Phân lập và khảo sát hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn của vi sinh vật nội sinh trên cây dừa cạn (Catharanthus roseus L.)

B GIÁO DO
I HC M TP. H CHÍ MINH


Tên đ tài:
PHÂN LP VÀ KHO SÁT HOT TÍNH
KHÁNG NM, KHÁNG KHUN CA VI
SINH VT N
(Catharanthus roseus L.)

KHOA CÔNG NGH SINH HC
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH  SINH HC PHÂN T


T LINH

MSSV : 1053010038
KHOÁ: 2010  2014



Li Cm n


 khóa lu
 tiên, Em xin gi c   c t       n tình
ng dn, ch bo em trong sut thi gian thc hi tài. Em xin cy
Nguyt cho chúng em nhiu kinh nghim quý báu.
Em xin gi li cn các Thy Cô khoa Công Ngh Sinh
Hc, Ti hc M Thành ph H ng dy và truyt 
kin thc cho em trong sut nhv 

 này.
Em xin cm anh  Võ Ngc Yn Nhi và ch Nguyn Th M
Linh, nhi
ch luôn ng h  tài.


Cui cùng con xin c, cluôn bên con, to mu
kin tt nh con hoàn thành vic hc ca mình.
Em xin gi li chúc sc khn tt c i th
Công ngh sinh hc, i hc m Thành ph H Chí Minh, xin chúc thy cô
ngày càng gc nhiu thành công.
phòng thí nghim Công ngh Vi
i hc M Thành ph H Chí Minh

Tôi xin chúc các bn ca tôi s ng
, cng hic tr , cho c.
Xin chân thành c
.

KHO A LUA N TO T NGHIÊP GVHD DNG NHA T LINH

SVTH LÊ SANH BAO i


MC LC I
DANH MC HÌNH IV
DANH MC BNG VI
DANH M VII
DANH MC CH VIT TT VIII
 1

 4
1.1  5
1.2  6
1.2.1  6
1.2.2  6
1.2.3  7
1.2.4  7
1.3            
T 8
1.3.1 t 8
1.3.2 
sinh 9
1.4  .
11
1.4.1 Escherichia coli 11
1.4.2 Salmonella typhi 12
1.4.3 Staphylococcus aureus 12
1.4.4 Pseudomonas aeruginosa 13
KHO A LUA N TO T NGHIÊ P GVHD DNG NHA T LINH

SVTH LÊ SANH BAO ii

1.5  14
1.5.1 Candida albicans 14
1.5.2 Dermatophytes 17
1.6  19
1.6.1  19
1.6.2  20
 21
2.1  22

2.2 VT LIU 22
2.3 THIT B, DNG CNG 22
2.3.1 Thit b 22
2.3.2  23
2.3.3 Môi tr 23
2.4 M 23
2.5  24
2.5.1  24
2.5.2  25
2.5.3  26
2.5.4  26
2.5.5  29
2.5.6 
 30
2.5.7 
 34
2.5.8  38
2.5.9  46
2.5.10  47
KHO A LUA N TO T NGHIÊ P GVHD DNG NHA T LINH

SVTH LÊ SANH BAO iii

 48
3.1. 
49
3.2.          
 52
3.2.1. n gây bnh
53

3.2.2. m gây bnh
57
3.3.           
 61
3.3.1. n gây bnh
64
3.3.2. m gây bnh 67
3.4.  72
3.4.1.  72
3.4.2.  75
3.5. THO LUN 79
 80
4.1.  81
4.2.  82
O 83
KHO A LUA N TO T NGHIÊ P GVHD DNG NHA T LINH

SVTH LÊ SANH BAO iv


Hình 1.1: Cây da cn 7
Hình 1.2: Escherichia coli 11
Hình 1.3: Salmonella typhi 12
Hình 1.4: Staphylococcus aureus 13
Hình 1.5: Pseudomonas aeruginosa 14
Hình 1.6: Candida 15
Hình 1.7: Microsporum 17
Hình 1.8: Trichophyton 18
 28
Hình 2.2: Kt qu vòng kháng khun gây bnh 32

