Xây dựng lý thuyết và thực nghiệm nhằm định danh một số loài nấm thuộc chi nấm ký sinh côn trùng bằng sinh học phân tử kết hợp sinh tin học nghiên cứu khoa học

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN
THAM GIA XÉT GIẢI THƯỞNG SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

X

D NG L THU ẾT VÀ TH C NGHI M

NH M Đ NH DANH M T SỐ LOÀI NẤM THU C CHI
NẤM K SINH C N TR NG B NG SINH HỌC PH N
T

KẾT H P SINH – TIN HỌC

Thuộc nhóm ngành khoa học: Vi sinh – Sinh học phân tử

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 4 năm 2014.


TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN
THAM GIA XÉT GIẢI THƯỞNG SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

X

D NG L THU ẾT VÀ TH C NGHI M

NH M Đ NH DANH M T SỐ LOÀI NẤM THU C CHI
NẤM K SINH C N TR NG B NG SINH HỌC PH N
T

KẾT H P SINH – TIN HỌC

Thuộc nhóm ngành khoa học: Vi sinh – Sinh học phân tử
Sinh viên thực hiện:

Nguyễn Thị Hải Ngọc

Nam, Nữ: Nữ

Tr

Nam, Nữ: Nữ

ng Thị

ch Vân

Hu nh Thảo Trân

Nam, Nữ: Nữ

Ph m Xuân Xinh

Nam, Nữ: Nữ

Trịnh Hồng Ln

Nam, Nữ: Nam

Dân tộc: Kinh
Lớp, khoa: Cơng Nghệ Sinh Học

Năm thứ: 4 /Số năm đào t o:4

Ngành học: Công Nghệ Sinh Học
Giảng viên h ớng dẫn: ThS. Lao Đức Thuận

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 4 năm 2014.


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, chúng tôi xin gửi lời cám n chân thành nhất đến những ng ời
thầy, những ng ời b n đã luôn ở bên, truyền cho chúng tôi niềm đam mê nghiên cứu
khoa học và cho những lời khun bổ ích để nhóm nghiên cứu có thể vững b ớc h n
trên con đ ờng mà mình đang b ớc đi.
Chúng tơi xin gửi lời tri ân sâu sắc đến cô PGS. TS. Lê Huyền Ái Thúy và
ThS. Lao Đức Thuận đã tận tình h ớng dẫn, giúp đỡ, truyền đ t kinh nghiệm và kiến
thức quý báu trong suốt thời gian phụ việc t i phịng thí nghiệm Sinh học phân tử để
hồn thành đề tài sinh viên nghiên cứu khoa học.
Cảm n các b n trong nhóm đề tài và tất cả các b n phụ việc trong phịng thí
nghiệm Sinh học phân tử đã nhiệt tình giúp đỡ, động viên chúng tơi trong những lúc
khó khăn trong thời gian thực hiện đề tài.
Chúng tôi xin gửi lời cám n đến các bậc sinh thành đã có cơng sinh thành và
d ỡng dục, ln t o mọi điều kiện tốt nhất trong quá trình chúng tơi thực hiện đề tài.

ình D

ng, ngày 07 tháng 04 năm 2014


Danh mục bảng biểu
Bảng 2. 1. ảng các m i sử dụng trong thực nghiệm ................................................. 31
Bảng 2. 2. Các thông số thiết lập cho chu k nhiệt trong phản ứng PCR để khuếch đ i
các v ng gen nrSSU, nrLSU, Rpb1, Tef1, Rpb2, Tub, Atp6 trong thực nghiệm nh sau:
.................................................................................................................................. 33
Bảng 3 1 .Thơng tin về trình tự và các thông số đánh giá c a các m i nh m khuếch đ i
các v ng gen mục tiêu đ ợc trình bày d ới đây: ........................................................ 38
Bảng 3 2. Kết quả kiểm tra DNA b ng mật độ quang phổ kế các mẫu nấm tách chiết có
bổ sung β-mercaptoethanol. ....................................................................................... 49
Bảng 3 3. Kết quả tổng hợp thiết lập chu k nhiệt PCR khuếch đ i các v ng gen
nrSSU, nrLSU, Rpb1, Rpb2, Tef1, Tub, Atp6 c a các mẫu nấm ký sinh côn tr ng. ..... 54
Bảng 3 4: Kết quả so sánh trình tự nrSSU, nrLSU, Rpb1, Tef1 đã hiệu ch nh với các
trình tự trên Gen ank ................................................................................................ 61
Bảng 3. 5: NGU N G C CÁC TR NH T

DN Đ

CS

D NG L M TH M

CHI U TRONG Đ T I T N KHO H C, NG N H NG GI NG, M S
C P TR N GEN

TRUY

NK .......................................................................................... 62

Bảng 3.6: Tổng hợp kết quả định danh các mẫu nấm t dữ liệu phân tử ..................... 77


Danh mục hình ảnh
Hình 1. 1: Cordyceps sinensis ngu n:http: medicinalmushroominfo.com ................ 5
Hình 1. 2: Cấu trúc hóa học c a cordycepin ................................................................. 7
Hình 1. 3: Cấu trúc gen và vị trí m i NS1 NS4 khuyếch đ i v ng gen nrSSU ............ 13
Hình 1. 4: S đ vị trí các v ng domain thuộc trình tự LSU. ...................................... 14
Hình 1. 5: Chức năng c a v ng CTD thuộc gen Rpb1 ................................................ 15
Hình 1. 6: Cấu trúc và c p m i khuyếch đ i gen Rpb2 ............................................... 15
Hình 1. 7: cấu trúc và c p m i khuyếch đ i gen Tef1 ................................................. 16
Hình 1. 8: Cấu trúc gen và m i khuyếch đ i gen Tub ................................................. 17
Hình 3. 1. Kết quả kiểm tra m i b ng last trên Gen ank ......................................... 40
Hình 3. 2. Kết quả sắp giống cột c a m i xuôi NS1 và trình tự gen nrSSU ............... 40
Hình 3. 3. Kết quả sắp gióng cột c a m i ng ợc NS4 và trình tự gen nrSSU............. 40
Hình 3. 4. Kết quả kiểm tra m i b ng last trên Gen ank ......................................... 41
Hình 3. 5. Kết quả sắp giống cột c a m i xi LR05 và trình tự gen nrLSU .............. 41
Hình 3. 6. Kết quả sắp gióng cột c a m i ng ợc LR5 và trình tự gen nrLSU ............. 41
Hình 3. 7. Kết quả kiểm tra m i b ng last trên Gen ank ......................................... 42
Hình 3. 8. Kết quả sắp gióng cột c a m i xi 983F và trình tự gen Tef1................... 42
Hình 3. 9. Kết quả sắp gióng cột c a m i ng ợc 2218R và trình tự gen Tef1 ............ 42
Hình 3. 10.Kết quả kiểm tra m i b ng last trên Gen ank ........................................ 43
Hình 3. 11. Kết quả sắp giống cột c a m i xuôi CRP 1 và trình tự gen Rpb1 ........... 43
Hình 3. 12. Kết quả sắp giống cột c a m i ng ợc RP 1Cr và trình tự gen Rpb1 ....... 43
Hình 3. 13. Kết quả kiểm tra m i b ng last trên Gen ank ....................................... 44
Hình 3. 14. Kết quả sắp giống cột c a m i xi fRPB2-5F và trình tự gen Rpb2 ....... 44
Hình 3. 15. Kết quả sắp giống cột c a m i ng ợc fRPB2-7cR và trình tự gen Rpb2 . 45

