Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn lactic

MỞ ĐẦU
1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Bacteriocin là một loại protein được tổng hợp bởi vi khuẩn. Nó có khả
năng ức chế sự phát triển của những loại vi khuẩn có cấu trúc tương tự.
Bacteriocin được A.Gratia tìm thấy đầu tiên năm 1925. Ông thực hiện công
trình nghiên cứu tìm cách tiêu diệt vi khuẩn, kết quả của công trình này tác
động mạnh đến sự phát triển của chất kháng sinh và chất kháng khuẩn được
sinh ra từ vi khuẩn [45].
Bacteriocin đa dạng về cấu trúc, chức năng, sinh thái. Bacteriocin có
khả năng tiêu diệt các vi khuẩn khác do sự tạo thành các kênh làm thay đổi
tính thấm của màng tế bào, nhiều loại bacteriocin còn có khả năng phân giải
ADN, ARN và tấn công vào peptidoglycan để làm suy yếu thành tế bào. Vì
vậy bacteriocin được dùng nhiều trong bảo quản thực phẩm, xử lý môi
trường, chế biến thức ăn chăn nuôi [16].
Vi khuẩn lactic hiện nay được quan tâm nhiều do chúng có khả năng
sinh tổng hợp nên bacteriocin. Vì thế việc nghiên cứu về vi khuẩn lactic và
bacteriocin là một vấn đề hết sức thiết thực và có ý nghĩa to lớn trong cuộc
sống con người[40].
Vi khuẩn lactic được ứng dụng trong nhiều ngành sản xuất, đặc biệt là
trong công nghiệp thực phẩm và một số ngành chế biến khác vì chúng có
khả năng sinh axit, tạo hương và kháng một số vi khuẩn nhờ khả năng sinh
tổng hợp bacteriocin[3].
Trong công nghiệp thực phẩm, việc nghiên cứu tuyển chọn cũng như
tạo ra những chủng vi khuẩn lactic có khả năng tổng hợp bacteriocin cao để
sử dụng trong quá trình lên men lactic không chỉ nhằm mục đích bảo quản
1
mà còn nhằm đưa ra thị trường các loại sản phẩm có tính chất và hương vị
mong muốn[41]. Các hướng ứng dụng của bacteriocin chủ yếu gồm:
- Bảo quản thực phẩm
- Bảo quản các sản phẩm sữa
- Bổ sung vào thức ăn gia súc

- Muối chua rau quả
Bên cạnh đó vi khuẩn lactic còn được sử dụng để sản xuất chế phẩm
Probiotic - là sản phẩm chứa một hay nhiều loại vi sinh vật sống có lợi cho
hệ tiêu hoá. Chúng có khả năng cải thiện hệ thống vi sinh trong đường ruột,
tác dụng tốt đến sức khoẻ con người hay động vật. Các chủng vi khuẩn được
sử dụng tạo chế phẩm như Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus
bulgaricus, Lactobacillus casei [47].
Trong ngành mỹ phẩm bacteriocin được sử dụng trong thành phần của
một số loại mỹ phẩm chăm sóc da vì có tính diệt khuẩn và giữ ẩm[17].
Những năm gần đây những nghiên cứu trên thế giới đã xác định được
bản chất của bacteriocin đồng thời xác định được một số loại bacteriocin do
vi khuẩn lactic sinh ra và khả năng ứng dụng của nó. Những công trình này đã
có những đóng góp tích cực , nâng cao chất lượng cuộc sống con người.
Đã có những nghiên cứu trong và ngoài nước quan tâm dến việc sử
dụng bacteriocin do vi khuẩn lactic tổng hợp để bảo quản thực phẩm, thay thế
các loại hoá chất bảo quản độc hại đồng thời tạo ra các sản phẩm có chất
lượng cao. Tuy nhiên để có thể thu nhận bacteriocin, cần thiết phải chọn lựa
những củng vi khuẩn có khả năng tổng hợp cao tiến tới có thể tạo dựng bằng
kỹ thuật sinh học những chủng mới thích hợp phục vụ cho sản xuất công
nghiệp.
Từ những vấn đề cấp thiết trên việc nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp
bacteriocin (chất kháng khuẩn) của một số chủng vi khuẩn lactic là một trong
2
những vấn đề quan trọng trong việc nghiên cứu về vi khuẩn lactic. Chính vì
vậy, tôi mạnh dạn chọn đề tài: ‘Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp
bacteriocin của vi khuẩn lactic’. Vi khuẩn lactic có thể được phân lập từ
nhiều nguồn khác nhau như dưa chua, nem chua, sữa chua trong đó tôi chọn
nem chua làm nguồn để phân lập vi khuẩn lactic cho việc nghiên cứu.
2. MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI
- Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh

tổng hợp bacteriocin cao.
-Khảo sát một số đặc điểm sinh lý và các yếu tố ảnh hưởng đến khả
năng tổng hợp bacteriocin của chủng tuyển chọn.
- Khảo sát khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh và tìm hiểu về bản chất
của bacteriocin thu nhận.
3. Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI
- Phân lập được vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin.
- Xác định tính chất đối kháng của bacteriocin với một số loại vi sinh
vật gây bệnh.
-Xác định được điều kiện nuôi cấy tốt nhất để vi khuẩn lactic sinh tổng
hợp bacteriocin cao.
- Bước đầu tìm hiểu về bản chất của bacteriocin
4. Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
- Đẩy mạnh hướng nghiên cứu ứng dụng bacteriocin trong việc sản
xuất các chất bảo quản dùng cho thực phẩm.
5. CẤU TRÚC CỦA LUẬN VĂN
Luận văn bao gồm các chương mục sau:
Mục lục
Danh mục các chữ viết tắt
Danh mục các bảng và hình vẽ
3
Mở đầu
Chương 1: Tổng quan
Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
Chương 3: Kết quả và thảo luận
Chương 4: Kết luận và kiến nghị
Tài liệu tham khảo
Phụ lục
4
Chương 1

TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LACTIC
1.1.1.Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic
Hầu hết các vi sinh vật sinh axit lactic đều thuộc về họ
Lactobacillaceae và được xếp vào bốn chi: Streptococcus, Pediococcus,
Lactobacillus và Leuconostoc
Vi khuẩn lactic có thể lên men dễ dàng các loại đường đơn như
glucose, galactose, mannose và đường kép như saccharose, maltose,
lactose được đồng hóa một cách chọn lọc hơn. Còn polysacarit (dextrin, tinh
bột, inulin ) thì chỉ được lên men lactic bởi một vài loài vi khuẩn [4].
Vi khuẩn lactic là những vi sinh vật có yêu cầu dinh dưỡng cao. Để
sinh trưởng bình thường, ngoài nguồn cacbon chúng cần nitơ, axit amin, một
số vitamin, các chất sinh trưởng và các chất khoáng. Trong quá trình lên men,
axit lactic tự do được sinh ra sẽ kìm hãm quá trình sinh trưởng cho nên sự có
mặt của một chất đệm là cần thiết để duy trì quá trình lên men [4].
Vi khuẩn lactic thường đòi hỏi đạm hữu cơ (protein, peptit, axit amin).
Chỉ có một số ít loài có khả năng sinh trưởng trên môi trường có đạm vô cơ là
nguồn đạm duy nhất. Muốn phát triển bình thường vi khuẩn lactic thường đòi
hỏi một số chất sinh trưởng. Có những loại vi khuẩn lactic (Lactobacillus
leichmannii, Lactobacillus casei, Lactobacillus arabinosus ) có tính mẫn
cảm cao đối với một loại chất sinh trưởng nào đó. Người ta thường sử dụng
chúng để tiến hành định lượng các chất sinh trưởng này.
Về mặt hình thái vi khuẩn lactic có dạng lưỡng cầu, tứ cầu, liên cầu
hoặc thành chuỗi [4].
Streptococcus lactic là loại vi khuẩn có hình bầu dục thường đứng
thành đôi hay thành từng chuỗi ngắn. Chúng phát triển thích hợp nhất ở 30-
5
35
o
C. Khi phát triển trong sữa chúng có thể làm tích lũy khoản 0.8-1.0% axit

lactic tức là khoảng 110-120
o
t (1
o
t là lượng axit chứa trong 100ml sữa được
trung hòa bởi 1ml NaOH 0.1N).
Streptococcus cremoris là loại cầu khuẩn xếp thành hình chuỗi, phát
triển tốt nhất ở 25-30
o
C, không có khả năng lên men maltose và dextrin, khả
năng tích lũy axit lactic tương tự như Streptococcus lactic, gram dương và
không sinh bào tử.
Lactobacillus bulgariccus là loại trực khuẩn hình que dài, phát triển tốt
ở 40-48
o
C, có khả năng tích lũy đến 3-3.5% axit lactic, gram dương và không
sinh bào tử.
Lactobacillus acidophillus có hình dạng tương tự như Lactobacillus
bulgariccus. Chúng cũng phát triển tốt ở 40
o
C, không sinh bào tử.
Vi khuẩn Lactobacillus delbruckii là loại trực khuẩn hình que ưa nhiệt,
chúng thích hợp phát triển ở 48-52
o
C và có khả năng tích lũy axit lactic, gram
dương và không sinh bào tử.
S .citrovorus, S. paracitrovorus, S. diaxeli lactic và S. thermophilus có
tế bào thường xếp thành hình chuỗi, gram dương và không sinh bào tử.
L. lactic, L. thermophilus là những trực khuẩn không tạo bào tử, gram
dương không di động.

L. casei và L. plantarium là những trực khuẩn xếp thành từng chuỗi,
gram dương và không sinh bào tử.
1.1.2.Quá trình lên men lactic [5]
Lên men lactic là quá trình chuyển hóa đường thành axit lactic và các
sản phẩm khác được thực hiện nhờ vi khuẩn lactic. Tùy thuộc vào các sản
phẩm tạo thành mà các quá trình lên men lactic được chia làm hai loại: lên
men đồng hình và lên men dị hình. Trong quá trình lên men đồng hình, sản
6
phẩm chính là axit lactic. Ngoài ra còn có một lượng nhỏ axit bay hơi, rượu
ethanol và các sản phẩm khác.
Quá trình lên men lactic đồng hình được biểu diễn như sau:
C
6
H
12
O
6
CH
3
COCOOH CH
3
CHOHCOOH + Q
Glucose axit piruvic axit lactic
Ở quá trình lên men dị hình, axit lactic không phải là sản phẩm chủ yếu
mà còn có nhiều sản phẩm khác như axit acetic, ethanol, CO
2
, H
2
cũng được
tạo thành với lượng đáng kể.

Quá trình lên men lactic dị hình được biểu diễn như sau:
C
6
H
12
O
6
CH
3
CHOHCOOH + CH
3
CH
2
OH +

Glucose axit lactic rượu etylic
COOHCH
2
CH
2
COOH + CH
3
COOH+ CO
2
+H
2
axit sucxinic axit acetic
Số lượng các sản phẩm phụ hoàn toàn phụ thuộc vào giống vi sinh vật,
vào môi trường dinh dưỡng và điều kiện ngoại cảnh, thông thường axit lactic
chiếm 40%, axit sucxinic chiếm khoảng 20%, rượu etylic chiếm khoảng

10%, axit acetic chiếm khoảng 10% và các loại khí chiếm khoảng 20%.
Trong số các loại vi khuẩn lên men lactic điển hình cần phải kể đến
các loài: Streptococcus lactic, Streptococcus cremoris, Lactobacillus
bulgariccus, Lactobacillus acidophillus, Lactobacillus delbruckii
(thermobacterium cereale), Lactobacillus plantarum, Lactobacillus
cucumeris fermentatic. Còn thuộc loại vi khuẩn lên men lactic không điển
hình có các loài trong giống Leuconostoc (Leuconostoc mesenteroides,
Leuconostoc dextraniccus) và giống phụ beta bacterium.
1.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi khuẩn lactic[4][8]
1.1.3.1. Nguồn cacbon
Nguồn cacbon tốt nhất là các loại đường, còn các polisacarit thì thực
chất không thể lên men. Tốc độ lên men các loại đường monosacharit,
7
disacharit và oligosacharit là khác nhau. Nếu khi nhân giống người ta dùng
một loại đường thông thường thì vi khuẩn có thể thích nghi với loại đường đó
và về sau chúng phát triển có hiệu quả trên môi trường chứa loại đường này
mà không làm ảnh hưởng đến khả năng lên men đối với các nguồn cacbon
khác.
1.1.3.2. Vitamin
Hàm lượng vitamin của môi trường giữ một vai trò quan trọng trong
sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic. Vitamin B6 một vitamin rất
quan trọng trong sự sinh tổng hợp các axit amin ở các vi khuẩn lactic cũng có
thể được thay thế bởi một số axit amin khác. Tuy nhiên tuỳ thuộc vào từng
loại vi khuẩn lactic, nhiều loại axit amin được coi là các axit amin không thay
thế, tức là buộc phải có mặt trong môi trường. Sự phụ thuộc của tốc độ sinh
trưởng của vi khuẩn lactic vào nồng độ các vitamin có thể được định lượng
bởi các phép thử. Vì vậy việc xác định loại vitamin cần thiết cho sự sinh
trưởng của từng loại vi khuẩn lactic khác nhau là rất quan trọng trong nghiên
cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường đến sự sinh trưởng và phát triển
của vi khuẩn lactic.

