Nghiên cứu khả năng điều hòa đáp ứng viêm của wedelolacton từ cây nhọ nồi trong điều trị bệnh nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng thông qua thụ thể dectin – 1

Nghiên cứu khả năng điều hòa đáp ứng viêm
của Wedelolacton từ cây nhọ nồi trong điều trị
bệnh nhiễm trùng nặng và chống nhiễm trùng
thơng qua thụ thể Dectin – 1
Thân Văn Minh
Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Khoa Sinh học
Luận văn ThS Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30
Ngƣời hƣớng dẫn: TS. Trịnh Tất Cƣờng
Năm bảo vệ: 2011
Abstract: Tổng quan về vai trò của dệ thống miễn dịch đối với bảo vệ cơ
thể. Trình bày khái niệm viêm, nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng
cũng nhƣ miễn dịch bẩm sinh của vật chủ đáp ứng quá trình nhiễm vi
khuẩn. Tìm hiểu cây nhọ nồi và vai trị của Wedelolactone trong qúa trình
chống viêm. Nghiên cứu khả năng điều hịa của Wedelolactone trong q
trình sản xuất cytokine tiền viêm và quá trình tạo phản ứng oxy hóa trong
BMDM thơng qua cấu tử đặc hiệu của Dectin-1. Đánh giá hiệu quả điều trị
của Wedelolactone trong chuột bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm
trùng gây ra bởi zymosan. Đƣa ra kết quả và thảo luận: khả năng sống của
tế bào không bị ảnh hƣởng bởi Wedelolactone; đánh giá khả năng
zymosan kích thích tế bào BMDM sinh cytokine; ...
Keywords: Sinh học thực nghiệm; Điều trị bệnh; Sinh học; Cây nhọ nồi;
Bệnh nhiễm trùng
Content
Nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng là hội chứng lâm sàng đặc trƣng bởi viêm hệ
thống do nhiễm trùng. Ngay cả điều trị tối ƣu, tỉ lệ tử vong do nhiễm trùng nặng và
choáng nhiễm trùng gần 40%. Tần suất của nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng gia
tăng 15 năm gần đây. Tại Mỹ: 750.000 ca/năm; là 1 trong 10 nguyên nhân tử vong
thƣờng gặp. Mặc dù, nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng đã đƣợc phát hiện từ 30
năm trƣớc, nhƣng các bệnh nhân mắc căn bệnh này vẫn có khả năng tử vong rất cao. Do

vậy, việc tìm kiếm phƣơng pháp và tá dƣợc chữa bệnh là một vấn đề cần thiết và cấp
bách để điều trị hiệu quả quá trình viêm hệ thống, và sẽ hỗ trợ cải thiện đƣợc khả năng
điều trị của bệnh nhân bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng.
Cây nhọ nồi (có tên khoa học là Eclipta prostrata hoặc Eclipta alba) là thực vật
thuộc họ cúc (Asteraceae) và mọc ở những vùng ẩm nhƣ một loại cỏ ở khắp thế giới.
Cây nhọ nồi mọc nhiều ở Ấn Độ, Trung Quốc, Thái Lan, Việt Nam [2] . Các hoạt tính
dƣợc học của Wedelolactone từ nhọ nồi đã đƣợc chứng minh ở in vitro và in vivo [31].
Cho đến nay, nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng vẫn là một trong các nguyên
nhân chính của những ca tử vong ở các bệnh nhân cần chăm sóc đặc biệt (ICU). Các
trƣờng hợp này vẫn tiếp tục gia tăng rộng khắp trên thế giới. Tại Việt Nam, trong nghiên
cứu chiết xuất tinh chế và xác định hoạt tính sinh học của Wedelolactone từ cây nhọ nồi
Việt Nam đã đƣợc tiến hành tại Phòng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Enzym và
Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội. Bƣớc đầu đã cho thấy tác dụng của
chất này trong quá trình chống viêm.
Với hoạt tính phịng chống viêm đầy tiêm năng của Wedelolactone, chúng tôi muốn
nghiên cứu sâu hơn nữa các đặc tính, cơ chế chống viêm và khả năng điều trị bệnh
nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng ở mức độ in vitro và in vivo tạo cơ sở cho các
nghiên cứu khoa học thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng sau này, nhằm đi đến đích
cuối cùng làm ra thuốc phòng ngừa và chữa trị các bệnh viêm nhiễm và đặc biệt là bệnh
nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng góp phần vào việc chăm sóc bảo vệ sức khỏe
cho cộng đồng. Xuất phát từ cơ sơ khoa học thực tiễn trên chúng tôi tiến hành đề tài:
“Nghiên cứu khả năng điều hòa đáp ứng viêm của Wedelolacton từ cây nhọ nồi trong
điều trị bệnh nhiễm trùng nặng và chống nhiễm trùng thơng qua thụ thể Dectin – 1”.
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. VAI TRÒ CỦA HỆ THỐNG MIỄN DỊCH ĐỐI VỚI BẢO VỆ CƠ THỂ
Miễn dịch bẩm sinh và miễn dịch đáp ứng là hai loại đáp ứng miễn dịch bảo vệ
quan trọng đối với các động vật có xƣơng sống. Miễn dịch đáp ứng bẩm sinh có vai trị
nhƣ hàng rào bảo vệ đầu tiên nhƣng lại khơng có khả năng nhận dạng lập lại các mầm
bệnh và trợ giúp đáp ứng miễn dịch đặc hiệu. Miễn dịch đáp ứng nhận dạng mầm bệnh

dựa vào chọn lọc một vùng cụ thể nhờ vô số các tế bào lymphocyte mang rất nhiều thụ
thể đặc hiệu kháng nguyên mà cho phép hệ thống miễn dịch có thể nhận dạng bất kỳ
kháng ngun bên ngồi xâm nhập vào cơ thể. Hệ thống miễn dịch bẩm sinh sử dụng vô
số các thụ thể để nhận dạng và đáp ứng tới những mầm bệnh trong giai đoạn ban đầu
của cơ thể. Quá trình nhận dạng mầm bệnh của các thụ thể có một vai trị vơ cùng quan
trọng trong q trình truyền tín hiệu tới những đáp ứng viêm, sản xuất những tế bào hiệu
quả mới tham gia vào quá trình viêm cục bộ và bắt đầu những đáp ứng của q trình
miễn dịch đáp ứng. Vơ số các thụ thể nhận dạng mầm bệnh mẫu (PRR) bao gồm thụ thể
Toll-like (TLR), lectin, Dectin-1 và các thụ thể scavenger quyết định tới khả năng sống
xót của vật chủ bằng quá trình nhận dạng những mẫu phân tử ở trên mầm bệnh nhƣ vi
khuẩn, virut, nấm có cấu trúc giống nhƣ trên các thụ thể riêng biệt đƣợc gọi là PAMP
(pathogenic associated molecules pattern). Quá trình nhận dạng mầm bệnh bằng q
trình thực bào kích thích thực bào hóa, sinh ra cytokine, chemokine tiền viêm, và thậm
trí là kích thích q trình ban đầu của miễn dịch đáp ứng.
2. KHÁI NIỆM VIÊM
Viêm (inflammation) là một phần đáp ứng sinh học phức tạp của các mao mạch với
các vị trí bị tổ n thƣơng trên cơ th ể do bị kích thích bởi các mầm bệnh hay là những tế
bào bị hỏng. Quá trình này nhằm bảo vệ các cơ quan, loại bỏ hay sửa chữa những vị trí
kích thích bị thƣơng và bị lỗi. Khi phản ƣ́ng viêm xảy ra , nhiề u loa ̣i tế bào sẽ đƣơ ̣c hoa ̣t
hóa và tập trung đến ổ viêm nhƣ các loa ̣i tế bào di chuyể n (migrating cells) gồ m: bạch
cầ u đơn nhân , đa nhân , các tế bào lympho , tiể u cầ u , tế bào nô ̣i ma ̣c… Các t ế bào này
giải phóng ra hàng loạt các chất trung gi an, phầ n lớn là các chấ t p rostaglandins (PG),
leukotrienes (LT), histamine, bradykinin, nhân tố hoa ̣t hóa tiể u cầ u và interleukin-1. Các
chấ t này la ̣i tiế p tu ̣c hoa ̣t hóa các tế bào khác làm giải phóng ra hàng loa ̣t các enzyme
“do ̣n de ̣p” chủ yế u phân giải protein nhƣ các prote inase, các interleukin, yếu tố ngoại tử
khối u (TNF-α), các superoxide, H+, hydroperoxide gây ra tổ n thƣơng mô , qua đó khép
kín q trình viêm mạn tính . Quá trình tiết ra của các chất trung gian nhƣ trên làm tăng
dòng chảy của máu tới những vùng bị xâm nhập và dẫn tới hiện tƣợng bị đỏ, nóng. Một
vài chất tiế t ra làm h ẹp dòng chảy của máu d ẫn tới bị sƣng. Khi quá trình viêm kéo dài

