Phân lập và khảo sát hoạt tính xâm nhiễm vi khuẩn Aeromonas hydrophila của thực khuẩn thể từ các ao nuôi cá tra ở Tiền Giang

Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018

Kỷ yếu khoa học

PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH XÂM NHIỄM VI KHUẨN
AEROMONAS HYDROPHILA CỦA THỰC KHUẨN THỂ TỪ CÁC AO
NUÔI CÁ TRA Ở TIỀN GIANG
Lê Bửu Kỳ*, Bùi Thế Huy
Trường Đại học Tiền Giang
*Tác giả liên lạc:
TÓM TẮT
Cá tra là một trong những đối tượng thủy sản xuất khẩu chủ lực của Việt Nam.
Tuy nhiên, dịch bệnh và tình hình đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Aeromonas
hydrophila đang là thách thức với ngành công nghiệp nuôi cá tra xuất khẩu. Với
mục tiêu phân lập, tuyển chọn và khảo sát đặc điểm sinh học của các dòng thực
khuẩn thể làm tiền đề cho những nghiên cứu ứng dụng để kiểm soát bệnh xuất
huyết trên cá tra gây ra do A. hyrophila, 26 dòng thực khuẩn thể đã được phân
lập bằng phương pháp Plaque Assay từ 100 mẫu nước ao nuôi cá ở tỉnh Tiền
Giang. Ba thực khuẩn thể pAh17.5TG, pAh18.1TG, pAh19.1TG được tuyển chọn
thông qua kết quả về phần trăm thực khuẩn thể không xâm nhiễm lần lượt 44,4%,
58,5% và 52,9% và chu kỳ xâm nhiễm được xác định là 15 phút. Phổ xâm nhiễm
đối với 36 chủng vi khuẩn A. hydrophila của 3 dòng thực khuẩn thể pAh17.5TG,
pAh18.1TG, pAh19.1TG dao động từ 77,2% đến 80,6%. Cả 3 dòng thực khuẩn
thể trên đều thuộc họ Myoviridae và có tính đặc hiệu cao khi khơng xâm nhiễm
các vi khuẩn gây bệnh trên thủy sản và vi khuẩn Probiotics được khảo sát.
Từ khóa: Aeromonas hydrophila, bacteriophages, kháng kháng sinh.
ISOLATION AND CHARACTERIZATIONS OF BACTERIOPHAGES
INFECTED AEROMONAS HYDROPHILA FROM TIEN GIANG
PROVINCE VIETNAM
Le Buu Ky*, Bui The Huy
Tien Giang University

*Corresponding Author:
ABSTRACT
Catfish (Pangasianodon hypophthalmus) is one of the most exported products of
Vietnam. Nonetheless, the epidemic and the antibiotic resistance status of
Aeromonas hydrophila are a challenge for the catfish industry. The aim of this
study was isolation, selection and investigation of the biological characteristics
of the bacteriophages as the basis for applied research to control hemorrhage
disease caused by A. hyrophila. The results showed 26 strains of bacteriophage
was isolated by Plaque Assay Methodology from 100 catfish ponds in Tien Giang
Province. Three phages including pAh17.5TG, pAh18.1TG, pAh19.1TG were
selected via the un-absorption rate for 44.4%, 58.5% and 52.9% respectively.
The time of lytic cycle was determined to be 15 minutes. Host range with 36 A.
hydrophila strains of pAh17.5TG, pAh18.1TG, pAh19.1TG ranged from 77.2%
to 80.6%. All three strains belong to the Myoviridae Family and have high
specific due to not infect the other aquatic pathogens and probiotics bacteria.
Keywords: Aeromonas hydrophila, antibiotic resistance, bacteriophages.
126


Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018

TỔNG QUAN
Trong những năm gần đây ngành công
nghiệp nuôi cá tra (Pangasianodon
hypophthalmus) xuất khẩu đang phát
triển mạnh và đã đưa cá tra trở thành sản
phẩm thủy sản xuất khẩu chủ lực của
nước ta. Tuy nhiên, dịch bệnh trên cá tra
ni xảy ra ngày càng nhiều và khó kiểm
sốt. Theo khảo sát của Từ Thanh Dung

và ctv. (2012), các bệnh gan thận mủ do
vi khuẩn Edwardsiella ictaluri, bệnh trắng
đuôi do Flavobacterium columnare và
bệnh xuất huyết do A. hydrophila gây ra
thường xuất hiện trong q trình ni cá
tra thương phẩm. Hiện nay, việc phòng và
điều trị bệnh trên cá tra chủ yếu vẫn phụ
thuộc vào các loại thuốc kháng sinh và
hóa chất. Người sử dụng thuốc kháng
sinh khơng đúng cách và không đúng quy
định là nguyên nhân gây ra hiện tượng vi
khuẩn kháng kháng sinh và dư lượng
kháng sinh trong cá tra thành phẩm.
Trước thực trạng đó, địi hỏi phải nhanh
chóng tìm ra các giải pháp hạn chế hoặc
thay thế việc sử dụng chất kháng sinh.
Liệu pháp thực khuẩn thể trong phòng và
trị bệnh cho cá là một xu hướng mới có
nhiều triển vọng được các trung tâm khoa
học trên thế giới tập trung nghiên cứu và
phát triển. Để có những hiểu biết cụ thể
hơn về thực khuẩn thể có khả năng xâm
nhiễm vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên
cá tra ni cơng nghiệp và những đặc tính
sinh học của thực khuẩn thể này, nghiên
cứu được thực hiện với mục tiêu đóng
góp nghiên cứu nền tảng tại Việt Nam
nhằm ứng dụng liệu pháp thực khuẩn thể
để kiểm soát bệnh do A. hydrophila gây
ra trên động vật thủy sản nói chung và cá

tra nói riêng.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
Vật liệu
Vi khuẩn A. hydrophila M, Bacillus
subtilis natto, được cung cấp từ Đại học

Kỷ yếu khoa học

Bách Khoa, Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí
Minh. Chủng Lactobacillus fermentum
VTCCB-1051, Lactobacillus plantarum
VTCCB-890 được cung cấp bởi Viện
Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam. Vi khuẩn
Vibrio
parahaemolyticus,
Vibrio
campellii, E. ictaluri được cung cấp bới
Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2.
Vi khuẩn Lactobacillus acidilactici được
cung cấp bởi Viện nghiên cứu Ứng dụng
Công nghệ TP.HCM. Vi khuẩn
Aeromonas veronii, Flavobacterium
columnare được cung cấp bởi Trường
Đại học Chulalongkorn, Thái Lan. Mẫu
nước dùng để phân lập thực khuẩn thể
được thu nhận tại các ao nuôi cá tra thuộc
Công ty Cổ phần Long An ở Huyện Cai
Lậy và Cơng ty TNHH Phước Hịa ở

Huyện Tân Phước tỉnh Tiền Giang.
Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp thu mẫu: mẫu nước ao nuôi
được thu cách mặt nước 30 cm ở 4 góc và
ở giữa của ao ni cá tra, mỗi góc cách bờ
khoảng 2 m, bảo quản trong thùng đá,
phân tích trong 24 giờ. Phân lập thực
khuẩn thể, khảo sát đặc điểm vịng sinh
tan, hoạt tính xâm nhiễm bằng dược thực
hiện bằng kỹ thuật Plaque Assay (Jin
Woo Jun et al., 2014). Phổ xâm nhiễm và
tính đặc hiệu được thực hiện bằng phương
pháp Plaque Drop Assay (Oda et al.,
2004; Namura et al., 2008). Đặc điểm
hình thái được xác định thơng qua kính
hiển vi điện tử truyền qua TEM, thực
khuẩn thể được phân loại theo Tổ chức
phân loại Virus quốc tế ICTV và
Ackerman et al. (2007).
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Kết quả phân lập thực khuẩn thể có
khả năng xâm nhiễm vi khuẩn A.
hydrophila bằng phương pháp Plaque
Assay
Tại 2 huyện Cai Lậy và Tân Phước thu
được 100 mẫu nước ao ni. Trong đó 30