1.1.3.3. Nhiệt độ
Nhiệt độ là một trong những nhân tố quan trọng nhất ảnh hưởng tới
sinh trưởng của vi khuẩn lactic. Tuỳ thuộc vào nhiệt độ tối ưu cho lên men và
cho sinh trưởng, vi khuẩn lactic được chia làm 2 loại: loại ưa nhiệt và loại ưa
ấm. Loại ưa nhiệt gồm có: L. bulgaricus, L. thermophilus, L. delbrueckii phát
triển tốt ở 45-62
o
C. Loại ưa ấm gồm có L. causasicus, L. lactis, L. helveticus,
L. acidophilus, L. bifidus phát triển tốt ở 37-45
o
C. L. casei, L. plantarum,
L.leichmanii, L. brevis, L. buchneri, L. pastorianus phát triển tốt ở 28-32
o
C.
8
1.1.3.4. Muối khoáng
Photphat là loại muối quan trọng nhất mà các vi khuẩn lactic yêu cầu.
Các muối amôn không thể được dùng làm nguồn nitơ duy nhất song chúng
gây một ảnh hưởng nhất định lên sự chuyển hoá một số axit amin. Sự có mặt
của một số loại muối khoáng không phải là bắt buộc và hàm lượng có sẵn của
chúng trong các môi trường phức hợp đã là đầy đủ.
1.2.TỔNG QUAN VỀ BACTERIOCIN
1.2.1.Giới thiệu chung về Bacteriocin [34], [45]
Bacteriocin là một loại protein được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn. Nó có
khả năng ức chế sự phát triển của những loại vi khuẩn có cấu trúc tương tự.
Bacteriocin được A.Gratia tìm thấy đầu tiên năm 1925 trong quá trình
nghiên cứu tìm cách tiêu diệt vi khuẩn, kết quả của công trình này đã thúc
đẩy sự phát triển những nghiên cứu về chất kháng sinh và chất kháng khuẩn
sinh ra từ vi khuẩn. Ông gọi chất phát hiện ra đầu tiên là Colicin vì nó có khả
năng tiêu diệt E.coli.

Những năm gần đây, những nghiên cứu về bacteriocin chủ yếu tập
trung vào vi khuẩn gram âm, trong đó điển hình là colicins. Tuy nhiên những
nghiên cứu về bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn gram dương cũng
đã được tiến hành và đã có nhiều báo cáo đã cung cấp những thông tin về vấn
đề này.
Những sản phẩm do vi khuẩn sinh ra có khả năng gây ức chế những vi
khuẩn khác có rất nhiều như enzyme, antibiotic, bacteriocin Người ta đã
đưa ra nhiều tiêu chí để định nghĩa bacteriocin, những tiêu chí này được dùng
trong nhiều trường hợp, áp dụng với nhiều mức độ khác nhau để định nghĩa
những loại bacteriocin khác nhau. Những tiêu chí như sau:
- Phạm vi ức chế đối với những loại khác
- Sự có mặt của loại protein hoạt động
9
- Cách thức hoạt động có tính kháng khuẩn
- Loại tế bào mà nó tác dụng
- Những yếu tố di truyền
- Do quá trình tổng hợp sinh học có tính ức chế
1.2.2. Tính đối kháng và phương pháp xác định tính đối kháng [34]
Tính đối kháng là khả năng ức chế sự phát triển của một vi sinh vật nào
đó. Hiện nay người ta đã xác đinh được nhiều chất có khả năng ức chế sự phát
triển của vi sinh vật như bacteriocin, chất kháng sinh, virus xâm nhiễm vi
khuẩn Vì vậy trong nghiên cứu bacteriocin thì vấn đề quan trọng là phải xác
định xem loại vi khuẩn mà mình nghiên cứu có tính đối kháng đối với một
loài vi sinh vật nào đó hay không. Hiện nay người ta đã xác định được một số
loại bacteriocin có thể kháng đồng thời nhiều loại vi sinh vật.
1.2.2.1.Phương pháp xác định tính đối kháng
Để xác định tính đối kháng, việc thử nghiệm được tiến hành trên môi
trường rắn có chủng chỉ thị. Tính đối kháng thể hiện khi chủng chỉ thị bị ức
chế trên môi trường đó. Hai phương pháp xác định tính đối kháng thường
được sử dụng là phương pháp đối kháng đồng thời và phương pháp đối

kháng dần dần.
Phương pháp đối kháng đồng thời đơn giản nhất do A.Gratia đưa ra.
Trong phương pháp này chủng thử nghiệm và chủng chỉ thị cùng được nuôi
cấy trên một môi trường, và tính đối kháng thể hiện ở việc chất ức chế của
chủng thử nghiệm khuếch tán vào môi trường và gây ức chế chủng chỉ thị. Sử
dụng đĩa thạch đã nuôi cấy chủng chỉ thị, sau đó tạo giếng trên đĩa thạch và
cho chủng thử nghiệm đã được nuôi ủ vào giếng. Phương pháp này thích hợp
đối với kiểm tra những khuẩn lạc riêng lẽ và áp dụng rộng rãi trong nghiên
cứu về mặt di truyền.
Phương pháp đối kháng dần dần do Fredericq đưa ra sau đó được cải tiến
10
thêm. Trong phương pháp này, chủng thử nghiệm được nuôi ủ trên đĩa thạch
trong một khoảng thời gian. Tiếp đó chủng chỉ thị được trải lên bề mặt của đĩa
thạch có chủng thử nghiệm. Phương pháp này có độ nhạy hơn so với phương
pháp đối kháng đồng thời và phương pháp này không phụ thuộc vào thời gian
và điều kiện nuôi ủ của chủng chỉ thị và chủng thử nghiệm. Một điểm hạn chế
của phương pháp này là yếu tố gây ức chế có thể bị bất hoạt do chất gây mê.
Cần kiểm tra cả hai phương pháp này để nhận biết một chủng có hoạt
tính kháng khuẩn hay không. Điều kiện tối thích cho chủng thử nghiệm phát
triển không cần thiết bằng điều kiện để chủng đó sinh tổng hợp chất kháng
khuẩn nhiều nhất.
Việc áp dụng những phương pháp này có thể xác định được loại vi
khuẩn nào có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin. Hạn chế của những phương
pháp này là không xác định cụ thể hoạt tính của bacteriocin. Cần loại bỏ
những yếu tố gây ức chế mà không có bản chất là bacteriocin.
1.2.2.2.Quan hệ giữa tính đối kháng và khả năng sinh tổng hợp bacteriocin
Khi nghiên cứu bacteriocin cần loại bỏ những hiện tượng giống
bacteriocin. Một số loài vi sinh vật có khả năng sinh ra kháng chất giống
bacteriocin. Một yếu tố quan trọng để phân biệt giữa bacteriophages và
bacteriocin là bacteriocin không mang yếu tố di truyền để tự nhân bản.

