THỬ NGHIỆM CHIẾT XUẤT KHÁNG THỂ SAU KHI TIÊM VACCINE DỊCH TẢ HEO CHO THỎ

B

GIÁO D C VÀ ĐÀO T O

TRƯ NG Đ I H C NƠNG LÂM THÀNH PH

H

CHÍ MINH

KHOA CHĂN NI – THÚ Y

KHÓA LU N T T NGHI P

TH

NGHI M CHI T XU T KHÁNG TH SAU KHI TIÊM
VACCINE D CH T HEO CHO TH

H và tên sinh viên:

Nguy n H ng Sơn

Ngành:

Thú y

Niên khóa:

2003 – 2008

Tháng 9/2008


TH

NGHI M CHI T XU T KHÁNG TH SAU KHI TIÊM VACCINE
D CH T HEO CHO TH

Tác gi

NGUY N H NG SƠN

Khóa lu n đư c đ trình đ đáp ng yêu c u c p b ng Bác s Thú y

Giáo viên hư ng d n
BSTY. Nguy n Kiên Cư ng
PGS.TS. Tr n Th Dân

Tháng 9/2008
i


L I C M ƠN
Tôi xin chân thành c m ơn:
- Ban Giám Hi u trư ng Đ i h c Nơng Lâm Tp. H Chí Minh
- Ban ch nhi m Khoa cũng như tồn b q th y cơ trong Khoa Chăn Nuôi – Thú
Y, quý th y cô Khoa Cơ B n và tồn th cán b cơng nhân viên trư ng đã h t lịng d y
d , giúp đ cho tơi trong su!t th i gian h c t p t i trư ng.
- PGS. TS. Tr n Th Dân và BSTY. Nguy n Kiên Cư ng ñã tr"c ti p hư ng d n và
giúp ñ tôi trong th i gian th"c hi n ñ# tài t!t nghi p.

- Các nhân viên thu c phòng Mi n d ch vi n Pasteur Tp. HCM ñã t n tình giúp đ ,
ch$ b o trong th i gian làm vi c t i vi n.
- Con vô cùng ghi ơn ba m% cùng nh&ng ngư i thân trong gia đình đã ln t o m i
đi#u ki n t!t v# tinh th n cũng như v t ch t cho con trong su!t quá trình h c t p.
- Các b n bè trong và ngoài l p đã h t lịng giúp đ , đ ng viên tôi
Nguy n H ng Sơn

ii


TÓM T T
Th i gian nghiên c u: t' tháng 2/2008 ñ n tháng 8/2008
Đ a ñi m nghiên c u:
Vi n Pasteur Tp. HCM
Trung Tâm Thú Y Vùng Tp. HCM
Phịng thí nghi m Sinh Lý trư ng Đ i h c Nơng Lâm Tp.HCM
Khu tr i bị trư ng Đai h c Nông Lâm Tp.HCM
V i m(c tiêu là tìm hi u phương pháp chi t xu t kháng th b ng ammonium
sulphate, ñ ng th i xem xét kh năng ñáp ng c a th) sau khi tiêm vaccine dich t , ñ# tài
ñư c ti n hành 2 ñ t.
Đ t 1 th* li#u tiêm vaccine và xét nghi m huy t thanh b ng phương pháp ELISA, t t
c các m u sau khi xét nghi m đ#u cho k t qu âm tính.
Đ t 2 xem xét kh năng đáp ng c a 2 nhóm th) v i vaccine, nhóm 2 đư c tiêm li#u
g p đơi nhóm 1, b ng cách l p cơng th c b ch c u và xét nghi m ELISA. Đ ng th i ti n
hành thu nh n huy t thanh, t a trong ammonium sulphate bão hòa, và thu h i b ng
phương pháp th+m tích đ tinh chi t kháng th (ch$ ti n hành tinh chi t kháng th ñ!i v i
huy t thanh thu nh n vào ngày th 30). K t qu tóm t,t c a ñ t 2 như sau:
- T- l các lo i b ch c u trung tính, b ch c u ñơn nhân và lâm ba c u . 2
nhóm có đi m chung là giai đo n ñ u t- l b ch c u trung tính tăng, giai ño n ti p theo tl b ch c u ñơn nhân tăng và giai ño n cu!i t- l lâm ba c u tăng.
- Ti n hành xét nghi m ELISA cho 2 nhóm vào ngày 1, ngày 20 (sau mũi

nh,c l i l n 3) và ngày 30 (sau mũi nh,c l i l n 4) k t qu là: / nhóm 1, th) 1 và th) 3
cho k t qu dương tính cịn th) 2 cho k t qu âm tính vào ngày 20 và 30 (th) 3 vào ngày
20 nghi ng có kháng th trong huy t thanh). / nhóm 2, th) 2 và th) 3 cho k t qu dương
tính cịn th) 1 cho k t qu âm tính vào ngày 20 và 30.
- Qua ph n trăm c ch (PI), nh n th y r ng hàm lư ng kháng th trong huy t
thanh sau khi tinh chi t cao hơn hàm lư ng kháng th trư c khi tinh chi t.

