MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG SỐ LƯỢNG NOÃN VÀ NUÔI NOÃN CHÍN TRÊN CHÓ

Báo cáo tốt nghiệp

MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG SỐ
LƯỢNG NỖN VÀ NI NỖN CHÍN
TRÊN CHĨ
GVHD:
PGS. TS. TRẦN THỊ DÂN
KS. NGUYỄN VĂN ÚT

SVTH : NGUYỄN BẢO KHÁNH
Ngành : THÚ Y
Khoá : 2002-2007

09/2007


Nội dun
g

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

2 NỘI DUNG & PHƯƠNG PHÁP
3 KẾT QUẢ & THẢO LUẬN
4 KẾT LUẬN & ĐỀ NGHỊ


Phần I




ĐẶT VẤN ĐỀ

Xã hội ngày càng phát triển, mức sống nhân dân tăng dần
thì đời sống tinh thần được chú trọng hơn. Mỗi người đều
có nhu cầu giải trí, bầu bạn, tâm sự và hơn hết là cần được
bảo vệ tính mạng cũng như tài sản. Ở đây chó là lồi vật
được ưa chuộng hàng đầu do bởi tính trung thành, sự
thơng minh, lịng can đảm.
Mặt khác, đời sống người dân ngày nay khá cao nên mức
độ thẩm mỹ cũng sâu sắc hơn. Chó được u thích trong
nhà phải là chó đẹp, giống quý, lạ mắt, mà phần lớn những
chú chó này là chó nhập từ nước ngồi với giá thành cao,
thủ tục phức tạp.








Đáp ứng nhu cầu trên, việc tạo ra chó con từ phơi sản xuất
in vitro được khuyến khích với các ưu điểm :
Tham gia vào quá trình chọn lọc, nhân giống, lai tạo để
đạt được những tính trạng mong muốn
Tối ưu hóa khả năng sinh sản của chó bố mẹ
Sản xuất được số lượng lớn phôi trong thời gian ngắn,
giá thành hạ

Tiền đề cho cơng nghệ sinh sản vơ tính trong tương lai
Vì vậy đề tài “Một số yếu tố ảnh hưởng số lượng
nỗn và ni nỗn chín trên chó” được thực hiện,
nhằm chuẩn bị bước đầu cho việc sản xuất phơi chó in
vitro.
Mục tiêu: Cải thiện quy trình ni nỗn trong phịng thí
nghiệm và khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến số
lượng noãn thu nhận và sự phát triển in vitro của noãn.


Phần I

I

NỘI DUNG & PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU

1.

THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM

2.

NỘI DUNG KHẢO SÁT

3.

VẬT LIỆU

4.

PHƯƠNG PHÁP TiẾN HÀNH


2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM


Thời gian

Từ 05/03/2007 đến 20/07/2007.


Địa điểm thực hiện

Phịng thí nghiệm Sinh Lý Sinh Hố, phịng Nuôi Cấy Tế Bào,
khoa Chăn Nuôi Thú Y, Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM.


2.2 NỘI DUNG KHẢO SÁT






Xác định mơi truờng ni nỗn chín.
So sánh số lượng nỗn thu được và tỉ lệ nỗn chín
sau IVM dựa theo thời điểm thu hoạch buồng trứng,
tuổi chó và kích thước buồng trứng.
Đánh giá ảnh hưởng của việc bổ sung βmercaptoethanol vào môi truờng nuôi in vitro đến tỉ lệ

nỗn chín.