Hamon và Peron đã dùng những phương pháp khác nhau để phân biệt
bacteriophages và bacteriocin. Trong đó bacteriophages kháng trysin hơn
bacteriocin còn bacteriocin không bị ảnh hưởng bởi tia cực tím và nhiều loại
bacteriocin chịu nhiệt rất tốt.
Một số vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzim bacteriolytic có
trọng lượng phân tử thấp có những đặc tính giống bacteriocin và rất khó để
phân biệt. Tóm lại có nhiều yếu tố có tính đối kháng không có bản chất
bacteriocin. Như bacteriophages là một loại vi rút cũng có khả năng diệt vi
11
khuẩn hay antibiotic là một loại kháng sinh cũng có khả năng diệt vi khuẩn.
Vì vậy tính đối kháng do nhiều nguyên nhân gây nên và một trong những
nguyên nhân tạo nên tính đối kháng giữa các chủng vi khuẩn là khả năng sinh
tổng hợp bacteriocin.
1.2.3. Sinh tổng hợp bacteriocin [34]
Điều kiện nuôi ủ đối với những loại sinh tổng hợp nên bacteriocin có
ảnh hưởng đến hoạt tính kháng khuẩn. Đối với nhiều chủng vi sinh vật điều
kiện nuôi cấy để khả năng sinh tổng hợp bacteriocin là cao nhất đã được xác
định.
1.2.3.1.Thành phần môi trường nuôi cấy
Đối với vi khuẩn gram dương có khả năng tạo bacteriocin thì rất thích
hợp với môi trường rắn. Tăng độ nhớt của môi trường bằng cách thêm agar,
dextran, glycerol hoặc tinh bột sẽ làm tăng khả năng sinh tổng hợp
bacteriocin của vi khuẩn streptococci. Nhiều loại môi trường khác nhau có tác
dụng khác nhau trong việc làm tăng hay giảm khả năng sinh tổng hợp
bacteriocin. Một số thành phần môi trưòng làm tăng khả năng sinh tổng hợp
bacteriocin phải kể đến là: cao men, mannitol, glucose, ion mangan
1.2.3.2.

Điều kiện nuôi cấy
Điều kiện nuôi cấy bao gồm nhiệt độ, thời gian, sự sục khí và pH ảnh

hưởng đến hoạt tính của bacteriocin.
Nhiệt độ thích hợp cho loại vi khuẩn có khả năng sinh bacteriocin phát
triển cũng là nhiệt độ thích hợp cho việc sinh tổng hợp bacteriocin. Mỗi loại
vi khuẩn thích hợp với một khoảng nhiệt độ khác nhau.
Số lượng bacteriocin trong một môi trường có thể sinh ra khác nhau ở
các pha khác nhau của một chu kỳ phát triển. Việc sinh tổng hợp bacteriocin
tốt nhất ở pha phát triển và giảm dần ở những pha tiếp theo. Nhiều nghiên cứu
12
cho thấy bacteriocin được sinh ra sau 8 giờ, đạt tối đa sau 18 giờ đến 24 giờ
và sau đó không sinh bacteriocin nữa [23].
Việc kiểm soát pH là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến khả năng
sinh tổng hợp bacteriocin.Tuỳ từng loại vi sinh vật mà việc điều chỉnh pH là
khác nhau.
1.2.4. Phương pháp chiết tách bacteriocin [2]
Bacteriocin có bản chất là protein nên việc chiết tách bacteriocin chính
là chiết tách protein. Các phương pháp chiết tách và tính sạch protein đều dựa
trên những tính chất hoá lý của protein như độ tích điện, kích thước phân tử,
độ hoà tan của protein cần chiết rút. Nhiều protein còn liên kết với các phân
tử sinh học khác nên việc chiết rút các protein này còn phụ thuộc vào bản chất
của các liên kết. Muốn thu nhận protein nguyên thể tức là protein có tất cả
tính chất tự nhiên đặc trưng của nó, cần sử dụng các biện pháp khác nhau
1.2.4.1. Phương pháp nhiệt độ:
Để tách các protein khác nhau dựa trên khả năng kết tủa của chúng
người ta có thể sử dụng phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của
nhiệt. Phương pháp này chỉ nên dùng với các protein bền với nhiệt. Dịch
protein được giữ ở 50-70
o
C trong thời gian xác định, sau đó protein tạp đã bị
biến tính được loại bỏ bằng cách lọc hoặc ly tâm. Như vậy, dịch chiết protein
thô bền với nhiệt có thể được thu nhận bằng cách cho kết tủa không thuận

nghịch.
Để thu nhận chế phẩm protein theo phương pháp kết tủa thuận nghịch
bằng các muối trung tính, cần tiến hành ở nhiệt độ thấp, đối với dung môi hữu
cơ cần tiến hành ở nhiệt độ dưới 0
o
C để tránh biến tính.
1.2.4.2.Phương pháp nồng độ proton
Protein là các chất lưỡng tính vì vậy trong dung dịch axit và kiềm
chúng sẽ bị phân ly như sau:
13
kiềm
Protein-COOH Protein-COO
-
+ H
+
axit
axit
Protein-NH
2
Protein-NH
3
+
kiềm
Do các axit amin trong chuỗi polypeptide còn tồn tại nhiều nhóm chức
tự do dưới dạng các ion hoá là nguyên nhân tạo ra tính đa diện của protein.
Phân tử protein rất dài nên nhóm ion tự do tận cùng của chuỗi polypeptide
không đáng kể chủ yếu các nhóm chức tự do khác của chuỗi bên quyết định
tính chất tích điện của phân tử protein. Mức độ ion hoá của các nhóm này phụ
thuộc vào giá trị pH. Các nhóm axit ở dạng anion trong môi trường kiềm, các
nhóm kiềm tồn tại ở dạng cation trong môi trường axit.

