BÁO cáo THÍ NGHIỆM GENOMIC PHÂN tử bài 4 ĐỊNH TÍNH BỆNH đốm TRẮNG và BỆNH còi TRÊN tôm BẰNG bộ KIT SHPT

TỔNG LIÊN ĐỒN LAO ĐỘNG VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TƠN ĐỨC THẮNG
KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM GENOMIC PHÂN TỬ

BÀI 4: ĐỊNH TÍNH BỆNH ĐỐM TRẮNG
VÀ BỆNH CỊI TRÊN TƠM BẰNG BỘ
KIT SHPT
Người hướng dẫn: TS PHẠM ĐÌNH CHƯƠNG
Người thực hiện: NGUYỄN HƯƠNG TRÀ - 61503034
THÁI NHẬT ANH - 61800913
ĐỖ THỊ BÍCH NHIÊN - 61800979
VÕ KHÁNH ÂN - 61800912
HUỲNH THỊ MINH THƯ – 61800999
Nhóm :

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2020

C7-N2


MỤC LỤC
I.

Tổng quan:........................................................................................................1
1.1

Bệnh đốm trắng WSSV(White Spot Syndrome Virus):..............................1

1.2

Bệnh còi MBV( Monodon Baculo Virus):..................................................1

1.3

Phương pháp Mutiplex PCR.......................................................................1

II. Vật liệu, phương pháp:....................................................................................2
2.1

Thiết bị........................................................................................................2

2.2

Hoá chất......................................................................................................2

2.2.1

Bộ Kit tách chiết genome vi khuẩn:.....................................................2

2.2.2

Bộ Kit PCR..........................................................................................3

2.2.3

Bộ Kit điện di......................................................................................3

2.3

Phương pháp:..............................................................................................3

2.3.1

Thu và bảo quản mẫu:.........................................................................3

2.3.2

Tách chiết DNA...................................................................................4

2.3.3

Thực hiện phản ứng PCR....................................................................4

2.3.4

Chạy điện di kết quả............................................................................5

III. Kết quả biện luận:............................................................................................7
3.1

Kết quả chạy điện di...................................................................................7

3.2

Biện luận, kiến nghị....................................................................................7


1

I.

Tổng quan:
I.1 Bệnh đốm trắng WSSV(White Spot Syndrome Virus):

Virus đốm trắng (WSSV) là tác nhân gây bệnh đốm trắng ở tôm nước mặn và tôm
nước ngọt.
Tôm bị bệnh đốm trắng (WSSV) thường có những triệu chứng ban đầu như bơi trên
mặt nước, tập trung thành từng đàn quanh bờ ao và sẽ chết hàng loạt trong vòng từ
5 -7 ngày sau đó với những dấu hiệu trên cơ thể như đốm trắng, rụng râu, thân có
màu đỏ và trong ruột trống rỗng.
I.2 Bệnh còi MBV( Monodon Baculo Virus):
Tác nhân gây bệnh MBV (Monodon Baculovirus) là virus type A Baculovirus
monodon, cấu trúc nhân (acid nucleoic) là ds ADN, có lớp vỏ bao, dạng hình que.
Khi tơm mới nhiễm virus MBV, dấu hiệu bệnh không biểu hiện rõ rμng. Khi tôm
nhiễm bệnh nặng và phát bệnh thường có biểu hiện một số dấu hiệu sau:
- Tơm có màu tối hoặc xanh tái, xanh xẫm. Tôm kém ăn, hoạt động yếu và sinh
trưởng chậm (chậm lớn).
- Các phần phụ và vỏ kitin có hiện tượng hoại tử, có nhiều sinh vật bám (ký sinh
trùng đơn bào, tảo bám và vi khuẩn dạng sợi).
- Gan tuỵ teo lại có mμu trắng hơi vùng, thối rất nhanh.
- Tỷ lệ chết dồn tích, cao tới 70% hoặc có thể tơm chết hầu hết trong ao.
I.3 Phương pháp Mutiplex PCR
Multiplex PCR là một phương pháp sinh học phân tử phổ biến nhằm khuếch đại
nhiều trình tự ADN chỉ trong một phản ứng PCR. Trong quá trình phân tích PCR đa
mồi, nhiều trình tự sẽ được khuếch đại cùng lúc sử dụng nhiều cặp mồi, tất cả các
thành phần được bổ sung vào cùng một ống phản ứng. Như một phương pháp cải


2

tiến của phản ứng PCR thông thường, phương pháp này giúp rút ngắn thời gian thực
hiện mà lại không ảnh hưởng tới kết quả thí nghiệm.