sẽ dẫn tới hiệu quả tích lũy và trạng thái mất cân bằng do quá trình viêm chi ếm ƣu thế
hơn quá trình kháng viêm và quá trình đơng tụ chiếm ƣu thế hơn q trình phân giải tơ


huyết (fibrin). Quá trình nghẽn mạch, thiếu máu cục bộ, các mô bị tổn thƣơng sẽ là hậu
quả tiếp sau dẫn tới viêm nặng và choáng do viêm, mất chức năng của đa cơ quan và tử
vong [23].
3. NHIỄM TRÙNG NẶNG VÀ CHỐNG NHIỄM TRÙNG
Nhiễm trùng có thể đƣợc định nghĩa nhƣ một phổ của những điều kiện lâm sàng gây
ra bởi đáp ứng miễn dịch của bệnh nhân tới quá trình nhiễm trùng mà đƣợc đặc trƣng
bởi viêm hệ thống và q trình đơng tụ [6,7,8]. Các bệnh nhân mắc nhiễm trùng nặng và
choáng nhiễm trùng trải qua hai giai đoạn đáp ứng miễn dịch [7] . Thời kỳ đầu sẽ biểu
hiện những đáp ứng viêm ồ ạt tới q trình nhiễm trùng. Hầu hết, đó là các cytokine tiền
viêm nhƣ TNF, interleukine (IL)-1, IL-6, IL-12, và interferon gamma (IFN gamma). Sau
đó, cơ thể sẽ điều hịa những đáp ứng này bằng sản xuất những cytokine kháng viêm
(IL-10), các chất ức chế của thụ thể TNF, thụ thể IL-1 loại II, và IL-1RA (một dạng bất
hoạt của IL-1) [12]. Các lớp đáp ứng viêm hệ thống của vật chủ đƣợc bắt đầu bằng một
số sản phẩm vi khuẩn. Những sản phẩm vi khuẩn (vi khuẩn gram âm bao gồm nội độc
tố: lipopolysaccharide (LPS), formyl peptides, ngoại độc tố và proteases; các vi khuẩn
gram dƣơng nhƣ ngoại độc tố, các siêu kháng nguyên, ngoại độc tố A của streptococcal
pyrogenic (SpeA), peptidoglycan, axít lipotechoic) và một số chất của vỏ tế bào nấm
(zymosan đƣợc phân tách từ Saccharomyces cerevisiae) liên kết các thụ thể trên
macrophage của vật chủ và kích hoạt những protein điều hòa (yếu tố nhân Kappa B
(NFқB)) [12]. Chẳng hạn, thụ thể Toll like 4 (TLR4) nhận dạng LPS, còn thụ thể
Dectin-1 nhận dạng đối với zymosan [8,15]. Sau đó, các thụ thể chuyển tín hiệu vào tế
bào. Hiệu quả tích lũy của những lớp viêm hệ thống này dẫn tới trạng thái mất cân bằng,
cùng với quá trình viêm chiếm ƣu thế hơn quá trình kháng viêm và q trình đơng tụ
chiếm ƣu thế hơn q trình phân giải tơ huyết (fibrin). Quá trình nghẽn mạch, thiếu máu
cục bộ, các mô bị tổn thƣơng sẽ là hậu quả tiếp sau dẫn tới nhiễm trùng nặng và choáng
nhiễm trùng, mất chức năng của đa cơ quan và tử vong [23].

4. MIỄN DỊCH BẨM SINH CỦA VẬT CHỦ ĐÁP ỨNG QUÁ TRÌNH NHIỄM VI
KHUẨN
Hệ thống miễn dịch bẩm sinh bao gồm vô số các thành phần khác nhau để chống
lại quá trình xâm nhập của vi sinh vật. Thứ nhất, các chức năng của hàng rào biểu bì của


cơ thể có thể cản trở q trình gây viêm nhiễm của mầm bệnh. Thứ hai, các tế bào và
các phân tử kiểm soát hoặc phá hủy các mầm bệnh mà có thể trốn thốt khỏi lớp hàng
rào bảo vệ biểu bì để xâm nhập tiếp vào bên trong. Thứ ba cũng là hàng rào quan trọng
nhất của hệ thống bảo vệ miễn dịch bẩm sinh đó các mơ của tế bào macrophage truyền
tin hiệu bảo vệ tế bào ở các vùng ngoại biên và hệ thống bổ thể của protein truyền tín
hiệu của hệ thống miễn dịch bẩm sinh dƣới dạng dịch nằm giữa khoảng không của mô
và máu. Quá trình nhận dạng bằng hệ thống miễn dịch sẽ loại bỏ các mầm bệnh xâm
nhập thông qua vô số cơ chế hiệu quả khác nhau. Hệ thống miễn dịch bẩm sinh có thể
xem nhƣ có vai trị quan trọng nhất trong quá trình viêm nhiễm.
4.1. Các thụ thể nhận dạng mầm bệnh (PRRs)
Thụ thể nhận dạng mầm bệnh (PRR, pathogen recognition receptor) đƣợc chia làm
ba nhóm chính bắt nguồn từ vị trí trong tế bào đó là: thụ thể huyết thanh hoặc phần dịch
của mô; màng tế bào hay cytoplasm; hay nằm trên màng hoặc trong dịch tế bào đƣợc
xem là thụ thể nhận dạng mầm bệnh [19]. Mỗi nhóm thụ thể PRR có các phối tử đặc
hiệu của chính mình để có thể nhận dạng một loại vi sinh vật nhất định [19]. Các thụ thể
này có thể nhận dạng mầm bệnh một cách trực tiếp (không thông qua opsonin) hoặc gián
tiếp (thông qua oposonin) [19]. Đối với In vivo, nhiều thụ thể có thể tham gia để nhận
dạng vi khuẩn thông qua đa phản ứng ở đa vị trí. Các phần có nguồn gốc từ nấm hay
mấm lớn đƣợc nhận bằng PRR giống nhƣ thụ thể TLR, thụ thể mannose, bổ thể 3 (CR3),
và dectin-1 [20]. Quá trình nhận dạng mầm bệnh của PRR kích thích q trình sản xuất
cytokine và chemokine dẫn tới quá trình hoạt động và sinh ra các tế bào khác tham gia
tới vị trí đang trong q trình bị viêm nhiễm. Từ đây, dẫn tới những phản ứng của miễn
dịch đáp ứng [12].
Fungi

Fungi

TLR2 TLR6

Fungi
Mannose
receptor

Dectin-1
CR3

CD11b CD18


Hình 1: Các thụ thể RRP đối với nấm có thể nhận dạng ra phần cacsbon. Thụ thể
Mannose nhận dạng thành phần mannan; TLR2 và TLR6, CR3, dectin-1 nhận
dạng β-glucans.
4.2. Thụ thể Toll- like (TLR)
Thụ thể Toll- like (TLR) là một protein màng mà nhận dạng ra các phân tử có sẵn
ở trên mầm bệnh (PAMP) [20]. Trong động vật có vú, họ thụ thể TLR bào gồm ít nhất
10 loại khác nhau. Chúng có một vai trị cơ bản tới nhận dạng các phối tử có nguồn gốc
từ mầm bệnh [20]. TLR2 có thể nhận dạng lipoproteins các gốc đƣờng có gắn lipid(lipoarabinomannan) từ thành tế bào của vi khuẩn và nấm [13]. TLR4 nhận dạng
lipopolysaccharide (LPS) từ thành tế bào của vi khuẩn gram âm [15]. TLR9 có thể nhận
dạng deoxycytidylate-phosphate-deoxyguanylate (CpG) có trong deoxyribonucleic acid
(DNA) của vi khuẩn [13]. Một vi sinh vật có thể đƣợc nhận bởi rất nhiều TLR. Thực tế,
tổ hợp của TLR có thể tham gia vào các đáp ứng viêm do macrophage hoặc tế bào
dendritic sinh ra trong quá trình cơ thể bị nhiễm mầm bệnh [20]. TLR bao gồm một
đoạn nằm bên trong tế bào đƣợc gọi là thụ thể Toll/IL-1 (TIR). Đoạn này sẽ tƣờng với
các đoạn TIR khác. Những đoạn TIR có chứa các phân tử tiếp nối giống nhƣ giống nhƣ