iii


M CL C
Chương 1. M

Đ U ..........................................................................................................1

1.1. Đ0T V1N Đ2 ........................................................................................................1
1.2. M3C TIÊU VÀ YÊU C4U....................................................................................1
1.2.1. M(c tiêu ...................................................................................................1
1.2.2. Yêu c u.....................................................................................................1
Chương 2. T NG QUAN...................................................................................................2
2.1. ĐÁP 5NG MI N D6CH.........................................................................................2
2.1.1. Kháng nguyên ..........................................................................................2
2.1.2. Kháng th .................................................................................................3
2.1.3. Các y u t! nh hư.ng ñ n kh năng ñáp ng mi n d ch c a ñ ng v t....4
2.1.4. Cơ ch hình thành đáp ng mi n d ch .....................................................8
2.2. KHÁI QUÁT V2 CÔNG TH5C B7CH C4U ......................................................9
2.3. VIRUS D6CH T8 HEO ........................................................................................10
2.3.1. Đ9c đi m hình thái .................................................................................10
2.3.2. Đ c l"c ...................................................................................................10
2.3.3. Đ9c đi m ni c y phân l p...................................................................11

2.4. VACCINE D6CH T8 HEO ..................................................................................11
2.3.1. Vaccine th h m i.................................................................................11
2.3.2. Vaccine ch t ...........................................................................................11
2.3.3. Vaccine như c ñ c.................................................................................11
2.5. CHI:T XU1T KHÁNG TH; ..............................................................................13
2.5.1. T a b ng ammonium sulphate ...............................................................13
2.5.2. Phương pháp tinh chi t b ng h th!ng gel l c.......................................15
2.5.3. Phương pháp tinh chi t b ng s,c ký ái l"c.............................................16
2.6. LƯ=C DUY>T M?T VÀI NGHIÊN C5U LIÊN QUAN ..................................17

iv


Chương 3. N I DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP ...............................................................18
3.1. TH@I GIAN VÀ Đ6A ĐI;M................................................................................18
3.1.1. Th i gian ................................................................................................18
3.1.2. Đ a ñi m .................................................................................................18
3.2. N?I DUNG NGHIÊN C5U.................................................................................18
3.3. VAT LI>U THÍ NGHI>M ...................................................................................18
3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C5U ........................................................................19
3.4.1. Gây ñáp ng mi n d ch trên th).............................................................19
3.4.2. L p công th c b ch c u..........................................................................22
3.4.3. Thu nh n huy t thanh và kháng th .......................................................22
3.5. CHB TIÊU THEO DÕI..........................................................................................25
3.6. XC LÝ SD LI>U ..................................................................................................25
Chương 4. K T QU VÀ TH O LU N.......................................................................26
4.1. ĐÁP 5NG CEA THF KHI TIÊM VACCINE ....................................................26
4.1.1. Đ t 1.......................................................................................................26
4.1.2. Đ t 2.......................................................................................................26
4.2. PH4N TRĂM 5C CH: (PI) CEA HUY:T THANH NGUYÊN VÀ SAU KHI

THHM TÍCH...................................................................................................................31
Chương 5. K T LU N VÀ Đ NGH ...........................................................................35
5.1. K:T LUAN...........................................................................................................35
5.2. Đ2 NGH6 ..............................................................................................................35
TÀI LI U THAM KH O................................................................................................36
PH N PH L C ..............................................................................................................38

v


DANH SÁCH CÁC CH

VI T T T

Ch vi t t t

Ti ng Anh

Ti ng Vi t

APC

Antigen presenting cell

T bào trình di n kháng
nguyên

ELISA

Enzyme – linked immuno

K thu t h p ph( mi n d ch

sorbent assay

g,n enzyme

FDC

Follicular dendritic cell

T bào tua . nang

Ig

Immunoglobulin

Globulin mi n d ch

MHC II

Major histocompatibility

Các kháng nguyên phù h p

complex class II antigens

tI ch c chính l p II

Surface immunoglobulin

Globulin mi n d ch màng t

SIg

bào
TH

Helper T cells

T bào lympho T h tr

TI

Inducer T cells

T bào lympho T c m ng

TDTH

Delayed type hypersensitivity

T bào lympho T gây quá

T cells

m n mu n

vi

DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1

Kháng ngun

2

Hình 2.2

C u trúc phân t* kháng th

3

HÌnh 2.3

Phương pháp th+m tích

14

Hình 2.4

S,c ký gel l c

15

Hình 2.5

S,c ký ái l"c

16

Hình 3.1

Chu ng ni th)

18

Hình 3.2

L y máu đ ng m ch gi&a tai

22

Hình 3.3

Th"c hi n th+m tích

24

Hình 3.4

Xét nghi m ELISA

25

vii

DANH SÁCH CÁC B NG
Trang
B ng 2.1

B ng công th c b ch c u c a m t s! gia súc nh) ................................. 9

B ng 2.2

M t s! lo i vaccine DTH s* d(ng t i Vi t Nam hi n nay ................... 12

B ng 3.1

Th i ñi m l y máu và tiêm vaccine ñ t . 1 ......................................... 20

B ng 3.2

Th i ñi m l y máu, tiêm vaccine, xét nghi m và l p công th c
b ch c u . ñ t 2.................................................................................... 21

B ng 4.1

K t qu ELISA ñ t 1 ............................................................................ 26

B ng 4.2

T- l b ch c u trung tính, đơn nhân và lâm ba c u
c a th) ñ!i ch ng.................................................................................. 27

B ng 4.3

T- l b ch c u trung tính, ñơn nhân và lâm ba c u
c a m i th) nhóm 1 .............................................................................. 28

B ng 4.4

T- l b ch c u trung tính, đơn nhân và lâm ba c u
c a m i th) nhóm 2 .............................................................................. 29

B ng 4.5

K t qu ELISA ñ t 2 ............................................................................ 31

