PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN Y HỌC

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN Y HỌC
Một trong những mục tiêu cơ bản của di truyền y học là hiểu biết cơ sở di
truyền. Trên cơ sở những hiểu biết đó, tìm ra các phương pháp nghiên cứu, phương
pháp thăm dò, chẩn đoán, điều trị bệnh một các có hiệu quả hơn. Trong tiểu luận,
chúng tôi sẽ trình bày một số phương pháp chủ yếu trong nghiên cứu, chẩn đoán và
trị liệu di truyền.
Một trong những thành tựu nổi bật của sự phát triển khoa học kỹ thuật ngày
nay là kỹ thuật phân tử. Kỹ thuật phân tử phát triển và nó được ứng dụng mạnh mẽ
trong rất nhiều lĩnh vực, đặc biệt nó giúp cho ngành Nông nghiệp, Y học có những
bước phát triển vượt bậc. Trong tiểu luận, chúng tôi cũng đi sâu trình bày những kỹ
thuật phân tử cơ bản, mới, được ứng dụng nhiều trong y học giúp cho việc chẩn
đoán, phòng, chữa bệnh di truyền và trong sản xuất tạo nhiều chế phẩm có chất
lượng cao.
1. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM TRONG NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN Y HỌC
1.1. Những khó khăn
Khi tiến hành nghiên cứu di truyền y học người ta gặp phải những khó khăn
chủ yếu như sau:
Rụng trứng sinh dục muộn, sinh sản chậm
Tổ chức cấu trúc di truyền của con người rất phức tạp
Không thể áp dụng các thí nghiệm lai ở sinh vật đối với con người
Số lượng con cháu trong các gia đình ngày càng ít
Thời gian sống và thời gian sinh trưởng của con người đều rất dài so với các
động vật thí nghiệm.
1.2. Những thuận lợi
Các đối tượng nghiên cứu là bệnh nhân nên dễ quản lý, theo dõi.
Ngày nay con người đã hiểu biết rất rõ về các đặc tính, hình thái, giải
phẫu, sinh lý, sinh hoá của mình.
Ngày càng có nhiều phương tiện kỹ thuật hiện đại giúp cho việc nghiên cứu
các tính trạng ở người được thuận tiện nhanh chóng và chính xác.
2. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN Y HỌC
2.1. Phương pháp nghiên cứu phả hệ

2.1.1.Khái niệm: Là phương pháp nghiên cứu sự di truyền 1 tính trạng nào đó
ở nhiều người trọng cùng 1 dòng họ qua nhiều thế hệ đề xem xét:
- Tính trạng trội hay lăn
- Tính trạng này do một gen hay nhiều gen quay định
- Tính trạng này có di truyền liên kết với giới tính hay không
- Khả năng mắc bệnh của các thế hệ tiếp theo
Trong một số trường hợp còn xác định được người dị hợp tử mang gen bệnh.
Phương pháp này kết hợp với các xét nghiệm khác cho phép có thể rút ra những lời
khuyên về di truyền chính xác và hữu ích cho các gia đình về việc sinh con hoặc
kết hôn.
2.1.2. Các bước tiến hành
2.1.2.1. Lập sơ đồ phả hệ
Để lập sơ đồ phả hệ (phả hệ đồ) người ta sử dụng hệ thống ký hiệu quốc tế để
biểu diễn với số lượng các thế hệ gia đình bệnh nhân ít nhất là từ 3 đến 4 thế hệ
theo những nguyên tắc cơ bản sau:
Các cá thể thuộc cùng một thế hệ được xếp cùng trên một hàng ngang theo
thứ tự ngày sinh từ trái sang phải và được đánh dấu bằng chứ số Ả rập (1,2,3,4 ).
Các thế hệ được xếp theo chiều dọc theo thứ tự từ trên xuống dưới và được
đánh dấu bằng chữ số La mã (I, II, III, IV ) ở phần đầu bên trái mỗi hàng.
Thế hệ này được nối với thế hệ kia bằng đoạn thẳng vuông góc từ giữa vạch kết
hôn của thế hệ trước xuống thế hệ sau.
Ngoài ra trong khi tiếp xúc với người bệnh phải tránh yếu tố tâm lý bất lợi của
họ khiến cho thông tin cung cấp cho bác sỹ bị sai lệch.
Một số ký hiệu thường dùng trong lập phả hệ.
1. Nam giới; 2. Nữ giới; 3. Không biết giới; 4. Có thai; 5. Người lành; 6. Người
bệnh; 7. Người có hội chứng bệnh hoặc dấu hiệu bệnh lý không đầy đủ/ dị hợp tử
mang gen lặn bệnh lý; 8. Người lành mang gen lặn bệnh lý liên kết-X; 9. Người
chưa có thông tin hoặc thông tin không đầy đủ; 10. Người không được kiểm tra kỹ
cũng bị bệnh như người bệnh; 11. Đương sự; 12. Chết; 13. Chết non ( ở tuổi thiếu
nhi); 14. Chết thai và dưới 1 năm; 15. Sẩy thai; 16. Vợ chồng; 17. Hai vợ (hai