Như vậy ở một giá trị pH xác định mỗi protein có một điện tích tổng số
nào đấy mà độ lớn của nó phụ thuộc vào số lượng các nhóm tích điện dương
và tích điện âm. Kết quả là ở giá trị nồng độ ion hydro cố định, các protein
khác nhau trong hỗn hợp sẽ có tổng điện tích khác nhau. Nhiều phương pháp
dùng để tách các hỗn hợp protein đều dựa vào đặc tính này. Các phân tử
protein mang điện tích tổng số cùng dấu đẩy nhau ra xa nên dễ tan vào dung
dịch. Mỗi một protein có một giá trị pH nhất định mà ở đó tổng số điện tích
âm và điện tích dương trong phân tử bằng không. Giá trị đó gọi là điểm đẳng
điện của protein. Điểm đẳng điện của các axit amin trung tính có giá trị pH tử
5.6-7.0, đối với các axit amin có tính axit là từ 3.0-3.2, đối với các axit amin
có tính kiềm là từ 9.7-10.8. Ở điểm đẳng điện độ hoà tan của protein là thấp
nhất, protein dễ bị kết tủa. Dựa vào tính chất này người ta có thể tách từng
phần protein trong hỗn hợp. Cũng giống như trường hợp tác dụng của nhiệt
độ trong việc tách chiết protein, có thể dùng phương pháp biến tính chọn lọc
14
nhờ tác dụng của pH môi trường. Dịch protein được giữ ở pH<5 trong thời
gian xác định. Protein tạp cũng được loại bỏ bằng cách lọc hoặc ly tâm.
1.2.4.3.Phương pháp dùng tác nhân hoá học
Có thể dùng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ để tách chiết
các protein. Phương pháp này tiến hành dựa trên cơ sở: độ hoà tan của protein
phụ thuộc vào sự tương tác của các nhóm tích điện trong phân tử protein với
các phân tử nước. Sự tương tác đó (còn gọi là sự hydrat hoá) sẽ bị giảm xuống
khi thêm vào dung dịch protein các dung môi hữu cơ hoặc các muối trung
tính. Dung môi hữu cơ thường dùng là ethanol, isopropanol, acetone hoặc hỗn
hợp các loại rượu.
Khi sử dụng các dung môi hữu cơ, cần chú ý tiến hành ở nhiệt độ thấp
(từ 5
o
C trở xuống). Dùng dung môi hữu cơ có thể tiến hành tách phân đoạn
dưới 0

o
C và có thể đến -20
o
C như vậy có tác dụng tốt đến độ ổn định của
protein. Khi đã có kết tủa, chú ý lấy nhanh kết tủa ra khỏi dung môi bằng cách
dùng máy ly tâm lạnh.
Các muối trung tính có thể dùng là (NH
4
)
2
SO
4
, Na
2
SO
4,
MgSO
4
… Tuy
nhiên người ta nhận thấy muối (NH
4
)
2
SO
4
là tốt nhất vì nó không làm hại và
làm ổn định hầu hết các loại protein. Loại muối này lại rẻ tiền và phổ biến.
Độ hòa tan của nó rất lớn ngoài ra nồng độ (NH
4
)

2
SO
4
cần thiết để kết tủa
protein khác nhau thì khác nhau rất nhiều.
Có thể dùng (NH
4
)
2
SO
4
ở cả 2 dạng: dạng bột và dạng dung dịch bão
hoà. Khi dùng bột, người ta cho từng ít một vào dịch chiết protein. Cách cho
cũng ảnh hưởng lớn đến lượng kết tủa ban đầu của protein. Khi cho muối vào
dịch chiết cần có máy khuấy từ để đảm bảo sự hoà tan của muối. Khi dùng
dung dịch bão hoà người ta đưa ra bảng tính số lượng muối cần thiết để pha
các dung dịch có độ bão hoà khác nhau ở những nhiệt độ nhất định.
15
Khái niệm về số phần trăm của độ bão hoà hoàn toàn đã được đề cập
đến. Protein có thể bị kết tủa ở 50% hoặc 70% của độ bão hoà hoàn toàn của
(NH
4
)
2
SO
4
. Khi cho dung dịch (NH
4
)
2

SO
4
bão hoà vào dịch chiết protein thì
nồng độ (NH
4
)
2
SO
4
không tăng đột ngột, sau khi kết tủa xong người ta thường
để lắng 2 giờ hoặc qua đêm, mục đích là tạo kết tủa hoàn toàn (ở phương
pháp dùng dung môi hữu cơ thì không cần để lâu. Kết tủa được lấy ra bằng
cách ly tâm lạnh hoặc lọc qua phễu Buchner. Khi hoà tan kết tủa lại người ta
thường thêm ion Ca
++
để làm bền protein
1.2.5. Đặc tính của bacteriocin [34]
1.2.5.1.Thành phần hoá học
Một vài loại enzim cụ thể như proteinases, lipases được sử dụng để
xác định thành phần hoá học của bacteriocin. Một trong những bacteriocin đã
được xác định thành phần hoá học là Streptosin STH1. Thành phần của nó
gồm protein, lipid và nhóm photphat.
Phân tích hoá học cho thấy bacteriocin là loại protein đơn giản, có
trọng lượng phân tử thấp. Tuy nhiên với nhiều chủng khác như Clostridia,
Staphylococci, Lactobacillus thành phần hoá học của bacteriocin bao gồm
protein, lipid và carbohydrate[49].
1.2.5.2.

Đặc tính lí học
Đặc tính lí học của một số bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn

gram dương được cho ở bảng sau:
16
Bảng 1.1. Đặc tính lí học của một số bacteriocin được sinh tổng hợp bởi
vi khuẩn gram dương
Bacteriocin Nhiệt độ cho
phép
pH Ảnh hưởng của enzim
Nhạy Bền
Megacin A-216 60
o
C/30phút 2-7 Chymotrypsin
Pepsin
Trypsin
Clostosin A 100
o
C/30 phút 4-9 Trypsin
Chymotrypsin
Pronase P
Rnase
DNase
Clostosin B 80
o
C/10 phút 4-9 Trypsin
Chymotrypsin
Pronase P
Rnase
DNase
Clostosin C 80
o
C/10 phút 4-9 Trypsin

Chymotrypsin
Pronase P
Rnase
DNase
Clostosin D 100
o
C/30 phút 4-9 Trypsin
Chymotrypsin
Pronase P
Rnase
DNase
Boticin E-S5 100
o
C/10 phút 1.1-
9.5
Trypsin
Chymotrypsin
Pepsin
DNase
Boticin P 60
o
C/30 phút 6.5-
7.5
Trypsin RNase
Dnase
Alkaline
phosphotase
Phospholipases C,D
Butyricin 7423 100
o