127

Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018

mẫu nước thu từ ao cá thương phẩm nuôi
thâm canh quy mô công nghiệp và 70
mẫu thu tại các ao sản xuất cá giống nuôi
quy mô công nghiệp. Kết quả từ 100 mẫu
nước phân lập bằng kỹ thuật Plaque
Assay thu được 26 dịng thực khuẩn thể
có khả năng xâm nhiễm A. hydrophila M
tương đương với tỷ lệ 26%. Các dòng
thực khuẩn thể sau khi phân lập bằng kỹ
thuật Plaque Assay sẽ được tiến hành
sàng lọc dựa vào độ mờ, rõ của vịng sinh
tan và đường kính vịng sinh tan. Các
dịng thực khuẩn thể cho vịng sinh tan rõ
có kích thước đường kính vịng sinh tan
lớn hơn 1mm, ngược lại các dịng thực
khuẩn thể có vịng sinh tan mờ có kích
thước nhỏ hơn 1mm. Các dịng thực
khuẩn thể ở vị trí TG17.5, TG18.1 và
TG19.1 có kích thước vịng sinh tan lớn
nhất tương ứng với 1,28±0,02 mm,
1,26±0,06 mm, 1,28±0,08 mm, khác biệt
khơng có ý nghĩa về mặt thống kê với
nhau nhưng khác biệt có ý nghĩa về mặt
thống kê với 23 dịng thực khuẩn thể cịn
lại.
Từ thí nghiệm phần trăm thực khuẩn thể
khơng xâm nhiễm cho kết quả 3 dịng
thực khuẩn thể pAh17.5TG, pAh18.1TG

và pAh19.1TG có phần trăm khơng xâm
nhiễm ở thời điểm 15 phút lần lượt là
44,2%, 58,5% và 52,9%, khác biệt khơng
có ý nghĩa về mặt thống kê với nhau. Khi
so sánh kết quả nghiên cứu này với các
cơng trình đã được cơng bố bởi các nhóm
tác giả Taruna Anand et al. (2015) cho
thấy: phần trăm thực khuẩn thể không
xâm nhiễm của pAh17.5TG (44,2%) và
pAh19.1TG (52,9%) là thấp hơn. Đồng
thời phần trăm khơng xâm nhiễm của
dịng thực khuẩn thể pAh17.5TG cũng
thấp hơn so với kết quả 51% khi nhóm tác
giả El Araby et al. (2016).
Ở thời điểm 30 phút, nồng độ của 3 dòng
thực khuẩn thể pAh17.5TG, pAh18.1TG
và pAh19.1TG tăng đột biến với tỷ lệ
phần trăm lần lượt là 123,7%, 79,8% và
409,9%. Từ các thời điểm khảo sát và số

Kỷ yếu khoa học

lượng thực khuẩn thể không xâm nhiễm,
xác định chu kỳ xâm nhiễm của 3 dòng
thực khuẩn thể pAh17.5TG, pAh18.1TG
và pAh19.1TG này là 15 phút. Chu kỳ
xâm nhiễm của các dòng thực khuẩn thể
phân lập tại Tiền Giang tương đương với
chu kỳ trong nghiên cứu của Jian-Bin
Wang et al. (2016) và ngắn hơn chu kỳ 30

phút của Jin Woo Jun et al. (2013).
Kết quả thí nghiệm khảo sát phổ xâm
nhiễm của các dòng thực khuẩn thể
Các dòng thực khuẩn thể sau khi được
phân lập và tuyển chọn ở Tiền Giang sẽ
được tiến hành thử phổ xâm nhiễm với 36
chủng vi khuẩn A. hydrophila được phân
lập và định danh ở các vùng khác nhau tại
Tiền Giang và Bến Tre từ bộ sưu tập
giống của Đại học Tiền Giang.
Kết quả thí nghiệm cho thấy: phổ xâm
nhiễm của 3 dịng thực khuẩn thể
pAh17.5TG, pAh18.1TG và pAh19.1TG
trên 36 chủng vi khuẩn A. hydrophila
phân lập được dao động từ 72,2% đến
80,6%. Trong đó dịng thực khuẩn thể
pAh19.1TG có phổ xâm nhiễm rộng nhất
là 80,6%. Khi so sánh với kết quả phổ
xâm nhiễm của Jin Woo Jun et al. thì kết
quả của 3 dịng thực khuẩn thể phân lập ở
Tiền Giang có kết quả hẹp hơn. Tuy
nhiên, khi so sánh với kết quả của nhóm
tác giả Jian-Bin Wang et al. vào năm
2016, phổ xâm nhiễm của các dòng thực
khuẩn thể pAh17.5TG, pAh18.1TG và
pAh19.1TG rộng hơn.
Dựa vào kết quả phần trăm tỷ lệ xâm
nhiễm của thực khuẩn thể đối với vi
khuẩn A. hydrophila thấy rằng khi tiến
hành tổ hợp các dòng thực khuẩn thể với

