2,5 Gb (Hendrix & Stewart, 2005). Biến động thành phần ADN ở các
loài nhị bội phản ánh mức độ nhiều hay ít của bản sao của các trình tự lặp lại khác
nhau (Zhao & cs., 1998), và các yếu tố transposome (Hawkins & cs., 2006). Thành
phần ADN của các loài đa bội xấp xỉ bằng tổng số của genome bố mẹ A và D (Liu
& cs., 2001).
1.2. TÌNH HÌNH SẢN XUẤT BƠNG TRONG VÀ NGỒI NƢỚC
1.2.1. Tình hình sản xuất bơng trên thế giới


1.5.1.1. Phương thức sản xuất
Trên thế giới hiện nay tồn tại hai phƣơng thức sản xuất bông:
- Sản xuất bông khơng có sự hỗ trợ của nhà nƣớc: Đây là phƣơng thức sản
xuất ở những vùng mà cây bông vẫn có ƣu thế vì khơng có cây trồng nào tốt hơn
hoặc những nƣớc và vùng trồng bông là vùng đất xấu (Châu Phi…), đời sống nhân
dân còn nghèo, thu nhập thấp; cây bơng có năng cao và trở thành cây có tác dụng
xóa đói giảm nghèo.
- Sản xuất bơng có sự hỗ trợ của nhà nƣớc: Điển hình cho phƣơng thức sản
xuất này là ba nƣớc lớn (Hoa Kỳ, Ấn Độ và Trung Quốc) chiếm hơn 75% sản lƣợng
bông thế giới. Việc hỗ trợ của mỗi nƣớc tuy khác nhau, nhƣng mục đích là làm cho
việc trồng bơng có thu nhập cao hơn so với các cây trồng cạnh tranh khác (kể cả
trong nƣớc và quốc tế).
Phƣơng thức sản xuất đƣợc nhà nƣớc hỗ trợ sản xuất bông tạo điều kiện áp
dụng tiến bộ khoa học trong nghiên cứu giống, cơ giới hóa việc trồng, chăm sóc và
tƣới tiêu nên sản xuất bơng có năng suất cao, chất lƣợng sản phẩm tốt.
1.5.1.2. Hiện trạng sản xuất
Vụ bông 2009-2010, tổng diện tích bơng trên thế giới là 33,5 triệu ha, trong
đó các nƣớc đang phát triển chiếm 70% diện tích và các nƣớc phát triển chỉ chiếm
có 30% diện tích. Mƣời nƣớc có diện tích trồng bơng lớn nhất thế giới đƣợc liệt kê

ở bảng 1.2, trong đó Ấn Độ dẫn đầu với diện tích là 8,7 triệu ha, tiếp theo là Mỹ 5,6
triệu ha, Trung Quốc 4,8 triệu ha và Pakistan 3,1 triệu ha. Điều đáng chú ý là 70%
diện tích bơng trên thế giới đƣợc trồng ở các nƣớc miền Nam và diện tích trồng của
ba nƣớc châu Á là Ấn Độ, Trung Quốc, Pakistan đã chiếm khoảng 50% diện tích
bơng thế giới (ISAAA, 2010).
Bảng 1.1. Các nƣớc có diện tích bơng lớn nhất thế giới năm 2009-2010
STT

Nước

Diện tích (triệu ha)

1

Ấn Độ

8,730

2

Mỹ

5,596

3

Trung Quốc

4,824

4

Pakistan

3,125


5

Uzbekistan

1,453

6

Brazil

0,75

7

Thổ Nhĩ Kỳ

0,654

8

Turkmenistan

0,550

9

Mali

0,516

10

Benin

0,415

Sản lƣợng bông thế giới đã tăng từ 9,8 triệu tấn niên vụ 1970-1971 lên 21,1
triệu tấn niên vụ 2009-2010, tức là tăng hơn 116% sau 40 năm. Danh sách mƣời
nƣớc có sản lƣợng bơng xơ lớn nhất thế giới đƣợc liệt kê ở bảng 1.3, trong đó Trung
Quốc dẫn đầu với 5,3 triệu tấn, tiếp theo là Mỹ 4,4 triệu tấn, Ấn Độ 2,5 triệu tấn.
Điều đặc biệt là trong mƣời nƣớc có sản lƣợng bơng cao nhất thế giới thì có sáu
nƣớc là các nƣớc đang phát triển. Về năng suất, Australia dẫn đầu với năng suất là
1.658 kg bông xơ/ha, tiếp theo là Syria 1.303 kg bông xơ/ha và Trung Quốc 1.103
kg bông xơ/ha (ISAAA, 2010).