Hình 3. 16. Kết quả kiểm tra m i b ng last trên Gen ank ....................................... 45


Hình 3. 17. Kết quả sắp giống cột c a m i xi T12 và trình tự gen Tub ................... 45
Hình 3. 18. Kết quả sắp gióng cột c a m i ng ợc T22 và trình tự genTub ............... 45
Hình 3. 19. Kết quả kiểm tra m i b ng last trên Gen ank ....................................... 46
Hình 3. 20. Kết quả sắp giống cột c a m i xuôi TP6-c1 và trình tự genAtp6 ........ 46
Hình 3. 21. Kết quả sắp gióng cột c a m i ng ợc ATP6- c2

và trình tự genAtp6 ... 46

Hình 3. 22. Kết quả điện di sản phẩm hai c p m i NS1 NS4, LR0R LR5 tách chiết
theo ph

ng pháp phenol: chloroform. ...................................................................... 48

Hình 3. 23. Kết quả điện di sản phẩm hai c p m i NS1 NS4, LR0R LR5 tách chiết
theo ph

ng pháp phenol: chloroform bổ sung β-mercaptoethanol. ........................... 48

Hình 3. 24. Kết quả điện di sản phẩm hai c p m i NS1/NS4, LR0R/LR5 bổ sung βmercaptoethanol, và tối u hóa nhiệt độ. .................................................................... 50
Hình 3. 25. Kết quả điện di c a sản phẩm PCR t c p m i 983F/2218R,
Crpb1/Rpb1Cr ........................................................................................................... 51
Hình 3. 26. Kết quả điện di sản phẩm PCR hai m i 983F/2218R, Crpb1/Rpb1Cr ở các
nhiệt độ khác nhau ..................................................................................................... 51
Hình 3. 27. Kết quả điện di sản phẩm PCR với hai c p m i fRpb2-5F/fRpb2-7cR và
T12/T22 ....................................................................................................................... 52
Hình 3. 28. Kết quả điện di sản phẩm PCR với c p m i ATP6-c1A/ATP6-c2A khuếch
đ i v ng gen atp6 ....................................................................................................... 53

Hình 3. 29. Kết quả điện di sản phẩm PCR c a hai mẫu DL0015, DL0075 với bốn c p
m i nrSSU, nrLSU, Tef1, Rpb1đã tối u hóa quy trình. .............................................. 56
Hình 3. 30. Hiệu ch nh tín hiệu nhiễu ở đầu m ch xi c a LSU ............................... 57
Hình 3. 31. Vị trí sai lệch c a hai kết quả giải trình tự ở đầu m ch xi c a LSU....... 57
Hình 3. 32. Hiệu ch nh ở v ng giữa trên 2 m ch LSU ................................................ 58
Hình 3. 33. Hiệu ch nh v ng 3, v ng 4 trên m ch xuôi LSU....................................... 59
Hình 3. 34. Hiệu ch nh v ng cuối mach xi LSU ..................................................... 59
Hình 3. 35. Hiệu ch nh v ng cuối trên m ch xuôi c a LSU ........................................ 59


Hình 3. 36. Hình kết quả last trình tự LSU m ch xi đã hiệu ch nh ........................ 60
Hình 3. 37. Kiểm tra mức độ t

ng đ ng b ng công cụ Dot plot ............................... 60


Danh mục những chữ viết tắt

ATP

: Adenosine triphosphate

BLAST

: Basic Local Alignment Search Tool

bp

: base-pair

DNA

: deoxyribonucleotide triphosphate

ETS

: external transcribed spacer

IGS

: intergenic spacer

ITS

: internal transcribed spacer

LSU

: large subunit

ML

: maximum likelihood

MP

: maximum parsimony

NJ

: neighbor-joining

nu

: nucleotide

rDNA

: ribosomal DNA

RNA

: ribosomal RNA

rRNA

: ribosomal RNA

SSU

: small subunit


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ...................................................................................... 3
1. N M K

SINH C N TR NG ......................................................................... 4

1.1.

Đ c điểm chung và thành phần loài ............................................................. 4

1.2.

Tiềm năng ứng dụng.................................................................................... 6

2. NGHI N C U Đ NH D NH V PHÁT SINH LO I ...................................... 9
2.1.

Đ c điểm nhận d ng và định danh ............................................................... 9

2.2.

Định danh phân tử ..................................................................................... 10

2.3.

Nhóm gen giữ nhà house-keeping gene trong định danh phân tử các loài

nấm . ................................................................................................................. 11
3. T NH H NH NGHI N C U TRONG N

C ................................................. 17

4. PH H PH N T ......................................................................................... 18
4.1.

Phả hệ phân tử trong nghiên cứu phát sinh loài .......................................... 18

4.2.

Những b ớc c bản trong nghiên cứu phát sinh ch ng loài........................ 18

5. K THU T PCR V GI I TR NH T

T

Đ NG ....................................... 23

5.1.

K thuật PCR ............................................................................................ 23

5.2.

