BÁO cáo THỰC HÀNH VI SINH đại CƯƠNG autosaved

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP.HCM
KHOA CƠNG NGHỆ HĨA HỌC & THỰC PHẨM

BÁO CÁO THỰC HÀNH
VI SINH ĐẠI CƯƠNG

GVHD: Th.S Nguyễn Minh Hiền
SVTH: Nguyễn Thị Nga
MSSV: 19125195
Lớp: DH19DD
Nhóm: 12


NỘI DUNG THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƯƠNG
GIỚI THIỆU CHUNG
1. Giáo trình phục vụ mơn học:
SV có thể sử dụng bất kì giáo trình nào về thực hành Vi sinh đại cương.
2. Nội dung học:
- Các thiết bị trong phòng thí nghiệm Vi sinh, chuẩn bị mơi trường dinh
dưỡng, phương pháp khử trùng.
- Phân lập, cấy chuyền VSV.
- Làm tiêu bản, quan sát tế bào VSV.
- Đếm tế bào men bằng Buồng đếm hồng cầu.
- Khảo sát 1 số phản ứng sinh hóa của vi khuẩn.
3. Yêu cầu của GV với SV:
- Yêu cầu kiến thức: chuẩn bị bài trước khi đến phịng thí nghiệm. GV
sẽ kiểm tra bài, nếu bất kì SV nào trong nhóm khơng chuẩn bị bài, cả
nhóm sẽ bị nghỉ buổi học đó và khơng được dạy và học lại.
- Sau khi kết thúc môn học, SV có 5-10 ngày để viết báo cáo. Nộp bài
cho 1 bạn (có chỉ định) trong nhóm. Bài báo cáo có ghi rõ họ, tên,
nhóm, tổ. Bài báo cáo SV có thể đánh máy hoặc viết tay.

- Yêu cầu kĩ năng: quan sát GV thực hiện thao tác và làm đúng các yêu
cầu khi thực hiện thao tác nuôi cấy VSV, làm tiêu bản, quan sát kính
hiển vi (KHV).
- Yêu cầu thái độ: nghiêm túc, nhanh nhẹn, thực hiện đúng quy định
trong PTN và các yêu cầu của GV. Tham gia tích cực trả lời câu hỏi
của GV cũng như đặt câu hỏi trong buổi học.


BÀI 1: MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG. PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG
1.1 Các thiết bị trong phịng thí nghiệm:
Thiết bị

Mục đích

Cân

Cân hóa chất, cân mơi trường

Bếp khuấy từ

Khuấy trộn, hịa tan, gia nhiệt các loại môi trường

Máy đồng nhất mẫu

Phân tán vi sinh vật vào mẫu đồng nhất

Nồi hấp tiệt trùng

Tiệt trùng mơi trường, dụng cụ bằng hơi nước bão hịa
ở nhiệt độ cao, áp suất cao

Tủ sấy

Sấy khô các dụng cụ bằng thủy tinh

Kính hiển vi

Quan sát tế bào VSV

Tủ lạnh

Bảo quản mẫu, vi sinh vật, môi trường

Tủ ủ

Ủ, nuôi cấy VSV ở nhiệt độ mong muốn

1.2 Môi trường nuôi cấy VSV:
1.2.1 Khái niệm:
Môi trường nuôi cấy VSV là môi trường chứa các chất dinh dưỡng cần thiết
cho sinh trưởng và phát triển của VSV.
1.2.2 Yêu cầu của môi trường dinh dưỡng ni cấy VSV: “đủ chất và đủ
lượng”
 Có đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết.
 Có độ pH thích hợp.
 Có độ nhớt nhất định.
 Khơng chứa các yếu tố độc hại.
 Tuyệt đối vô trùng.
1.2.3 Phân loại:

1.2.3.1

Phân loại môi trường theo công dụng:
- Môi trường tăng sinh
- Môi trường chọn lọc
- Môi trường phân biệt
- Môi trương chọn lọc – phân biệt