2.3 VẬT LIỆU

2.3.1 Nguồn mẫu
Buồng trứng chó từ chó ở lị mổ anh Phước, quận Thủ Đức,
Tp. Hồ Chí Minh.
2.3.2 Thuật ngữ


IVM (in vitro maturation): trưởng thành trong ống nghiệm



GV (germinal vesicle): giai đoạn túi mầm



GVBD (germinal vesicle breakdown): giai đoạn vỡ túi mầm



MI (metaphase I): trung kỳ I



MII (metaphase II): trung kỳ II

2.3 VẬT LIỆU (t.t)

2.3.3 Các giai đoạn phát triển của nỗn

GV

MI

GVBD

MII (nỗn chín)


2.4 PHƯƠNG PHÁP TiẾN HÀNH

2.4.1 Bố trí khảo sát
Khảo sát 1: Ảnh hưởng của thời điểm thu hoạch buồng
trứng lên số lượng nỗn thu được và tỉ lệ nỗn chín sau
IVM


 Mục tiêu

So sánh số lượng noãn thu được và tỉ lệ nỗn chín sau IVM ở các
thời điểm lấy mẫu khác nhau.
 Cách thực hiện
Chia thời điểm thu hoạch buồng trứng theo 4 giai đoạn khảo sát từ
05/03/2007 đến 28/03/2007 (lơ 1, có 20 chó), từ 01/04/2007 đến
27/04/2007 (lơ 2, có 26 chó), từ 02/05/2007 đến 31/05/2007 (lơ 3, có
17 chó) và từ 01/06/2007 đến 16/06/2007 (lơ 4, 13 chó).

 Chỉ tiêu quan sát
Số lượng nỗn thu được và tỉ lệ nỗn chín sau khi IVM với mơi
trường cơ bản NCSU 37.


2.4 PHƯƠNG PHÁP TiẾN HÀNH (t.t)

2.4.1 Bố trí khảo sát (t.t)
Khảo sát 2: Ảnh hưởng của tuổi chó đến số lượng nỗn
thu được và tỉ lệ nỗn chín sau IVM


 Mục tiêu

So sánh số lượng noãn thu được và tỉ lệ nỗn chín sau IVM ở các
độ tuổi.
 Cách thực hiện
Khảo sát dựa vào 4 giai đoạn tuổi của chó, từ 5 đến 12 tháng tuổi
(lơ 1, có 12 chó), > 12 đến 18 tháng tuổi (lơ 2, có 14 chó), > 18 đến
24 tháng tuổi (lơ 3, có 11 chó) và > 24 tháng tuổi (lơ 4, có 8 chó).
 Chỉ tiêu quan sát
Số lượng nỗn thu được và tỉ lệ nỗn chín sau khi IVM với mơi
trường cơ bản NCSU 37.


2.4 PHƯƠNG PHÁP TiẾN HÀNH (t.t)

2.4.1 Bố trí khảo sát (t.t)
Khảo sát 3: Ảnh hưởng của kích thước buồng trứng lên
số lượng nỗn thu được và tỉ lệ chín của noãn



 Mục tiêu

So sánh số lượng noãn thu được và tỉ lệ nỗn chín sau IVM ở các
kích thước buồng trứng.
 Cách thực hiện
Kích thước buồng trứng được tính theo cơng thức:
Kích thước (mm3) = Dài (mm) x Rộng (mm) x Dày (mm)
Phân chia 4 nhóm kích thước buồng trứng chó, ≤ 500 mm3 (lơ 1, có
11 chó), > 500 mm3 và ≤ 1000 mm3 (lơ 2, có 23 chó), > 1000 mm3 và
≤ 1500 mm3 (lơ 3, có 8 chó) và > 1500 mm3 (lơ 4, có 3 chó).
 Chỉ tiêu quan sát
Số lượng noãn thu được và tỉ lệ nỗn chín sau khi IVM với mơi
trường cơ bản NCSU 37.


2.4 PHƯƠNG PHÁP TiẾN HÀNH (t.t)

2.4.1 Bố trí khảo sát (t.t)
Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của β-mercaptoethanol đến tỉ
lệ chín của nỗn sau khi ni


 Mục tiêu

Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ β-mercaptoethanol đến sự
phát triển của noãn.
 Cách thực hiện
Bố trí thí nghiệm theo nồng độ β-mercaptoethanol được bổ sung

vào môi truờng cơ bản NCSU 37, với 3 nghiệm thức là 0 µM (lơ đối
chứng, 10 chó), 50 µM (lơ 2, 10 chó), 100 µM (lơ 3, 10 chó).
 Chỉ tiêu quan sát
Chất lượng nỗn sau IVM và mức độ phát triển của noãn.