chồng); 18. Vợ chồng ngoài giá thú; 19. Hôn nhân cùng huyết thống; 20. Hôn nhân
không có con; 21. Anh chị em cùng bố mẹ; 22. Hai hôn nhân với các con của mỗi
hôn nhân; 23. Số con không biết; 24. Không rõ là con để hay không; 25. Con nuôi
(không cùng huyết thống); 26. Con sinh đôi một hợp tử; 27. Con sinh đôi hai hợp
tử; 28. Không rõ kiểu sinh đôi một hợp tử hay hai hợp tử; 29. Con ngoài hôn nhân;
30. các thế hệ; 31. Anh chị em trong cùng một thế hệ.
2.1.2.2. Phân tích phả hệ
Đây là bước quan trọng để xác định tính chất di truyền và cách thức di truyền
của tính trạng bệnh lý. Để làm công việc này phải hiểu và biết vận dụng các qui
luật di truyền cơ bản kết hợp với việc tính toán thống kê để sử lý các dữ liệu từ phả
hệ.
Hình 3.2: Một số sơ đồ phả hệ điển hình.
(A) Trội autosome; (B) Lặn autosome; (C) Lặn liên kết-X;
(D) Trội liên kết-X; (E) Liên kết-Y
Ví dụ: Nếu như trong một phả hệ, ở các thế hệ đều thấy có người bị bệnh, khả
năng mắc bệnh ở cả giới nam và giới nữ đều như nhau, trong gia đình có cha hoặc
mẹ bị bệnh mà tỷ lệ các con bị bệnh là 50%, thì có thể nghĩ rằng bệnh là bệnh di
truyền do gen trội nằm trên nhiễm sắc thể thường gây ra.
Còn nếu như trong phả hệ thấy bệnh được di truyền có tính chất cách quãng, con
trai bị bệnh nhiều hơn con gái, ông ngoại truyền bệnh cho cháu trai thì có thể cho
rằng bệnh là bệnh di truyền do gen lặn nằm trên nhiễm sắc thể giới tính X gây ra.
2.1.3. Kết quả nghiên cứu:
-Đã xác định được nhiều gen quy định tính trạng ở người là gen trội hay lặn. Ví dụ
+ Da đen, tóc quăn, môi dày, mũi cong, long mi cong là các tính trạng trội
+ Da trắng, tóc thẳng, môi mỏng, mũi cao, long mi ngắn là các tính trạng lăn.
- Xác định được một số gen gây bệnh nằm trên NST giới tính. Ví dụ:
+ Bệnh mù màu, máu khó đông, tật dính ngón tay… là do gen lặn nằm trên X.
+ Tật dính ngón tay 2-3, túm lông ở tai do gen trên NST giới tính Y qui định.
- Xác định được một số tính trạng do nhiều gen quy định. Ví dụ:
+ Năng khiếu toán, âm nhạc, hội họa,… là di truyền đa gen, song chịu ảnh

hưởng của môi trường và xã hội.
2.2. Phương pháp trẻ sinh đôi (đồng sinh)
2.2.1. Những đặc điểm và giá trị của phương pháp
Phương pháp trẻ sinh đôi là phương pháp dựa vào các trẻ sinh đôi.
Đây là một trong những phương pháp có hiệu quả nhất để đánh giá vai trò của
yếu tố di truyền và môi trừơng đối với sự phát triển một tính trạng nào đó ở người.
Phương pháp trẻ sinh đôi cũng thường được sử dụng để đánh giá hiệu quả của
các phương pháp nuôi dạy trẻ, đánh giá chất lượng các loại thực phẩm, các loại
thuốc
2.2.2. Các bước tiến hành
2.2.2.1. Chọn các mẫu sinh đôi
Các mẫu sinh đôi có thể được lựa chọn bằng 2 cách. Một là trong dân cư lựa
ra các trẻ sinh đôi rồi trong các trẻ sinh đôi ấy chọn lấy các cặp có tính trạng cần
nghiên cứu. Hai là từ các nhóm dân cư lựa ra những trẻ có tính trạng cần nghiên
cứu sau đó chọn ra các cặp sinh đôi.
Cần chú ý thêm là chỉ tiến hành nghiên cứu khi có đủ cả 2 người trong mỗi
cặp. Còn nếu chỉ có một người thì loại bỏ cả hai.
2.2.2.2. Chẩn đoán kiểu sinh đôi
Đây là bước quan trọng đòi hỏi sự chính xác cao. Để chẩn đoán chính xác phải
sử dụng rất nhiều các chỉ tiêu so sánh về hình thái, sinh lý, sinh hóa như giới tính,
màu tóc, màu mắt, màu da, dạng tóc và kiểu phủ tóc, lông trên đầu và thân, hình
dạng miệng, mũi, tai, vân da bàn tay, các hệ thống nhóm máu, các protein huyết
thanh v.v
Hình 3.3: Rau thai và các màng ở trẻ sinh đôi.
A. Rau thai, màng nuôi và màng đệm đều riêng; B. Rau thai chung, màng đệm
chung, màng ối riêng; C. Rau thai và màng đệm chung, màng ối dính
Nếu như tất cả các chỉ tiêu so sánh ở 2 người trong cặp sinh đôi đều giống
nhau thì chứng tỏ đó là các trẻ sinh đôi có nguồn gốc một hợp tử (cùng trứng). Còn
nếu chúng không giống nhau hoặc có giống nhau nhưng mức độ giống cũng không
khác biệt gì nhiều so với các anh chị em ruột khác trong gia đình thì điều đó chứng