yếu tố phân chia tế bào 88 (MyD88), protein nối tiếp có đoạn TIR (TIRAP), mộ đoạn
TIR có chứa phần interferon-β (TRIF), và phân tử tiếp nối với TRIF (TRAM) [20]. Quá
trình nhận dạng mầm bệnh của TLR2 sẽ kích thích q trình hoạt động của yếu tố hoạt
động nhân tế bào là NF-kB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B
cells), và sản xuất ra các cytokine tiền viêm nhƣ tumor necrosis factor, TNF-α thông qua
đoạn TIRAP và đoạn MyD88, nhƣng q trình nhận dạng của TLR4 lại kích thích hoạt
động của NF-κB thơng qua TIRAP, MyD88 và kích thích hoạt động của đoạn phiễn mã
của interferon (IFN) giống nhƣ quá trình sản xuất IFN kiểu 1 [27].
4.3.Thụ thể Dectin- 1
Q trình nhiễm nấm đã kích hoạt q trình hoạt động ban đầu của các đáp ứng
miễn dịch bẩm sinh trong động vật có vú thơng qua các cơ quan cảm ứng đối với quá
trình nhiễm trùng [16]. Chất β-glucan là một thành phần quan trọng trong vỏ của tế bào
của nấm. Tế bào có thể nhận ra đƣợc thành phần này khi xâm nhập đó là nhờ vao sự


hoạt động của thụ thể Dectin-1. Thụ thể này nằm trên màng tế bào có một đoạn kiểu C
lectin gắn với loại màng kiểu II và có một đoạn bên trong cytoplasma của tế bào cùng
với một phần hoạt động dựa vào thụ thể miễn dịch tyrosine [8].
Dectin-1 đƣợc biểu hiện trên các dòng tế bào myeloid, monocyte, đại thực bào, tế
bào trung tính và tế bào tua [16]. Cho đến nay thụ thể Dectin-1 đã đƣợc hiểu rất rõ là
một thụ thể biểu hiện mạnh nhất trên đại thực bào trong quá trình thực bào của nấm. Đặc
biệt thụ thể này có thể nhận dạng đặc hiệu đối với β-glucan hoặc zymosan (một chất có
chứa một hàm lƣợng lớn β-glucan và đƣợc tách chiết từ Sacchomyces). Các đáp ứng
thực bào đối với quá trình nhận dạng vi sinh vật sẽ sản xuất ra các cytokine, chemokine,
quá trình thực bào hóa, giết mầm bệnh bằng sản xuất ra các peptide kháng vi sinh vật,
phản ứng oxy hóa (ROS) và RNS [16].
4.4. Thụ thể Dectin-1 hoạt động cùng với TLR2 để nhận dạng các phối tử có nguồn
gốc từ vi sinh vật
Zymosan là một hợp chất mà lƣợng β-glucan trong thành tế bào của
Saccharomyces cerevisiae chiếm phần chính [8,16]. Thành phần của zymosan có βglucan, mannan, và chitin. Thành phần này đƣợc nhận dạng bằng một số thụ thể chẳng

hạn nhƣ TLR2, TLR6, Dectin-1, thụ thể mannose, và CR3 [16]. Chất này đã đƣợc chứng
minh là kích thích q trình đại thực bào và quá trình viêm cả ở in vivo và in vitro [16].
Dectin-1 hoạt động cùng với một số TLR để nhận dạng ra nấm [16]. Thụ thể này
cùng với TLR2, Dectin-1 nhận dạng ra zymosan hoặc nấm Candida albicans truyền tín
hiệu điều hịa hoạt động của yếu tố nhân kích hoạt tế bào T (NFAT) và q trình sản
xuất interleukin (IL)-2, IL-10, và IL-12 p70 trong tế bào dendritic [16, 26]. Dectin-1
cũng tham gia vào quá trình thực bào, hoạt động của yếu tố tự phân bào (ERK)1/2
(extracellular signal-regulated kinase), và quá trình sản xuất các cytokine tiền viêm cùng
với TLR2 để nhận dạng ra Mycobacterium abscessus [16]. Hơn nữa, Dectin-1 tham gia
cùng với TLR2 và TLR4 trong đáp ứng miễn dịch bẩm sinh tới nhận Mycobacterium
ulcerans để kích thích sinh ra gốc oxy hóa (ROS) và sản xuất ra chemokines và IL-37
trong kerainocyte của ngƣời. Do vậy, Dectin-1 thực hiện một vai trò hoạt động giống
nhƣ một thụ thể chính nhận dạng ra q trình nhiễm nấm và mycobacterium [16].


Hình 2: Tín hiệu Dectin-1 hợp tác cùng TLR để nhận dạng nấm
Dectin-1 nhận dạng ra nấm để sinh ra quá trình enzyme kinsase của tyrosine ở lách
(Syk) và một đoạn protein caspase 9 (CARD)9. CARD9 tác động cùng với B-cell lymphoma-10
(Bcl-10) và vùng phiên mã gen 1 của lympho (MALT1) để kích thích tạo ra ROS và q trình
hoạt động của NF-κB. Quá trình biểu hiện của Dectin-1 expression tăng cường q trình sản
xuất cytokine trong sự có mặt của TLR2 và TLR6.

4.5. Glucocorticoid
Glucocorticoid đã đƣợc sử dụng nhƣ một chất chống viêm cùng với rất nhiều cơ
chế trong q trình hoạt động của nó [17]. Rất nhiều nghiên cứu đã chứng minh
glucocorticoid có thể điều hịa đƣợc chức năng của các tế bào viêm, đặc biệt là quá trình
phiên mã của các gen sinh cytokine [11]. Hơn nữa, glucocorticoid có thể ức chế q
trình sản xuất các cytokine tiền viêm nhƣ TNF-α, IL-6, IL-1, và làm giảm quá trình tiết
gốc nito và q trình hoạt hóa các yếu tố mô trong tế bào macrophage [22]. Do vậy,
glucocorticoid đã đƣợc sử dụng trong điều trị một số bệnh viêm nhiễm và các bệnh mẫn

cảm miễn dịch. Nhƣng hơn nữa, chúng có tiềm năng vô cùng to lớn trong hoạt động
kháng viêm và giảm q trình miễn dịch khơng có lợi cho cơ thể [9,17, 21].
Nhìn chung, quá trình viêm hệ thống mất kiểm soát đƣợc xem nhƣ là các đặc
trƣng của nhiễm trùng, của triệu chứng viêm cấp tính đƣờng hơ hấp. Một chất đƣợc biết
đó Hydrocortisone, là một glucocorticoid, có thể làm giảm đi đáng kể mức plasma của
protein C, phospholipase A2, và loại bỏ bớt các tế bào neutrophil trong các bệnh nhân bị
nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng [22]. Những nghiên cứu gần đây cũng chỉ ra
chất này có thể điều hòa hầu hết các cytokine tiền viêm [11], bao gồm ức chế các
cytokine có vai trị quan trọng trong miễn dịch bẩm sinh và nhiễm trùng [22]. Hiệu quả
của glucocorticoid đã đƣợc chứng minh trong các bệnh nhiễm trùng nặng nhƣ nhiễm vi
khuẩn meningitis, pneumocystis pneumonia, typhoid fever, và những trƣờng hợp nhiễm
H5N1 [11].
4.6 ROS và p47phox
4.6.1.Gốc oxy hóa ROS
ROS (reactive oxygen species) là một đại diện nhỏ của phản ứng oxy hóa, bao
gồm superoxide (O2-) anion, hydrogen peroxide (H2O2), peroxyl (ROO-) radical, acid
(HOCl), ozone (O3)[14]. ROS đƣợc tạo ra thông qua một loạt các phản ứng mà bắt đầu
bằng quá trình tạo ra superoxide [14]. Quá trình tạo ra ROS trong sinh lý đƣợc xem nhƣ
sản phẩm phụ xảy ra trong mitochondria, cytochrome P-450, và các yếu tố tế bào khác
[23]. ROS có thể tƣơng tác cùng với vô số phân tử, bao gồm những phân tử hữu cơ nhỏ,
protein, lipid, carbohydrate và nucleic acid [14]. Thông qua những tƣơng tác, ROS có
thể gây ra thảm họa hoặc làm thay đổi chức năng của phân tử đích [14]. Nicotinamide
adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidases (Nox) cũng tạo ra ROS. Thực ra,
ROS tham gia trong các cơ chế truyền tín hiệu kích thích liên quan tới khả năng miễn
dịch và q trình viêm [14]. ROS kích thích hoạt động của NF-κB. Ví dụ, q trình sản
xuất của TNF-α đƣợc điều hịa bằng con đƣờng NF-kB đƣợc kích hoạt bởi ROS trong tế
bào Kuffer, macrophage ở trong gan [25]. Hơn nƣa, ROS có thể điều hịa hoạt động
activator protein-1 (AP-1) (một yếu tố tham gia trong q trình viêm) thơng qua nhiều