2.4 PHƯƠNG PHÁP TiẾN HÀNH (t.t)

2.4.2 Cách tiến hành


Xác định tuổi chó
 Vì mẫu được lấy ở lị mổ, nên việc đốn tuổi chó được dựa

vào hình dạng của răng .
 Công thức răng:

Răng sữa: 2(3/3 cửa + 1/1 nanh + 3/3 tiền hàm) = 28
Răng vĩnh viễn: 2(3/3 cửa + 1/1 nanh + 4/4 tiền hàm + 2/3 hàm) = 42
 Thời gian mọc răng :
4 tháng tuổi trở lên: xuất hiện các răng vĩnh viễn.


2.4 PHƯƠNG PHÁP TiẾN HÀNH (t.t)

2.4.2 Cách tiến hành (t.t)


Xác định tuổi chó (t.t)

Cơng thức răng ở chó trưởng thành


2.4 PHƯƠNG PHÁP TiẾN HÀNH (t.t)

2.4.2 Cách tiến hành (t.t)


Thu buồng trứng từ chó
Đặt chó nằm ngửa, xác định vị trí cần mổ, sát
trùng vùng mổ
Mổ bụng chó 1 đường 5 – 7cm, cách rốn 2cm
Dùng 2 ngón tay tìm 2 buồng trứng trái và phải
Dùng kéo cắt, thu nhận phức hợp gồm buồng
trứng và 1 phần ống dẫn trứng
Trữ trong PBS có bổ sung 75 µg/ml Penicillin,
50 µg/ml Streptomycine ở 30 - 370C
Vận chuyển nhanh về phịng thí nghiệm


2.4 PHƯƠNG PHÁP TiẾN HÀNH (t.t)

2.4.2 Cách tiến hành (t.t)


Xử lý buồng trứng
Buồng trứng sau khi mang về phịng thí
nghiệm, được xịt khử trùng bằng cồn 70%
Tách buồng trứng ra khỏi mơ mỡ
Đo kích thước các chiều của buồng trứng

Trữ trong PBS có bổ sung 75 µg/ml Penicillin,
50 µg/ml Streptomycine ở 30 - 370C
Chuyển vào tủ thao tác vô trùng


2.4 PHƯƠNG PHÁP TiẾN HÀNH (t.t)

2.4.2 Cách tiến hành (t.t)


Tìm và rửa noãn
Chuyển buồng trứng vào dung dịch HEPES –
TL – PVA, cắt trứng
Xem dưới kính hiển vi, độ phóng đại 40 lần
Tìm những nỗn tốt (đen, đồng nhất, có 2
hoặc 3 lớp tế bào hạt), đường kính > 100 µm
Rửa 2 lần trong mơi trường NCSU 37 có bổ
sung 1 µg/ml FSH, 10 UI/ml hCG, 1 µg/ml
estradiol


2.4 PHƯƠNG PHÁP TiẾN HÀNH (t.t)

2.4.2 Cách tiến hành (t.t)


Nuôi nỗn

Chuyển các nỗn sau khi rửa vào mơi trường ni nỗn chín dạng
giọt, có phủ dầu khống trên bề mặt, đặt trong tủ ấm CO2, nuôi ở

điều kiện 370C, 5% CO2 trong 72 giờ. Mơi trường ni chín trứng là
NCSU 37 có bổ sung FSH (1 µg/ml), hCG (10 UI/ml), estradiol (1
µg/ml). Thể tích giọt ni là 100 µl, mỗi giọt ni 10 nỗn, 4 giọt ni
trong 1 đĩa petri nhỏ, được phủ 4 ml dầu khoáng.