B ng 4.6

K t qu PI c a huy t thanh nguyên khi ELISA ................................... 32

B ng 4.7

PI c a th) I1 và th) I3 nhóm 1 ............................................................. 32

B ng 4.8

PI c a th) II2 và th) II3 nhóm 2........................................................... 32

B ng 4.9

So sánh PI trong huy t thanh và PI sau khi th+m tích .......................... 33

viii

DANH SÁCH CÁC BI U Đ
Trang
Bi u ñ 4.1 T- l c a ba lo i b ch c u . th) ñ!i ch ng qua các ngày .................... 27
Bi u đ 4.2 Trung bình c a ba lo i b ch c u . th) nhóm 1 qua các ngày............... 28
Bi u đ 4.3 Trung bình c a ba lo i b ch c u . th) nhóm 2 qua các ngày............... 29
Bi u đ 4.4 PI trung bình c a th) nhóm 1và nhóm 2 vào ngày 20 và 30 ................ 33
Bi u ñ 4.5 PI c a huy t thanh nguyên và PI c a d ch th+m tích............................ 34

ix


Chương 1
M Đ U
1.1. Đ!T V N Đ
Ngày nay, vi c s n xu t nhi#u lo i kháng th ph(c v( cho cơng tác ch+n đốn ho9c
dùng trong đo lư ng hàm lư ng ch t n i ti t ñang tr. nên c p thi t. Kháng th sau khi
tinh s ch có th đư c s* d(ng làm b kít, chJng h n b kít trong phương pháp ELISA,
ñây là m t trong nh&ng phương pháp xét nghi m cho k t qu khá nhanh và chính xác.
Hi n t i có nhi#u phương pháp đ chi t xu t kháng th , hai phương pháp thư ng
đư c s* d(ng là phương pháp s,c kí và phương pháp s* d(ng ch t In ñ nh như
ammonium sulphate. Phương pháp s,c kí cho hàm lư ng kháng th cao tuy nhiên như c
ñi m c a phương pháp này là địi h)i ph i có trang thi t b , nguyên li u ñ,t ti#n và kĩ
thu t th"c hi n ph c t p. Riêng v i phương pháp s* d(ng ammonium sulphate, ngoài vi c
cho ra hàm lư ng kháng th tương ñ!i t!t, phương pháp này ñơn gi n và d th"c hi n.
V i m(c đích tìm hi u v# k thu t cũng như hi u qu c a phương pháp s* d(ng
ch t In ñ nh ammonium sulphate trong chi t xu t kháng th , ñư c s" cho phép c a Khoa
Chăn nuôi – Thú y cùng v i s" hư ng d n c a BSTY. Nguy n Kiên Cư ng và PGS.TS.
Tr n Th Dân chúng tôi ñã th"c hi n ñ# tài “Th" nghi m chi t xu#t kháng th$ sau khi
tiêm vaccine d%ch t& heo cho th'”.

1.2. M C TIÊU VÀ YÊU C U
1.2.1. M(c tiêu
Áp d(ng k thu t tách chi t kháng th t' thú thí nghi m.
1.2.2. Yêu c)u
Tiêm các li#u vaccine d ch t heo cho th) thí nghi m.
Thu nh n huy t thanh t' th) thí nghi m.
Li trích kháng th b ng ammonium sulphate và bao th+m tích.


Chương 2
T NG QUAN
2.1. ĐÁP *NG MI+N D CH
2.1.1. Kháng nguyên
2.1.1.1. Đ%nh nghĩa
Có th t m hi u kháng nguyên là nh&ng ch t có đ9c tính như sau:
- Tính sinh mi n d ch: kh năng kích thích cơ th có m t đáp ng mi n d ch.
- Tính đ9c hi u: kh năng k t h p ñ9c hi u v i kháng th trong mi n d ch
d ch th . Riêng trong mi n d ch trung gian qua t bào, kháng nguyên có kh năng k t h p
ñ9c hi u v i các th( th trên b# m9t lympho T m n c m.
2.1.1.2. Khái ni m epitop
Epitop là nh&ng c u trúc trên b# m9t c a phân t* kháng nguyên, và có kh năng kích
thích t o kháng th chun bi t.
Epitop có 2 đ9c tính:
Tính kháng ngun:
là đ9c tính c a m t epitop có c u
trúc ba chi#u liên k t bI sung v i
ph n c u trúc ba chi#u c a phân t*
kháng th . Ph n c u trúc này c a
phân t* kháng th ho9c c a th( th
đư c g i là paratop.

Tính

mi n

epitop gây ra m t ñáp
d ch trong m t cơ th .

d ch:
ng mi n

Hình 2.1: Kháng nguyên
( />rchive.html)


N u kháng ngun là protein thì kích thư c c a m t epitop kháng nguyên vào
kho ng 5 – 10 acid amin. M t phân t* kháng nguyên có th có m t ho9c nhi#u epitop. S!
lư ng epitop ph( thu c vào kích thư c c a phân t* kháng nguyên và thư ng có kho ng 1
epitop cho m i 5 kDa.
2.1.2. Kháng th$
2.1.2.1. Đ%nh nghĩa
Kháng th ñư c g i là globulin mi n d ch (Ig = immunoglobulin). / ngư i có 5
l p Ig g m IgG, IgA, IgM, IgD và IgE. / ñ ng v t tùy t'ng loài: cá chép ch$ có IgG; .
lồi nhai l i có IgA, IgM và IgG; . gà ngồi IgA, IgM và IgG cịn có IgY; IgY không
tương ng v i lo i nào trên ngư i (d n li u Lê Văn Hùng, 2002). Nhìn chung các Ig đ#u
có chung đ9c đi m: các Ig đ#u là protein hình c u.
2.1.2.2. C#u trúc c-a m.t phân t" immoglobulin
M i phân t* Ig đ#u có hai
chu i polypeptide n9ng kí hi u là
chu i H (heavy chain) và hai
chu i nh% ký hi u L (light chain).