Bảng 1.2. Các nƣớc có sản lƣợng bơng cao nhất thế giới năm 2009-2010
STT
1
2
3
4
5

6
7
8
9
10

Nước
Trung Quốc
Mỹ
Ấn Độ
Pakistan
Uzbekistan
Thổ Nhĩ Kỳ
Brazil
Australia
Syria
Ai Cập

Sản lượng (triệu tấn)
5,320
4,420
2,508
1,853
1,055
0,880
0,750
0,670
0,335
0,314

Năng suất xơ (kg/ha)
1.103
790
287
593
726
1.345
999
1.658
1.303
994

Mặt khác, diện tích trồng bơng chuyển gen trên thế giới ngày càng gia tăng.
Nếu diện tích trồng bơng trên thế giới năm 2009 là 32 triệu ha (ISAAA, 2009) thì
trong đó, bơng chuyển gen chiếm 28% (9 triệu ha). So với năm 2008, diện tích
trồng bông chuyển gen tăng 11% (9 triệu ha trong năm 2009 so với 7,2 triệu ha
trong năm 2008). Trong số các nƣớc trồng bông chuyển gen, Ấn Độ là nƣớc có diện
tích trồng bơng chuyển gen tăng nhanh nhất thế giới (tăng 400% so với năm 2008).
Năm 2008, Ấn Độ chỉ có 100 ngàn ha bơng chuyển gen nhƣng năm 2009 diện tích
bơng chuyển gen tăng lên 500 ngàn ha. Trung Quốc cũng là nƣớc có sự gia tăng
diện tích trồng bơng chuyển gen đáng chú ý: năm 2008 có 2,8 triệu ha nhƣng năm
2009 đã tăng lên 3,7 triệu ha (chiếm 60% diện tích bơng). Theo dự báo của các
chun gia, diện tích trồng bơng chuyển gen trên thế giới sẽ tiếp tục gia tăng trong
những năm tới và hƣớng chuyển gen vào cây bông sẽ tập trung vào việc tạo ra các
giống bông kháng sâu bệnh là chủ yếu, nhƣng bên cạnh đó chất lƣợng sợi bơng
cũng đƣợc quan tâm nhiều (ISAAA, 2010).
1.2.2. Hiện trạng ngành sản xuất bông ở Việt Nam
Ngành trồng bông và kéo sợi tại Việt Nam đã có lịch sử lâu đời nhƣng nó chỉ
trở thành ngành trọng điểm trong khoảng 2 thập kỷ gần đây khi đất nƣớc tiến vào
công cuộc Công nghiệp hóa, hiện đại hóa. Chỉ trong 10 năm từ 2000 đến 2010, Dệt

May Việt Nam đã vƣơn trở thành ngành đạt kim ngạch xuất khẩu lớn nhất cả nƣớc
với doanh thu 11,5 tỷ đơ la Mỹ, trong đó trồng bơng và kéo sợi là hai khâu đoạn đầu
của chuỗi dệt may. Cũng trong 10 năm đó, ngành kéo sợi đã tăng trƣởng trên 300%