Giải trình tự tự động .................................................................................. 24

CHƯƠNG 2: V T LI U – PHƯƠNG PHÁP ....................................................... 25
1. TH I GI N V Đ

ĐI M NGHI N C U .................................................. 26

2. V T LI U V PH

NG PHÁP NGHI N C U ........................................... 26

2.1.

ộ mẫu nấm ký sinh côn tr ng .................................................................. 26

2.2.

Dung cụ – thiết bị – hóa chất ..................................................................... 26

2.3.

Danh mục các phần mềm sử dụng ............................................................. 28

3. TI N TR NH NGHI N C U .......................................................................... 28
3.1.

Thu thập mẫu ............................................................................................ 29


3.2.

Tách chiết DN tổng số t hệ sợi nấm ký sinh cơn tr ng .......................... 29

3.3.

PCR........................................................................................................... 31

3.4.

Xác định trình tự đã khuyếch đ i ............................................................... 34

3.5.

Hiệu ch nh trình tự .................................................................................... 34

3.6.

So sánh với c sở dữ liệu Genbank ............................................................ 35

3.7.

Xây dựng bộ c sở dữ liệu DN ............................................................... 35

3.8.

Dò tìm mơ hình tiến hóa ............................................................................ 35

3.9.

Xây dựng cây phát sinh loài ...................................................................... 35

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LU N .......................................................... 37
1. K T QU ĐÁNH GIÁ M I ........................................................................... 38
1.1.

Đánh giá m i trên IDT .............................................................................. 38

1.2.

Kết quả kiểm tra m i b ng BLAST c a 7 gen............................................ 40

2. X Y D NG QUY TR NH TH C NGHI M NH M KHU CH Đ I V NG
GEN nrSSU, nrLSU, Rpb1, Tef1, RPb2, Tub, Atp6 CHO CÁC M U N M K

SINH C N TR NG............................................................................................... 47
3. K T QU HI U CH NH TR NH T ............................................................. 56
4. K T QU SO SÁNH V I C S D
5. X Y D NG

D

LI U TR NH T

LI U GEN

NK .............................. 61

nrSSU, nrLSU, Rpb1, Rpb2, Tef1, Tub,

Atp6 ........................................................................................................................ 62
6. K T QU X Y D NG C Y PHÁT SINH LO I ......................................... 66
CHƯƠNG 4. KẾT LU N VÀ ĐỀ NGH ............................................................... 79
TÀI LI U THAM KHẢO ....................................................................................... 81
PHỤ LỤC ................................................................................................................. 84


Đề tài SVNCKH cấp trường năm học 2013-2014

ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong những năm gần đây, nhiều loài nấm thuộc chi nấm ký sinh côn tr ng đã
đ ợc rất nhiều nhà khoa học ở khắp n i quan tâm nghiên cứu. Đây là chi nấm quý
hiếm có nhiều ứng dụng trong nhiều l nh vực nh y d ợc, kiểm soát sinh học. Ngay t
năm 1878, nhà vi khuẩn học ng ời

nh Miles Joseph erkeley đã công bố về nấm ký

sinh côn tr ng Cordyceps sinensis đông tr ng h thảo . Đây là một lo i nấm d ợc liệu
quý hiếm, đ ợc đánh giá cao và có ảnh h ởng sâu rộng đối với nền y học Trung Quốc
trong nhiều thế k . Cordyceps sinensis có ho t tính chống phát triển tế bào khối u,
chống oxi hóa và kích thích sự đáp ứng miễn dịch c a c thể, nhờ đó chữa trị đ ợc
nhiều bệnh liên quan đến thận, huyết áp, tim m ch, miễn dịch, nội tiết tố, ung th …
Gần đây, nhiều nghiên cứu cho thấy khơng ch có Cordyceps sinensis mà nhiều lồi
khác trong chi Cordyceps và các chi họ hàng Isaria, Metarcordyceps cũng mang l i
những tiềm năng ứng dụng cao trong y d ợc.
Tr ớc đây, việc định danh và xây dựng hệ thống phân lo i học các loài nấm này
ch yếu dựa trên phân tích hình thái giải phẫu. Tuy nhiên, cơng tác định danh nấm dựa
vào hình thái đến nay vẫn ch a xây dựng đ ợc một hệ thống phân lo i chính xác cho
các lồi thuộc chi nấm này. Trong thực tế, việc định danh nấm b ng hình thái g p
nhiều khó khăn là do nấm ký sinh cơn tr ng là chi nấm lớn có thành phần lồi vơ c ng
phong phú và có khả năng biến đổi cao theo điều kiện môi tr ờng. M t khác, chúng
luôn t n t i d ng l ỡng danh: thể vơ tính anamorph và thể hữu tính teleomorph .
ởi vậy, để giải quyết những khó khăn này, rất nhiều nhà nghiên cứu đã cố gắng tìm
kiếm một ph

ng pháp mới giúp định danh chính xác lồi và xây dựng hệ thống phát

sinh ch ng lo i c a nhóm nấm này. Hiện nay, nghiên cứu định danh phân tử kết hợp
với Tin – Sinh học là xu h ớng mới, giúp giải quyết các vấn đề mà định danh hình thái
vẫn ch a làm r .
Trong nghiên cứu này chúng tôi h ớng tới xây dựng lý thuyết và thực nghiệm
nh m định danh một số lồi nấm thuộc chi nấm ký sinh cơn tr ng b ng ph
sinh học phân tử kết hợp sinh tin học.

ng pháp

ớc đầu, chúng tôi tiến hành khảo sát in-silico:

thu đ ợc c sở dữ liệu cục bộ c a 7 v ng gen mục tiêu nrSSU, nrLSU, Tef1, Rpb1,
1


Đề tài SVNCKH cấp trường năm học 2013-2014
Rpb2, Atp6. Sau đó chúng tơi tiến hành thực nghiệm xây dựng quy trình tách chiết
DNA t hệ sợi nấm, tối u hóa chu trình PCR để khuếch đ i 7 v ng gen mục tiêu, giải
trình tự, xây dựng và so sánh các cây phả hệ phân tử t c sở dữ liệu trình tự thu thập
đ ợc. Quy trình này nh m h trợ định danh chính xác h n ph

ng pháp quan sát hình

thái một số lồi nấm ký sinh côn tr ng. Chúng tôi hy vọng đề tài định danh b ng cây
phả hệ dựa vào nhiều v ng trình tự này s góp phần xây dựng một quy trình định danh
nấm tin cậy, làm c sở cho các nghiên cứu ứng dụng ở Việt Nam.