S" khác bi t ch y u gi&a hai l p
Ig là . chu i n9ng. Các chu i H
ho9c L trên cùng m t phân t*
kháng th

bao gi

cũng gi!ng

nhau hồn tồn t'ng đơi m t. Các
chu i đư c n!i v i nhau b ng
nh&ng c u n!i disulfua (-S-S-).
Chu i nh%
Chu i nh% có tr ng lư ng

Hình 2.2: C u trúc phân t* kháng th
( />ismate5.html)

kho ng 22.000 Da, có th phân
bi t hai týp chu i nh% khác nhau đó là týp kappa (κ) và týp lamda (λ). Hai chu i này có


tính kháng ngun khác nhau hồn tồn. T$ l mang chu i nh% κ và λ c a các Ig khác
nhau gi&a các lồi.
M i chu i nh% có 214 acid amin. Th t" các acid amin 108 – 214 là hồn tồn khơng
thay đIi. Cịn các acid amin t' 1 – 107 có th thay đIi v# th t". Đo n này ñư c g i là
vùng bi n ñIi VL (variable light), trong vùng bi n ñIi có ño n thay ñIi m nh nh t g i là
vùng siêu bi n (hypervariable regions).
Chu i n9ng
Chu i n9ng có tr ng lư ng phân t* 50.000 Da, g m 446 acid amin ñư c chia làm

hai ph n: vùng h ng ñ nh CH (constand heavy) và vùng bi n ñIi VH (variable heavy).
Ngư i ta phân bi t 5 l p Ig ch

y u d"a vào s" khác nhau c a các m ch

polypeptide trong chu i n9ng. N u trong chu i n9ng c a Ig có các chu i:
- Gamma (γ) thì Ig đó đư c g i là IgG
- Muy (O) thì Ig đó ñư c g i là IgM
- Alpha (α) thì Ig đó đư c g i là IgA
- Delta (δ) thì Ig đó đư c g i là IgD
- Epsilon (ε) thì Ig đó đư c g i là IgE
Ngồi các ph n b t bi n và siêu bi n, chu i n9ng cịn m t nhóm glucid đư c g i là
oligosaccharide có nhi m v( c! đ nh bI th giúp cho kháng th d dàng bám vào b# m9t
c a t bào th"c bào và quy t ñ nh tính kháng nguyên c a phân t* kháng th .
Theo quan ñi m ngày nay, vùng siêu bi n c a chu i n9ng và chu i nh% tham gia
vào s" hình thành v trí k t h p c a kháng nguyên v i phân t* kháng th (d n li u Lê Văn
Hùng, 2002).
2.1.3. Các y u t/ &nh hư0ng ñ n kh& năng ñáp 3ng mi4n d%ch c-a đ.ng v5t
2.1.3.1. Lồi đ.ng v5t
Đáp ng mi n d ch càng tăng khi có s" khác bi t di truy#n càng l n gi&a thú gây
mi n d ch (túc ch ) v i lồi đư c s* d(ng t o kháng nguyên, b.i vì kháng nguyên sS có


nhi#u epitop l ñ!i v i túc ch . Đ!i v i h u h t các kháng nguyên protein, th) là thú
thu n ti n ñ gây mi n d ch th"c nghi m.
2.1.3.2. Y u t/ di truy6n
Kh năng ñáp ng mi n d ch c a thú còn ph( thu c vào y u t! di truy#n. V i cùng
m t lo i kháng nguyên, n u ñưa vào các cá th khác nhau sS cho ñáp ng mi n d ch khác
nhau. Thông thư ng các thú lai khác dịng có kh năng kích thích mi n d ch cao hơn các
thú lai cùng dòng.

2.1.3.3. Kháng nguyên
a. Tính l c a kháng nguyên
Đi#u ki n quan tr ng đ m t kháng ngun có tính sinh mi n d ch cao là s" khác
bi t ch ng loài gi&a túc ch và kháng nguyên.
Trong mi n d ch d ch th , kháng nguyên càng l v i túc ch bao nhiêu, kh năng
sinh mi n d ch càng cao b y nhiêu. Còn trong mi n d ch qua trung gian t bào, ch$ c n s"
khác nhau gi&a các cá th cũng gây ñáp ng mi n d ch cao.
Có m t s! thành ph n gây t" mi n d ch v i chính cơ th đó – đây là hi n tư ng do
t" kháng th . Ví d(: trong b nh viêm c u th n do cơ ch mi n d ch, cơ th sinh kháng th
ñ ch!ng l i chính c u th n c a cơ th mình.
b. C u t o hóa h c c a kháng ngun
Nhìn chung các kháng ngun là protein hay polysaccharide đ#u có tính mi n d ch
cao, ngay c khi chúng . d ng hòa tan hay trong c u trúc ph c t p.
Các ch t g m lipid, steroid, acid nucleic có tính sinh mi n d ch y u ho9c khơng có
tính sinh mi n d ch, tr' khi chúng ñư c g,n v i m t protein t i ñ tr. thành m t ph c h p
có tính sinh mi n d ch.
Các kháng ngun đư c tIng h p t' m t lo i acid amin thì có tính sinh mi n d ch
y u. Các kháng nguyên ñư c tIng h p t' hai lo i acid amin tr. lên có tính sinh mi n d ch
cao. N u trong m ch polypeptide có thêm acid amin m ch vịng (đ9c bi t là tylosin) sS
làm tăng tính sinh mi n d ch c a phân t* polypeptide đó.