từ 1,2 triệu cọc sợi với tổng sản lƣợng 120.000 tấn lên 3,75 triệu cọc đạt 420.000
tấn. Trong khi đó, ngành trồng bông lại diễn ra theo chiều hƣớng ngƣợc lại. Năm
2000, sản lƣợng bông cả nƣớc đạt 18.000 tấn thì đến năm 2010 chỉ cịn 13,000 tấn
– tức cịn khoảng 70% sản lƣợng năm 2000. Nếu nhƣ năm 2000 bông trong nƣớc
đáp ứng khoảng 20% nhu cầu kéo sợi thì đến năm 2010, tỷ lệ này chỉ cịn 1,3% - đây
là một dấu hiệu rất đáng lo ngại đặc biệt giá bông thế giới tăng cao một cách bất
thƣờng (tăng 2,2 lần) chỉ trong vòng hai năm 2009, 2010, đe dọa tới sự tăng trƣởng
ổn định của ngành sợi Việt Nam nói riêng và tồn ngành dệt may nói chung.
1.2.2.1. Hình thức tổ chức, chế độ sản xuất bơng tại Việt Nam
Trƣớc năm 1995, sản xuất bông trong nƣớc tập trung ở các nông trƣờng quốc
doanh. Lúc bấy giờ sản xuất bông chƣa hội đủ các yếu tố để đảm bảo cho sự thành
công nhƣ kỹ thuật, hệ thống quản lý, đội ngũ công nhân… nên sản xuất bông chƣa
hiệu quả. Vì vậy, chủ trƣơng của nhà nƣớc là giao các nông trƣờng về cho địa
phƣơng quản lý và từ năm 1996 đến nay sản xuất bông chuyển sang hình thức trồng
trong nơng dân. Hình thức này có hiệu quả và phù hợp với điều kiện ở Việt Nam.
Nhƣng mặt trái của hình thức này là ngun liệu khơng ổn định do phụ thuộc vào
giá cả thị trƣờng và nông dân tự do lựa chọn, quyết định trồng cây nào có lợi trên
đất của mình.
Quy mơ sản xuất bơng ở Việt Nam còn phân tán, nhỏ lẻ trong hộ nơng dân,
rất ít nhóm kinh tế, mức độ cơ giới hóa cịn rất thấp và đặc biệt là chƣa có vùng tập
trung lớn nên rất khó áp dụng các tiến bộ kỹ thuật đồng bộ để nâng cao năng suất và
chất lƣợng bông hạt. Số hộ sản xuất bông tự cấp tự túc chiếm hơn 80%. Dân tộc
thiểu số chiếm 15-20% tổng số hộ sản xuất bơng.
1.2.2.2. Diện tích, năng suất, sản lượng bơng trong nước
- Về diện tích: Nhờ có các tiến bộ kỹ thuật và đổi mới về phƣơng thức quản

lý sản xuất nên sản xuất bông tăng mạnh, cao nhất là niên vụ 2002/2003 đạt 34.100
ha; vụ 2003/2004 diện tích bắt đầu giảm sút; vụ 2006/2007 diện tích giảm cịn
20.900 ha, bằng khoảng 60% vụ 2002/2003 và vụ 2009/2010 chỉ cịn 9.600 ha.
Ngun nhân chính khiến diện tích bơng vải giảm mạnh là do năng suất q thấp
(trung bình chỉ chừng 12 tạ/ha) và giá thu mua không cao (9.000 đồng/kg), khiến


nông dân không “mặn mà” với cây bông vải bằng một số loại cây công nghiệp ngắn
ngày khác.
- Sản lƣợng bơng phụ thuộc khá nhiều về diện tích trồng bơng, trong 10 năm
qua, sản lƣợng bơng trong nƣớc cũng có xu hƣớng giảm dần. Đỉnh điểm ở niên vụ
2002/2003, diện tích gieo trồng đạt 34,1 nghìn ha thì sản lƣợng bơng cũng đạt cao
nhất tới 40,0 nghìn tấn. Vụ 2006/2007 giảm xuống cịn 28,6 nghìn tấn và đến năm
2008/2009, sản lƣợng rớt xuống thấp nhất, chỉ cịn 8,0 nghìn tấn tƣơng ứng với diện
tích trồng bơng bị thu hẹp nhất là 5,8 nghìn ha.
- Về năng suất: Năng suất bơng vải qua các năm 2000-2010 nhìn chung có xu
hƣớng tăng, nhƣng thực chất là tăng rất chậm, không đáng kể so với sự phát triển
của cầu thị trƣờng ngành dệt may. Suốt trong 10 năm, chỉ dao động từ 10-14,6 tạ/ha,
trung bình tăng khoảng 0,46 tạ/ha/1 năm. Với sản lƣợng thấp và năng suất tăng
chậm nhƣ vậy, thì bơng vải trong nƣớc chỉ đáp ứng đƣợc khoảng 2% nhu cầu bông
xơ cho ngành sợi. Nhƣ vậy, ngành sợi của Việt Nam xem nhƣ mất trắng nguồn cung
nguyên liệu từ trong nƣớc và phải nhập khẩu gần 100% bông xơ từ nƣớc ngồi.
Bảng 1.3. Tình hình sản suất bơng vải tại Việt Nam năm 2000-2010
Năm
2000
2001
2002
2003
2004
2005