tỏ rằng đó là các trẻ sinh dôi có nguồn gốc 2 hợp tử (khác trứng). Mức độ giống,
khác nhau giúp chẩn đoán kiểu sinh đôi có thể được thực hiện bằng các phiếu điều
tra bằng câu hỏi đối với chính đối tượng, bố mẹ, người thân trong gia đình như bố
mẹ có hay nhầm lẫn không, thầy giáo, các bạn trong lớp có hay lẫn giữa hai người
hay không v.v
Đối với các trẻ sơ sinh, có thể chẩn đoán kiểu sinh đôi qua tính chất của các
màng quanh thai: màng ối (trong), màng đệm (ngoài). Ở trẻ sinh đôi hai hợp tử
luôn có màng đệ riêng, màng ối và nhau thai riêng. Tuy nhiên có trường hợp các
thai khác hợp tử làm tổ ở tử cung thành hàng, cái này cạnh cái kia thì nhau thai có
thể chung. Trường hợp có màng ối riêng nhưng có màng đệm chung ở sinh đôi hai
hợp tử là rất hiếm. Nếu có màng đệm riêng, màng ối riêng, rau thai chung thì cũng
có thể là sinh đôi một hợp tử nhưng rất hiếm gặp (chiếm 25% số sinh đôi một hợp
tử và 50% sinh đôi hai hợp tử).
2.2.2.3. Đối chiếu so sánh các chỉ tiêu, rút ra kết luận đánh giá
Đánh giá mức độ tương đồng: để đánh giá mức độ tương đồng của một tính
trạng nào đấy ở các cặp sinh đôi người ta sử dụng một công thức tính gọi là công
thức Alen- Smith:
K
p

=
Ở đây C là số cặp tương đồng; D là số cặp không tương đồng theo tính trạng so
sánh
Thí dụ: Khi nghiên cứu tính trạng là bệnh tâm thần phân liệt ở 50 cặp sinh đôi
một hợp tử (MZ) người ta thấy có 43 cặp, trong đó cả 2 trẻ đều bị bệnh (tương
đồng) còn 7 cặp thì chỉ có một trẻ trong mỗi cặp bị bệnh (không tương đồng). Theo
công thức Alen- Smith ta có thể tính được mức độ tương đồng trong trường hợp
này là:
K
pMZ

= = = 86 (%)
Còn khi nghiên cứu tính trạng này ở 50 cặp sinh đôi hai hợp tử ( DZ ), nếu
người ta thấy số cặp tương đồng là 8, số cặp không tương đồng là 42 thì ta sẽ có
mức độ tương đồng trong trường hợp này là:
K
pDZ
= = 16 (%)
Đánh giá vai trò của yếu tố di truyền và yếu tố môi trường: để xác định vai
trò của yếu tố di truyền đối với sự phát triển của một tính trạng nào đó, người ta áp
dụng một công thức tính khác gọi là công thức Holzinger:
H = (%)
Theo công thức này ta có thể tính được vai trò của yếu tố di truyền đối với bệnh
tâm thần phân liệt theo các số liệu ở trên:
H = = = 83 (%)
Vì mỗi tính trạng ở con người đều là kết quả của sự tương tác giữa yếu tố di
truyền (H) và yếu tố môi trường (C) ở những mức độ khác nhau. Bởi vậy để xác
định vai trò của yếu tố môi trường trong trường hợp này đối với bệnh tâm thần
phân liệt, ta có:
H + C = 100% ; C = 100% - H = 100% - 83% =17%.
2.3. Phương pháp vân da
2.3.1. Những đặc điểm và giá trị của phương pháp
Phương pháp nghiên cứu vân da là phương pháp nghiên cứu di truyền y học
dựa trên những đặc tính của các đường nét, hình thù của bề mặt da ở các đầu ngón
tay và lòng bàn tay.
Phương pháp này có giá trị trong việc góp phần chẩn đoán sớm một số bệnh lý
ở người, trong lĩnh vực khoa học hình sự và trong việc xác định trẻ sinh đôi.
Cơ sở khoa học của phương pháp vân da là ở chỗ hình thù và đường nét vân da
mang tính cá thể nghiêm ngặt do chúng được kiểm soát bởi nhiều gen. Trong quá
trình phát triển cá thể, các hoa vân trên tay được hình thành từ tháng thứ sáu và hầu