nhau thành từng cặp như sau pAh17.5TG
và pAh18.1TG, pAh17.5TG và
pAh19.1TG, pAh18.1TG và pAh19.1TG
thì cho kết quả phổ xâm nhiễm lần lượt là
77,8%, 80,6% và 80,6%. Khi tổ hợp cả 3
dòng thực khuẩn thể trên với nhau thì cho
kết quả phổ xâm nhiễm là 80,6%. Từ kết
quả trên, có thể sử dụng riêng lẻ thực
khuẩn thể pAh19.1TG, tổ hợp của dùng

128


Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018

thực khuẩn thể này với một trong hai
dòng thực khuẩn thể còn lại hoặc cả ba
dòng thực khuẩn thể. Tuy nhiên, để mở
rộng nghiên cứu phổ xâm nhiễm đối với
các vi khuẩn A. hydrophila phân lập trên
các đối tượng thủy sản và các vùng nuôi
thủy sản khác ở Đồng bằng Sơng Cửu
Long, tổ hợp 3 dịng thực khuẩn thể
pAh17.5TG, pAh18.1TG và pAh19.1TG
sẽ được đề xuất lựa chọn làm nguyên liệu
cho các nghiên cứu tiếp theo.
Kết quả phân loại các dòng thực khuẩn
theo ICTV dựa vào kết quả chụp TEM
Dựa vào kết quả ảnh chụp TEM của 3
dòng thực khuẩn thể được phân lập từ các

ao nuôi cá tra ở Tiền Giang, tiến hành ghi
nhận kích thước đầu, cổ và đuôi. Kết hợp
với các tiêu chuẩn phân loại theo họ thực
khuẩn thể của ICTV.
Từ kết quả ảnh chụp TEM của 3 dòng
thực khuẩn thể pAh17.5TG, pAh18.1TG
và pAh19.1TG cho thấy cả 3 dịng thực
khuẩn thể trên đều có cùng một loại cấu
trúc cơ thể bao gồm đầu, cổ và đuôi. Từ
cấu trúc cơ thể trên có thể xếp các dịng
thực khuẩn thể thể pAh17.5TG,
pAh18.1TG và pAh19.1TG vào họ
Myoviridae. Kết quả phân loại của 3 dòng
thực khuẩn thể phân lập được ở tỉnh Tiền
Giang trong nghiên cứu này cũng tương
đồng với cơng bố của nhóm tác giả
Taruna Anand et al. (2015).
Kết quả thí nghiệm khảo sát tính đặc
hiệu của các dòng thực khuẩn thể
Tiến hành khảo sát tính đặc hiệu của các
dòng thực khuẩn thể được phân lập và
tuyển chọn trước đó trên các chủng vi
khuẩn gây bệnh trên động vật thủy sản A.
veronii, E. ictaluri, F. columnare, V.
parahaemolyticus, V. campellii, và các
chủng vi khuẩn có đặc tính probiotics
đang được ứng dụng trong nuôi trồng
thủy sản bao gồm: L. fermentum, L.
plantarum, L. acidilactici, B. subtilis
natto. Kết quả thí nghiệm khảo sát độ đặc