c. Kích thư c c a phân t kháng nguyên
Kháng ngun có kích thư c l n và c u trúc càng ph c t p thì chúng càng d b
đ i th"c bào phát hi n và x* lí nên có tính sinh mi n d ch cao. Nh&ng kháng nguyên có
c u trúc phân t* nh) d b đ i th"c bào b) qua nên có tính sinh mi n d ch th p.
Ngoài ra, các kháng nguyên có kích thư c nh) có th g,n v i các protein mang ñ
t o ñáp ng mi n d ch.
d. Cách gây mi n d ch và li u lư ng kháng nguyên
V i nh&ng kháng nguyên m nh, ñưa kháng nguyên vào ñư ng m ch máu có th d

dàng gây đáp ng mi n d ch (ví d(: vi khu+n, virus, t bào). Nhưng v i kháng ngun hịa
tan thì ph i có quy trình gây mi n d ch thích h p, t!t nh t là ñư ng tiêm trong da, dư i da
và ph i tiêm nh,c l i nhi#u l n (d n li u Lê Văn Hùng, 2002).
N u lư ng kháng nguyên q ít thì khơng đ gây đáp ng mi n d ch. Ngư c l i,
n u lư ng kháng nguyên nhi#u quá sS gây c ch mi n d ch.
Quy trình gây mi n d ch có nh hư.ng l n t i tính sinh mi n d ch c a phân t*
kháng nguyên. Gây mi n d ch trên hai lô thú thu n ch ng v i cùng m t lo i kháng
nguyên nhưng . hai quy trình ch ng ng'a khác nhau thì đáp ng mi n d ch cũng khác
nhau. V i nh&ng kháng nguyên y u thư ng ph i ch ng ng'a b ng quy trình h t s c
nghiêm ng9t và ch ng nhi#u l n m i có đáp ng mi n d ch m nh. Trong khi đó, nh&ng
kháng ngun m nh có khi ch$ c n ch ng ng'a m t l n cũng gây ñáp ng mi n d ch
m nh.
e. Hi u ng c ng l c kháng nguyên
N u cùng m t lúc gây m n c m nhi#u lo i kháng nguyên cho con thú, kháng th
ñ9c hi u ñư c sinh ra tương ng v i m i lo i kháng nguyên; tuy nhiên, lư ng kháng th ít
nh t ngang b ng ho9c nhi#u hơn so v i khi kháng ngun đó tác d(ng m t mình. Hi n
tư ng này là s" c ng l"c kháng nguyên hay c ng kích thích kháng nguyên. Đây là cơ s.
khoa h c cho các nhà ch t o vaccine ña giá. Tuy nhiên, cũng c n ph i chú ý r ng: n u
cùng m t lúc cho con thú m n c m hai lo i kháng nguyên (m t li#u m nh, m t li#u nh%)


thì con thú ch$ ph n ng v i kháng nguyên li#u m nh. Hi n tư ng này g i là s" c nh
tranh kháng nguyên. Hi n tư ng c nh tranh kháng nguyên ch$ x y ra . hai kháng nguyên
có c u trúc hóa h c g n gi!ng nhau (d n li u Lê Văn Hùng, 2002).
f. Ph n ng th phát (ph n ng nh )
N u s* d(ng kháng nguyên cho m t con v t ñã ñư c m n c m v i kháng ngun
đó m t l n r i, hàm lư ng kháng th sS tăng s m và nhi#u hơn l n đ u (có trư ng h p g p
hàng trăm l n). Ph n ng nh này t n t i trong m t th i gian khá dài sau mũi tiêm th
nh t. Đó là nh các t bào lympho sau ti p xúc v i kháng nguyên ñã tr. thành t bào ký
c, ñ khi kháng nguyên vào l n sau sS l p t c tăng sinh thành dịng t bào có ho t tính

mi n d ch.
g. Ch t b tr
Các tá ch t ñư c s* d(ng r ng rãi ñ tăng hi u qu c a các lo i vaccine, tăng kh
năng th"c bào c a ñ i th"c bào ñ!i v i kháng nguyên. Ngoài ra, tá ch t cịn gây m t ph n
ng viêm khơng đ9c hi u làm tăng tính sinh mi n d ch.
Các nghiên c u g n ñây ñã k t lu n tá ch t có tác d(ng làm tăng lympho h tr
(helper T cells - TH). Khi bI sung tá ch t vào kháng nguyên sS làm kháng nguyên t n t i
lâu hơn trong cơ th túc ch . Kháng ngun đư c gi i phóng d n d n có tác d(ng gi!ng
như kích thích mi n d ch nhi#u l n.
M t s! lo i tá ch t: Freund’s complete adjuvant (FCA) và Freund’s incomplete
adjuvant (FIA), aluminium hydroxide (ALUM), ribi adjuvant system (RAS)…
h. S h p tác t bào
Có hai lo i đáp ng mi n d ch: ñáp ng mi n d ch qua trung gian t bào do lympho
T ph( trách và ñáp ng mi n d ch d ch th do lympho B ph( trách. Hai hình th c này có
liên quan ch9t chS v i nhau. Trong ñáp ng mi n d ch d ch th v i nhi#u lo i kháng
nguyên, s" h tr c a lympho T là r t quan tr ng. Nh&ng t bào lympho T làm nhi m v(
này ñư c g i là lympho TH.