như không bị biến đổi trong suốt cuộc đời.
Hình 3.4: Các delta đáy ngón a,b,c,d;
các vùng trong lòng bàn tay (Th, Hy,
I1,I2,I3,I4) và gã ba trục t.
Hình 3.5. Các đường vân chính A,B,C,D
và kiểu vân trong lòng bàn tay.
2.3.2. Các bước tiến hành
2.3.2.1. Lấy mẫu in vân da trên giấy trắng
2.3.2.2. Phân tích mẫu in theo các chỉ tiêu
Tổng số các đường vân đầu ngón.
Công thức vân đầu ngón.
Cường độ vân đầu ngón.
Tần số mỗi loại vân.
Chỉ số Cummins.
Các kiểu vân trên vùng mô cái và mô út.
Góc ngã ba trục atd.
Số lượng và hình dạng các rãnh lòng bàn
Rút ra các kết luận nhận xét so sánh kết quả nghiên cứu ở các nhóm đối
tượng khác nhau.
Các miền quanh gan bàn tay (1-13)
và chỉ số Cummins.
Các kiểu vân đầu ngón: 1: vân cung
đơn giản; 2: vân cung lều; 3; vân
móc/búi/nút; 4,5,6: kiểu vân vòng đối
xứng, vòng xoáy và vòng móc kép.
Mức độ giống nhau về nếp vân da và quan hệ huyết thống.
Quan hệ Mức độ giống nhau
Thực tế Lý thuyết
Sinh đôi một hợp tử 0,95 1,00
Sinh đôi hai hợp tử 0,49 0,50

Anh chị em ruột 0,5 0,50
Bố mẹ- con 0,48 0,50
Không quan hệ huyết
thống
0,05 0,00
2.4. Phương pháp nghiên cứu di truyền phân tử.
Các thành tựu to lớn trong những năm gần đây về lĩnh vực Di truyền học
người, đặc biệt là thành tựu giải mã bộ gene người đạt được là nhờ sử dụng các
kỹ thuật sinh học phân tử như tách chiết, phân tích định tính và định lượng
nucleic acid; các phương pháp lai phân tử: Southern blot, Northern blot, lai tại
chỗ (in situ hybridization), ; các phương pháp xác định trình tự nucleic acid;
tạo dòng (cloning); xây dựng thư viện bộ gene, thư viện cDNA; phương pháp
PCR (polymerase chain reaction); Sinh tin (Bioinfomatics),
2.4.1.Các phương pháp tách chiết acid nucleic, các phương pháp định
tính và định lượng cơ bản.
2.4.1.1.Các phương pháp tách chiết acid nucleic:
2.4.1.1.1.Phương pháp tách chiết DNA.
+ Bước 1: phá màng tế bào, màng nhân: nghiền tế bào, mô trong hỗn hợp,
chất tẩy (SDS) và proteinase để phá vỡ màng tế bào, màng nhân, giải phóng
DNA ra môi trường đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA.
Chất tẩy là các phân tử lưỡng cực, sẻ kết hợp với protein màng và các
phân tử phospholipid làm phá vỡ cầu trúc màng.
Chất tẩy ion hóa có tác dụng phá màng mạnh, chất tẩy không ion hóa có
tác dụng phá màng nhẹ hơn.
+ Bước 2: loại protein: lắc mẫu trong dung dịch phenol: chloroform để
biến tính protein đồng thời không hòa tan acid nucleic. Protein bị biến tính sẻ
không hòa tan trong pha nước có chứa acid nucleic và sau khi li tâm sẻ tủa
thành một lớp nằm giữa pha nước và pha phenol : chloroform. Thu hồi acid
nucleic trong pha nước.
+ Bước 3: thu hồi acid nucleic : thu hồi dưới dạng tủa acid nucleic nhằm

thu nhận acid nucleic dưới dạng cô đặc để bảo vệ chúng khỏi sự phân li của các
enzyme và khi cần có thể hòa tan lại trong nước theo nồng độ mong muốn. Có
thể tủa trong ethanol hoặc trong isopropan ol.
2.4.1.1.2.Tách chiết ARN.
Phương pháp tách chiết ARN toàn phần cũng bao gồm các bước cơ bản như
tách chiết ADN:
- Giải phóng ADN và ARN ra khỏi màng tế bào.
- Tách bỏ phần protein.
- Tủa acid nucleic
Bước tiếp theo: dịch chiết chứa acid nucleic được ủ với ADN polimerase để
phân hủy ADN. Sau đó phân hủy dịch chiết chứa ARN trong nước; tủa bằng
ethanol, để thu được ARN toàn phần. mARN có thể tách riêng. Dựa vào cấu
trúc phân tử có đuôi mARN có đuôi poly A có thể tách mARN bằng sắc ký ái
lực trên cột oligo T –cellulose. Hiện nay đã sử dụng bộ kit ( bộ mẫu thử chuyên
dụng) sử dụng các viên bi từ có mang oligo T trên bề mặt. Thông qua liên kết
bổ sung A=T các mARN bám lên bề mặt các viên bi từ. Sau đó bằng kỹ thuật li
tâm thu lại các viên bi và tách mARN. Kỹ thuật này cho phép tách giữ lại
mARN với khối lượng rất nhỏ.
Chú ý trong quá trình thao tác,
tránh lẫn ADN và ARN, ARN của
đối tượng khác vào dụng cụ.
Tránh các enzym phá hủy ADN
hoặc ARN cần nghiên cứu. Đặc
biệt ARN không bền dễ bị phân li
bởi ARN polimerase. Sau khi tách
chiết ADN kiểm tra độ tinh khiết
của ADN bằng xác định tỉ lệ
OD260/OD280 và OD260/OD 230 = 1,7 – 2 được coi là sạch hoặc bằng
phương pháp điện di ADN.
2.4.1.1.3.Phương pháp sắc ký