Hình 2.3: Kt qu vòng kháng 34
Hình 2.4: Cách b trí mi kháng 35
Hình 3.1: i th chng BVR7 sau 24 gi nui cng NA 49
Hình 3.2: i th chng DVT63 sau 24 gi nui cng NA 50
Hình 3.3: i th chng HVT83 sau 24 gi nui cng NA 50
Hình 3.4: i th chng BNT41 sau 3 ngày nui cng PDA 50
Hình 3.5: i th chng DNT47 sau 3ngày nui cng PDA 51
Hình 3.6: i th chng DNT47 sau 3 ngày nui cng PDA 51
ng Escherichia coli 55
Pseudomonas aeruginosa c . 55
Staphylococcus aureus 56
Salmonella typhi c
56
Candida albicans. 59
Trichophyton mentagrophytesHVR26 59
Trichophyton rubrumHVR26 60
KHO A LUA N TO T NGHIÊ P GVHD DNG NHA T LINH

SVTH LÊ SANH BAO v

Hình 3.14: Kháng nm Microsporum gypseum ca chng HVR26 60
Escherichia
coli 65
 Staphylococcus aureus HNT60, DNT51,
BNT41. 66
Salmonella typhiBNR3, BNR5, BNL77. 66
Trichophyton mentagrophytes 68
Trichophyton mentagrophytes 69
Trichophyton rubrum 70
Trichophyton rubrum 70

Microsporum gypseum 71
Microsporum gypseum 71

 72

73

74

75
 76
 77
Hình 3.30: Quan sát khun lc BNT43 trên PDA 77
Hình 3.31: Bào t chi kính hin vi 78
Hình 3.32: Quan sát khun lng PDA 78
Hình 3.33: Chi kình hin vi 79

KHO A LUA N TO T NGHIÊ P GVHD DNG NHA T LINH

SVTH LÊ SANH BAO vi

Bng 2.1: Biu hin các mc phát trin ca khóm nm 47
 49
 52
nh kh i kháng ca vi sinh vt ni sinh vi vi
khun gây bnh 53
Bng 3.4: K 57
 61
t qu nh kh n gây bnh ca các chng vi
nm ni sinh 64

B 67
nh khTrichophyton mentagrophytes
h 68
nh khTrichophyton rubrum 
 69
nh khMicrosporum gypseum 
 71
Bng 3.11. Kt qu nh danh sinh hóa chng DVR12, VVL131. 73
Bng 3.12: Kt qu th nh danh sinh hóa chng HVR26, GVT70 75

KHO A LUA N TO T NGHIÊ P GVHD DNG NHA T LINH

SVTH LÊ SANH BAO vii

 24
 2.2: Quy trình th kháng khun 37

KHO A LUA N TO T NGHIÊ P GVHD DNG NHA T LINH

SVTH LÊ SANH BAO viii


LPCB Lactophenol Cotton Blue
NA: Nutrient Agar
NB: Nutrient Broth
PDA: Potato Dextrose Agar
TSA: Trypticase Soy Agar
NXB: 
Cs: 
CFU : Colony Forming Unit    hình thành

khun lc
SDA : Sabouraud Dextrose Agar
S. aureus: Staphylococcus aureus
E. coli: Escherichia coli
S. typhi: Salmonella typhi
P. aeruginosa: Pseudomonas aeruginosa
C. albicans: Candida albicans
M. gypseum Microsporum gypseum
T. rubrum: Trichophyton rubrum
T.mentagrophytes Trichophyton mentagrophytes