cơ chế khác nhau [28].
4.6.2. Vai trò của p47phox trong quá trình sinh ROS


Nox sản xuất ROS thông qua rất nhiều tiểu đơn vị của nó bao gồm các thành
phần điều hịa cytoplasma là Rac, p67phox, p47phox, p40phox và các protein màng
flavocytochrome b558, bao gồm tiểu đơn vị gp91phox (Nox2) và p22 phox [28]. p47phox
có vai trị cơ bản đối với hoạt động của Nox [28]. Ở trạng thái bất hoạt, p47phox chuyển
động tới các tiểu đơn vị trong cytoplasma khác là p67phox và p40phox. Ở trạng thái
hoạt động, các tiểu đơn vị này sẽ kết hợp lại và chuyển electron ra ngoài màng tế bào
đƣợc biết nhƣ các gốc oxy hóa (O2-) [10]. Nhiều cơng bố đã chỉ ra p47phox có một vai
trị quan trọng đối với q trình tạo nên ROS. Nó đƣợc biểu hiện trong các tế myeloid,
các đoạn mơ nhƣ ở bên trong tai, ở nơron thần kinh, các tế bao gan, phổi [14].
O2-

Hình 3: Quá trình liên kết để tạo ra ROS (gốc oxy hóa)
Ở trạng thái bất hoạt của tế bào, các prtotein thuộc cytoplasma bao gồm phức hệ p40phox,
p47phox, và p67phox, và guanosine diphosphate (GDP), không liên kết với dạng cytochrome
b558 bao gồm gp91phox (Nox2) và protein p22phox. Khi ở trạng thái hoạt động, có sự thay đổi
của GDP đối với guanosine-5'-triphosphate (GTP) trên Ras được xem như là độc tố C3
botulinum dẫn tới kích hoạt. Lúc này, p47phox được phospho hóa và truyền tín hiệu tới và làm
cho phức hệ p67phox, p40phox được chuyển tới trên màng tế bào plasma. Q trình phospho
hóa của p47phox sẽ làm thay đổi cấu trúc dẫn tới tương tác với p22phox. Quá trình chuyển tới
màng của phức hệ p67phox, p40phox sẽ làm cho p67phox tương tác với Nox2. Cuối cùng enzym
GTP trên Rac tương tác cùng với Nox2. Phức hệ được hoạt động và tạo ra superoxide (O2-)
bằng chuyển electron từ NADPH trong cytoplasma thành oxy hóa ra ngồi tế bào [14].


4.7. Vai trò của đại thực bào trong đáp ứng viêm
Đại thực bào (macrophage) là những tế bào bạch cầu, phân nhóm thực bào, có vai

trị quan trọng trong hệ miễn dịch không đặc hiệu cũng nhƣ hệ miễn dịch đặc hiệu ở
động vật có xƣơng sống. Vai trị chính của chúng là thực bào các thành phần cặn bã của
tế bào và các tác nhân gây bệnh. Ngoài ra, chúng còn đóng vai trị các tế bào trình diện
kháng nguyên khởi động đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cơ thể. Do đóng vai trị quan
trọng trong q trình thực bào của cơ thể, đại thực bào có liên quan đế n m ột số tình
trạng bệnh lý do miễn dịch. Ví dụ các đại thực bào tham gia vào quá trình hình thành u
hạt (granuloma) hay các tổn thƣơng viêm do nhiều nguyên nhân khác nhau. Trong hội
chứng đáp ứng viêm hệ thống và trong nhiễm trùng huyết, đại thực bào giải phóng các
cytokine gây viêm mạnh, đóng vai trị quan trọng trong q trình bệnh lý của các hội
chứng này. Các cytokine chính đƣợc phóng thích bởi đại thực bào gồm: interleukin-1
(IL-1), yếu tố họai tử khối u TNF-α, IL-6, IL-8, IL-12, IFN-γ, nitric oxide (NO) vàc các
phân tƣ̉ dinh kế t tế bào dẫn đế n làm tăng quá trinh viêm
́
̀

. Nhƣ vâ ̣y, viê ̣c kiể m soát sản

xuấ t các chấ t này có thể làm giảm khả năng viêm . Macrophage là tế bào có kích thƣớc
tƣơng đố i lớn và có khả năng đáp ƣ́ng nhanh với các kich thich viêm ta ̣o ra bởi LPS
́
́
Ngoài ra, các TLR ở macrophage đƣợc biểu hiện m ạnh hơn so với các tế bào ba ̣ch cầ u
khác (Hình 4) nên nó thƣờng đƣơ ̣c lƣ̣a cho ̣n trong các mô hinh sàng lo ̣c và nghiên cƣ́u
̀
cơ chế kháng viêm in vitro

Macrophage
Granulocyte

Hình 4: Biể u hiên của các thụ thể ở các tế bào bạch cầu

̣
5. Mô hinh nghiên cƣu viêm thƣc nghiêm in vivo sƣ̉ du ̣ng LPS
̣
̣
́
̀

.


Khả năng kháng viêm của một chất nghiên cứu , đă ̣c biê ̣t là sau bƣớc sàng lo ̣c in vitro,
chỉ đƣợc khẳng định khi tiến hành thử nghiệm trên mơ hình động vật thực nghiệm . Đối
với chấ t kháng viêm , các nghiên cứ u thƣờng sƣ̉ du ̣ng chuô ̣t vì hê ̣ gen chuô ̣t và nguời có
mƣ́c đô ̣ tƣơng đồ ng khá cao (85%) [18]. Ngồi ra , sƣ̉ du ̣ng ch ̣t sẽ ít tố n kém và dễ
thƣ̣c hiê ̣n hơn so với các đô ̣ng vâ ̣t thƣ̣c nghiê ̣m khác . Các nghiên cứu trƣớc đây thƣờng
sử dụng trực tiếp các mơ hình gây viêm thực nghiệm in vivo để sàng lọc và nghiên cứu
cơ chế kháng viêm của chấ t cầ n nghiên cƣ́u

. Các mơ hình này thƣờng là : i) sƣ̉ du ̣ng

carrageenan, mô ̣t polysaccharide tách tƣ̀ tảo đỏ , để gây viêm ở chân chuột (caageenaninduced hind paw edema ) trong điề u kiê ̣n có mă ̣t và vắ ng mă ̣t của chấ t cầ n nghiên cƣ́u
và sau đó so sánh thể tích bàn chân viêm với đối chứng

[33]; ii) gây viêm xoang bu ̣ng

(peritroneal inflammation ) bằ ng cách t iêm carrageenan vào bu ̣ng chuô ̣t trong điề u kiê ̣n
có mặt và vắng mặt của chất nghiên cứu . Lƣơ ̣ng dich viêm tiế t trong xoang bu ̣ng chuô ̣t
̣
sẽ đƣợc thu lại và so sánh với đối chứng về thể tích cũng nhƣ lƣợng bạch cầu và protein
trong dich [15]; iii) gây viêm ma ̣n tính