2006
2007
2008
2009
2010

Năng suất
Diện tích gieo trồng Sản lượng
(nghìn ha)
(nghìn tấn)
(tạ/ha)
18,6
18,8
10,1
27,7
33,6
12,1
34,1
40,0
11,7
27,8
35,1
12,6
28,0
28,0
10,0
25,8
33,5
13,0
20,9

28,6
13,7
12,1
16,1
13,3
5,8
8,0
13,8
9,6
12,1
12,6
9,1
13,3
14,6
(Theo Tổng cục thống kê Việt Nam, năm 2011)

1.2.2.3. Tác động của sâu bệnh đối với năng suất và chất lượng của cây bông vải.
Ở Việt Nam, do đặc thù khí hậu là nhiệt đới ẩm nên cây bơng bị rất nhiều loại
côn trùng, sâu bệnh khác nhau gây hại, làm ảnh hƣởng đến năng suất cũng nhƣ chất
lƣợng bơng sợi trong nƣớc. Những lồi gây hại thƣờng thấy xuất hiện trên cây bông


là sâu (sâu xanh, sâu đo, sâu hồng, sâu loang), rầy xanh (Amrasca devastans), bọ trĩ
(Thrips tabaci) và rệp bông (Aphis gossypii).
Trong các lồi gây hại, rệp là lồi có sức tàn phá mạnh nhất cho cây bơng.
Rệp có đặc tính đẻ con, cả rệp non và trƣởng thành đều chích hút dịch cây làm cho
lá co rút lại, cây sinh trƣởng kém. Trong quá trình gây hại rệp thải ra chất mật dính
tạo điều kiện cho nấm đen phát triển đồng thời truyền virus gây bệnh xanh lùn cho
cây bông – một loại bệnh khá phổ biến và gây hại quan trọng cho cây bông ở Việt
Nam hiện nay.

Từ những năm 1984-1985, bệnh xanh lùn đƣợc phát hiện lần đầu tiên tại Nha
Hố (Ninh Thuận), nhƣng chƣa gây hại đáng kể, sau đó, tác hại của bệnh tăng dần.
Dịch bệnh đầu tiên xảy ra tại Ninh Thuận năm 1991, tại Nha Hố trên 80 ha trồng
bông bị bệnh với tỷ lệ 50-100%, gây thiệt hại trên 50% sản lƣợng bông. Năm 1993,
dịch bệnh xảy ra tại huyện Tuy Phong (Bình Thuận), 450 ha trồng bơng bị bệnh với
tỷ lệ 90-100%, nhiều nơi không thu hoạch đƣợc, thiệt hại ƣớc tính trên 80% sản
lƣợng bơng, gây ảnh hƣởng đến thu nhập của nhiều nông dân trồng bông. Trƣớc
năm 2000, bệnh thƣờng xuyên xuất hiện và gây hại nặng cho các vùng trồng bơng
nhƣ Ninh Thuận, Bình Thuận và Bình Phƣớc. Từ năm 2000 đến nay, bệnh đã xuất
hiện cả ở Đắc Lắc và Gia Lai. Năm 2001 bệnh đã gây thiệt hại lớn và làm mất hồn
tồn 14 ha bơng ở huyện Đắc Mil (Đắc Lắc), năm 2002 ở huyện Chƣ Sê (Gia Lai)
với 20 ha không cho thu hoạch… Bệnh là một trong những trở ngại chính trong việc
“tăng tốc” mở rộng diện tích và nâng cao năng suất bông của ngành bông Việt Nam.
Ở Việt Nam, nghiên cứu bệnh xanh lùn đƣợc bắt đầu từ năm 1985 tại Viện Nghiên
cứu bơng và Cây có sợi (nay là Viện Nghiên cứu Bông và Phát triển Nông nghiệp
Nha Hố). Kết quả cho thấy triệu chứng bệnh xanh lùn bông ở Việt Nam giống nhƣ
bệnh xanh lá và cuốn lá ở Châu Phi, Nam Mỹ và Thái Lan. Con đƣờng lan truyền
của bệnh trong tự nhiên cũng nhờ côn trùng môi giới là rệp bơng (Aphis gossypii)
mà việc phịng trừ, tiêu diệt chúng là không thể thực hiện đƣợc (Nguyễn
Thị Thanh Bình, 1999).
Hiện nay, việc sử dụng giống kháng là sự lựa chọn tối ƣu nhất trong công tác
quản lý bệnh cũng nhƣ giải quyết các vấn đề liên quan đến môi trƣờng do sử dụng