KHO A LUA N TO T NGHIÊ P GVHD DNG NHA T LINH

SVTH LÊ SANH BAO 1






KHO A LUA N TO T NGHIÊ P GVHD DNG NHA T LINH

SVTH LÊ SANH BAO 2
Cc Catharanthus
roseus L.Vinca rosea L., thuc h c hoang di và
c trng  nhi c nhit Nam, n Ð, Indonesia, Philippine,
châu Phi, châu Úc, Braxin  Vit Nam, da cn là cây hoang di có vùng phân b
 tnh Qun Kiên Giang dc theo vùng ven bin, 
i tp trung nhiu  các tnh mi: Thanh Hóa, Ngh
Hu, Qum dân gian 

Vit Nam và Trung Quc u thông
tiu tin, cha b. i dân dùng tr b
ng, tiêu hóa kém và l (


, các hp cht vincristine, vinblastine có tác dng chng ung
 (Gupta và cs., 2005)

 o sát hp cht ting vi khun ni
sinh trên cây da c  c Vibrio cholerae, Klebsiella pneumoniae,
Escherichia coli, Candida albicans gây b
            Bacillus cereus,

Vi sinh vt ni sinh là nhng vi sinh vt (ch yu là nm và vi khun) s
e m
            u
nghiên cp trung vào các hoh hc ca vi nm và vi khun ni sinh
(Strobel, 2003). Trong i nh - mô thc vt nên 
 có nhiu hot tính sinh hn vùng r hoc  vi
khun khác c phân lp t b mt cây trng ho t (Dowler và cs., 1974;
Andrews, 1992). 
công b
KHO A LUA N TO T NGHIÊ P GVHD DNG NHA T LINH

SVTH LÊ SANH BAO 3
                


t ni
sinh có kh t ng d sn xun

ting ca cht kháng khu
Kigelia
africana      Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus,
Escherichia colit ni sinh thc vt có mt tit l
p cht kháng nm, kháng khun có ho
ch phm sinh hc dùng cho phòng tr
chúng tôiPHÂN LP VÀ
KHO SÁT HOT TÍNH KHÁNG NM, KHÁNG KHUN CA VI SINH
VT NI SINH TRÊN Catharanthus roseus L.)
 Ni dung nghiên cu:
- Phân lp vi khun, vi nm ni sinh.
-  gia vi sinh vt ni sinh

- 










KHO A LUA N TO T NGHIÊ P GVHD DNG NHA T LINH

SVTH LÊ SANH BAO 4




KHO A LUA N TO T NGHIÊ P GVHD DNG NHA T LINH

SVTH LÊ SANH BAO 5
1.1 H
 là nhng nhng vi sinh vt (ch yu là nm và vi khun)
se m
0; Wellington và Marcela, 2004) t bo v c nhng
ng cng, vi khun ni sinh thc vt to thành nhng  vi khun,
xâm chim và nt cây. Nhng vi khung xâm chim vào
vùng không gian  gia các t bào, chúng có th c phân lp t tt c các b phn
ca cây, bao gm c ht ging (Vii sinh thc vt
c tìm thy trong hu ht  các loài thc va chúng hình
thành mt lot các mi quan h n, cng sinh dinh
ng, hi sinh, 
Vi khun ny thc v
trò là mu hòa sinh hc (He và cs, 2009). i ta cho rng hong
h sinh ca thc vt có s hin din ca vi sinh vt nt cht "kích hot
sinh h kích hot các h thng phn ng mt cách nhanh
nh m i thc vc h sinh (Bandara và cs, 2006;
Strobel và Daisy, 2003). Vi khun ni sinh sn xut hàng lo
 t nhiên có li cho thc vt ký ch mà ta có th ng dng trong y hc, nông
nghip hay công nghip. Ngoài ra nó còn có tii b các cht gây ô nhim

t bng kh  c trên thc vt tr
nên màu m thông qua vic hòa tan lân và c m. Nhiu nghiên c ra
rng vi khun ni sinh có kh c mm bnh trên thc vt,  côn
trùng và c  tuyn trùng. Trong mt s ng hp chúng có th y mnh t
ny mm ca hy s u kin bt li và nâng
cao kh ng ca thc vt (Chanway, 1997; Bent, 1998). Vi khun ni
sinh còn có th n mm bnh phát trin bng cách tng hp các cht ni
 tip tc tng hp các cht chuyn hóa và các hp cht
hng hp t hp sn xut
các hp cht ngu nhiên, các cht chuy
KHO A LUA N TO T NGHIÊ P GVHD DNG NHA T LINH