+ Sắc ký ái lực: trên poly U-Sepharose hay oligodT-cellulose, dùng để tinh
sạch mARN.
+ Sắc ký lọc gel dùng
trong phân tách các acid
nucleic và nucleotic tự do
sau quá trình tạo mẫu dò
(probe) đánh dấu.
+ Sắc ký trong hiệu suất
cao: có độ phân giải rất
cao dùng trong tinh sạch các oligonucleotide tổng hợp, plasmid, phân tách các
đoạn DNA.
+ Sắc ký trao đổi ion trên vi cột để thu hồi một lượng rất nhỏ DNA.
2.4.1.2.Các phương pháp định tính và định lượng thô acid nucleic.
2.4.1.2.1.Phương pháp định lượng bằng quang phổ kế.
Cho phép định lượng tương đối nồng độ acid nucleic có trong mẫu.
Nguyên tắc là dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng
260 nm của các base.
Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm của các mẫu đo cho phép xác
định nồng độ acid nucleic trong mẫu dựa vào mối tương quan một đơn vi
OD
260nm
tương ứng với nồng độ:
+ 50µg/ml cho một dung dịch DNA sợi dôi.
+ 40µg/ml cho một dung dịch DNA hay RNA sợi đơn.
Định tính: độ sạch dựa trên tỉ số OD
260
/OD
280
, tính chất của các acid nucleic
(mạch đôi/đơn) (280nm là bước sóng ở đó các protein có mức độ hấp thụ cao

nhất.
2.4.1.2.2.Phương pháp
điện di.
Mục tiêu:
+ Định tính: sự hiện diện,
cấu hình phân tử, kích thước.
+ Định lượng: hàm lượng tương đối so với thang hàm lượng.
+ chuẩn bị: thu hồi đoạn DNA (dùng trong tạo dòng)
Nguyên tắc: dựa vào đặc tính, cấu trúc của acid nucleic: tích điện âm đồng
đều trên khắp bề mặt của điện trường nên sẻ di chuyển về cực dương của điện
trường. Tính linh động của phân tử khi di chuyển trong điện trường phụ thuộc
vào khối lượng phân tử và nồng độ các chất cấu thành gel.
Kiểu điện di: Agarose, Polyacylamide, điện li trong trường xung (PDGE –
Pulse Field Gel Electrophoresis).
a.Điện di trên gel polyacrylamide.
Được dùng để tách các đoạn có kích
thước nhỏ, dưới 1000 cặp base.
Điện di theo phương thẳng đứng.
Độ phân giải cao, phân biệt được
những trình tự chỉ cách nhau 1
nucleotide.
Phương pháp phát hiện: DNA
phóng xạ tự gỉ, xanh methylene,
ethidium bromide, protein – xanh
coomassie nhuộm nitracte bạc.
ứng dụng: tinh sạch các
oligonucleotic tổng hợp, xác định trình tự DNA, tách các trình tự DNA có
khoảng cách gần bằng nhau, SDS – PAGE (phân tích protein).
b. Điện di trên gel agarose.
Gel agarose là loại gel thông dụng nhất, thường dùng để phân tách những