1.2.3.2

Phân loại môi trường theo thành phần hóa học:

Mơi trường tự nhiên

Gồm các hợp chất tự nhiên, chưa xác định rõ thành
phần

Môi trường tổng hợp

Môi trường đã biết thành phần hóa học

Mơi trường bán tổng

Trong mơi trường này đã có chứa một số hợp chất từ

hợp

nguồn gốc tự nhiên và một số chất hóa học đã biết roc
thành phần hóa học

1.2.3.3

Phân loại mơi trường theo trạng thái vật lí:

Trạng thái vật lý

Hàm lượng Agar/lit

Cơng dụng của môi trường

Môi trường lỏng

0g/lit

Nhân giống

Môi trường rắn

15-20g/lit

Phân lập, cấy truyền

Môi trường bán lỏng

4-5g/lit

Kiểm tra khả năng di động

(thạch mềm)

1.2.4 Cơng thức mơi trường:
Các thơng tin có trong cơng thức môi trường:
 Tên môi trường: Xylose Lysine Deoxycholate Agar (XLD Agar)
 Mục đích: ni cấy Salmonella


 Thành phần và số lượng:
+ Yeast extract: ......................................................................3gm
+ L-Lysine: ............................................................................5gm
+ Lactose: ..............................................................................7.5gm
+ Sucrose: ..............................................................................7.5gm
+ Xylose: ...............................................................................3.5gm
+ Sodium chloride:.................................................................5gm
+ Sodium deoxycholate: ........................................................2.5gm
+ Sodium thiosulfate: ............................................................6.8gm
+ Phenol red: .........................................................................0.08gm
+ Agar: ...................................................................................15gm
 pH: 7,4 ± 0,2
 Chế độ khử trùng: 121ᵒC / 15’ / 0,1 Mpa
1.2.5 Các bước để nấu môi trường:
B1: Cân đong hóa chất theo cơng thức
B2: Đun nếu cần
B3: Kiểm tra pH
B4: Phân phối môi trường vào dụng cụ thủy tinh
B4: Khử trùng
1.3 Phương pháp khử trùng:
1.3.1 Khử trùng môi trường:


Phương pháp

Tiệt trùng bằng

Nhiệt độ/thời gian
121ᵒC / 15’ / 0,1 Mpa

nồi hấp

Nguyên lý khả năng diệt VSV
Dùng hơi nước bão hòa ở nhiệt độ
cao, áp suất 0,1 Mpa để tiêu diệt bào
tử và tế bào sinh dưỡng của VSV

Thanh trùng

80-100ᵒC / 15-30’

Pastuer

Đun cách thủy để tiêu diệt tế bào sinh
dưỡng của VSV

Tiệt trùng

80-100ᵒC / 15’ trong

Tyldan

3 ngày liên tiếp

Tiêu diệt tế bào sinh dưỡng và bào tử

1.3.2 Khử trùng dụng cụ:
 Dụng cụ thủy tinh:
+ Nồi hấp tiệt trùng (phương pháp nhiệt ẩm)
+ Tủ sấy (phương pháp nhiệt khô): 180ᵒC / 30’ hoặc 160ᵒC / 2h
 Dụng cụ nhựa: nồi hấp tiệt trùng
 Khử trùng PTN: tia tử ngoại, đèn UV


BÀI 2: PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VÀ CẤY CHUYỀN VSV
2.1 Phân lập:
2.1.1 Khái niệm:
Phân lập VSV là quá trình tách riêng các loài VSV từ quần thể ban đầu và đưa
về dạng khuẩn lạc.
2.1.2 Mục đích phân lập
- Để nghiên cứu các đặc điểm về hình thái, tính chất sinh lí, sinh hóa của vi
sinh vật
- Tạo ra được dịng thuần
2.1.3 Phương pháp phân lập:
VSV

Men,
VK

Que cấy

Phương Pháp

Que cấy
vòng

2.2 Phương pháp cấy chuyền
2.2.1 Khái niệm:
Cấy chuyền là truyền vi sinh vật từ mơi trường này sang mơi trường khác
2.2.2 Mục đích:
- Giúp bảo quản, nhân giống và sinh hóa
- Bảo tồn vi sinh vật thuần khiết


2.2.3 Phương pháp cấy chuyền:
VSV

Môi trường

Que cấy

Phương pháp
B1: Viết tên VSV
B2:Khử trùng que cấy trên ngọn lửa đèn
cồn.