hiệu của 3 dòng thực khuẩn thể thể
pAh17.5TG, pAh18.1TG và pAh19.1TG

Kỷ yếu khoa học

đối với các dòng vi khuẩn gây bệnh điển
hình trong ni trồng thủy sản và vi
khuẩn có đặc tính probiotics cho thấy: tất
cả các dịng thực khuẩn thể đều không
xâm nhiễm. Kết quả khảo sát độ đặc hiệu
của các dòng thực khuẩn thể được phân
lập ở Tiền Giang thì tương đồng với kết
quả của Jin Woo Jun et al. vào năm 2013
và Jian-Bin Wang et al. vào năm 2017. Từ
kết quả này có thể kết luận các dòng thực
khuẩn thể đã phân lập và tuyển chọn bao
gồm
pAh17.5TG, pAh18.1TG và
pAh19.1TG có tính đặc hiệu cao đối với
vi khuẩn A. hydrophia.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận
Sau quá trình tuyển chọn 26 dòng thực
khuẩn thể phân lập từ 100 mẫu nước ở 20
ao nuôi cá tra ở Tiền Giang cho kết quả
ba dòng thực khuẩn thể được đặt tên là
pAh17.5TG, pAh18.1TG và pAh19.1TG
có vịng sinh tan rõ, đường kính vòng sinh
tan lớn nhất lần lượt là 1,28±0,02 mm,
1,26±0,06 mm, 1,28±0,08 mm. Chu kỳ

xâm nhiễm của 3 dòng thực khuẩn thể
pAh17.5TG, pAh18.1TG và pAh19.1TG
là 15 phút, phần trăm thực khuẩn thể
không xâm nhiễm lần lượt là 44,2%,
58,5% và 52,9%, phổ xâm nhiễm rộng
dao động từ 72,2% đến 80,6%. Trong đó,
dịng thực khuẩn thể pAh19.1TG có phổ
xâm nhiễm rộng nhất. Cả 3 dòng
pAh17.5TG, pAh18.1TG và pAh19.1TG
đều thuộc họ Myoviridae dựa và kết quả
ảnh chụp dưới kính hiển vi điện tử truyền
qua TEM và có độ đặc hiệu cao với vi
khuẩn A. hydrophila khi không xâm
nhiễm một số chủng vi khuẩn gây bệnh
thường gặp trên thủy sản và các chủng vi
khuẩn Probiotics.
Kiến nghị
Tiếp tục nghiên cứu xây dựng đường
cong sinh trưởng và khảo sát các yếu tố
ảnh hưởng đến mật độ thực khuẩn thể
theo thời gian. Đồng thời, phân lập vi
khuẩn A. hydrophila tại các vùng nuôi

129


Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018

khác tại ĐBSCL và trên các đối tượng
thủy sản khác để mở rộng thí nghiệm

khảo sát phổ xâm nhiễm nhằm làm tiền
đề cho những nghiên cứu tiếp theo nhằm

Kỷ yếu khoa học

ứng dụng thực khuẩn thể như một tác
nhân kiểm soát sinh học bệnh do A.
hydrophila gây ra.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
ACKERMANN, H.W. 2007. 5500 Phages examined in the electron microscope.
Archives of Virology. Vol.152: 227-243.
EL-ARABY DA, GAMAL EL-DIDAMONY AND MARIHAN MEGAHED TH.
2016. New approach to use phage therapy against Aeromonas hydrophila
induced motile Aeromonas Septicemia in Nile Tilapia. Journal of Marine
Science: Research & Development. Vol.6 (3): 1-6.
JIAN-BIN WANG, NIEN TSUNG LIN, YI HSIUNG TSENG, SHU FEN WEN.
2016. Genomic Characterization of the Novel Aeromonas hydrophila Phage
Ahp1 Suggests the Derivation of a New Subgroup from phiKMV-Like Family.
PLoS ONE. Vol.11 (9): 1-20.
TỪ THANH DUNG, M CRUMLISH, NGUYỄN THỊ NHƯ NGỌC, NGUYỄN
QUỐC THỊNH VÀ ĐẶNG THỤY MAI THY. 2004. Xác định vi khuẩn gây
bệnh trắng gan trên cá Tra (Pangasius hypophthalmus). Tạp chí Khoa học Đại
học Cần Thơ Chuyên ngành Thủy Sản. 137-142.

130