đoạn có kích thước 0,5 – 20 kb.
Điện di theo phương nằm ngang.
Độ phân giải thay đổi khi nồng độ agarose hay loại agarose thay đổi.
Phát hiện bằng phóng xạ tự ghi, nhuộm ethidium bromicde. Chất này có khả
năng gắn xen vào giữa các base của acid nucleic và sẻ phát huỳnh quang dưới
tia tử ngoại.
Ứng dụng: phát hiện một trình tự DNA, phân tích trình tự các hỗn hợp DNA
(Southern blot), chuẩn bị nguyên liệu.
2.4.2.Các phương pháp lai phân tử.
2.4.2.1.Cơ sở của lai phân tử.
Khái niệm về lai phân tử:
+ Khi một phân tử DNA mạch đôi được đun lên một nhiệt độ vượt quá nhiệt
độ nóng chảy Tm thì hai mạch sẻ tách rời nhau do sự phá vỡ các liên kết H ở
hai mạch.
+ Sau khi hai mạch tách rời nếu nhiệt độ phản ứng được làm giảm từ từ
cộng với điều kiện thí nghiệm thích hợp, chúng sẻ bắt cặp trở lại, hiện tượng
này gọi là sự lai phân tử.
Đặc điểm của sự lai phân tử:
+ Đặc hiệu tuyệt đối: sự tái bắt cặp chỉ xảy ra giữa hai trình tự hoàn toàn bổ
sung với nhau.
+ Các trình tự bổ sung có thể là DNA, RNA dẫn đến sự hình thành các phân
tử DNA – RNA, RNA – RNA hay các phân tử lai DNA – DNA.
2.4.2.2.Các kiểu lai phân tử.
2.4.2.2.1.Lai trên pha lỏng.
Các trình tự cần lai nằm trong pha lỏng, là một dung dịch đệm. Sự lai phân
tử xảy ra khi các trình tự này gặp nhau do chuyển động nhiệt và khi nhiệt độ
môi trường thấp hơn Tm. Phương pháp này sử dụng để phát hiện các trình tự
tương đồng giữa các loài hay một cá thể.
2.4.2.2.2.Lai tại chổ:
trình tư acid nucleic cần tìm không được tách chiết ra khỏi mô hay tế bào.

Quá trình lai với mẫu dò đã được đánh dấu và phát hiện các phân tử lai được
thực hiện ngay trên NST, tế bào hay lát cắt mô.
2.4.2.2.3.Lai trong pha rắn.
Một tron hai trình tự cần lai là cố định trên giá thể rắn ( màng lai). Phát hiện
phân tử lai thông qua mẫu dò (probe) có đánh dấu đồng vị phóng xạ.
Ba kỹ thuật lai trên pha rắn thông dụng là Southern blot, Nothern blot và Dot
blot.
a.Southern blot.
Nguyên tắt của Southern blot là màng lai nitrocellulose có khả năng tiếp
nhận DNA đã được biết từ lâu và được sử dụng trong nghiên cứu lai acid
nucleic khác nhau vào những thập niên 1950 và 1960.
Đầu thập niên 1970, sự ra đời của phương pháp điện di trên gel đã cho phép
các đoạn DNA được cắt bởi enzyme hạn chế có thể được phân tách dựa trên cơ
sở kích thước của chúng.
Từ đó nước phát triển tiếp theo của phương pháp chuyển các đoạn DNA
phân tách từ gel lên lai màng lai nitrocellulose.
Phương pháp này được Southern mô tả tại đại học Edingburgh vào năm 1975.
Southern Blot bao gồm các bước cơ bản sau:
- Cắt DNA bằng enzym hạn chế thích hợp.
- Điện di sản phẩm cắt trên
gel agarose.
- Làm biến tính DNA ngay
trên gel, DNA sợ kép sẻ
được tách thành DNA sợ
đơn. Chỉ DNA sợi đơn mới
có thể chuyển lên màng lai.
- Chuyển DNA đã biến tính
lên màng lai ( màng
nitrocellulose hay màng
nylon). Việc chuyển DNA

thường được tiến hành
bằng hoạt tính mao dẫn
trong khoảng vài tiếng
hoặc có thể dùng một thiết
bị thấm chân không. Trong quá trình chuyển, vị trí các đoạn DNA vẫn được
giữ nguyên không thay đổi.
- Lai DNA đã được cố định trên màng với mẫu dò (probe) DNA có đánh dấu.
- Quá trình này dựa trên nguyên tắc bổ sung giữa DNA trên màng lai với mẫu
dò. Để đánh giá người ta thường sử dụng P32, biotin/streptavidin hoặc một
vài mẫu dò phát quang sinh học.
- Định vi các phân tử DNA – mẫu dò. Nếu sử dụng các mẫu dò đánh dấu
phóng xạ thì dùng phương pháp phóng xạ tự ghi (autoradiograph) để xác
định. Nếu sử dụng biotin/ streptavidin thì dùng phương pháp so màu hoặc
nếu sử dụng mẫu dò phát quang sinh học thì thì phát hiện bằng sự phát
quang.
b.Northern blot.
Sau khi Southern mô tả phương pháp Southern blot năm 1975, người ta
dung một phương pháp tương tự để xác định các đoạn RNA đặc biệt gọi là
Northern blot.
Northern blot bao gồm các bước sau:
+ RNA (RNA tổng số hoặc chỉ mRNA) bằng phân tách bằng điện di trên
gel agarose.
+ RNA sau khi đã được phân tách chuyển lên màng lai (các phân tử RNA
giữ nguyên vị trí như ở
trên gel)
+ RNA cố định trên
màng lai với mẫu dò
DNA sợi đơn ( hoặc
RNA ) có đánh dấu
phóng xạ hoặc được gắn