ên c nh đó cịn

cung cấp cái nhìn tổng quan giúp đánh giá khả năng phân biệt lồi c a các trình tự
nrSSU, nrLSU, Tef1, Rpb1, Rpb2, Tub, Atp6 làm tiền đề cho nghiên cứu hiệu quả các
lồi nấm ký sinh cơn tr ng có giá trị cao và nghiên cứu ứng dụng định danh phân tử
cho nhiều loài nấm quý khác.

2


Đề tài SVNCKH cấp trường năm học 2013-2014013-2014

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

3


Đề tài SVNCKH cấp trường năm học 2013-2014
1. NẤM K SINH C N TR NG
1.1.

Đ c iểm chung và thành ph n oài
Cordyceps là một chi nấm ký sinh trên côn tr ng Kobayashi,1982, Spatafora,

Blackwell, 1993) thuộc họ Clavicipitaceae, bộ Hypocreales, lớp Pyrenomycetes, ngành
nấm túi scomycota. Chi Cordyceps xuất phát t tiếng Latin, “cord” = “ch y”, “ceps”
= “đầu” đã mơ tả đúng đ c điểm hình d ng trong tự nhiên c a nấm có hình giống nh
gậy đánh khúc qn cầu, đầu có d ng hình ch y. Điểm nổi bật c a nấm ký sinh côn
tr ng là những giá trị y d ợc độc đáo và quý hiếm với loài đ ợc biết đến đầu tiên là
Cordyceps sinensis, sống ký sinh trên ấu tr ng c a các loài sâu thuộc chi Thitarodes
đ c biệt là Thitarodes armoricanus; Thitarodes baimaensis có tên gọi thơng th ờng là
“Đông Tr ng H Thảo”[1]. Giá trị y d ợc c a lo i nấm này đã đ ợc ghi nhận h n
2000 năm qua ở Trung Quốc và ph

ng Đông nh ng mới đ ợc giới khoa học ph

ng

Tây biết đến t năm 1726, khi đ ợc giới thiệu trong một hội nghị khoa học t i Paris
[1]. Cordyceps là đơng d ợc có giá trị cao, đ ợc ứng dụng nhiều trong y d ợc, có ho t
tính chống phát triển tế bào khối u, chống oxi hóa và kích thích sự đáp ứng miễn dịch

c a c thể, nhờ đó chữa trị đ ợc nhiều bệnh liên quan đến thận, huyết áp, tim m ch,
miễn dịch, nội tiết tố, ung th … Gần đây, nhiều nghiên cứu cho thấy khơng ch có
Cordyceps sinensis mà nhiều lồi khác trong chi Cordyceps và các chi họ hàng cũng
mang l i những tiềm năng ứng dụng cao trong y d ợc.
Trong tự nhiên, Cordyceps sinh sôi nảy nở tốt trong các khu r ng ôn đới và
nhiệt đới ẩm ớt. Chúng th ờng sống ký sinh trên ấu tr ng và cả trên cá thể tr ởng
thành c a nhiều lồi cơn tr ng khác nhau. Sau khi xâm nhập vào c thể côn tr ng, bào
tử nấm s nảy mầm và phát triển thành hệ sợi nấm. Hệ sợi nấm s xâm chiếm và thay
thế các mô vật ch và s hình thành quả thể khi g p điều kiện thích hợp (Liu et al.,
1998). Do vậy, quả thể c a Cordyceps th ờng đ ợc tìm thấy trên xác nhộng ho c ấu
tr ng c a côn tr ng sau một thời gian nhiễm nấm. Quả thể nấm có d ng hình trụ, có
thể phân nhánh hay có hình d ng phức t p. Chi nấm này và một vài các chi họ hàng
phân bố nhiều ở Châu Á, đ c biệt là v ng Đơng Á, ngồi ra cịn có ở Châu Úc và một
số n ớc Châu

u. Cordyceps trong tự nhiên rất khó tìm vì chúng ch đ ợc tìm thấy ở
4


Đề tài SVNCKH cấp trường năm học 2013-2014
độ cao t 4000-5000m so với m t n ớc biển trên các cao nguyên Himalaya, Tây T ng,
Tứ Xuyên, Thanh Hải, Cam Túc, Vân Nam… Đây cũng là một chi nấm có thành phần
loài phong phú với h n 400 loài Cordyceps đã đ ợc miêu tả [2].

Hình 1. 1: Cordyceps sinensis
ngu n:http: medicinalmushroominfo.com
Gần đây đa số các nấm ký sinh ở động vật chân đốt c a bộ Hypocreales đều
đ ợc xếp vào chi Cordyceps thuộc họ Clavicipitaceae (Spatafora, Blackwell, 1993).
Phân lo i này dựa trên các đ c điểm: thể túi d ng trụ, đ nh túi dày và các bào tử túi
d ng sợi th ờng có thể ngắt rời thành nhiều bào tử thứ cấp Sung et al., 2007 . Nghiên

cứu phát sinh loài gần đây dựa vào các v ng trình tự c a 5-7 gen đã bác bỏ Cordyceps
và Clavicipitaceae là hai đ n ngành monophyly . Năm 2007, Sung và cộng sự đã sắp
xếp l i hệ thống nhóm nấm Cordyceps và Clavicipitaceae, kết quả phân lo i thành ba
họ đ n ngành: Clavicipitaceae s.s.
(Clavicipitaceae lớp

Clavicipitaceae lớp A), Cordycipitaceae

và Ophiocordycipitaceae Clavicipitaceae lớp C) (Sung et al.,

2007a, 2007b, Spatafora et al., 2007).
Việc phân lo i phát sinh loài hiện t i c a nấm Hypocreleales (Sung et al., 2007)
nh sau:
Clavicipitaceae s.s: Conoideocrella, Hypocrella, Metacordyceps, Moelleriella,
Orbiocrella, Regiocrella, Samuelsia, Shimizuomyces, Villosiclava, …
5


Đề tài SVNCKH cấp trường năm học 2013-2014
Ophiocordycipitaceae: Cordyceps s.l., Elaphocordyceps, Ophiocordyceps,…
Cordycipitaceae: scopolyporus, Cordyceps, Hyperdermium, Torrubiella, …
Chi Cordyceps s.l (Clavicipitaceae, Hypocreales, Ascomycota) gần đây đã đ ợc
chia thành 3 họ và 4 chi là: Metacordyceps (Clavicipitaceae), Elaphocordyceps
(Ophiocordycipitaceae),

Ophiocordyceps

(Ophiocordycipitaceae),

Cordyceps

(Cordycipitaceae) (Sung et al., 2007)[2].
Tiềm năng ứng ụng

1.2.