2.4 PHƯƠNG PHÁP TiẾN HÀNH (t.t)

2.4.2 Cách tiến hành (t.t)


Thu nhận nỗn sau khi ni
Chuyển nỗn sau khi ni vào đĩa chứa PBS –
PVA
Thêm 200 µl hyaluronidase 0,1% vào, để trong
15 phút
Dùng pipette Pasteur làm bong lớp tế bào hạt
tụ xung quanh noãn bằng cách hút nhẹ nhàng
noãn ra vào pipette
Đánh giá phân loại nỗn. Chuyển qua phiến
kính, nhuộm NST


2.4 PHƯƠNG PHÁP TiẾN HÀNH (t.t)

2.4.2 Cách tiến hành (t.t)


Đánh giá phân loại noãn
 Noãn được phân loại, đánh giá sau khi ni 72 giờ.

 Nỗn được phân thành 3 loại: nỗn xấu, nỗn tốt và nỗn chín.
Nỗn xấu

Nỗn tốt

Nỗn chín

- Gồm những nỗn thối hố
- Tế bào chất khơng đồng
nhất, bị co cụm hay phân tán
- Không xuất hiện thể cực thứ
nhất

- Là các nỗn chưa chín
- Tế bào chất đồng nhất,
chiếm hết xoang tế bào
- Không xuất hiện thể cực thứ
nhất

- Là các noãn trưởng thành
- Tế bào chất đồng nhất
 
- Có sự xuất hiện thể cực thứ
nhất


2.4 PHƯƠNG PHÁP TiẾN HÀNH (t.t)

2.4.2 Cách tiến hành (t.t)


Nhuộm noãn
Chuyển noãn qua giọt PBS – PVA mới, rửa
trong 15 phút, chuyển lên phiến kính
Cố định bằng hỗn hợp acetic acid: ethanol
Trét silicon lên 4 góc của lamelle, đậy lá kính
Ngâm trong hỗn hợp acetic acid: ethanol (1: 3
v/v) trong 48 giờ
Rửa lại bằng ethanol 100% mới
Nhuộm bằng dung dịch 1% aceto-orcein trong
15 phút
Rửa bằng dung dịch acetoglycerol đến khi
sạch màu, xem ở KHV x100


Phần I

II

KẾT QUẢ & THẢO LUẬN

1.

KHẢO SÁT 1

2.

KHẢO SÁT 2

3.

KHẢO SÁT 3

4.

THÍ NGHIỆM 4


3.1 KHẢO SÁT 1: Ảnh hưởng của thời điểm thu hoạch buồng trứng
lên số lượng noãn thu được và tỉ lệ nỗn chín sau IVM
Bảng 3.1.1. Số lượng nỗn thu và tỉ lệ noãn phát triển tốt ở các thời điểm
Thời điểm thu hoạch
Chỉ tiêu

Tháng 3
(1)

Tháng 4
(2)

Tháng 5
(3)

Tháng 6
(4)

Số chó cái

20

26

17

13

Số nỗn thu
được / chó

22,8 ± 4,04a

27,19 ± 2,65b

40,06 ± 6,18b

37,38 ± 5,83b

0,025

Tỉ lệ noãn phát
triển tốt (%)

20,8 ± 3,7

26,12 ± 3,32

22,27 ± 3,63

31,34 ± 7,68

0,324

P

Bảng 3.1.2. Tỉ lệ noãn ở các giai đoạn phát triển theo thời điểm trong năm
Thời điểm thu hoạch

Giai đoạn phát
triển của nỗn
ni

Tháng 3
(1)

Tháng 4
(2)

Tháng 5
(3)

Tháng 6
(4)

P

GV (%)

37,07 ± 7,37

39,42 ± 4,33

42,89 ± 7,58

52 ± 8,79

0,433

GVBD (%)

6,41 ± 2,31

8,46 ± 2,45

7,32 ± 2,47

5,24 ± 1,95

0,817

MI (%)

4,49 ± 1,48

3,54 ± 1,4

5,95 ± 2,25

5,61 ± 2,31

0,746

MII (%)

1,2 ± 0,66

2,64 ± 1,17

3,06 ± 1,2

3,8 ± 2,23

0,58


Biểu đồ 3.1. Số lượng noãn thu được và tỉ lệ noãn phát triển
ở các thời điểm thu hoạch