SVTH LÊ SANH BAO 6
c tìm kim các cht
chuy i nên t    
         M     y thuc
kháng sinh mc ch min dch và các hp cht ch
c tính ca mt s
 (Schutz, 2001). Nghiên c sn sinh cht chuyn
hóa mi trong s ng sinh hc ca vi khun ni sinh có th phát hin các loi
thuc m u tr có hiu qu các bnh  i, thc vng vt (Strobel,
1993). Hixem nni bt, 

 (Strobel, 2003).
1.2 
Catharanthus roseus L., Vinca rosea L.

1.2.1 




1.2.2 
 : Plantae
 : Magnoliophyta
 : Magnoliopsida
 : Gentianales
 : Apocynaceae
Chi : Catharanthus
 : Catharanthus roceus L.
KHO A LUA N TO T NGHIÊ P GVHD DNG NHA T LINH

SVTH LÊ SANH BAO 7

Hình 1.1: Cây da cn
Catharanthus
roceus

1.2.3 

cao 0,4  0,8 

 
-7 cm, -
-
-

t-
ngang. -
   (
19912011).

1.2.4 
Catharanthus rosesus
 c hoang dc trng  nhi c nhi  n Ð,
KHO A LUA N TO T NGHIÊ P GVHD DNG NHA T LINH

SVTH LÊ SANH BAO 8
Indonesia, Philippine, châu Phi, châu Úc, Braxin Ti châu Âu và châu M 
nhng vùng nóng  tr nhng vùng lc trng theo
mùa vì không chc lnh. Cây da cn là loài cây chu kin khô
hn và thiu chng, nó khá ph bin trong các kn cn nhii

Ti Vit Nam, da cn là cây hoang di, có khi mc gn loi trên
các bãi i rng phi lao, trng c cây bi thp, có kh u
kin ca vùng cát ven bin. Da cn có vùng phân b t nhiên
 tnh Qun Kiên Giang dc theo vùng ven bin,
i tp trung nhiu  các tnh mi An, Tha
Thiên -Hu, Qu
Ta cn ch c trng làm cc tr thu
hoch ly thân, lá và r  ch thuc.
1.3 ,

1.3.1 t
Vi sinh











KHO A LUA N TO T NGHIÊ P GVHD DNG NHA T LINH

SVTH LÊ SANH BAO 9
trong hc
 (Strobel, 2003).


 nh nghiên cu vi sinh vt ni sinh và các hp cht hóa hc có hot
tính kháng nm gây bnh  ng kho nghim ti Tha Thiên
Hu   
g




 (Strobel, 2003).


(B
. N
khun ni sinh mi Hevea brasiliensis kim soát sinh hc chng li các tác nhân
gây bnh r

, 1997).






1.3.2 

KHO A LUA N TO T NGHIÊ P GVHD DNG NHA T LINH

SVTH LÊ SANH BAO 10
Trên th gii
     


1.3.2.1 


  Rhyncholacis penicillata          



 Serratia marcescens
t cây R. penicillata  sn xut Oocydin A, mt
hp cht 
1.3.2.2 



Kennedia nigriscan

Streptomyces
 nghim y hc dân gian
mt s cha st, r da cn có tác

dng t
   Bacillus cereus, Klebsiella pneumoniae, Vibrio cholerae,
Escherichiae coliCandida albican.
1.3.2.3 