Các kháng nguyên là protein khi vào cơ th thư ng tương tác v i các lympho TH
và ho t hóa t bào này nên thư ng có tính sinh mi n d ch m nh. Các kháng nguyên là
carbonhydrate khi vào cơ th không tương tác v i lympho TH, nên tính sinh mi n d ch
y u.
2.1.4.Cơ ch hình thành đáp 3ng mi4n d%ch
Đ/i v7i kháng ngun ph( thu.c tuy n 3c
Kháng nguyên ph( thu c tuy n c sS b ñ i th"c bào b,t và x* lý, sau đó các quy t
đ nh kháng ngun này ñư c trình di n trên b# m9t ñ i th"c bào. Các lympho T ñ n nh n
di n các quy t đ nh kháng ngun, trong đó lympho T c m ng (TI) có vai trị quan tr ng
ñ9c bi t.
Khi nh n di n ñư c quy t ñ nh kháng nguyên ñ9c hi u n m trong ph c h p kháng

nguyên c a ñ i th"c bào, lympho TI b kích thích và ti t ra y u t! C1 đ ho t hóa đ i th"c
bào. Đ i th"c bào ñư c ho t hóa sS ti t ra interleukin 1 đ tác đ ng tr. l i lympho TI. Sau
khi ñư c ho t hóa, lympho TI tăng sinh và ti t ra interleukin 2, ch t này sS tác ñ ng lên
m t lo t t bào, trư c h t là các lo i t bào lympho cùng ñ n nh n di n các quy t ñ nh
kháng nguyên ñư c trình di n trên b# m9t đ i th"c bào, đó là lympho T h tr cho
lympho B, lympho T gây quá m n mu n. Các t bào này sau khi ñã nh n di n ñư c các
quy t đ nh kháng ngun thì xu t hi n các th( th đ ti p nh n kích thích c a interleukin
2. Sau khi có hai tín hi u c n và đ , chúng ho t hóa và phát huy tác d(ng.
Lympho T gây quá m n mu n (TDTH) sS tăng sinh và ti t ra lymphokin có nh
hư.ng đ n ho t đ ng c a các t bào khác t i nơi có m9t kháng ngun, d n đ n hình
thành ph n ng viêm ki u quá m n mu n.
Đ/i v7i kháng ngun khơng ph( thu.c tuy n 3c
M t s! ít kháng nguyên có th ho t tác làm tăng sinh bi t hóa lympho B r i s n
xu t kháng th mà khơng c n s" giúp đ c a lympho T. Các kháng ngun này thư ng có
đ9c ñi m chung là m t ñ i phân t* do s" trùng phân c a các ñơn v nh) và có kh năng


ho t hóa lympho B. Ví d(: lipopolysaccharide, dextran, ficoll… (d n li u Ph m Hoàng
Phi t, 2006).
2.2. KHÁI QUÁT V CÔNG TH*C B CH C U
B ch c u trung tính có kích thư c 10 – 15 µm. Giai đo n non có nhân hình móng
ng"a, hình g y; khi già nhân chia thành 2 – 5 thùy nên còn g i là b ch c u ña nhân. T
bào này v n ñ ng amip, xuyên m ch, th"c bào m t s! v t l nh). B ch c u trung tính tăng
trong nhi#u b nh truy#n nhi m, ph n ng viêm có m , b ng ñ c, hay tiêm protein l vào
cơ th (d n li u Tr n Th Dân và Dương Nguyên Khang, 2006).
B ch c u ưa acid kho ng 14 – 20 µm, nhân hình móng ng"a, hình b u d(c, hình ba
lá. T bào ch t có h t b,t màu eosin. H t nh) có . lồi nhai l i (trâu, bị, dê, c'u), h t v'a
. heo, h t to . ng"a.
B ch c u ưa bazơ có kích thư c 10 – 18 µm. Chúng có r t ít trong máu.
Lâm ba c u có hai lo i. Lâm ba c u l n có kích thư c 10 – 18 µm, có kh năng v n

ñ ng amip gi i h n. Lâm ba c u nh) có kích thư c kho ng 6 – 10 µm.
B ch c u đơn nhân l n kho ng 14 – 22 µm, cịn g i là đ i th"c bào, có vai trị lo i
b) các mô bào ch t.
Công th c b ch c u thay đIi đi đơi v i nh&ng xáo tr n cơ quan t o máu. Ví d(: khi
b kh!i u b ch huy t làm cho lâm ba c u tăng; khi b kh!i u t y xương làm cho b ch c u
h t tăng; khi b kh!i u m ng lư i võng n i làm cho b ch c u ñơn nhân l n tăng.
B&ng 2.1: B ng công th c b ch c u c a m t s! gia súc nh)
BC ưa acid

BC ưa bazơ

Lâm ba c u

BC đơn nhân

Chó

BC trung
tính
60 – 75

3–8

0,2 – 0,6

20 – 25

2–4

Mèo

55 – 63

3–6

0,2 – 0,6

30 – 35

2–4

Th)

45 – 55

1–3

1–5

35 – 45

4–6

B

40 – 45

3–6

0,4 – 0,8

45 – 50

4–8

Loài

(d n li u Tr n Th Dân và Dương Nguyên Khang, 2006)