̣

(chronic inflammation ) bằ ng cách tiêm

carrageenan vào phầ n cơ chuô ̣t trong điề u kiê ̣n có mă ̣t và vắ ng mă ̣t của chấ t nghiên cƣ́u
để tạo khối u . Sau đó khố i u đƣơ ̣c lấ y ra để đo tro ̣ng lƣơng khô so vớ

i mẫu đố i chƣ́ng

[29]. Hiê ̣n nay, mô hình gây viêm thƣ̣c nghiê ̣m sƣ̉ du ̣ng ta ̣i nhiề u phòng thí nghiê ̣m trên
thế giới go ̣i là shock nô ̣i đô ̣c tố (endotoxin shock model ) thƣờng sƣ̉ du ̣ng zymosan của
nấm (mô ̣t tác nhân gây viêm ma ̣nh ) để gây v iêm cấ p và viêm đă ̣c hiê ̣u với thu ̣ thể
Dectin-1 cầ n nghiên cƣ́u . Ở mô hình này , ch ̣t sau khi đƣơ ̣c gây viêm sẽ đƣ ợc tiêm
chấ t nghiên cƣ́u . Hàm lƣợng các chất trung gian tiết ra trong quá trình tiền viêm cũng
nhƣ nhƣ̃ng yế u tố tham g iá vào các con đƣờng tín hiệu viêm đƣợc theo dõi và đánh giá ,
ví dụ nhƣ cytokine, chemokine tiền viêm (TNF-a; IL-6, IL-8) và kháng viêm(IL-10),
interferon, q trình phospho hóa các yếu tố tự phân bào protein kinase (MAPKs), hay
phản ứng ơxy hóa. Tƣ̀ đó tác du ̣ng của chấ t nghiên cƣ́u đƣơ ̣c khẳ ng đinh . Với mô hình
̣
in vivo này, viê ̣c đánh giá tác du ̣ng của chấ t kháng viêm sẽ có hê ̣ thớ ng , chính xác và chi
tiế t hơn ở mƣ́c phân tƣ̉ .
6. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGỒI NƢỚC
6.1.Tình hình nghiên cứu ngồi nƣớc
Các chất kháng viêm đƣợc phân loại thành 3 nhóm chính gồm:
6.1.1. Các chất kháng viêm khơng có bản chất steroid (NSAID)


Đa ̣i diê ̣n cho nhóm này là aspirin , ibuprofen và naproxen . Cơ chế kháng viêm của
NSAID đƣơ ̣c phát hiê ̣n là do chúng ƣ́c chế sƣ̣ tổ ng hơ ̣p PG . Đích tác du ̣ng đƣơ ̣c biế t rõ
nhấ t của các chấ t này là cyclooxygenase

(COX), là enzym có vai trị chuyển hóa axit

arachidonic thành prostaglandins (PG) và thromboxane (TX). Mô ̣t số NSAID la ̣i có khả
năng ƣ́c chế enzym liên quan đế n sƣ̣ bào mòn màng nhày da ̣ dày . Nghiên cƣ́u lâm sàng
đã chƣ́ng minh các chấ t NSAID này có tác du ̣ng ƣ́c chế sƣ̣ hinh thành PG ở màng nhày
̀
dạ dày. Tuy nhiên, salysilate, mô ̣t chấ t kháng viêm thuô ̣c nhóm này cũng có tác du ̣ng ƣ́c
chế sƣ̣ sinh tổ ng hơ ̣p của PG nhƣng la ̣i không làm bào mòn màng nhày da ̣ dày nhƣ
aspirin. Lý do tại sao lại có sự khác nhau về cơ chế tác dụng giữa aspirin và salisylate là
vấ n đề chƣa giải thich đƣơ ̣c [31].
́
6.1.2.Các chất kháng viêm có bản chất steroid
Steroid là một hợp chất hữu cơ có cấu trúc mang một vịng 4 cycloalkane. Th ̣c về
nhóm chất này có các chất corticoid

. Chúng tác dụ ng thông qua ƣ́c chế enzyme

phospholipases A 2, là enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển hóa phospholipase A

2

thành axit arachidonic . Nhƣ vâ ̣y, cuố i cùng thì corticoid cũng ƣ́c chế s ự sinh tổng hợp
của PG , TX và LT. Các chất kháng viêm có bản chất sterod ức chế phospholipase A 2
mô ̣t cách gián tiế p thông qua viê ̣c giải phóng các chấ t ƣ́c chế protein có tên go ̣i là
macrocortin, lipomodulin hay renocortin có khố i lƣơ ̣ng phân tƣ̉ đa ̣t khoảng 15, 30 và 40
kDa. Đa ̣i diê ̣n nhó m chấ t này là lipocortin đã đƣơ ̣c tinh sa ̣ch , thƣơng ma ̣i và đƣơ ̣c xem
là một trong nhƣ̃ng chấ t kháng viêm ma ̣nh [31].. Các chất có bản chất steroid thƣờng là
phố i tƣ̉ của thu ̣ thể glucocorticoid.
6.1.3. Các chất khác

Th ̣c về nhóm này có vàng và colchicine . Trong trƣờng hơ ̣p của colchichine , chấ t
này ức chế sự hình thành tinh thể urate trong khớp của bệnh nhân gout thông qua việc
làm giảm sự tiết các chất chemotaxis của bạch cầu đa nhân và giải ph

óng enzyme

lysosom. Colchicine có tác du ̣ng ƣ́c chế đă ̣c hiê ̣u sƣ̣ giải phóng mô ̣t glycoprotein có
trọng lƣợng phân tử 8400 Da. Đây là mô ̣t chấ t chemotaxis của ba ̣ch cầ u đa nhân đớ i với
các bạch cầu trung tính và monocytes có khả n ăng thƣ̣c bào các thể urate [31].
6.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc
Việt Nam là nƣớc có khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng và ẩm nên khả năng mắc các
bệnh nhiễm trùng nặng và choáng khuẩn do viêm là rất cao. Cho đến nay, viêm nặng và


choáng do viêm vẫn là một trong các nguyên nhân chính của những ca tử vong ở các
bệnh nhân cần chăm sóc đặc biệt. Các trƣờng hợp này vẫn tiếp tục gia tăng rộng khắp cả
trên thế giới và Việt Nam. Trong nhiề u trƣờng hơ ̣p , quá trình bị viêm kéo dài mà không
đƣơ ̣c điề u tri ̣kip thời còn dẫn đế n nhƣ̃ng bê ̣nh man tính nguy hiể m nhƣ tim ma ̣ch , tiể u
̣
̃
đƣờng, thấ p khớp…
Việt Nam cũng là nƣớc có nguồn tài nguyên sinh vật rất phong phú, đặc biệt về
thực vật. Theo thống kê của Viện Dƣợc liệu thì tính đến năm 2000, nƣớc ta có gần 4000
lồi thực vật, 22 loài tảo và trên 33 loài động vật đƣợc dùng làm thuốc ở các mức độ
khác nhau, đó là chƣa kể đến nhiều loài tảo biển và động vật biển cũng có thể đƣợc dùng
làm thuốc[2]. Các số liệu trên đây cho thấy tiềm năng to lớn của nguồn dƣợc liệu Việt
Nam có thể sử dụng trong các nghiên cứu sàng lọc để tim ra nh ững chất có hoạt tính
̀
dƣợc học q hiếm, trong đó có các chất chống viêm mới có hiệu quả cao mà khơng gây
ra các phản ứng phụ. Tuy vậy, có thể nói các nghiên cứu khoa học một cách có hệ thống

và chi tiết về điều tra, khai thác, đánh giá tác dụng và sử dụng các chất hoạt tính sinh
học từ nguồn tài nguyên sinh vật trong nƣớc để phát triển thành các sản phẩm thuốc mới,
phục vụ cho bảo vệ và chăm sóc sức khỏe cộng đồng cịn rất hạn chế.
Trong lĩnh vực nghiên cứu và ứng dụng các chất kháng viêm, có thể nói rằng
chúng ta chƣa có các nghiên cứu sâu cũng nhƣ chƣa có các hệ thống và mơ hình nghiên
cứu hiện đại về q trình viêm và tác dụng của chất chống viêm. Đây chính là cơ sở để
phát triển các sản phẩm thuốc có thể thƣơng mại đƣợc trên thị trƣờng Việt Nam và quốc
tế. Các nghiên cứu về viêm đƣợc thực hiện chủ yếu ở Viện Dƣợc liệu Trung ƣơng, các
trƣờng Đại học Dƣợc, trƣờng Đại học Y Hà Nội và Học viện Quân y 103. Các nghiên
cứu ở nhƣ̃ng cơ sở này mới chỉ dừng ở mức tạo đƣợc mơ hình gây viêm thực nghiệm in
vivo cổ điể n nhƣ đã trinh bày ở trên . Cụ thể là các thí nghiệm đƣợc thực hiện trên chu ột
̀
thông qua sử dụng chất gây viêm carrageenan để tạo mơ hình viêm cấp dƣới hình thức
gây phù bàn chân chuột và gây viêm màng bụng chuột sau khi tiêm chất gây viêm này.
Việc gây viêm mãn tính sử dụng chất amiant để tạo u hạt trong cơ thể chuột. Việc đánh
giá tác dụng kháng viêm đƣợc thực hiện bằng cách đo thể tích bàn chân, đo thể tích dịch
viêm ổ bụng, đo trọng lƣợng khối u hạt tách ra, đếm số lƣợng bạch cầu so với mẫu đối
chứng, từ đó đánh giá tác dụng kháng viêm của các chất nghiên cứu. Ngoài ra, việc đánh