1.2.1. Các thành ph n inh ưỡng chung của Cor yceps – các thành ph n hóa
học
Các phân tích hố học cho thấy trong sinh khối c a Cordyceps sinensis có chứa
nhiều thành phần dinh d ỡng nh : các amino acid, vitamin E, K,

1,

2,

12, C…

Ngoài ra, chúng còn chứa nhiều đ ờng, bao g m cả mono-, di-, oligosaccharide và
nhiều phức hợp polysaccharide, protein, sterol, nucleoside, và các nguyên tố vi l ợng
K, Na, Ca, Mg, Fe, Cu, Mn, Zn, Pi, Se, l, Si, Ni, Sr, Ti, Cr, Ga, V, và Zr
1.2.2. Thành ph n hoạt chất chính của Cor yceps
1.2.2.1. Cordycepin
Cordycepin có cấu trúc hóa học 3 -deoxyadenosin, là một hợp chất có ho t tính
sinh học đ ợc ly trích t quả thể và hệ sợi nấm Cordyceps militaris lần đầu tiên vào
năm 1950. Cordycepin là chất kháng ung th hiệu quả Itol et al., 1994, Noriko
Yoshikawa, 2007). Cordycepin đ ợc ly trích t C. kyushuensis c ho t t nh cao h n ly
trích t C. sinensis và C. militaris. Hàm l ợng cordycepin trong Cordyceps nuôi cấy
cao h n so với tự nhiên, và trong sợi nấm cao h n so với ấu tr ng ch . (Sun et al,
2003).

6


Đề tài SVNCKH cấp trường năm học 2013-2014

Hình 1. 2: Cấu trúc hóa học c a cordycepin
1.2.2.2. Polysaccharid
Polysaccharid là một trong những hợp chất chính trong Cordyceps chiếm
khoảng 3-8

khối l ợng. Các polysaccharide hay những hợp chất có ngu n gốc t

đ ờng c a Cordyceps bao g m d-mannitol (cordycepic acid), beta-glucan, betamannan và một số các polysaccharide phức t p kết hợp nhiều lo i phân tử đ ờng khác
nhau. Các polysaccharide có khả năng chống ung th nh ng không tấn công trực tiếp
mà gián tiếp b ng việc kích ho t các hệ thống miễn dịch khác nhau Wasser, 2002 .
ên c nh đó, chúng cịn có khả năng giảm l ợng đ ờng trong máu Kiho et al., 2000 ,
kháng oxy hóa, kháng viêm cũng nh tác động điều hòa miễn dịch (Wang et al., 2012).
1.2.2.3. Sterol
Các sterol trong Cordyceps đ ợc tìm thấy g m: ergosterol, delta-3 ergosterol,
ergosterol peroxide, 3-sitosterol, daucosterol, campesterol... Ergosterol có trong hệ sợi
và là một sterol u thế trong nấm. Các ergosterol và các đ ng phân c a nó có ho t tính
kháng virus, điều hồ tim m ch, điều trị bệnh thận (Zhou et al., 2009) D ng glycosyl
hố c a ergosterol peroxide có tác dụng ức chế sự tăng sinh các dòng tế bào ung th
K562, Jurkat, WM-1341, HL-60 và RPMI-8226 (Bok et al., 1998).
1.2.2.4. rotein

cid min và c c h p chất h c

Hàm l ợng protein trong Cordyceps vào khoảng 29,1 – 33% bao g m 18 acid
amin: acid aspartic, threonin, serin, glutamat, prolin, glycin, valin,.... Các acid amin có

7


Đề tài SVNCKH cấp trường năm học 2013-2014
hàm l ợng axid amin cao nhất là glutamat, arginin, acid aspartic và có d ợc tính cao
nhất là arginin, glutamat, tryptophan, tyrosin. Ngồi ra, Cordyceps cịn chứa nhiều hợp
chất có tính phân cực là hydrocarbon, alcohol, aldehyde… . Các protein, peptide,
polyamine, các amino acid và một số các dipeptide vòng c a Cordyceps cũng có ho t
tính chống ung th và tiềm năng miễn dịch. Nấm Hypcrealean AP và vài loài trong chi
Cordyceps có khả năng sản xuất ra các chất chuyển hóa thứ cấp có ho t tính sinh học
làm ngu n tiềm năng để sản xuất d ợc phẩm và thuốc điều trị. Ví dụ: Cyclosporin

là

thuốc ngăn ch n miễn dịch với thành phần d ợc chất là cyclosporin có tác dụng kìm
hãm hệ miễn dịch giúp ích trong cấy ghép các bộ phận c a c thể ng ời. Cyclosporin
là một sản phẩm chuyển hóa c a Cordycepin đ ợc phân lập t nấm Tolypocladium
inflatum (Wenger et al., 1984). Nấm này đ ợc biết là d ng sinh sản vơ tính c a nấm
Elaphocordyceps subsessilis (= Cordyceps subsessilis) (Hodge et al., 1996; Sung et al.,
2007).
1.2.3. Ứng ụng trong y ược
1.2.3.1. Điều trị ung thư
Nhiều loài nấm trong chi Cordyceps có vai trị tăng c ờng miễn dịch tác dụng
h trợ tốt cho bệnh nhân ung th . Rất nhiều nghiên cứu đã đ ợc công bố chứng minh
khả năng ức chế khối u c a Cordyceps. Có thể kể đến một vài nghiên cứu nh : ức chế
sự phát triển c a tế bào khối u (Bok et al., 1999, Nakamura, 1999; Im, 2003), khả năng
kháng ung th c a alkali-soluble polysaccharide thu t C. phioglossoides (Yanada,
1984), khả năng gây độc tế bào để chống tế bào ung th c a Paecilomyces tenuipes
(Shim et al., 2000; Ban et al., 1998)...
1.2.3.2. Hệ thống miễn dịch:

Cordyceps có tác dụng điều hịa miễn dịch c a c thể và ngăn ng a bệnh. Nhiều
cơng trình nghiên cứu đã cơng bố, Cordyceps có khả năng ức chế miễn dịch thơng qua
kiểm sốt các rối lo n tự miễn dịch và viêm khi xảy ra tổn th

ng mơ, ngăn ch n q

trình thải ghép sau khi cấy ghép nội t ng Taylor, Watson, radley, 2005 , điều khiển
miễn dịch bẩm sinh và đáp ứng miễn dịch Li

Tsim, 2004, Ng.T.B & Wang, 2005).