với một enzyme tạo
thành phân tử lai RNA –
DNA hoặc RNA - RNA
sợi kép.
+ Vị trí của mẫu dò
được xác định bằng
phương pháp phóng xạ tự
ghi nếu nó được đánh dấu phóng xạ. Trong trường hợp mẫu dò được gắn với
enzyme thì đem ủ với một cơ chất không màu. Enyme liên kết với nó sẻ biến
đổi thành một sản phẩm màu có thể nhìn thấy hoặc phát ra ánh sáng mà có thể
phát hiện bằng phim X quang một cách trực tiếp.
c.Phương pháp Dot blot – Slot blot
Lai theo phương pháp Dot blo là phương pháp sàng lọc nhanh thường thực
hiện với những mẫu dò ASO để phân biệt sự khác nhau giữa các alen ở vị trí
một nu. Phương pháp này không cần điện di trên thạch mà bằng thấm trực tiếp
từ đó để xác định những đoạn nu khác nhau.
Quy trình thực hiện của kỹ thuật qua các bước sau:
+ Bước 1: dung dịch ADN được biến tính bằng nhiệt độ hay bằng dung dịch
Kali để tách ADN sợi kép thành ADN sợi đ.
+ Bước 2: Gắn ADN đích đã được biến tính lên màng lai.
+ Bước 3: đưa màng lai chứa ADN đích vào dung dịch chứa ADN dò.
+ Bước 4: sau khoảng 20 – 24h ADN dò sẻ gắn vào ADN đích tạo thành
chuổi kép.
+ Bước 5: Rửa màng lai. Để khô tự nhiên sau đó phân tích bằng tự chụp
phóng xạ.
Ngoài ra còn có thể gắn ADN dò lên màng lai, ADN đích được để ở trong
dung dịch và các bước tương tự như trên.
 Phương pháp lai tại chổ (In Situ Hybridization)
Phương pháp lai tại chổ vừa là phương pháp di truyền tế bào vừa là
phương pháp di truyền phân tử. Phương pháp thường được dùng là lai NST ở kì

giữa hoặc NST trong nhân tế bào gian kỳ với ADN dò đã được đánh dấu bằng
đồng vị phóng xạ hoặc bằng phóng xạ huỳnh quang. Quang sát sự có mặt của
đoạn ADN đích trong đoạn ADN lai bằng tự chụp hình phóng xạ hoặc bằng
kính hiễn vi huỳnh quang. Bằng phương pháp này chuỗi nhẹ kappa của globulin
miễn dịch đã được xác định có locus trên nhánh ngắn của NST số 2.
 Phương pháp lập bản đồ mất đoạn.
Phương pháp này dựa vào sự có mặt hay vắng mặt của một số vùng đặc biệt
nào đó hoặc của một locus trong ADN lấy từ bệnh nhân có bất thường NST hay
từ mẫu lai các tế bào sô ma của người và gậm nhấm, trong mẫu có chứa đoạn ADN
đã biết trước của NST người. Lập bản đồ mất đoạn đặc biệt có ích cho lập bản đồ
NST X vì một số lượng lớn các bất thường trên NST X đã được xác định.
 Thông tin về khoảng cách hình thể.
Các đoạn ADN giới hạn là các đoạn ADN sau khi được cắt bởi enzim giới
hạn được lai với các mâu đánh dấu ngoài tế bào bằng phương pháp Southern
blotting, bao gồm các giai đoạn cắt ADN, tách ADN bằng điện li, thấm ADN từ
gel agarose điện li lên màng nitrocellulose hoặc nylon và sau đó lai ADN và
đọc bằng chụp hình phóng xạ nếu đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ hoặc đọc
theo phương pháp huỳnh quang nếu đánh dấu bằng nhuộm màu huỳnh quang.
Ngoài các phương pháp trên người ta còn sử dụng các phương pháp nghiên cứu
mô phỏng học, phương pháp điều tra dịch tễ học và phương pháp di truyền lâm
sàng trong nghiên cứu Di truyền học người.
2.5. Phương pháp di truyền tế bào
2.4.1. Những đặc điểm và giá trị của phương pháp
Đây là phương pháp được dùng phổ biến hiện nay để phát hiện và quan sát nhiễm sắc
thể, qua đó xác định các dị dạng nhiễm sắc thể, các hiện tượng lệch bội, hiện tượng
cấu trúc lại nhiễm sắc thể dẫn đến nhiều bệnh di truyền hiểm nghèo ở người.
Dùng mô gồm nhiều tế bào đang phân chia mạnh như mô tuỷ xương , mô bào thai,
mô tinh hoàn, khối u ác tính làm tiêu bản để phân tích, đánh giá nhiễm sắc thể.
Là phương pháp bắt buộc trong chẩn đoán phân biệt các bệnh nhiễm sắc thể.
Là phương pháp được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu các tác nhân gây đột