giá tác dụng kháng viêm cũng chủ yếu đƣợc thực hiện với các cao chiết thơ của thực vật.
Điển hình nhƣ các nghiên cứu của Đă ̣ng Diễm Hồ ng và cô ̣ng sƣ̣ với các dich chiế t rong
̣
tảo biển Việt Nam [1]. Nhóm nghiên cứu đã phát hiện thấy dịch chiết methanol của hai
loài tảo biển là Sargassum swartzii và Ulva reticulata thể hiê ̣n hoa ̣t tinh kháng viêm cao
́
mà không gây độc v ới động vật thử nghiệm [1]. Hàng loạt các nghiên cứu khác trong
thời gian gầ n đây cũng chỉ sƣ̉ du ̣ng các mô hinh nghiên cƣ́u này để đánh giá tác du ̣ng
̀
kháng viêm của các dịch chiết thực vật nghiên cứu . Ví dụ nhƣ Hà Vân Oanh và c ộng sự

(2010) trên cao lỏng của rễ cây bạch đồng nữ (Clerodendrum chinense) [4], Đỗ Thị
Oanh và cộng sự (2010) trên cao sói r ừng (Sapium sebiferum) [3] hay Nguyễn Thị Bích
Hằng (2009) trên cao lỏng lá vọng cách (Premna corymbosa) [5]... Nhƣ vậy có thể nói
rằng, mơ hình nghiên cứu viêm và đánh giá tác dụng kháng viêm ở Việt Nam hiện nay là
đơn giản, cổ điể n , tố n nhiề u thời gian và thi ếu tin câ ̣y. Nhƣ vâ ̣y, chúng ta còn thiếu các
nghiên cứu hiện đại với các mơ hình gây viêm đ ạt chuẩn quốc tế hay nghiên cứu cơ chế
kháng viêm thông qua đánh giá ảnh hƣởng của chất nghiên cứu lên các thụ thể nhƣ TLR,
GC, mức độ giải phóng các chất trung gian đƣợc tiết ra trong quá trình tiền viêm và
viêm, các tín hiệu gây viêm đặc hiệu. Đặc biệt, cho đến nay chúng ta chƣa có mơ hình
sàng lọc in vitro cho phép sàng lọc nhanh, chính xác và hiệu quả các chất kháng viêm
mới từ các nguồn nguyên liệu khác nhau.
7. CÂY NHỌ NỒI VÀ VAI TRÒ CỦA WEDELOLACTONE TRONG QUÁ
TRÌNH CHỐNG VIÊM
7.1. Cây nhọ nồi
Thực vật là nguồn vô giá đối với những sản phẩm dƣợc học. Trên thế giới, những
thực vật có tính dƣợc học đƣợc sử dụng truyền thống đã sản xuất ra một loạt những hợp
chất có rất nhiều tiềm năng chữa bệnh. Việt Nam, trong lĩnh vực dƣợc học đã sản xuất
nhiều sản phẩm có nguồn gốc từ thực vật mang những dƣợc tính mới. Thực vật làm
thuốc đã góp một phần quan trọng trong điều trị một số bệnh thông qua những dƣợc tính
quí giá [2]..
Cây nhọ nồi hay là cây cỏ mực, hàn liên thảo (danh pháp khoa học: Eclipta alba
Hassk, hoặc Eclipta prostrata L.) là một loài cây thuộc Họ Cúc.


Cây nhọ nồi là cây cỏ, sống một hay nhiều năm, mọc đứng hay mọc bò, cao 30-40cm.
Thân màu lục hoặc đỏ tía, phình lên ở những mấu, có lơng cứng. Lá mọc đối, gần nhƣ
khơng cuống, mép khía răng rất nhỏ; hai mặt lá có lơng. Hoa hình đầu, màu trắng, mọc ở
kẽ lá hoặc ngọn thân, gồm hoa cái ở ngồi và hoa lƣỡng tính ở giữa. Quả bế dài 3mm, có
2-3 vảy nhỏ, có 3 cạnh, hơi dẹt.

Hình 5: Cây nhọ nồi
Theo đơng y cây nhọ nồi có thể chữa can, thận âm hƣ, các chứng huyết nhiệt,
chứng ho ra máu, nôn ra máu, đại tiện và tiểu tiện ra máu, chảy máu cam, chảy máu
dƣới da, băng huyết rong huyết, râu tóc sớm bạc, răng lợi sƣng đau.
7.2. Wedelolactone
Cây nhọ nồi bao gồm nhiều hợp chất hữu cơ giống nhƣ wedelolactone (I) và
demethylwedelolactone (II), polypeptide, polyacetylene, dẫn suất thiophene, steroid,
triterpene and flavonoid [30]. Đặc biệt, Wedelolactone đƣợc biết có một loạt những hoạt
tính sinh học và đƣợc sử dụng trong điều trị bệnh viêm gan, xơ gan, kháng vi khuẩn [30].
Ngoài ra, Kobori và cộng sự đã chứng minh đƣợc vai trò của Wedelolactone nhƣ một
chất ức chế IKK, một kinase đóng vai trị quan trọng trong hoạt động của yếu tố NF-κB,
bằng cách tác động đến con đƣờng photphoryl hóa IκBα [30].
Bên cạnh đó, một hợp chất hữu cơ tự nhiên bao gồm Wedelolactone và một số chất
từ cây Wedelia canlendulacea đã đƣợc sử dụng trong y học ở Nam Mỹ giống nhƣ thuốc
kháng lại nọc độc của rắn [32].

Trong y học truyền thống của Trung Quốc,


Wedelolactone đƣợc sử dụng điều trị những bệnh về gan, các bệnh viêm nhiễm virut
[30]. Hơn nữa, Wedelolactone có khả năng giảm sự phát triển của ung thƣ. Gần đây, một
số nghiên cứu đã cơng bố Wedelolactone có khả năng ức chế sự phát triển của dòng tế
bào ung thƣ tiền liệt tuyến, tuyến yên, và hiệu quả trên dòng tế bào MDA-MB-23 (tế bào
ung thƣ vú) [30]. Ngoài ra, mới đây, hoạt tính của Wedelolactone tách chiết từ cây nhọ
nồi đã đƣợc tiến hành tại Phịng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và ProteinĐại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội bƣớc đầu đã có những kết quả đáng quan tâm về
khả năng chống viêm. Đây là cơ sở để chúng tôi tiếp tục nghiên cứu sâu hơn nữa về khả
năng phòng và chữa bệnh nhiễm trùng nặng và chống nhiễm trùng của hoạt chất tiềm
năng trên mơ hình viêm in vitro thơng qua thụ thể Dectin-1 và in vivo trên chuột bị
choáng nhiễm khuẩn do tiêm zymosan một cấu tử đặc hiệu của thụ thể Dectin-1, góp
phần làm sáng tỏ vai trò của hoạt chất Wedelolactone trong vai trò điều trị chống viêm.

Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1.Động vật thí nghiệm
Chuột Swiss đƣợc mua từ Viện vệ sinh dịch tế trung ƣơng. Trọng lƣợng chuột từ 1820gram.
2.1.2. Hóa chất
Wedelolactone đƣợc cung cấp từ Phịng Thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Enzym
và Protein. Cấu tử đặc hiệu của Dectin-1: zymosan (sigma, Mỹ), ELISA kit IL-6, IL-10,
TNF, IL12p40 (BD Bioscience, Mỹ). Kit đếm tế bào sống chết (CellTiter 96® AQueous
One Solution Cell Proliferation Assay, Promega, Mỹ). Laminarin (chất ức chế Dectin-1),
Galactan (chất đối chứng dƣơng, Sigma), các hóa chất mua của hãng Sigma. Thuốc
chống viêm Desamethasone (một loại thuốc sử dụng chống nhiễm trùng nặng và choáng
nhiễm trùng, Sigma, Mỹ).
2.1.3. Thiết bị nghiên cứu
Tủ ấm CO2, Tủ cấy vô trùng Naure, Máy đọc ELISA(bio-rad, Mỹ), Tủ lạnh: Kính
hiển vi soi ngƣợc (Olympus, Nhật), Máy khuấy từ nhiệt (Đức), kính hiển vi laze hội tụ


(LSM 510)… và các dụng cụ thí nghiệm thơng thƣờng khác nhƣ: đĩa nuôi cấy 24, 48, 96
giếng (Corning, Mỹ), kim uống, kim tiêm, dao, kéo.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1.Tách chiết macrophage từ tủy xƣơng của chuột
2.2.2.Đánh giá hoạt tính độc tố của Wedelolactone tới khả năng sống của BMDM bằng
kít đếm tế bào sống chết
2.2.3. Đánh giá khả năng sản xuất cytokine bằng ELISA Kit
2.2.4. Phân tích ức chế của Wedelolactone trong q trình tạo phản ứng oxy hóa
2.2.5. Gây nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng ở chuột bằng tiêm zymosan
2.2.6. Đánh giá hiệu quả sống xót của chuột bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng
trong chuột bằng Wedelolactone
2.2.7. Đánh giá hiệu quả ức chế quá trình sinh cytokine trong huyết thanh của Chuột bị

nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng bằng tiêm Wedelolactone
2.2.8. Đánh giá hiệu quả Wedelolactone và Dexamethason trong điều trị chuột bị nhiễm
trùng nặng và chống nhiễm trùng
2.2.9.Phân tích thống kê

Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
1. Khả năng sống của tế bào khơng bị ảnh hƣởng bởi Wedelolactone
Để khẳng định Wedelolactone có gây độc tố đối với tế bào BMDM hay không,
BMDM đƣợc chia đều vào các giếng khác nhau trên đĩa nuôi tế bào 96 giếng với mật độ
1x 105. Các BMDM này đƣợc sử lý với Wedelolactone ở các nồng độ khác nhau nhƣ
trên hình 1. Sau đó, BMDM đƣợc ủ cùng với 10 μl kit đếm tế bào. Kết quả đƣợc chỉ ra ở
trên Hình 1, tỉ lệ phần trăm của các BMDMs khơng có sự khác biệt giữa BMDMs đƣợc
sử lý với các nồng độ khác nhau của Wedelolactone sau 48 giờ. Kết quả này, cho thấy
Wedelolactone không có khả năng gây độc với BMDM.


TỶ LỆ TẾ
BÀO SỐNG
(%)

100
75
50
25

ĐC

10

20

30

(μg/ml )

Hình 8: Wedelolactone khơng gây độc đối với tế bào BMDM
BMDMs được nuôi với mật độ 1×105 tế bào/ giếng. Sau 3-4 ngày, các tế bào này được
sử lý cùng với Wedelolactone ở các nồng độ lần lượt là 10, 20, 30 μg/ml. Các tế bào sống đã
được đo bằng kit đếm tế bào. Dữ liệu chỉ ra sự sai số của ba thí nghiệm độc lập

2. Đánh giá khả năng zymosan kích thích tế bào BMDM sinh cytokine
Để xác định việc kích thích q trình sinh các cytokine tiền viêm và kháng viêm của
BMDM bằng zymosan, BMDM sau khi đã đƣợc nuôi trong đĩa 48 giếng với mật độ là
1x105 sẽ đƣợc ủ với zymosan (100 µg/ml) ở các thời gian khác nhau nhƣ trên hình 2. Nhƣ
vậy, zymosan (100µg/ml) kích thích BMDM, sinh cytokine TNFα , IL 6, IL 12p40, IL-10
tăng dần từ mốc 0h , 4h ,8h , 18h sau đó bắt đầu giảm. Từ kết quả này, chỉ ra rằng thời gian
ủ Zymosan để sinh ra Cytokine nhiều nhất là sau 18 giờ


nồng độ cytokine (pg/ml)
15000

nồng độ cytokine (pg/ml)
15000 IL-6

TNF-α

10000

10000

5000

5000

0

0
0 4 8

12000

18

48

(h)

0 4 8

10000

IL12p40

18

48

(h)

IL-10

8000
8000
4000
4000
2000
0
4

8

18

0

48 (h)

0 4 8

18

48 (h)

Hình 9: Zymosan kích thích tế bào BMDM sản xuất cytokine tiền viêm và kháng
viêm.
BMDMs từ chuột được ủ với zymosan 100 (µg/ml). Dịch tế bào được ủ với zymosan ở
các thời gian khác nhau lần lượt là 0, 4, 8, 18, 48 giờ sẽ được đánh giá đối với quá trình sản
xuất cytokine bằng ELISA.. Các kết quả được biểu hiện sai số ý nghĩa bởi 5 thí nghiệm độc lập.

3. Wedelolactone ức chế q trình sinh cytokine tiền viêm trong BMDM đƣợc kích
thích bởi zymosan
Wedelolactone có khả năng làm giảm sốt, chống ung thƣ (). Tuy nhiên, vai trị
của nó trong q trình truyền tín hiệu viêm gây ra bởi zymosan vẫn chƣa đƣợc chứng
minh. Để đánh giá hiệu quả Wedelolactone trong quá trình này, BMDM đã đƣợc ủ với
các nồng độ khác nhau của Wedelolactone trong 45 phút. Sau đó, BMDM đƣợc ủ tiếp
với zymosan sau 18 giờ. Từ hình 10 cho thấy Wedelolactone đã ức chế quá trình sản
xuất cytokine tiền viêm TNF, IL-6, IL12p40. Trái lại, đối với protein kháng viêm IL-10
thì Wedelolactone lại khơng có khả năng ức chế. Từ kết quả này cho thấy với nồng độ


nồng độ cytokine (pg/ml)

nồng độ cytokine (pg/ml)
15000 IL-6

12000 TNF-α

10000

8000

5000

4000

Hình 10: Wedelolactone ức chế quá trình sinh cytokine tiền viêm trong BMDM
0

DM

2.5

0

DM
10
đƣợc20 µg/ml
kích thích bằng zymosan2.5

5
W

5

10

20 µg/ml

W
zymosan

zymosan

12000 IL-10

12000 IL-12p40

8000

8000

4000
4000
0
0

DM

2.5

5
W

10

20 µg/ml

DM

2.5

5

10

20 µg/ml

W
zymosan

zymosan

zymosan

4. Wedelolactone điều hịa q trình sinh cytokine tiền viêm thơng qua thụ thể
Dectin-1
Thụ thể Dectin-1 tham gia chính trong quá trình nhận dạng miễn dịch ban đầu
của nấm thơng qua liên kết glucan [59]. Do đó, Wedelolactone đã đƣợc điều tra xem có
khả năng ức chế q trình sản xuất cytokine do zymosan kích thích. Đối với mục đích
này, BMDMs đã đƣợc ủ cùng với một số nồng độ tăng dần của laminarin, một chất có
khả năng ức chế quá trình hoạt động của thụ thể Dectin-1 [27], hoặc polysaccharide
galactan ở các nồng độ giống nhƣ laminarin sau 45 phút. Tiếp theo, các tế bào đƣợc ủ
cùng với Wedelolactone (hình 11A), Dex (hình 11B) trƣớc khi ủ với zymosan. Tế bào ủ
cùng với Laminarin xuất hiện quá trình sinh ra cytokine ngƣợc lại với tế bào không sử lý
với Laminarin ở hình 11A. Các cytokine TNF-α, and IL-6 in BMDMs đã tăng dần theo
nồng độ của Laminarin. Trái lại, các tế bào đƣợc sử lý cùng với polysaccharide galactan
vẫn cho kết quả giống nhƣ tế bào đƣợc sử lý với Wedelolactone. Giống nhƣ kết quả


Hinh 11A, các kết quả trên hình 4B cũng cho kết quả tƣơng tự. Những kết quả này gợi ý
rằng thụ thể Dectin-1 có một vai trị cơ bản trong quá trình Wedelolactone và Dex
truyền đi quá trình ức chế zymosan kích thích sinh ra cytokine tiền viêm trong BMDMs.