8


Đề tài SVNCKH cấp trường năm học 2013-2014
1.2.4. Ứng ụng kiểm sốt cơn trùng
Ngồi tiềm năng ứng dụng trong y d ợc, các lồi Cordyceps cịn đ ợc ứng
dụng trong kiểm soát sinh học. Do đ c điểm ký sinh trên côn tr ng, Cordyceps trở
thành thiên địch c a các lồi cơn tr ng gây h i. Vì vậy nhiều loài đã đ ợc sử dụng
rộng rãi trong đấu tranh sinh học kiểm sốt dịch bệnh, trong đó phổ biến là các loài
Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae và Normurea rileyi. Theo McCoy (1990),
các tiêu chí quan trọng để các lồi nấm cơn tr ng có thể đ ợc sử dụng làm thuốc tr
sâu sinh học bao g m khả năng gây độc cho ký ch cao, có tác dụng nhanh, có phổ ký
ch rộng, có tính ổn định trong ni cấy và bảo quản, dễ dàng lên men chìm, dễ kiểm
sốt và phân tích số l ợng, và an tồn cho con ng ời. Theo Taborsky (1992), ứng dụng
đầu tiên sử dụng Metarhizium anisopliae cho đấu tranh sinh học đ ợc thực hiện vào
năm 1888 bởi Krassilstchik. Trên thị tr ờng hiện có sản phẩm thuốc tr sâu sinh học
Green Muscle đ ợc làm t nấm Metarhizium anisopliae var. acridum giúp thay thế
thuốc tr sâu hóa học để kiểm sốt châu chấu ở Châu Phi. T i Việt Nam, nhiều nghiên
cứu đã thành công trong việc sử dụng nấm ký sinh cơn tr ng phịng trị các lo i cơn

tr ng và sâu h i cây tr ng, điển hình nh nấm Metarhizium anisopliae và Beauveria
bassiana đã đ ợc ứng dụng trong phòng tr mối nhà (Nguyễn D

ng Khuê, 2005 ,

sâu khoang h i cải xanh V Thị Thu Oanh và cộng sự, 2005 , sâu h i đậu t

ng và

đậu xanh (Ph m Thị Th y và cộng sự, 2005), rầy mềm và các loài sâu h i lúa Trần
Văn Hai và cộng sự, 2006; Nguyễn Thị Lộc và cộng sự, 2002).
2. NGHIÊN CỨU Đ NH DANH VÀ PHÁT SINH LOÀI
2.1.

Đ c iểm nhận ạng và

nh anh

Tr ớc đây, việc định danh và xây dựng hệ thống học các lồi nấm này ch yếu
dựa trên phân tích hình thái giải phẫu. Các đ c điểm để nhận biết họ Clavicipitaceae
bao g m: thể túi d ng trụ, đ nh túi dày và các bào tử túi d ng sợi th ờng có thể ngắt
rời thành nhiều bào tử thứ cấp Sung et al., 2007 . Năm 1982, Kobayashi trên c sở
xử lý các thơng tin t việc phân tích 282 loài Cordyceps, 59 loài Torrubiella và 75 loài
thuộc về các chi lân cận khác đã xây dựng nên khóa định lo i cho nhóm Cordyceps và

9


Đề tài SVNCKH cấp trường năm học 2013-2014
Torrubiella. Khóa phân lo i này đến nay vẫn đ ợc xem là hữu hiệu nhất để định danh

nhóm nấm này theo ph

ng pháp cổ điển

Cụ thể, đ c điểm chung các loài nấm ký sinh cơn tr ng trong các chi chính
thuộc Cordyceps sensu lato đ ợc miêu tả nh sau: Sung et al., 2007)
Cordyceps s.s: th ờng có màu vàng nh t, sáng, quả thể mềm ví dụ:Cordyceps
militaris , ký sinh trên ấu tr ng và nhộng c a Lepidoptera và Coleoptera, đ ợc tìm
thấy d ới lớp sỏi đất ho c lớp lá d ới đất.
Elaphocordyceps g m tất cả các loài sống ký sinh ở Elaphomyces hay ký sinh
trên nhộng ve sầu.
Metarcordyceps: ch mới có một số lồi đã đ ợc mô tả và đ ợc biết nhiều ở
Đông Á. Quả thể nấm t

i có màu t trắng Metarcordyceps youngmunensis , màu

hoa cà, màu tím, màu xanh lá cây. Các mẫu nấm khơ có màu sẫm h n ho c màu đen
ví dụ, Metarcordyceps taii . Kết cấu c a quả thể g m hệ sợi và ít c i h n chi
Cordyceps s.s, các loài ký ch th ờng bị chôn v i d ới đất.
Ophiocordyceps: là chi lớn nhất c a nấm gây bệnh động vật chân đốt. Nhiều
lồi có sắc tố đậm đ ợc tìm thấy trong đất Ophiocordyceps sinensis) và trong g mục
(Ophiocordyceps variabilis . Hình thái quả thể đa d ng t y theo lồi, có thể có hình
ch , d o dai hay hình ch y, có hệ sợi…
Thực tế, cho đến nay việc định danh b ng hình thái vẫn ch a xây dựng đ ợc hệ
thống phân lo i lồi chính xác do đ c điểm hình thái c a các lồi thuộc chi nấm ký
sinh cơn tr ng có khả năng biến đổi rất cao phụ thuộc vào điều kiện mơi tr ờng và sự
phong phú về thành phần lồi nên các nhà nghiên cứu đã g p phải rất nhiều khó khăn
trong cơng tác định danh nấm. Ngồi ra, đ c điểm l ỡng danh giữa thể hữu tính d ng
quả thể và thể vơ tính d ng mycelium) c a nấm cũng là vấn đề gây khó khăn cho
việc định danh. Hiện nay, với sự phát triển m nh m c a sinh học phân tử, ph

ng

pháp định danh phân tử kết hợp với tin sinh học đã giúp h trợ xác định chính xác h n
các lồi c a nấm ký sinh cơn tr ng, trong đó có các lồi thuộc chi Cordyceps.
2.2.