II.

Vật liệu, phương pháp:
II.1Thiết bị
- Máy vortex
- Máy ly tâm eppendorf
- Máy PCR
- Máy điện di + đèn UV
- Bộ kit định tính bệnh trên Tôm
- Bể điều nhiệt
- Erlen 250ml (dùng để tăng sinh mẫu)
- Becher 100ml
- Micropipette 100-1000μl, 10-100μl, 0.5-10μl
- Eppendorf 1,5 ml – đã hấp khử trùng
- Eppendorf 0,2 ml – đã hấp khử trùng
- Đầu tip (trắng, vàng, xanh) – đã hấp khử trùng
II.2Hoá chất
II.2.1 Bộ Kit tách chiết genome vi khuẩn:
 Solution 1: Dung dịch ly trích Alkaline I:
- 50 mM Glucose: duy trì độ thẩm thấu
- 25 mM Tris-HCl (pH 8): Làm thành tế bào vi khuẩn yếu đi
- 10 mM EDTA (pH 8): Ức chế DNAses
- 100 μg/ml RNase A: Phân hủy RNA
 Solution 2: Binding buffer : Gel solubilization buffer:
- 6 M Guanidine Thiocyante
- 50 mM Tris-HCl

- pH 7,5 20 mM
- EDTA pH 8,0
 Solution 3: Washing buffer
- 100 mM NaCl
- 1 mM EDTA pH 8,0
- 10 mM Tris-HCl pH 8.0 50% Ethanol


3




-

Rửa tạp chất trong quá trình tinh sạch DNA từ gel agarose
Solution 4: Elution buffer: TE (pH 8)
10 mM Tris–HCl
1 mM EDTA
Hòa tan và bảo vệ DNA hoặc RNA khỏi sự phân cắt.
Ethanol 70%
II.2.2 Bộ Kit PCR
E.coli PCR mix
Chứng dương E.coli
Chứng âm
II.2.3 Bộ Kit điện di
Thang DNA 100bp:
6X GelRed Loading Buffer
Tae 50X
Agarose:

-

II.3Phương pháp:
II.3.1 Thu và bảo quản mẫu:
Đối với tôm thương phẩm: lấy mang, chân bơi, gan tuỵ, bao tử, đường ruột

-

(lượng mẫu không quá 0.5g)
Đối với tôm bố mẹ: lấy mẫu phân hoặc một phần gốc chân bơi (lượng mẫu

-

khơng q 0.5g)
Mẫu phải được lấy khi tơm cịn sống và được bảo quản ngay trong cồn 96%

-

nếu chưa tách chiết ngay
Thế tichs cồn hơn 3 lần thể tích mẫu. Sau khi cố định, mẫu giữ ở nhiêtj độ

-

-20
-

II.3.2 Tách chiết DNA
Cân một lượng mẫu không quá 0.5g cho vào tube 1.5mL. Thêm vào 250 L

-

Solution 1. Nghiền mẫu thịt bằng chày nghiền mẫu
Cho thêm 250L Solution 2 vào, tiếp tục nghiền đến khi mẫu đồng nhất hoàn

-

toàn
Thêm 500L Solution 3( đã bổ sung Ethanol), vortex đều.


4

-

Ly tâm tốc độ 8000rpm trong 1 phút và chuyển 500L dịch nổi sang cột
silica đặt sẵn trong tube 2mL. Ly tâm ở tốc độ 8000 rpm trong 1 phút. Giữ lại

-

cột và loại bỏ phần chất lỏng bên dưới
Đặt lại cột vào tube 2mL cũ. Rửa với 500L Solution 3 và ly tâm tốc độ

-

8000rpm trong 1 phút. Giữ lại cột và loại bỏ phần chất lỏng bên dưới
Chú ý: Rửa thêm 1 lần nữa để tăng độ tinh sạch.
Làm khô cột bằng ly tâm 8000rpm trong 1 phút
Chuyển cột sang tube 1.5mL. Thêm 50L Solution 4 và ủ ở nhiệt độ phòng 2
phút. Ly tâm ở tốc độ 8000rpm trong 2 phút, thu phần dịch chứa DNA bên

-

dưới
Lưu trữ ở -20°C
II.3.3 Thực hiện phản ứng PCR
Rã đông ống WSSV/MBV PCR Mix, trộn đều, sau đó spindown để tồn bộ

chất lỏng đi xuống đáy
- Hút mẫu:
 Mẫu 1: Chứng dương PCR :
Hút 20L PCR mix + 5L chứng dương E.coli
 Mẫu 2: Chứng âm PCR:
Hút 20L PCR mix + 5L nước cất PCR
 Mẫu 3: Chứng âm tách chiết:
Hút 20L PCR mix + 5L chứng âm tách chiết
 Mẫu 4: PCR mẫu:
Hút 20L PCR mix +5L DNA mẫu