Ti n trình phịng v c a cơ th có th d" đốn qua s" bi n đIi c a t- l các lo i
b ch c u trong công th c b ch c u, nó chia làm 3 kỳ như sau (d n li u Tr n Th Dân và
Dương Nguyên Khang, 2006).
- Giai ño n ñ u: tIng s! b ch c u tăng cùng v i b ch c u trung tính tăng.
- Giai đo n 2: tIng s! b ch c u gi m cùng v i b ch c u ñơn nhân tăng.
- Giai ño n lành b nh: tIng s! b ch c u ti p t(c gi m, b ch c u ưa acid và
lâm ba c u tăng cao.
2.3. VIRUS D CH T HEO
Virus d ch t heo (DTH) thu c gi!ng Pestivirus c a h Flaviviridae, có đ9c đi m
khơng nhân lên trong đ ng v t khơng xương s!ng và có ph n ng chéo gi&a các virus
trong gi!ng.
2.3.1. Đ8c đi$m hình thái
- Kích thư c nh)
- Đ!i x ng 20 m9t
- Có v) b c
- Ch$ s! l,ng: 140 s
- T- tr ng: 1,13
2.3.2. Đ.c l9c
Các ch ng virus có đ c l"c cao gây ra b nh c p tính, t- l ch t cao cùng v i s"
bùng nI c a các I d ch. Heo nhi m virus cư ng ñ c sS th i virus v i s! lư ng l n trong

su!t quá trình b nh. Các ch ng có đ c l"c th p gây b nh . th bán c p tính, mãn tính
ho9c . th khơng đi n hình, gây t- l ch t cao trên bào thai và heo sơ sinh.
Các ch ng có đ c l"c khác nhau thì có t!c đ lây lan khác nhau. Tuy nhiên, s" phát
b nh còn ch u nhi#u nh hư.ng b.i các y u t! như gi!ng, tuIi, s" c nh tranh mi n d ch và
ñi#u ki n dinh dư ng (van Oirschot, 1998).


2.3.3.Đ8c đi$m ni c#y phân l5p
Trên đ ng v t c m th(: khi tiêm truy#n qua cơ th heo, các ch ng virus DTH gi&
ngun các đ9c tính gây b nh và mi n d ch c a chúng. S" thích nghi c a virus đ!i v i các
lồi ñ ng v t khác làm thay ñIi tính gây b nh c a virus ñ!i v i heo (Stadejek, 1994). Th)
là ñ ng v t ñư c chú ý nh t, ñ9c bi t là ñ t o ra nh&ng ch ng virus vaccine gi m đ c.
Trên mơi trư ng ni c y t bào, virus có th nhân lên trên m t s! l n lo i t bào,
ñ9c bi t là t bào nguyên th y t' th n heo (PK – 15 hay R.P) và c trên t bào d ch hồn
heo. Virus khơng gây b nh tích t bào trên t bào ni c y.
2.4. VACCINE D CH T HEO
2.3.1. Vaccine th h m7i
Bao g m vaccine tái tI h p E2 (gp55) và vaccine DNA mã hóa E2… Các vaccine
này ngồi vi c b o h heo ch!ng b nh DTH, còn phân bi t đư c heo có kháng th do
nhi m b nh hay do tiêm vaccine d"a trên s" phát hi n kháng th kháng protein Erns hay
NS3 (vaccine ti u ph n) hay E2 (vaccine tái tI h p). Các kháng th này ñư c g i là kháng
th ñánh d u (marker antibodies) (Koenen và ctv,1999).
2.3.2. Vaccine ch t
Ưu ñi m c a vaccine này là m c đ an tồn nhưng có như c đi m là ñáp ng mi n
d ch ch m, kém và th i gian b o h ch$ ñư c vài tháng ngay c sau khi tiêm nh,c l i
nhi#u l n.
2.3.3. Vaccine như:c ñ.c
Vaccine này t o ñư c mi n d ch cao, mi n d ch này thư ng phát tri n trong vòng
4 – 7 ngày sau tiêm phịng và kéo dài vài năm. Tuy nhiên, vì m c ñ như c ñ c chưa ñ t
yêu c u nên tính an tồn và In đ nh v# di truy#n là v n ñ# c n ñư c chú tr ng trong s n

xu t vaccine (d n li u Nguy n Ti n Dũng, 2002).


Hi n nay, nư c ta ñang s* d(ng m t vài lo i vaccine DTH như sau:
B&ng 2.2: M t s! lo i vaccine DTH s* d(ng t i Vi t Nam hi n nay

Tên thương m i c a

Ch ng virus

vaccine DTH

dùng s n xu t

(Nư c s n xu t)

vaccine

Th i ñi m tiêm l n
Cách s n xu t

đ u (heo con t' nái

vaccine

đã tiêm phịng, vùng
đe d a)

DTH ĐƠNG KHƠ
C

Th) hóa

15 – 30 ngày tuIi

Thiveral

T bào th n heo

28 – 35 ngày tuIi

C

T bào th n heo

30 ngày tuIi

C

T bào th n heo

(Vi t Nam)
COLAPEST
(Hungary)
PESTIFFA
(Pháp)
PEST – VAC

1 tu n trư c tuIi

(M )

phát b nh

PORCILIS CSF LIVE

1 – 2 tháng tuIi (lưu
GPE

T bào th n heo

(Hà Lan)

ý lư ng KT m%
truy#n)

(d n li u Nguy n Th Thu H ng, 2003)