thuốc trừ sâu và nguồn gen kháng bền vững nhất vẫn là nguồn gen đƣợc chọn lọc tự
nhiên từ các giống kháng.
Tại Việt Nam, công tác chọn tạo giống bông năng suất cao, chất lƣợng xơ tốt,
chống chịu với sâu bệnh và điều kiện ngoại cảnh đã đạt đƣợc nhiều kết quả khả
quan. Nhiều giống bông do Viện nghiên cứu Bông và PTNN Nha Hố chọn tạo đã
đƣợc công nhận là giống quốc gia và đƣa vào phổ biến trong sản xuất, gồm có các

giống bơng lai: L18, VN20, VN35, VN15, VN01-2, VN01-4, GL03 và các giống
bông luồi: TH1, TH2, M45610, TM1, MCU9, LRA5166, D162, C118.
1.3. MỘT SỐ CHỈ THỊ ADN TRONG NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN
1.3.1. Sự đa dạng ADN
Sinh vật trên hành tinh của chúng ta rất phong phú và đa dạng, chính vì sự đa
dạng đó mà từ xa xƣa để phân biệt giữa chúng với nhau, con ngƣời đã xếp sinh vật
vào các bậc phân loại khác nhau.
Một hệ thống phân loại sinh vật truyền thống đƣợc dùng phổ biến đó là thang
phân loại 6 bậc gồm: ngành, lớp, bộ, họ, chi, loài. Thang phân loại này đƣợc xây
dựng dựa trên các tiêu chuẩn hình thái (chỉ thị hình thái), vì vậy nó vẫn chƣa mô tả
đƣợc hết sự phong phú của thế giới sinh vật nên ngƣời ta lại phải sử dụng đến các
tiêu chuẩn bổ sung để phân loại sinh vật chi tiết hơn nữa nhƣ dƣới chi, dƣới lồi…
Vì hệ thống phân loại nói trên dựa vào kết quả quan sát các đặc điểm hình thái,
chính vì vậy mà đã gặp rất nhiều khó khăn khi tiến hành phân loại sâu hơn, chi tiết
hơn nhƣ các nghiên cứu đa dạng dƣới loài, nhất là đối với giới thực vật và vi sinh
vật, trong khi đó sự phân loại dƣới lồi lại đóng vai trò rất quan trọng. Để khắc phục
hạn chế này ngƣời ta phải sử dụng chỉ thị “phi hình thái” ở dạng phân tử mà một
trong số đó là chỉ thị ADN. Khi nói đến đa dạng ADN, nghĩa là sự khác nhau ở mức
độ phân tử ADN giữa các cá thể trong cùng một loài sống ở một vùng địa lý nhất
định. Nghiên cứu đa dạng ADN thực chất cũng là phân loại nhƣng ở mức độ ADN
để xác định sự khác biệt hay giống nhau giữa hai cá thể trong cùng loài; chẳng hạn
nhƣ sự giống, khác nhau giữa các giống bơng vải trong một lồi phụ mà khơng thể
phân biệt đƣợc qua chỉ thị hình thái.
1.3.2. Chỉ thị ADN.


Chỉ thị ADN (DNA marker) bao gồm các chỉ thị RFLP, PCR…, các chỉ thị
này đƣợc dùng để phát hiện, phân tích và tổng hợp ra những đoạn ADN mới. Chỉ
thị RFLP gồm các mẫu dò (probe) là những đoạn ADN (hoặc ARN) đƣợc sử dụng
để lai với ADN của hệ gen cần phân tích. Chỉ thị PCR đƣợc phân chia thành các chỉ