Lỏng

B2: Lấy mẫu VSV.
Que cấy B3: Mở ống đã được chuẩn bị để cấy
vòng

VSV đưa que cấy vào phần dịch lỏng rồi
rút ra.

Men,

Thao tác giống môi trường lỏng chỉ

vi
khuẩn

khác ở chỗ que cấy chứa VSV được đưa

Thạch nghiêng

vào cuối phần thạch nghiêng và cấy zíc
zắc lên
Thao tác giống mơi trường lỏng chỉ

Thạch nghiêng sâu

Que cấy khác ở chỗ dùng que cấy thẳng đút sâu
thẳng

Thạch đứng
2.3 Kết quả thực hành:

vào và kéo dần lên theo đường zíc zắc
Giống thạch nghiêng sâu


Hinh anh kêt qua phương phap cây chuyền

Mặt trước

Mặt sau
Hình ảnh nấm men được phân lập trên đĩa petri trong môi trường Sab


BÀI 3: PHƯƠNG PHÁP LÀM TIÊU BẢN VÀ QUAN SÁT TẾ BÀO VSV
3.1 Quan sát đại thể:
Quan sát khuẩn lạc bằng mắt để thấy được đặc điểm của khuẩn lạc như màu sắc,
hình dạng, đường kính, độ vun, bóng, nhăn, có sợi…
Việc quan sát đại thể các khuẩn lạc điển hình trên mơi trường phân lập chọn lọc
giúp dự đốn được đó là VSV nào.
Sinh viên mơ tả khuẩn lạc cuả VSV mình đã phân lập ở Bài 2:
Khuẩn lạc của S.C(nấm men) trên mơi trường PDA
Hình dạng: trịn

Bờ, mép khuẩn lạc: nhẵn, trịn

Đường kính: 1mm

Màu sắc: trắng đục

3.2 Quan sát vi thể
Làm tiêu bản và quan sát tiêu bản đó dưới kính hiển vi để thấy được:
 Quan sát đặc điểm sinh học của nấm mốc:
+ Đặc điểm của sợi nấm: màu sắc, có vách ngăn hay khơng có vách ngăn
+ Đặc điểm của cơ quan sinh sản: hình dạng, cách sắp xếp các bộ phận của
cơ quan sinh sản.
+ Hình dạng, cấu tạo, cách sắp xếp của bào tử.
 Quan sát đặc điểm sinh học của nấm men:

+ Hình thái, kích thước tế bào nấm men.
+ Sự nảy chồi của nấm men.
+ Hình dạng, số lượng bào tử trong 1 túi bào tử.
 Quan sát đặc điểm sinh học của vi khuẩn:


+ Hình thái, cấu tạo của vi khuẩn.
+ Xác định vi khuẩn thuộc nhóm Gram+ hoặc Gram-.
3.2.1 Làm tiêu bản nấm mốc (phương pháp giọt ép)
3.2.2 Làm tiêu bản bằng phương pháp nhuộm đơn:
B1: Ghi tên VSV. Làm vết bôi.
B2: Cố định vết bôi: hơ trên ngọn lửa đền cồn đến khi vết bôi khô.
B3: Nhuộm màu (sử dụng 1 trong các loại thuốc nhuộm sau: Gentiant Violet,
Fuschin, Xanh metylen, Xanh coton…). Nhỏ thuốc vào vết bôi đã cố định,
để 1 phút, rửa nước.
B4: Quan sát tiêu bản dưới KHV. Khi thực hiện thao tác, sử dụng thuốc
nhuộm màu gì thì tế bào sẽ bắt màu đó.
Phương pháp nhuộm đơn thường áp dụng cho nấm men. Khi sử dụng phương pháp
này để nhuộm màu vi khuẩn thì lúc quan sát KHV sẽ chỉ thấy được: Hình dạng,
kích thước, màu sắc và cách sắp xếp của tế bào VSV.
3.2.3 Làm tiêu bản bằng phương pháp nhuộm kép:
B1: Ghi tên VSV. Làm vết bôi
B2: Cố định vết bôi: Hơ trên ngọn lửa đèn cồn đến khi vết bơi khơ.
Mục đích:
+ Giết chết VSV
+ Gắn chặt VSV trên
lame

+ Giúp VSV dễ bắt màu thuốc nhuộm
+ Giúp VSV không bị trôi khi rửa

nước

B3: Nhuộm màu:
 Nhỏ thuốc nhuộm Gentiant Violet. Để 1 phút. Rửa nước.
 Nhỏ Lugol. Để 1 phút. Rửa nước. Tẩy cồn. Rửa nước.
 Nhỏ thuốc nhuộm Safranin. Để 30 giây. Rửa nước.
B4: Quan sát KHV vật kính 100. Vẽ hình quan sát được:



Bài tập ở nhà:
1. So sánh phương pháp nhuộm đơn và nhuộm kép. SV trả lời theo gợi ý
trong bảng 1.
Bảng 1. So sánh pp nhuộm đơn, nhuộm kép
Nhuộm đơn
Giống
Khác
nhau

Quy trình
sản xuất

Mục đích

Nhuộm kép

Cố định vết bơi rồi nhuộm và để quan sát dưới
kính hiển vi
Nhuộm màu 1 lần ( sử
Nhuộm màu 2 lần, đầu

dụng 1 trong các loại
tiên nhỏ thuốc nhuộm
thuốc nhuộm: Fuschin, Gentiant violet (Crystal
xanh metylen, xanh
violet), sau đó nhỏ
coton, Gentiant violet)
Lugol, nhuộm thêm 1
lần nữa bằng thuốc
nhuộm Fuschin ( hoặc
Safranin).
Giúp phân biệt 2 nhóm Giúp quan sát và phân
VK (gram – và gram +) biệt cấu trúc tế bào dễ
dàng hơn so với việc
nhuộm đơn.

2. Tại sao phải nhỏ dầu xem kính lên tiêu bản khi quan sát kính hiển vi ở
vật kính 100?
Phải nhỏ dầu xem kính lên tiêu bản khi quan sát KHV ở vật kính 100 vì:
 Dầu soi là một trong những phụ kiện KHV không thể thiếu khi sử dụng với
chức năng dùng để quan sát các vật mẫu có kích thước siêu hiển vi mà độ
phóng đại của kính khơng thể làm rõ vật mẫu. Đặc điểm của Dầu soi KHV
là dầu trong suốt, có chỉ số khúc xạ cao.
 Ở vật kính 100, vật kính cần phải sử dụng kết hợp với dầu soi kính hiển vi,
loại vật kính này được gọi là vật kính ngâm dầu. Dầu soi hỗ trợ làm tăng độ
phân giải hình ảnh, cho chất lượng hình ảnh khi quan sát rõ nét hơn. Sử
dụng dầu soi vào trực tiếp mẫu vật cần quan sát sau đó dùng vật kính ngâm
dầu để quan sát có độ phóng đại và chất lượng hình ảnh tốt nhất.