5

-

Đóng nắp PCR và spindown để chất lỏng di chuyển xuống đáy trước khi đặt

-

vào máy
Set chu trình nhiệt:

1 chu kỳ - 95 oC – 3 phút
45 chu kỳ - 95 oC – 10 phút
60 oC - 20 giây
72 oC - 40 giây
1 chu kỳ - 72 oC - 3 phút
-4 – vô cực
II.3.4 Chạy điện di kết quả
Bảng 1: Pha DNA ladder
Nồng độ mẹ

Nồng độ con

V hút

2L

2L

2L

6L

1L

1L

Nước cất

To 6L

3L

Total

6L

6L

DNA ladder
Gel Red loading
dye

Bảng 2: Pha mẫu chạy điện di


6

Gel Red loading
V hút
dye
Chứng âm PCR

10L

2L

10L

2L

10L

2L

10L

2L

Chứng âm tách
chiết
PCR mẫu
Chứng dương
PCR


7


8

III.






-

Kết quả biện luận:

III.1
Kết quả chạy điện di

M(Marker): Ladder (5 µL) dài 1000 bp
Lane 1:Chứng âm tách chiết ( 7µL)
Lane 2:Chứng âm PCR (7 µL)
Lane 3:Mẫu (7 µL)
Lane 4:Chứng dương (1 µL)
III.2
Biện luận, kiến nghị
III.2.1 Biện luận kết quả:
Kết quả dự kiến:
+ Mẫu dương tính với WSSV: xuất hiện băng kích thước 526bp (giữa vạch
500bp và 600bp), nằm trên cùng
+ Mẫu dương tính với MBV: xuất hiện băng với kích thước 200bp (giữa
vạch 100 và 200)
+ Chứng nội xuất hiện băng với kích thước 102bp
+ Vạch mờ phía dưới vạch 100bp là vạch mồi còn thừa lại sau phản ứng
+ Trong chứng dương bao gồm sẵn DNA tôm, MSSV và MBV
STT

WSSV

MBV

IC

Kết luận

9

(526bp)

(200bp)

(102bp)

+

+

-/+

1

Mẫu dương tính cả WSSV/
MBV

2

+

-

+

Mẫu dương tính WSSV

3

-

+

+

Mẫu dương tính MBV

4

-

-

+

Mẫu âm tính

5

-

-

-

Khơng thể kết luận

- Kết quả dựa vào chạy điện di

+ Chứng âm PCR, chứng âm tách chiết, mẫu và chứng dương đều xuất hiện
vạch ở 102bp – có chứng nội
+ Mẫu khơng có vạch ở 526bp và 200bp
 Kết luận: mẫu âm tính với cả WSSV/ MBV
III.2.2 Sự cố xảy ra và cách khắc phục
Sự cố

Nguyên nhân

Khắc phục

Khơng xuất hiện vạch Cài đặt sai chương trình Kiểm tra lại chương trình
nào ở tất cả các giếng, kể PCR
cả chứng dương

Thiết bị PCR gặp sự cố
Hoá chất của kit không

chạy PCR
Kiểm tra lại hoạt động
của thiết bị PCR

được bảo quản đúng chỉ Kiểm tra lại điều kiện
định

bảo quản và hạn chế sử
dụng của kit

Chứng

dương

bình Hàm lượng DNA thu Pha loãng 10 lần dịch

thường mẫu xét nghiệm được quá cao
không cho vạch DNA, kể

DNA và thực hiện lại


10

cả vạch của chứng nội

Có chất ức chế trong mẫu phản ứng PCR
Bổ sung một lượng nhỏ
chứng dương mục tiêu
vào mẫu tách chiết. Nếu
kết quả vẫn âm tính thì
kết luận có chất ức chế
trong mẫu. Tiến hành
tách chiết lại hoặc xử lý
như cách 1

Xuất hiện vạch DNA Micropippet

bị

nhiễm Vệ

sinh

hoặc

trong chứng âm, chứng DNA mục tiêu hoặc sản Micropippet
âm tách chiết

phẩm PCR

mới,

thay
sử

dụng filter tip

Mơi trường lồm việc bị Sử dụng hố chất PCR
nhiễm DNA

khác
Yêu cầu bộ phận kĩ thuật
đến vệ sinh môi trường
làm việc


11