thị khác nhau nhƣ: AFLP, RAPD, SSR, RGA, STS, CAPS… Mỗi chỉ thị PCR nói
trên có một loại mồi (primer) đặc trƣng, là những đoạn ADN sợi đơn có kích thƣớc
phổ biến khoảng từ 10 đến 30 nucleotide đƣợc sử dụng làm đoạn khởi đầu trong
phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để tổng hợp nhân tạo ra những đoạn ADN mới
(Lã Tuấn Nghĩa và cs., 2004)
1.3.2.1. Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
Đầu những năm 80 của thế kỷ 20, kỹ thuật RFLP ra đời và đƣợc biết đến là
loại chỉ thị mới – chỉ thị ADN thế hệ đầu tiên, với những ƣu điểm vƣợt trội so với
những chỉ thị hình thái và chỉ thị hóa sinh đang đƣợc sử dụng trong đánh giá đa
dạng di truyền lúc đó (Botstein, 1980). RFLP là một kỹ thuật nhận dạng ADN bằng
cách lai axit nucleic. Bản chất của kỹ thuật này là dựa trên sự phân cắt ADN bằng
enzym giới hạn và sự lai (liên kết) giữa các bazơ bổ sung trên hai sợi đơn axit
nucleic (sợi ADN hoặc mARN). Khi xử lý ADN bằng enzym giới hạn sẽ thu đƣợc
những mảnh ADN nhỏ hơn có kích thƣớc khác nhau, những mảnh này sau đó đƣợc
điện di và cho lai với mẫu dò, nếu chúng bổ sung với mẫu dị thì sẽ cho phản ứng lai.
Kết quả của phản ứng lai là chúng ta có thể xác định đƣợc sự đa hình giữa các mẫu
ADN khác nhau.
RFLP là chỉ thị đồng trội do có thể phát hiện đƣợc các alen khác nhau của
một locus trong hệ gen nhân, hệ gen ti thể hay hệ gen lục lạp bằng một mẫu dị đặc
hiệu, chính vì thế, kỹ thuật lai axit nucleic này cịn có ý nghĩa rất quan trọng trong
lập bản đồ gen, phân lập gen, xác định số bản sao của một gen, phân tích cấu trúc và
chức năng gen….
1.3.2.2. Chỉ thị PCR (Polymerase Chain Reaction)
PCR có nghĩa là phản ứng trùng phân hay phản ứng chuỗi polymerase. Bản
chất của PCR đó là sự tổng hợp nhân tạo tạo ra các đoạn ADN mới, với sự tham gia
của các thành phần chính gồm: ADN khn, dNTP, mồi (primer), enzym


polymerase (Taq), MgCl2 và đệm PCR; phản ứng đƣợc thực hiện trong máy chu kỳ
nhiệt, hay còn gọi là máy PCR.

Hiện nay, một số kỹ thuật nhƣ: RAPD, AFLP, Microsatelite đang đƣợc ứng
dụng khá phổ biến để phân tích genome thực vật, những kỹ thuật này có điểm giống
nhau chính là đều dựa vào nguyên lý PCR, sự khác nhau cơ bản giữa chúng đó là
mỗi kỹ thuật có một loại mồi đặc trƣng.
a) Chỉ thị RAPD (Randomly Amplified Polymorphism DNA)
RAPD có nghĩa là đa hình ADN đƣợc nhân bản ngẫu nhiên. RAPD là một kỹ
thuật xây dựng dựa trên nguyên lý PCR, với những mồi đƣợc thiết kế ngẫu nhiên
dài khoảng 10 nucleotide. Trong phản ứng, các mồi RAPD gắn ngẫu nhiên vào
ADN khn ở bất kỳ vị trí nào mà có trình tự bổ sung với nó. Phản ứng sau đó xảy
ra với sự tham gia của enzym Taq, dNTP và các thành phần khác. Về cơ bản, chỉ thị
RAPD là một chỉ thị trội, nghĩa là chỉ thị này không phân biệt đƣợc giữa những cá
thể đồng hợp tử và dị hợp tử trong quần thể F2.
RAPD là một kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện, không mất nhiều thời gian, ít
tốn kém. Kỹ thuật này rất phù hợp cho phân tích đa dạng di truyền và lập bản đồ
gen sử dụng quần thể RIL (Recombinant Inbred Line). Hạn chế lớn nhất của kỹ
thuật RAPD đó là nó rất nhạy cảm với nhiều yếu tố nhƣ: các thành phần tham gia
phản ứng và đặc biệt là nhiệt độ gắn mồi, vì yếu tố gắn mồi mà có thể có hai kết quả
khác nhau với cùng một thí nghiệm sử dụng hai máy PCR khác nhau.
b) Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)
Kỹ thuật AFLP đƣợc phát triển cũng dựa trên nguyên lý PCR để nhân bản
những đoạn ADN đã đƣợc phân cắt bởi enzym giới hạn (restriction enzyme). Điểm
cơ bản nhất của kỹ thuật này đó là sự thiết kế mồi PCR đặc trƣng. Các bƣớc chính
của kỹ thuật AFLP bao gồm: (i) phân cắt DNA đồng thời bằng hai enzyme giới hạn
tạo đầu cắt so le, sau đó gắn với các adapter oligonucleotide có trình tự đƣợc thiết
kế dựa trên trình tự nhận biết của enzyme giới hạn; (ii) cặp mồi đƣợc thiết kế bổ
sung với trình tự adapter gắn vào sẽ đƣợc sử dụng để nhân đoạn DNA giữa hai vị trí
nhận biết giới hạn; (iii) điện di phân tách sản phẩm PCR.
Do kết hợp đƣợc những đặc điểm của RFLP và RAPD nên kỹ thuật AFLP có
nhiều ƣu điểm nhƣ: đơn giản, ổn định, khả năng ứng dụng rộng. Về cơ bản, AFLP