3. Giải thích cơ chế bắt màu tím của VK gram (+) và bắt màu hồng của

VK gram(-)
- Vi khuẩn Gram + có lớp Peptidoglycan dày, nhiều Acid teichoic, chúng
khơng bị ảnh hưởng bới sự tẩy màu bằng cồn, vẫn giữ ngun được màu
tím ban đầu.
- Vi khuẩn Gram- có lớp Peptidoglycan mỏng gắn với màng Phospholipid
kép, xen kẽ với protein ở màng ngoài, lớp màng này dễ bị phá hủy khi tẩy
màu, do đó phức hợp tinh thể Gentiant-Iod không bền, bị tẩy màu và màu bị
thay bởi thuốc nhuộm bổ sung.


BÀI 4: ĐẾM TRỰC TIẾP NẤM MEN BẰNG BUỒNG ĐẾM HỒNG CẦU
4.1 Giới thiệu buồng đếm hồng cầu (BĐHC):
BĐHC là phiến kính thủy tinh hình chữ nhật, trên đó có khắc lưới đếm.
Lưới đếm là một hình vng, có cạnh 1mm, gồm 25 ô vuông lớn, 1 ô vuông lớn có
16 ơ vng nhỏ; các ơ vng lớn chia cắt nhau bởi 3 đường kẻ song song, chiều
cao đường khắc trên lưới đếm là 0,1mm
S lưới đếm = 1mm2

S ô vuông nhỏ = mm2
V ô vuông nhỏ = mm2

S ô vng lớn = mm2

Hình 1: Buồng đếm hồng cầu

Hình 2: Lưới đếm


Hình 3: Lưới đếm quan sát ở vật kính 10 dưới KHV
Từ vật kính 10, SV chuyển qua vật kính 40 để thấy được hình ảnh 1 ơ vng lớn.

SV quan sát và tìm đúng 4 ơ vng lớn ngồi cùng ở 4 góc.

Hinh 4: 4 ơ vng lớn ở 4 góc của lưới đếm ở vật kính 40
4.2 Quy trình đếm nấm men
Bước 1. Pha lỗng dịch mẫu


Hình 5: Quy trình pha lỗng mẫu
Bước 2. Đưa dịch mẫu vào lưới đếm
Bước 3. Đếm tế bào nấm men
Quan sát lưới đếm ở vật kính 10, chuyển qua vật kính 40 để đếm các tế bào trong
5 ơ vng lớn theo vị trí đường chéo góc. Ghi lại kết quả.
Cách đếm: Đếm tất cả tế bào trong ô vuông lớn và tế bào nằm trên 2 cạnh liên tiếp
(hình 6)

Hình 6: Cách đếm tế bào trong ơ vng lớn


4.3Tính kết quả:
A: Tổng số tế bào đếm được ở 5 ơ vng

V: thể tích ơ vng nhỏ

lớn

1000: hệ số chuyển mm3 thành mL

10-n: nồng độ pha loãng được đếm
Theo kết quả quan sát: A= 272
Số TB/ml = x 1000

= x 1000
= x 4000 x 102 x 1000 = =1360000000 (TB/ml)
Kết quả của nhóm
Số tế bào trong 5 ơ lớn
Ơ 1: 36

Ô2 : 42

Ô 3: 59

Ô 4: 71

Ô 5: 64

4.4 Ưu và nhược điểm của phương pháp đếm trực tiếp tế bào nấm men bằng
Buồng đếm hồng cầu:
 Ưu điểm: cho kết quả nhanh chóng, thường được dùng để đếm những vi
sinh vật có kích thước lớn như nấm men, bào tử nấm mốc.
 Nhược điểm:
+ Không phân biệt được số tế bào sống và tế bào chết.
+ Dễ nhầm lẫn tế bào vi sinh vật với các vật thể khác trong mẫu.
+ Sai số cao.
4.5Ứng dụng của đếm trực tiếp nấm men trên Buồng dếm hồng cầu:
Dùng để đếm tế bào hồng cầu trong máu, nấm men và vẽ đường cong sinh
trưởng.