C/10 phút 2-12 Trypsin
Perfringocin
11105
100
o
C/30 phút 2-12 Trypsin
17
1.2.6.Phổ hoạt động của bacteriocin[34]
Hầu hết các bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn gram âm có
hoạt tính ức chế các loài cùng họ hàng. Đối với bacteriocin được sinh tổng
hợp bởi vi khuẩn gram dương có hoạt tính ức chế các loại vi khuẩn gram
dương. Tuy nhiên một vài loại vi khuẩn gram âm bị ức chế bởi bacteriocin
hay chất giống bacteriocin được sinh ra bởi vi khuẩn gram dương. Những vi
khuẩn gram dương có khả năng ức chế vi khuẩn gram âm như Lactobacillus
acidophilus, Bacillus cereus, Streptococci, Staphylococci, Corynebacteria.
1.2.7.Phương thức hoạt động của bacteriocin[34]
Cơ chế kháng khuẩn được thực hiện trên các plasmids. Có 2 lớp
plasmid, lớp lớn là những plasmid có số lượng sao chép thấp và lớp nhỏ là
những plasmid có số lượng sao chép cao. Những plasmid lớn mang những
gen khác như colicin operon. Colicin operon thường được cấu tạo bởi một số
gen chính. Những gen này bao gồm một gen miễn dịch, môt gen cấu trúc
colicin và một Brp (bacteriocin release protein). Nghiên cứu cho thấy việc
duy trì plasmid colicin rất quan trọng đối với tế bào có họ hàng với chúng bởi
vì nếu một tế bào mất gen miễn dịch nó nhanh chóng bị phá hủy bởi colicin.
Cùng lúc colicin được phóng ra từ tế bào phân chia bằng việc sử dụng lysis
protein làm chết tế bào.
Bản thân colicin bao gồm 3 phần hình cầu. phần thứ nhất quy định mục
tiêu và gắn với cơ quan cảm nhận của tế bào nhạy cảm. Phần thứ 2 liên quan
đến chuyển mã hợp tác với tế bào mục tiêu. Phần thứ 3 là có chức năng tiêu
diệt và tạo ra một lổ trong màng tế bào mục tiêu hoặc hoạt động như một hạt

nhân dể phân giải DNA hoặc RNA của tế bào mục tiêu. Bởi vì chúng nhằm
vào cơ quan cảm nhận nhất định và sử dụng cơ chế chuyển mã nhất định nên
các tế bào có thể tự thân kháng lại colicin bằng cách ức chế hoặc xóa bỏ gen
18
cho những protein này. Tế bào có tính kháng như vậy có thể bị mất một thành
phần chủ chốt (ion sắt hoặc vitamin B) nhưng có lợi là không bị tiêu diệt.
Trong bài báo cáo Nobel Laureate, Salvador e. Luria, 1969, nhấn mạnh
colicin là độc tố phá vỡ sự ổn định của màng tế bào. Ông ta không hoàn toàn
đúng nhưng colicin làm mất nguồn năng lượng của tế bào.
1.2.8. Ứng dụng của bacteriocin [27], [ 36]
Bacteriocin đượic ứng dụng nhiêù trong thực phẩm. Bacteriocin được
ứng dụng trong giai đoạn đầu của việc ủ bột làm bánh mì, trong lên men súc
xích (kháng Listeria) và trong sản xuất phomat (kháng Listeria và Clostridia).
Những ứng dụng cuả bacterin được nghiên cứu trong suốt quá trình lên men
trong ống nghiệm ở phòng thí nghiệm. Những chủng vi khuẩn sinh tổng hợp
bacteriocin đóng vai trò quan trọng trong công nghiệp thực phẩm như nuôi ủ
ban đầu, nuôi ủ lên men , nâng cao chất lượng và tính an toàn thực phẩm. Hơn
nữa chất kháng khuẩn được sản sinh bởi vi khuẩn lactic đóng vai trò quan
trọng trong cơ thể sống diễn ra trong hệ tiêu hoá của con người vì vậy gây ảnh
hưởng đến sức khoẻ con người.
1.3.CÁC LOẠI VI SINH VẬT GÂY BỆNH DÙNG THỬ NGHIỆM
TÍNH ĐỐI KHÁNG VỚI BACTERIOCIN[1]
1.3.1. Escherichia coli:
Escherichia coli là một trong những vi sinh vật thường gặp trong môi
trường. Nhiều người không coi E.coli là vi sinh vật gây bệnh do thực phấm
song những nghiên cứu gần đây cho thấy một số chủng của chúng thực sự có
khả năng gây bệnh lây lan qua thực phẩm rất nghiêm trọng.
E.coli là dạng trực khuẩn Gram âm kỵ khí tùy nghi, không sinh bào tử,
khá phổ biến trong tự nhiên và đặt biệt trong đường tiêu hóa của người và
động vật. Chúng lên men đường lactose và glucose, cho phản ứng dương tính

với indol và methyl red song có phản ứng âm tính với Voges Proskauer và
19
citrate. Cách hữu hiệu nhất để định danh loài là xác định kiểu huyết thanh,
dùng kháng thể tương hợp với kháng nguyên O, H và K của các chủng E.coli
khác nhau.
Phần lớn E.coli phân lập từ môi trường là loại không gây bệnh. Nhóm
E.coli gây bệnh đường ruột EPEC (enteropathogenic E.coli diarrheagenic
E.coli) thuộc nhóm huyết thanh đã được xác định về mặt dịch tễ là những tác
nhân gây bệnh tuy vẫn chưa chứng minh được cơ chế gây bệnh của chúng
thuộc dạng nội độc tố không chịu nhiệt hay nội độc tố chịu nhiệt hay thuộc
nhóm xâm nhiễm dạng Shigella. Một nhóm E.coli gây bệnh khác là EIEC
(enteroinvasive E.coli) rất giống với Shigella bởi khả năng gây bệnh lỵ do
xâm nhiễm và chứng tiêu chảy ở người. Nhóm E.coli gây bệnh cuối cùng là
ETEC (enterotoxigenic E.coli) có khả năng sinh một hoặc cả hai loại độc tố
ruột từng được biết rõ là loại không chịu nhiệt và loại bền nhiệt không có tính
kháng nguyên.
Một trong những đặc tính quan trọng của E.coli liên quan đến khả năng
chỉ thị sự nhiễm phân trong nước là do thời hạn sống sót của chúng. Chúng
thường chết đi sau cùng một khoảng thời gian như các vi sinh vật gây bệnh
khác có ở ruột. Ở thực phẩm qua các biện pháp xử lý như ướp lạnh, cấp đông,
chiếu xạ E.coli bị tiêu diệt trong khi một số vi sinh vật gây bệnh khác vẫn
chống chịu được và sống sót. Tương tự như vậy nước qua xử lý vẫn chứa một
số vi sinh vật gây bệnh trong khi E.coli đã bị tiêu diệt. Chỉ đối với những thực
phẩm có tính axit E.coli mới thực sự có giá trị như một chỉ thị về vệ sinh do
tính chống chịu cao của chúng đối với pH thấp [1].
20
1.3.2. Salmonella
Salmonella là ví dụ kinh điển của các bệnh do thực phẩm. Salmonella
enteritidis được phân lập từ năm 1884 và hiện vẫn là một tác nhân gây bệnh
do thực phẩm quan trọng. Đây là loại trực khuẩn Gram âm kỵ khí tùy nghi,