A

B

4800

4800

3600

3600

2400

2400

1200

1200

0
8000

0
8000

IL-6

6000

TNF-

**
IL-6

6000

4000

4000
2000

2000

0
800

0
800

600

600

400

400

200

200

0

M ĐC ĐC

IL-12p40

0
M ĐC ĐC

lam

gal

W
Dexa

Hình 11: Wedolactone hoặc Dex điều hịa q trình đáp ứng viêm kích thích bằng
zymosan thơng qua thụ thể dectin-1.
5. Wedelolactone điều khiển quá trình sinh ROS do zymosan kích thích thơng qua
thụ thể Dectin-1
Zymosan có thể kích thích q trình sản xuất ROS trong đại thực bào [16]. Tuy
nhiên, vai trị của Wedelolactone trong q trình sinh ROS do zymonsan kích thích
trong BMDB vẫn chƣa rõ. Để điều tra quá trình này, BMDMs đã đƣợc ủ cùng với
Laminarin hoặc Galactan trong 60 phút trƣớc khi ủ với Wedelolactone (20g/ml) hoặc
Dex (100nM). Sau đó, các tế bào này đƣợc ủ tiếp với zymosan trong 30 phút. Các tế bào
này tiếp tục đƣợc ủ với DHE theo nhƣ phần phƣơng pháp. Nhƣ chỉ ra ở Hình 12A,
zymosan đã kích thích tạo ra ROS, tuy nhiên q trình sản xuất ROS đã bị ức chế bởi tế
bào đƣợc ủ với Wedelolactone nhƣng quá trình này bị đảo ngƣợc đối với tế bào đƣợc ủ
với Laminarin. Tuy nhiên, điều này không xảy ra với tế bào đƣợc ủ với galactan. Trên
hình 12B, kết quả tƣơng tự hình 12A khi thay Wedelolactone bằng Dex. Những kết quả
này chỉ ra rằng Wedelolactone đã điều hịa q trình sinh ROS do zymosan kích thích
trong BMDM thơng qua thụ thể Dectin-1.


A

B
Zym

Zym
Quá trình
sản xuất
ROS(O2-)

Quá
trình
sản xuất
ROS(O2)

W

Dexa

***

lam+

gal+

lam+

gal+

W

W

Dexa

Dexa

Hình 12: Wedelolactone hoặc Dex ức chế q trình sản sinh ROS đƣợc kích thích
bởi zymosan thơng qua Dectin-1
6. Wedelolactone bảo vệ chuột bị nhiễm trùng nặng và chống nhiễm trùng gây ra
bởi zymosan
Zymosan kích thích q trình viêm cấp tính và làm hỏng đa cơ quan trong các mơ
hình động vật bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng [23,24]. Để đánh giá hiệu quả
điều trị của Wedelolactone trong chuột bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng,
chuột đã đƣợc chia thành 4 nhóm khác nhau (mỗi nhớm 10 con) đƣợc tiêm với
Wedelolactone lần lƣợt là 10 mg/kg, 20 mg/kg, 30 mg/kg trọng lƣợng cơ thể và nhóm
đối chứng khơng đƣợc tiêm Wedelolactone. Sau 24 giờ, các nhóm chuột này sẽ đƣợc
tiêm zymosan (2 mg/g trọng lƣợng cơ thể). Khả năng chuột sống xót đƣợc tính sau 5
ngày đƣợc tiêm với zymosan. Trên hình 6 cho thấy chuột sau 5 ngày nếu không nhận
đƣợc Wedelolactone đã chết 100%. Tuy nhiên, chuột nhận đƣợc Wedelolactone ở các
nồng độ khác nhau thì khả năng sống xót đã tăng dần. Ở nồng độ Wedelolactone 20
mg/ml tỉ lệ sống xót gần 40% cũng gần giống nhƣ tỉ lệ chuột sống xót với
Wedelolactone 30 mg/ml. Từ kết quả này, cho thấy Wedelolactone có thể cải thiện đƣợc
q trình điều trị chuột bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm khuẩn tại nồng độ 20
mg/ml.
ĐC (n=10)

Khả
100
năng
sống 80

xót
60
(%)

W= 10 mg/kg (n= 10)

40

P=0.0123*

(%)

ĐC (n=10)
W= 20 mg/ kg (n=10)

Khả
năng 100
sống 80
xót(%)

0

20

40

60

80

100 (h)

0

ĐC (n=10)
W= 30 mg/ kg (n=10)

60

60
40

40

20

20
0

Khả
năng 100
sống 80
xót

20
0

0

20

40

60

80

100 (h)

0

20

40

60

80

100 (h)


7. Wedelolactone đã làm giảm khả năng sản xuất cytokine trong chuột bị nhiễm
trùng nặng và choáng nhiễm trùng

IL-6

Nồng độ 2000

TNF-

Nồng độ4000

cytokine 1500
(pg/ml)

cytokine 3000
(pg/ml)
2000

1000

1000

500

0

ĐC ĐC

0

W

ĐC

ĐC

W

Zym

Zym

Hình 14: Wedelolactone đã ức chế quá trình sinh cytokine tiền viêm trong chuột bị
nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng
8. Hiệu quả của Wedelolactone và Dexamethasone trong chuột bị nhiễm trùng
nặng và choáng nhiễm trùng

A

Khả
năng
sống xót 100
(%)

ĐC
W(20mg/kg)
Dex (1mg/kg)

80
60
40
20
0

0

20

B Nồng độ

40

60

80

100 (h)

Nồng độ

Cytokine

4000

TNF-

cytokine
(pg/ml)2000

(pg/ml) 3000
2000

IL-6

1500
1000

1000

0

500
ĐC ĐC Dex W

Zym

0

ĐCĐC Dex W

Zym

Hình 15: Hiệu quả điều trị của Wedelolactone cao hơn so với Dexamethasone.


KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KÊT LUẬN
1. Nghiên cứu này đã chứng minh đƣợc vai trò của Wedelolactone với nồng độ 20μg/ml
trong q trình kháng viêm thơng qua thụ thể Dectin-1:
- Ức chế đƣợc quá trình sinh cytokine tiền viêm TNF, IL-6, IL12p40.
- Ức chế q trình sinh gốc oxy hóa.
2. Quan trọng hơn, Wedelolactone với nồng độ là 20mg/kg trọng lƣợng cơ thể có thể
cải thiện đƣợc sự sống của chuột bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng.
KIẾN NGHỊ
1. Tiếp tục nghiên cứu sâu hơn trong cơ chế chống viêm bằng thử trên các đối tƣợng
khác nhau ngoài chuột.
2. Xác định thêm Wedelolactone có phải là một cấu tử của thụ thể Glucocorticoid
hay không.

References
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

1. Đặng Diễm Hồng, Hoàng Minh Hiền, Nguyễn Minh Thanh, Châu Văn Minh,
Nguyễn Trọng Thông (2008) Nghiên cứu khả năng kháng viêm từ rong tảo biển
Việt Nam. Tạp chí Hố học. 46(5A): 81-90.
2. Đỗ Tất Lợi (2000) Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. NXB Y học Hà Nội.
3. Đỗ Thị Oanh, Phạm Thanh Kỳ, Nguyễn Thi ̣Bích Hằ ng , Nguyễn Tro ̣ng Thông , Phạm
Thị Vân Anh (2010) Nghiên cƣ́u tác du ̣ng chố ng viêm và bảo vê ̣ gan của cao sói
rƣ̀ng (Sapium sebiferum) trên thƣ̣c nghiê ̣m. Tạp chí Dược học. 50(411): 36-39.
4. Hà Vân Oanh , Phạm Xuân Sinh , Nguyễn Thái An , Nguyễn Tro ̣ng Thông , Phạm Thị
Vân Anh (2010) Nghiên cƣ́u tác du ̣ng chố ng viêm cấ p của cao lỏng rễ ba ̣ch đồ ng
nƣ̃ (Clerodendrum Chinese var. simplex (Mold) SL Chen) trên thƣ̣c nghiê ̣m . Tạp
chí Dược học. 50(414): 20-23.