BÀI 5: KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH SINH HĨA CỦA VSV
5.1

Mục đích
- Góp phần định danh VK (Gram -)
- Khảo sát tính chất sinh lý của vi khuẩn
5.2 Yêu cầu khi thực hiện phản ứng sinh hóa
Yêu cầu về VSV:
- VSV phải ở pha phát triển, còn non
- VSV phải thuần khiết
Yêu cầu thời gian đọc kết quả: sau 24 – 48 giờ ni cấy
5.3
Phản

Một số phản ứng cơ bản:

Mục đích

Mơi trường

ứng

Cách thực

Ngun lí

hiện

Simon

Xác định

Citrate

khả năng
VSV sử

 Tên mơi trường: Simon Cấy VSV
Citrate Agar
 pH: 6,9 ± 0,2

dụng
Simon
Citrate

 Chất chỉ thị màu:
Bromothymol Blue

như nguồn  Thành phần:
Carbon
duy nhất

+ Amonium

quả
VSV sử dụng

Dương

vào mơi

Citrate sinh ra

tính: màu

trường SCA

CO2 làm kiềm

xanh da

Ủ 24-48h,

hóa mơi trường.

trời.

nhiệt độ

VSV sử dụng

Âm tính:

37ᵒC

nguồn đạm duy

màu xanh

Đọc kết quả

nhất là Amonium

lá hoặc

để tạo ra NH3 làm màu vàng

Dihydrogen

kiềm hóa môi

Phosphate: 1g

trường.

+ Dipotassium
Hydrogen
Phosphate: 1g
+ NaCl: 5g

Đọc kết

NH4+ → NH3+

nhạt


+ Sodium Citrate: 2g
+ MgSO4 : 0,2g
+ Bromothymol Blue:
0,08g
+ Agar: 13g

Kligler

Phát hiện

Iron

khả năng

Agar

sử dụng

(K.I.A)

các nguồn
Carbonhy
drate
(glucose,
…), sinh
H2S, tạo
hơi H2,
CO2

 Tên môi trường:
Kligler Iron Agar
 pH: 7,4 ± 0,2
 Chất chỉ thị màu:
Phenol Red
 Thành phần:

Cấy VSV

VSV sử dụng

Màu đen:

vào môi

Glucose trước và

có khí

trường KIA.

tạo ra Acid

H2S

Ủ 24-48h,

(pH<7) mơi

Nứt

nhiệt độ

trường có màu

thạch:

37ᵒC.

vàng, khi Glucose

sinh khí

hết:

H2/CO2

Đọc kết quả.

+ Peptone: 20g

Nếu khơng sử

+ Lactose: 10g

dụng được

vàng: lên

Lactose thì Acid

men

yếu chuyển

glucose

+ Glucose: 1g
+ NaCl: 5g
+ Feric Ammonium
Sulfat: 0,2g
+ Agar: 13g
+ Phenol red: 0,025g

Vàng /

thành muối kiềm và lactose
(pH>7), mơi
Đỏ /
trường có màu
vàng: lên
đỏ một phần ở
men
trên, H2S tác
glucose
dụng với Fe tạo
kết tủa đen ở bề
mặt.
Nếu sử dụng


Lactose thì
Lactose lên men
tạo Acid (pH<7),
mơi trường có
màu vàng.
Khơng sử dụng

Lactose và
Glucose, mơi
trường có màu
đỏ.
Sinh

Phát hiện

Indol

khả năng
oxy hóa

 Tên mơi trường:
Tryptophan Broth
 pH: 6.8 ± 0,2

tryptophan
thành các
dạng của
indol.

 Thuốc thử: Kovac’s

Cấy VSV

Tryptophan được

Dương

vào mơi

vi khuẩn sử dụng

tính: có

trường.

nhờ enzyme

vịng

Ủ 24-48h,

tryptophan để tạo

trong

nhiệt độ

thành indol.

màu đỏ.

37ᵒC.

Indol + thuốc thử
Kovac’s → màu
đỏ.

Âm tính:

Nhỏ vài giọt

màu vàng

thuốc thử

(màu

Kovac’s.

thuốc

Đọc kết quả.

thử)