không sinh bào tử , di động bằng chu mao.
Có ba dạng bệnh thực sự do Salmonella. Sốt thương hàn do Salmonella
typhy, nhiễm trùng máu do Salmonella cholera-suis, rối loạn tiêu hóa do
Salmonella typhimurium và Salmonella enteritidis. Các triệu chứng bệnh do
Salmonella như nôn mửa, đau đầu, ớn lạnh, tiêu chảy, sốt xuất hiện 12-24 giờ
sau khi ăn phải thức ăn chứa 1-10 triệu Salmonella trong 1 g. Bệnh kéo dài 2-
3 ngày. Phần lớn bệnh nhân hồi phục song cũng có những trường hợp tử
vong, đặt biệt ở người già, trẻ sơ sinh, người suy yếu hệ miễn dịch.
Hầu hết các tiêu chuẩn vi sinh thực phẩm đều không cho phép có
Salmonella trong thành phẩm, sự hiện diện của chúng được kiểm tra gắt gao
bởi các cơ quan chức năng. Theo phương pháp truyền thống việc phát hiện
Salmonella bao gồm những bước như tiền tăng sinh, tăng sinh, tăng sinh chọn
lọc, các thử nghiệm sinh hóa và cuối cùng là thử nghiệm huyết thanh mất thời
gian khoảng 7 ngày. Hiện nay đã có nhiều nỗ lực để rút ngắn thời gian phát
hiện Salmonella bằng những phương pháp như thử nghiệm ELISA và thử
ADN, mất thời gian khoảng 48 giờ. Tuy nhiên khi một mẫu có khả năng
dương tính cần tiến hành các thao tác truyền thống để khẳng định sự có mặt
của Salmonella.
Do kém chịu nhiệt, Salmonella dễ dàng bị tiêu diệt khi thức ăn được
đun nấu phù hợp. Việc làm lạnh, cấp đông, bảo đảm vệ sinh có tác dụng quan
trọng làm giảm thiểu nguy cơ nhiễm bệnh. Hiện nay Salmonella vẫn là một
trong những vi sinh vật gây bệnh quan trọng nhất từ thực phẩm [1].
21
1.3.3.Listeria monocytogenes
Những năm gần đây Listeria monocytogenes nổi lên như một tác nhân
gây bệnh từ thực phẩm quan trọng. Đây là một loại trực khuẩn Gram dương
ngắn, nhỏ, không sinh bào tử, thường có kiểu chuyển động xoay tròn quanh
trục thân thành từng đợt rất đặc trưng trong tiêu bản giọt treo. Chúng có thể
phát triển trên môi trường nuôi cấy đơn giản ở vùng pH giữa 5 và 9. Trên môi
trường thạch rắn khuẩn lạc của chúng trông như những giọt sương trong suốt,

hơi nhuốm màu lam nhạt khi nhìn qua ánh sáng phản chiếu dưới góc 45
o
C.
Listeria thuộc loại ưa lạnh, có thể phát triển ở nhiệt độ thấp đến 2.5
o
C
và cao đến 44
o
C. Các chuyên gia FDA khuyến cáo cần lưu ý đến việc làm vệ
sinh ống dẫn lạnh trên trần vì đó là nới có điều kiện thuận lợi cho Listeria
phát triển và tích tụ. Bởi sản phẩm sữa từng dính dáng đến các cơn dịch bệnh
so Listeria, nhiều nghiên cứu được tập trung vào loại sản phẩm này. Câu hởi
liệu Listeria monocytogenes có sống sót qua được chế độ thanh trùng kiểu
Pasteur (63
o
C trong 30 phút hoặc 72
o
C trong 15 giây) hay không hiện vẫn
còn bỏ ngỏ bởi chưa ai có được câu trả lời khẳng định. Điều đáng lưu ý là chế
độ thanh trùng sữa hiện nay vẫn chưa tính đến khả năng chịu nhiệt của
Listeria monocytogenes.
Liều lượng gây bệnh của Listeria monocytogenes hiện vẫn chưa được
biết. Bệnh bắt đầu từ đường tiêu hóa với những triệu chứng như tiêu chảy, sốt
nhẹ. Trường hợp nặng chủng gây bệnh có thể sản sinh trong các đại thực bào
và gây nhiễm trùng máu. Vi khuẩn tác động lên hệ thần kinh trung ương, tim,
mắt và có thể thâm nhập bào thai trong bụng mẹ gây sẩy thai, đẻ non hoặc
nhiễm trùng thai nhi.
Listeria monocytogenes được phân lập từ nhiều loại thực phẩm khác
nhau như thịt, cá, rau, sữa và cả nước bề mặt. Cần chú ý kiểm tra sự hiện diện
của vi sinh vật ở mọi công đoạn trong quá trình chế biến thực phẩm, từ môi