Đ nh anh phân tử
10


Đề tài SVNCKH cấp trường năm học 2013-2014
Định danh phân tử là ph

ng pháp phân lo i sinh vật ở mức độ phân tử dựa

trên c sở so sánh trình tự nucleotide và axit amin c a các phân tử DNA, RNA,
Protein. Trong nghiên cứu định danh phân tử, việc lựa chọn v ng trình tự DNA, RNA,
Protein để khảo sát giữa các loài là một b ớc quan trọng, trình tự này cần đảm bảo tính
bảo t n cao trong c ng một loài nh ng biến động lớn giữa các loài khác nhau. Đối với
định danh một số lồi thì v ng gen giữ nhà housekeeping gen đã đ ợc sử dụng phổ
biến trong nhiều năm gần đây. Việc định danh phân tử thông qua xây dựng và phân
tích cây phả hệ phân tử. Các nhà nghiên cứu có thể dựa vào các ch tiêu nh địa hình
học c a cây phả hệ, giá trị bootstrap, sự phân nhóm để lý giải mối t

ng quan c a các

đối t ợng trên cây, kết hợp với các dữ kiện hình thái, giải phẫu học nh m định danh
chính xác các đối t ợng quan tâm. Hiện nay, định danh phân tử đang trở thành ngành
khoa học mũi nhọn trong phân lo i học, bổ sung trong phân lo i học truyền thống

những ph

ng pháp nghiên cứu mới và giải quyết các vấn đề cịn ch a sáng tỏ nh

tính đa d ng di truyền, phát sinh loài, h trợ định danh các lồi mà định danh hình thái
cịn h n chế.
2.3.

Nhóm gen giữ nhà (house-keeping gene) trong

nh anh phân tử các oài

nấm.
House-keeping genes là những gen đ ợc biểu hiện th ờng xuyên ở mức t

ng

đối ổn định trong bất k điều kiện nào, chúng mã hóa cho các protein giữ vai trò quan
trọng trong tế bào. Các protein mà chúng mã hóa th ờng liên quan đến những chức
năng cần thiết cho q trình ni d ỡng và duy trì tế bào. Nhờ vậy, trong định danh
phân tử nấm housekeeeping gene đã đ ợc sử dụng nhiều vì chúng là những v ng trình
tự bảo t n cao giúp ích cho việc so sánh và phân tích mối quan hệ giữa các lồi. Đối
với nhóm Cordyceps, v ng gen SSU nrDNA, LSU nrDNA đã đ ợc sử dụng phổ biến
để nghiên cứu phát sinh loài trong những năm gần đây Smit et al., 1999; orneman
Hartin, 2000; Schabereiter-Gurtner et al., 2001 . Tuy nhiên, cây phát sinh loài đ ợc
xây dựng dựa trên dữ liệu c a những v ng gen mã hóa rRN

c a ribosome vẫn ch a

giải quyết đ ợc mối quan hệ ở cấp độ chi và loài. Điều này đã khiến các nhà phân lo i

học tìm kiếm những gen thay thế, đ c biệt là những gen mã hóa protein để nghiên cứu
phả hệ phân tử. Những gen mã hóa protein nh : Tef1-α, Rpb1, Rpb2, Tub, Atp6 đã
11


Đề tài SVNCKH cấp trường năm học 2013-2014
đ ợc chọn trong dự án

FTOL

ssembling the fungal tree of life và trong nhiều

nghiên cứu phả hệ dựa trên nhiều locus (multi-locus) gần đây Chaverri et al., 2003;
Lutzoni et al., 2004; Reeb et al., 2004; Tanabe et al., 2004; Thell et al., 2004; Cai et
al., 2005). Hiện nay, h ớng nghiên cứu kết hợp nhiều gen g m gen mã hóa rRN c a
ribosome và gen mã hóa protein đang phổ biến và đem l i nhiều kết quả giúp định
danh tốt h n. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng các gen thuộc nhóm housekeeping genes, trong đó bao g m gen nrSSU (nuclear ribosomal small subunit – tiểu
đ n vị nhỏ c a ribosome), nrLSU (nuclear ribosomal large subunit – tiểu đ n vị lớn
ribosome và nhiều gen khác nh Tef1 (elongation factor 1α – nhân tố kéo dài 1α ,
Rpb1 (largest subunit of RNA polymerase II – tiểu đ n vị lớn nhất c a RNA
polymerase II), Rpb2 (second largest subunit of RNA polymerase II – tiểu đ n vị lớn
thứ hai c a RNA polymerase II), Tub β tubulin và Atp6 mitochondrial

tp6 . Các

phân tích c a chúng tơi đều dựa vào DN vì chúng có u điểm là cho nhiều thông tin
h n, trong khi acid amin có tính thối hóa. Các trình tự DN cho nhiều thông tin h n
là do chúng đột biến nhiều h n nhờ đó giúp ch ra mối quan hệ gần gũi giữa các loài
tốt h n dựa vào các v ng biến biến động.
2.3.1. Vùng gen gen m hóa rRNA của ri osome (nrSSU, nrLSU)

Đối với nhóm Cordyceps v ng gene mã hoá cho RN
ribosome, rDN
rDN

ribosome DN

đã đ ợc sử dụng phổ biến để nghiên cứu trong nhiều năm gần đây.

ribosomal DN

là nhóm gene mã hóa rRN

c a ribosome, có nhiều bản sao

và khơng mã hóa cho bất k protein nào. Đây là v ng gen bảo t n nên đ ợc xem là c
sở chính xác để tìm ra sự t

ng đ ng và các khác biệt c a các sinh vật c ng lồi hay

khác lồi, đóng vai trị quan trọng trong các nghiên cứu q trình tiến hóa, phát sinh
lồi, phân lo i nấm và xác định tính đa d ng di truyền c a sinh vật cũng nh các dòng
nấm do việc phân lo i nấm dựa vào đ c điểm hình thái, đ c điểm sinh hóa có kết quả
phân lo i th ờng khơng chính xác và cần khoảng thời gian dài Guarro et al., 1999 .
2.3.1.1. V ng gen nrSSU
Gen nrSSU đóng vai trị quan trọng trong việc mã hóa v ng 18S rRN