là chỉ thị trội và vị trí nhiễm sắc thể của chúng chƣa xác định, do vậy nếu dùng chỉ
thị này để lập bản đồ gen ở quần thể F 2 thì cần phải sử dụng kết hợp với các chỉ thị
khác đã biết trƣớc vị trí nhiễm sắc thể nhƣ: RFLP hoặc Microsatelite.
c) Chỉ thị Microsatelite
Khi nghiên cứu genom của một số sinh vật ngƣời ta đã phát hiện ra những
đoạn ADN có chiều dài khác nhau phân bố một cách ngẫu nhiên mà trình tự của nó
bao gồm các nhóm nucleotide giống nhau nhắc lại nhiều lần; các nhóm này thƣờng
có số lƣợng khơng vƣợt q 5 nucleotide ví dụ nhƣ (TG) n hoặc (AAT)n. Và ở cây
bơng vải, các nhóm nucleotide đã phát hiện đƣợc gồm GA, GT, CAT, CTT. Những
đoạn ADN lặp lại nhƣ vậy đƣợc gọi là Microsatelite hay cịn có các tên khác nhƣ:
SSLPs (single sequence length polymorphism), SSRs (simple sequence repeats),
STRs (short tADNom repeats). Các đoạn ADN nhắc lại này có trình tự hai đầu rất
đặc trƣng cho mỗi đoạn; bởi vậy mà trình tự đặc trƣng ở hai đầu của đoạn nhắc lại
này đã đƣợc sử dụng để thiết kế mồi cho PCR.
Chỉ thị SSR có hai ƣu điểm lớn so với các chỉ thị ADN khác là:
- Tính đặc hiệu cao: các đoạn mồi SSR đƣợc thiết kế dựa trên vùng trình tự
sƣờn có tính bảo thủ cao của các đoạn lặp SSR, do đó sản phẩm nhân gen của phản
ứng SSR-PCR đặc hiệu và ổn định hơn các chỉ thị DNA ngẫu nhiên (RAPD). Bên
cạnh đó, nhờ tính chất bảo thủ của vùng trình tự sƣờn mà các mồi SSR có thể đƣợc
sử dụng chéo giữa các lồi có quan hệ di truyền gần gũi (Roder và cs, 1995; Lã
Tuấn Nghĩa, 2004).
- Di truyền đồng trội và mức độ đa hình cao: Trải qua tiến hóa và các biến
đổi di truyền, số lần lặp lại các motif SSR thay đổi rất nhiều và làm cho các đoạn
SSR có chiều dài khác nhau. Bởi vậy, phản ứng SSR-PCR có thể phát hiện các alen
khác nhau trong một locus SSR, qua đó phát hiện đƣợc các cá thể đồng hợp tử và dị
hợp tử ở locus đó (chỉ thị đồng trội).