biến nhiễm sắc thể ở người.
Kỹ thuật lai tế bào soma và kỹ thuật hiện băng nhiễm sắc thể ra đời đã cho phép
nghiên cứu cơ chế ung thư, hoạt động của gene trong quá trình phát triển cá thể và
góp phần tích cực vào việc lập bản đồ di truyền người.
2.4.2. Các bước tiến hành
Thu nhận các mẫu nghiên cứu trực tiếp từ các tổ chức trong cơ thể hay nuôi cấy
tế bào ngoài cơ thể.
Làm các tiêu bản hiển vi nhiễm sắc thể ở kỳ giữa trong quá trình phân chia hay
nhân ở kỳ nghỉ.
Phân tích các tiêu bản dưới kính hiển vi theo các chỉ tiêu nghiên cứu quốc tế.
Dựng Karyotype các trường hợp điển hình.
2.6. Phương pháp hóa sinh
2.5.1. Những đặc điểm chung và giá trị của phương pháp
Là phương pháp nghiên cứu được tiến hành nhờ sự giúp đỡ của các phương
tiện máy móc kỹ thuật và các hoá chất chuyên dụng.
Là phương pháp cho phép phát hiện khuyết tật của các gen thông qua các sản
phẩm bất thường đầu tiên của chúng là các loại protide cấu trúc, protide enzym mà
từ đó dẫn đén các biểu hiện bệnh lý
Là phương pháp bắt buộc trong chẩn đoán các bệnh di truyền chuyển hoá.
2.5.2. Các bước tiến hành
Bước nghiên cứu thăm dò với các trắc nghiệm đơn giản nhằm phát hiện các
trường hợp nghi ngờ trong dân cư.
Bước nghiên cứu chi tiết với các trắc nghiệm chính xác và phức tạp để phục vụ
cho việc chẩn đoán xác định.
2.7. Phương pháp thăm khám lâm sàng bệnh di truyền.
Nhiều bệnh di truyền không
chỉ biểu hiện ở một cơ quan,
một phần cơ thể mà thường
biểu hiện ở dạng đa dị tật với
những thay đổi ở các phần

khác nhau của cơ thể, thay
đổi về cả thể lực và trí lực,vì vậy bệnh án di truyền liên quan đến nhiều chuyên
khoa của y học.
Độ biểu hiện của gen còn phụ thuộc vào thời gian, vì vậy mức độ biểu hiện của
bệnh không giống nhau ở các thời điểm khác nhau. Chính vì thế thăm khám ở
thời điểm này không xác định được bệnh, nhưng thăm khám ở thời điểm khác
lại xác định được.
Để xác định nguyên nhân, cơ chế của bệnh, cần tổ chức để thăm khám xét
ngiệm được các thành viên bên gia đình người bệnh, xây dựng gia hệ để xác
định được quy luật, cơ chế của bệnh.
2.8. Phương pháp tạp giao thực nghiệm.
Phương pháp tạp giao thực ngiệm là phương pháp ngiên cứu di truyền học cổ
điển nhất di truyền học cổ điển nhất và hiện nay vẫn là phương pháp chủ yếu áp
dụng cho động vật thực vật.
Cho hai loài hoặc hai chung giao phối với nhau rồi theo dõi các tính trạng của
các thế hệ con. Muốn phân tích được quy luật di truyền, cần chọn hai mẫu sinh
vật có một hoặc vài tính chất đối lập nhau để theo dõi các tính trạng qua nhiều
thế hệ.
Mẫu sinh vật cần có bốn điều kiện:
1- Đời sống ngắn
2 -Sinh được nhiều thế hệ con.
3 -Cho nhiều biến dị.
4 –Dễ duy trì.
Các vi sinh vật có đời sống ngắn như nấm,nhất là nấm Neurospora crassa
thường dùng để ngiên cứu hoạt động của gen. Vi khuẩn và virut gần đây được
sử dụng nhiều, lúa mạch và ngô là cây lương thực bậc cao cùng được ngiên cứu
rộng rãi.
2.9. Phương pháp nghiên cứu quần thể.
Bằng các điều tra, xét ngiệm hàng loạt ở các quần thể khác nhau,các nhà di
truyền học xác định

dược tần số của một
tính trạng. Ví dụ : tần số
đột biến tự nhiên của
NST ở người bình
thường, tần số mù màu,
tần số các bệnh của Hb,
từ đó tính ra tần số của quần thể.
Có thể áp dụng phương pháp điều tra dịch tể học để đánh giá anh hưởng của
các nhân tố môi trường đến bệnh tật di truyền.
Phương pháp thuần tập được được tiến hành ở hai nhóm quần thể: một nhóm
có tiếp xúc với yếu tố nguy cơ gây bệnh, một nhóm không tiếp xúc với yếu tố
nguy cơ gây bệnh, từ đó so sánh
phân tích, đánh giá ảnh hưởng
của yếu tố nguy cơ đến tần số
đột biến biểu hiện bằng tần số
bệnh di truyền, tần số dị tật bẩm
sinh ỏ từng nhóm.
Phương pháp này dựa vào phương trình Hardy - Weinberg, đánh giá tần số
các kiểu hình để tính mật độ các gene trong quần thể liên quan đến các bệnh di
truyền. Nó còn cho phép đánh giá các hậu quả của giao phối cận huyết và theo
dõi sự di truyền của các quần thể người về mặt nguồn gốc.