đ n vị

hình thành tiểu phần nhỏ c a ribosome . Gần đây, nhiều cây phát sinh loài đ ợc xây
12

Đề tài SVNCKH cấp trường năm học 2013-2014
dựng dựa trên v ng trình tự nrSSU gen mã hóa tiểu phần nhỏ c a ribosome đã ch ra
mối quan hệ giữa các lồi. V ng gen nrSSU có tính bảo t n cao do đó nó ph hợp cho
các nghiên cứu ở cấp họ và xa h n, đ ợc d ng trong việc khảo sát mối quan hệ tiến
hóa giữa các lồi. Để thu nhận trình tự cần phân tích, v ng nrSSU có thể đ ợc đọc
trình tự b ng một c p m i phổ quát universal primer . Các c p m i này đ ợc thiết kế
dựa trên các trình tự nucleotide bảo t n c a v ng gen 18S rRN

White et al.,1990 .

Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng c p m i NS1/NS4 bởi tính phổ quát giúp
khuếch đ i và giải trình tự đ ợc nhiều mẫu nấm ký sinh cơn tr ng. Đây là c p m i đã
đ ợc sử dụng trong nhiều nghiên cứu phả hệ phân tử trong những năm gần đây White
et al., 1990).

Hình 1. 3: Cấu trúc gen và vị trí m i NS1 NS4 khuyếch đ i v ng gen nrSSU
2.3.1.2. V ng gen nr SU (nuclear ribosomal large subunit)
Trình tự nrLSU-rRNA là v ng gen mã hóa RN
phần lớn c a ribosom . Các trình tự mã hóa cho rRN

25S-28S c a ribosome (tiểu
có tính bảo t n cao do đó nó

ph hợp cho các nghiên cứu ở cấp họ hay xa h n. Cấu trúc c a nrLSU-rRN

ngoài

những v ng bảo t n cịn có những v ng biến động gọi là domain D1 D2 D3 Ddivergence region, các số đ ợc đánh thứ tự 1,2,3.. bắt đầu t đầu 5 -3

[3]. Các

domain khác nhau c a 25-28S rDNA (tiểu phần lớn LSU) chứa nhiều thông tin cho
phép so sánh các cấp phân lo i t cao xuống đến cấp độ loài Gue ho et al., 1993 . Đ c
biệt, v ng DN

D1 D2 mã hóa cho tiểu phần lớn c a ribosome gần đây đ ợc xem là

13


Đề tài SVNCKH cấp trường năm học 2013-2014
rất hữu ích cho việc phân lo i phần lớn các loài nấm có giá trị y d ợc (Kurtzman &
Robnett, 1997; Fell et al., 2000).

Hình 1. 4: S đ vị trí các v ng domain thuộc trình tự LSU.
Các nghiên cứu phả hệ phân tử đối với nấm t lâu đã sử dụng v ng gen mã hóa
RNA c a ribosom (nrSSU, nrLSU làm v ng gen mục tiêu trong nghiên cứu. Bởi vì,
những v ng gen này chứa nhiều thơng tin di truyền có tính bảo t n cao, đ ợc biết rộng
rãi trên thế giới và có khả năng thiết kế đ ợc các c p m i phổ quát giúp khuếch đ i và
giải trình tự các trình tự c a nhiều loài nấm. C p m i LR0R LR5 là c p m i phổ quát
đ ợc biết đến nhiều nhất và cũng đ ợc sử dụng trong nhiều nghiên cứu phả hệ phân tử
nấm trong những năm gần đây Vilgalys

Hester, 1990 . C p m i này đ ợc thiết kế

để khuyếch đ i v ng D1-D2 và cho kết quả khuếch đ i khoảng 800-1300bp.
(Sonnenberg et al., 2007) [3]. V ng D1, D2 là những domain khác nhau n m trên v ng
gen LSU có khả năng giải quyết việc định danh những lồi có mối liên quan rất gần

gũi với nhau bởi các domain này chứa nhiều thơng tin di truyền, có tính biến động.
2.3.2. Vùng gen Rpb1 (largest subunit of RNA polymerase II)
Gen Rpb1 mã hóa cho tiểu phần lớn tứ nhất cho enzym RNA polymerase II.
Enzym này có vai trị xúc tác q trình phiên mã RN t DNA ở Eukaryote. Trong đó,
gen Rbp1 có chứa v ng lập l i heptapeptide hay chính xác h n là chu i amino acid
Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro- (Tyrosine-Serine-Proline-Threonine-Serine-Proline- có tên
là CTD, trong đó Ser ở vị trí thứ 5 phosphoryl hóa bởi ho t động kinase c a TFII,
14


Đề tài SVNCKH cấp trường năm học 2013-2014
kích ho t enzyme RNA polymerase II chuyển dịch qua promotor và phiên mã. Do cấu
trúc l p l i đ c biệt này đã làm cho gen rpb1 có độ bảo t n cao giúp phân biệt giữa các
nhóm lồi. [4]

Hình 1. 5: Chức năng c a v ng CTD thuộc gen Rpb1
2.3.3. Vùng gen Rpb2 (second largest subunit of RNA polymerase II)
Gen Rpb2 có chức năng liên kết với các tiểu phần khác t o nên cấu trúc liên kết
giữa DN

và RN

mới đ ợc tổng hợp. Vì Rbp2 là một gen có kích th ớc lớn và có

tốc độ thay đổi tiến hóa chậm nên rất hữu ích cho việc phân tích các mối quan hệ phát
sinh lồi trong nấm (Liu et al, 1999) [5].

Hình 1. 6: Cấu trúc và c p m i khuyếch đ i gen Rpb2
(C p m i đ ợc đ t tên theo vị trị exon mà chúng bắt c p )
2.3.4. Vùng gen Tef1(e ongation factor 1α )

Gen Tef1 the elonggation factor 1 alpha là gen mã hóa cho protein EF-1. EF-1
xúc tác việc gắn nhóm aminoacyl tRN s vào vị trí

c a ribosome tiểu phần 40S,

phản ứng cần GTP. Sau đó nhờ nhân tố kéo dài EF-2 và sự tham gia th y phân GTP
s giúp dịch chuyển peptidyl-tRNA t vị trí

sang vị trí P và ribosome di chuyển dọc
15