22
trường, nguyên liệu, điều kiện sản xuất, vận chuyển đến sản phẩm cuối cùng.
Nấu chín thực phẩm là một biện pháp hữu hiệu để giảm nguy cơ nhiễm bệnh
[1].
1.3.4. Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus là cầu khuẩn hiếu khí tùy nghi Gram dương
thường kết dạng chùm, có mặt phổ biến mọi nơi, thường thấy trên da, xoang
mũi, tóc ở người (đây chính là nguồn nhiễm quan trọng nhất vào thực
phẩm). Khi phát triển trong thực phẩm Staphylococcus aureus có khả năng
sinh một loại độc tố protein có phân tử lượng thấp (khoảng 30 kDa) gọi là độc
tố đường ruột của Staphylococcus (A, B, C1, C2, C3, D và E). Các độc tố trên
có thể gây nôn mửa, đau thắt bụng, tiêu chảy, kiệt sức ở mức nghiêm trọng
sau 4-6 giờ từ lúc ăn. Sự hồi phục xảy ra sau 24-72 giờ. Nạn nhân không chết
nhưng rất đau đớn do các phản ứng cực kỳ dữ dội. Các loại độc tố này thuộc
loại chịu nhiệt. Một khi đã hình thành trong thực phẩm việc đun sôi không
phá hủy được chúng. S.aureus không có khả năng cạnh tranh cao so với các
vi sinh vật gây hỏng thực phẩm khác (như Pseudomonas ) nhưng khi không
có đối thủ cạnh tranh, chẳng hạn trong thực phẩm muối hoặc chế biến, chúng
có thể sinh sôi và tạo ra các độc tố bền nhiệt.
Biện pháp cần thiết để ngăn Staphylococcus aureus phát triển trong
thực phẩm là trữ lạnh các sản phẩm chín hoặc giữ nóng các thực phẩm ăn
nóng. Chỉ cần 4 giờ ở nhiệt độ phòng Staphylococcus aureus cũng tạo ra một
lượng độc tố đủ để gây tai họa.
Staphylococcus aureus có khả năng chống chịu cao đối với những
chất như tellurite, neomycin, polymycin, sodium azide. Những chất trên được
dùng làm tác nhân ức chế trong các môi trường nuôi cấy chọn lọc. Tuy có khả
năng phát triển tốt trên các môi trường không chứa NaCl, có thể phát triển tốt
ở nồng độ 7-10% một số chủng có thể phát triển ở nồng độ 20%. Nồng độ
23
NaCl tối đa ở đó Staphylococcus aureus có thể phát triển còn phụ thuộc vào

những thông số khác như nhiệt độ, pH, hoạt tính nước [1].
1.4.TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU, ỨNG DỤNG BACTERIOCIN TRONG
VÀ NGOÀI NƯỚC
1.4.1. Trên thế giới:
Hiện nay việc nghiên cứu, ứng dụng bacteriocin do vi khuẩn lactic sinh
tổng hợp nên đang là một hướng nghiên cứu được nhiều nhà khoa học quan
tâm. Và cũng đã có những công trình nghiên cứu và ứng dụng thành công ,
góp phần vào việc nâng cao chất lượng cuộc sống của nhân loại. Bacteriocin
là một chất kháng khuẩn có khả năng ức chế một số vi khuẩn gây bệnh, nhờ
khả năng này mà việc ứng dụng của vi khuẩn lactic đa dạng và phong phú
hơn.
Năm 1970, nhóm tác giả D.A. Kekessy và J.D.Piguet thuộc viện Vệ
sinh và An toàn thực phẩm - Thuỵ Sĩ đã nghiên cứu một phương pháp mới
trong việc phát hiện bacteriocin. Chủng vi sinh vật đối kháng được nuôi ủ trên
đĩa môi trường thạch dinh dưỡng, sau đó tạo giếng có đường kính 0.5mm
bằng cách khoét bỏ agar trên đĩa. Cho một lượng vi khuẩn có khả năng sinh
tổng hợp bacteriocin vào giếng, sau thời gian nuôi ủ vòng kháng khuẩn sẽ
xuất hiện, thể hiển bởi một vòng sáng rõ quanh giếng [23].
Năm 1976, nhóm tác giả John R. Tagg, Adnan S. Dajani và Lewis W.
Wannamaker thuộc khoa vi sinh- trường đại học Otago, New Zealand, trường
đại học Dược Minnesota, Minnesota đã nghiên cứu về những loại bacteriocin
của vi khuẩn gram dương và cho ra nhiều kết quả có giá trị. Nghiên cứu đã
cho biết được tính đối kháng của bacteriocin, cách đặt tên và phân loại
bacteriocin, chiết tách và tinh sạch bacteriocin, phân tích hoạt tính
bacteriocin, các loại hoạt động của bacteriocin và ứng dụng của bacteriocin
[25].
24
Năm 1992, nhóm tác giả R.Yang, M.C Joshnon và B. Ray thuộc Đại
học Wyoming, Laramie đã nghiên cứu một phương pháp mới để chiết tách
một lượng lớn bacteriocin từ vi khuẩn lactic với tên đề tài : ‘Novel method to

extract large amounts of bacteriocins from lactic acid bacteria’.Phương pháp
này dùng môi trường pediocin AcH, nisin, sakacin A, leuconocin Lcm1 làm
tăng hiệu quả chiết tách và thu được một lượng bacteriocin nhiều hơn quá
trình phân lập [35].
Năm 1999, các tác giả Raf Callewaert và Luc De Vuyst thuộc Khoa
công nghệ sinh học ứng dụng -Đại học Brussel, Bỉ đã nghiên cứu việc sinh
tổng hợp bacteriocin của Lactobacillus amylovorus DCE 471 và có ứng dụng
cải tiến và làm ổn định các sản phẩm lên men. Việc sinh tổng hợp thu nhận
bacteriocin bị ức chế bởi nồng độ của nguồn nitrogen [36].
Cũng trong năm 1999, nhóm tác giả Farida Khalid, Roquya Siddiqi và
Naheed Mojgani thuộc khoa vi sinh -Trường đại học Karachi-Pakistan đã
nghiên cứu tìm ra một loại bacteriocin mới có tên lactocin LC-09. Lactocin
LC-09 được phân lập từ chủng vi khuẩn lactobacillus có trong một mẫu bệnh.
Loại này ức chế được một số loại lactobacillus và vi khuẩn Gram dương khác
như Listeria ivanovii, Streptococcus agalactii và S. peyogenes. Đặc tính của
Lactocin LC-09 là chịu nhiệt (4 giờ ở 100
o
C) và thích hợp với môi trường có
pH axit. Loại bacteriocin này bị khử hoạt tính bằng cách sử dụng enzim
protease. Có thể dùng acridine orange, ethidium bromide để gây đột biến
trong việc sản sinh ra loại bacteriocin này [24].
Năm 2002 Soore cùng cộng sự đã nghiên cứu việc tạo ra một chất
kháng khuẩn đặc biệt của vi khuẩn lactic gọi là bacteriocin. Bacteriocin được
sử dụng như một chất bảo quản thực phẩm tự nhiên có khả năng thay thế các
loại hoá chất bảo quản khác. Bacteriocin có bản chất là protein nên rất an
toàn đối với sức khoẻ con người [41].
25