2.5. CHI T XU T KHÁNG TH
2.5.1. T-a b;ng ammonium sulphate
Kháng huy t thanh thu đư c khơng nh&ng ch a kháng th mà cịn có m t s! ch t
khác. Đ tách kháng th ra kh)i kháng huy t thanh ta có th dùng phương pháp s,c kí, k t
tinh hay t a trong mu!i…
Phương pháp t a kháng th trong ammonium sulphate là m t trong nh&ng phương
pháp phI bi n nh t ñ tách protein ra kh)i dung d ch. Trong dung d ch, protein liên k t
v i nư c b ng các liên k t hydrogen thơng qua các nhóm ion tích đi n c a chúng. Khi
thêm vào m t lư ng l n các ion nh) và tích đi n l n như ammonium hay sulphate thì
nh&ng nhóm này c nh tranh v i protein ñ g,n vào các phân t* nư c, do đó làm gi m kh
năng hịa tan c a protein và chúng k t t a l i. Protein k t t a có th hịa tan l i trong mơi

trư ng có n ng đ ammonium sulphate th p hơn. Kh năng k t t a c a các protein khác
nhau tùy thu c vào s! lư ng và v trí các nhóm c"c tích đi n, tr ng lư ng phân t* c a
protein, pH c a dung d ch, nhi t ñ x y ra s" k t t a.
Đ t a kháng th ngư i ta thư ng s* d(ng ammonium sulphate (đơi khi dùng
sodium sulphate). N ng ñ mu!i ñ kháng th k t t a . các lồi thì khác nhau. H u h t
các kháng th c a th) có th k t t a . dung d ch mu!i bão hòa 40 %, còn . chu t kho ng
45-50 %. B.i vì h u h t các thành ph n khác c a huy t thanh không k t t a . kho ng
n ng đ mu!i này và khơng có s" khác bi t l n gi&a hai n ng ñ trên nên n ng ñ mu!i
bão hòa 50 % là m c thích h p nh t cho h u h t các ng d(ng khác nhau (d n li u
Nguy n Vân Anh, 2005).
M t ñi m b t l i c a kháng th t a trong ammonium sulphate bão hịa là kháng th
khơng đư c tinh s ch vì có các phân t* protein có tr ng lư ng phân t* l n khác cũng k t
t a. Do đó, ngồi vi c t a trong mu!i ammonium sulphate c n ph i k t h p v i m t s!
phương pháp khác (s,c ký ái l"c, s,c ký l c) n u yêu c u kháng th cu!i cùng ph i ñư c
tinh s ch hoàn toàn.


Tinh chi t kháng th$ b;ng phương pháp thM t trong các phương pháp cI ñi n ñ lo i mu!i ra kh)i protein kháng th là th+m
tích. Dung d ch protein ñư c ch a trong bao th+m tích làm b ng cellulose có th,t nút .
hai đ u. Bao này ñư c ñ9t trong c!c l n ch a dung d ch đ m có ái l"c th p và đ . nhi t
đ l nh có khu y tr n v'a ph i. Trên bao th+m tích có nh&ng l nh) cho phép nh&ng phân
t* mu!i có kích thư c nh) đi ra ngồi cịn các phân t* protein kháng th có kích thư c l n
đư c gi& l i trong bao th+m tích. S" khu ch tán các phân t* mu!i vào trong dung d ch
đ m th+m tích v n ti p t(c cho ñ n khi n ng ñ mu!i bên trong và bên ngồi bao th+m
tích đ t tr ng thái cân b ng (thư ng kho ng 5 – 6 gi ). N u sau khi ñ t tr ng thái cân
b ng mà dung d ch protein chưa lo i h t mu!i thì đ9t bao th+m tích trên vào m t dung
d ch ñ m m i và c ti p t(c như th cho ñ n khi lo i h t mu!i ra kh)i dung d ch protein.
Trong q trình th+m tích, ngồi mu!i cịn có các ch t chuy n hóa có kích thư c nh) như
ATP, coenzyme… cũng b lo i ra kh)i bao th+m tích.

Hình 2.3: Phương pháp th+m tích
( />

2.5.2. Phương pháp tinh chi t b;ng h th/ng gel l=c
Là phương pháp đ phân
tách các phân t* có kích thư c và
tr ng lư ng phân t* khác nhau
b ng cách cho chúng đi qua c t
gel.
S,c kí l c dùng v t li u là
nh&ng vi h t gel có kh

năng

ng m nư c r t cao. Các h t gel
này là nh&ng s i polymer dài, có
nh&ng c u n!i liên k t ngang ñ
làm gi m b t ñ m#m, ch u ñư c
s c ép khi b nén mà không bi n
d ng, v n cho phép dung mơi lưu
thơng.
Gi&a các s i polymer có
khơng gian tr!ng cho phép các
phân t* tan trong dung môi có th
th m vào, do đó có th di chuy n
quanh co trong c u trúc c a h t

Hình 2.4: S,c ký gel l c
( />erheads-1/ch5_mol-seive.jpg)

gel.
Khi cho h n h p ch a nh&ng phân t* có kích thư c khác nhau qua c t s,c kí, v i
nh&ng l có kích thư c gi i h n nh t đ nh thì các phân t* có kích thư c l n hơn không
khu ch tán qua l . Do ñó, chúng sS ra kh)i c t trư c. Nh&ng phân t* nh) khu ch tán vào
trong l gel và di chuy n trong l gel. Sau đó chúng sS ñư c ñ+y ra kh)i c t b ng dung
d ch ñ+y.