KHO A LUA N TO T NGHIÊ P GVHD DNG NHA T LINH

SVTH LÊ SANH BAO 11
1.4 

1.4.1 Escherichia coli
Phân lo
Phân ngành : Proteobacteria
Lp : Gamma Proteobacteria
B : Enterobacteriales
H : Enterobacteriaceae
Chi : Escherichia
Loài : Escherichia coli
(Nguyn Thanh B   
Phng, 2012)
Hình 1.2: Escherichia coli
E. coli là trc khuc trung bình t 2  3 µm x 0,5 µm;
trong nhu kin không thích hp (ví d ng có kháng sinh)
vi khun có th ri ch. Rt ít chng E. coli có vu ht có lông
và có kh ng.
E. coli phát trin d ng nuôi cng , hiu khí
tùy nghi, nhi  t 5  40
o

C  u kin thích hp E. coli phát trin rt
nhanh, thi gian th h ch khon 30 phút.
E. coli là vi khung trú  ng tiêu hóa ci, có th c tìm
thy  ng hô hng sinh dc. E. coli u trong các vi khun
gây bnh tiêu chng tit ning mm
khun huyt. E. coli có kh nh khi xâm nhp vào nhng v 
th ng chúng không hin din.
E. coli hi khe mnh ch gây bnh khi có d vt hay
h thng min dch ca ký ch b suy yu.
KHO A LUA N TO T NGHIÊ P GVHD DNG NHA T LINH

SVTH LÊ SANH BAO 12
E. coli gây bng rut. Tác nhân gây bng tiêu hóa bt c khi
nào ký ch nu s ng vi khun. Truyn bnh ch yu qua th
c ung b nhim vi khun hay truyn t i khác. (Nguyn
Thanh Bng, 2012)
1.4.2 Salmonella typhi
Phân loi
Phân ngành : Proteobacteria
Lp : Gamma Proteobacteria
B : Enterobacteriales
H : Enterobacteriaceae
Chi : Salmonella
Loài : Salmonella typhi
(Nguyn Thanh Bng, 2012)
Hình 1.3: Salmonella typhi
S. typhi là trc khun Gram âm, có lông xung quanh thân. Vì vy có kh 
c khong 0,4 - 0,6 x 2 - S. typhi là vi
khun hiu khí tùy nghi, phát tring nuôi cng.
ng thích hp sau 24 gi khun lc trung bình 2  4

mm.
Kh nh ca S. typhi:
S. typhi ch gây bi, ch yu gây bn B
hàn có th gây bin chng ch yu là xut huyt tiêu hóa và thng rut. Mt s bin
chng ít g          p, viêm thn.
(Nguyn Thanh Bng, 2012)
1.4.3 Staphylococcus aureus
Phân lo
Gii : Prokaryote
Phân ngành : Firmicute
KHO A LUA N TO T NGHIÊ P GVHD DNG NHA T LINH

SVTH LÊ SANH BAO 13
Lp : Firmibacteria
H : Micrococceae
Chi : Staphylococcus
Loài : Staphylococcus aureus
(Nguyn Thanh Bng, 2012)

Hình 1.4: Staphylococcus aureus
S. aureus là vi khung kính 0,5  1,5 µm, có th
ng riêng l, tng chui ngn, hoc t u gi
i vi khung và không sinh bào t
trên da và màng nhy ci vng v    ng Baird
Parker, khun lc có vòng sáng rng 2  5 mm.
S. aureus gây ra hai loi hi chng nhic và nhim trùng:
- Nhic có th do hot tính ca mt hoc mt vài sn phm ca S.aureus
c t) mà không cn có s hin din ca vi khui chng sc nhic,
hi chng phng ngoài da, hi chng ng c th
- Nhim trùng là do S. aureus xâm nho v ca vt ch khi b

tm chm trùng da và mô mm, nhim trùng h
hô hp, nhim trùng h thm trùng huyt, nhim trùng tiu,
nhim trùng ni mch, nhi
S. aureus gây ra nhiu bnh nhim trùng, tao m c  ng
xy ra  nhng ch c trên b mt, gây ra nhiu bnh truyn
nhim nghiêm trch, viêm màng não, nhim trùng
tiu và nhng bnh nguy hi y, viêm màng trong tim.
(Nguyn Thanh Bo, 2008).
1.4.4 Pseudomonas aeruginosa
Phân loi
Phân ngành : Proteobacteria
KHO A LUA N TO T NGHIÊ P GVHD DNG NHA T LINH

SVTH LÊ SANH BAO 14
Lp : Gamma Proteobacteria
B : Pseudomonadales
H : Pseudomonadaceae
Chi : Pseudomona
Loài : Pseudomonas aeruginosa
(Nguyn Thanh Bo, 2008;
ng, 2012)
Hình 1.5: Pseudomonas aeruginosa
P. aeruginosa là trc khun m xanh, thng ho    
xou tròn, dài 1 - 5 µm, rng 0,5 - 1 µm, ít khi có v có mt ít lông  mt
ng, không sinh nha bào, bt màu Gram âm. Chúng mc   nhit
rng (10  44
0
 35
0
c, có th gp hai loi

khun lc: mt loi to, nhn, b tri dt, gia li lên; mt loi khác thì xù xì.
Kh nh ca P. aeruginosa:
Trc khun m xanh là loi vi khun gây bu ki b
suy gim min dch, b bnh ác tính hay mãn tính, khi dùng corticoid lâu dài, vic
s dng kháng sinh tùy tim trùng da, m
viêm da chc  các vùng k hoc viêm tai ngoài, viêm loét giác mc, Ngoài
ra P. aeruginosa uyên gây nhim trùng vt bng, vp,
huyt, dch não ty, tit niu và hô hp.
Trc khun gây viêm m (m u kin thun li chúng
gây bm khun huyt hoc viêm ph qun, viêm màng não,
viêm tai giy. (Nguyn Thanh Bng, 2012)
1.5          

1.5.1 Candida albicans
1.5.1.1 
Gii : Nm
Ngành : Ascomycota
KHO A LUA N TO T NGHIÊ P GVHD DNG NHA T LINH

SVTH LÊ SANH BAO 15
Phân ngành : Saccharomycotina
Lp : Saccharomycetes
B : Saccharomycetales
H : Saccharomycetaceae
Chi : Candida
(Maheshwari, 2010)
Hình 1.6: Candida
(Ngun: wikipedia.org)
Nm men Candida có hình tròn hay hình bu dc, sinh sn bng cách ny chi
hay cho sm gi và bào t bao dy.

C. albicans là thành viên ca h vi sinh vt  da và niêm mc. Nó là nhân t
gây nhim khi có s  và cho phép nó phát trit
ngoài tm kim soát. C. albicans ng sng vô hi  màng nhy ci và
ng vt máu nóng (ming, rung xuyên  trên da  dng
 nhu kin nhnh, nm men phân hóa thành dng s xâm
nhp vào màng nhng không kim soát và gây nhng bm nm
ng.
C. albicans là tác nhân gây bnh  da, móng, niêm mc (Candidasis,
Moniliasis). vi nm có th xâm nhm huyt
và bnh nm ni tng rt nguy him. Kh n ti  hai dng hình thái là t bào
và si giúp loài này nhanh chóng chuyu kin thích hp và
khó b tiêu dit (Trn Linh Tc, 2006; Maheshwari, 2010).
1.5.1.2 c tính sinh lý ca Candida albicans
C. albicans có th phát trin tt  20  38
0
C, pH t 2,5  7,5, hình dng t bào
i t u dc sang dng si, ng bi
 sinh sn hu tính, có th sn sinh ng mm và bào t vách
dày chic sinh ra  u khun ty gi.