(LUẬN văn THẠC sĩ) xác định một số loài nấm hiện diện trên cây lúa (oryza sativa) nhiễm bệnh đạo ôn và cháy lá thu thập tại tỉnh an giang và kiên giang
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (3.6 MB, 79 trang )
BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
---------------
Vũ Thị Tuyết Nhung
XÁC ĐỊNH MỘT SỐ LOÀI NẤM HIỆN DIỆN TRÊN CÂY LÚA
(Oryza sativa) NHIỄM BỆNH ĐẠO ÔN VÀ CHÁY LÁ THU THẬP
TẠI TỈNH AN GIANG VÀ KIÊN GIANG
LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM
TP.Hồ Chí Minh, tháng 4 năm 2021
download by :
BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
---------------
Vũ Thị Tuyết Nhung
XÁC ĐỊNH MỘT SỐ LOÀI NẤM HIỆN DIỆN TRÊN CÂY LÚA
(Oryza sativa) NHIỄM BỆNH ĐẠO ÔN VÀ CHÁY LÁ THU THẬP
TẠI TỈNH AN GIANG VÀ KIÊN GIANG
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 8420114
LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. Nguyễn Hồng Dũng
TP.Hồ Chí Minh, tháng 4 năm 2021
download by :
i
LỜI CAM ĐOAN
Người thực hiện đề tài xin cam đoan: Đề tài này là cơng trình nghiên cứu
thực sự của cá nhân, được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Nguyễn
Hoàng Dũng. Các số liệu thu thập và kết quả phân tích trong đề tài là trung thực,
đề tài không trùng với bất kỳ đề tài nghiên cứu khoa học nào. Những thông tin
tham khảo đều được trích dẫn cụ thể nguồn sử dụng.
Tp.HCM, ngày
tháng
năm 2021
Người thực hiện
Vũ Thị Tuyết Nhung
download by :
ii
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến ban lãnh đạo Viện Sinh
học Nhiệt đới, Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện
cho tôi đi học và đã hỗ trợ tồn bộ kinh phí, máy móc trang thiết bị để tạo điều
kiện giúp tơi hồn thành đề tài tốt nghiệp này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và tri ân sâu sắc đối với TS. Nguyễn
Hoàng Dũng Trưởng phòng Vi Sinh, Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Viện Hàn Lâm
Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam cũng như phụ trách hướng dẫn đề tài cho tơi
đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn, giảng dạy, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời
gian thực hiện đề.
Tôi xin chân thành cảm ơn Học viện Khoa học và Công nghệ, đặc biệt là
các thầy cô giáo trực tiếp giảng dạy các chun đề của tồn khóa học đã tạo điều
kiện, đóng góp ý kiến cho tơi trong suốt q trình học tập và hồn thành luận văn
này.
Tơi xin chân thành cảm ơn anh chị phòng Vi sinh, Viện Sinh Học Nhiệt
Đới, Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam và các bạn lớp Sinh học
thực nghiệm đã luôn đồng hành, chia sẻ và giúp đỡ em trong suốt thời gian học
tập và thực hiện đề tài.
Bên cạnh đó, cơng lao khơng thể thiếu khi kể đến góp phần khơng nhỏ trong
q trình tơi thực hiện luận văn thạc sỹ đó chính là nguồn năng lượng sống từ gia
đình và bạn bè tơi. Tơi muốn nói lời cảm ơn tới gia đình vì đã chăm sóc, động
viên tơi cả về thể chất lẫn tinh thần, luôn mang cho tôi những động lực cố gắng.
Xin trân trọng cảm ơn!
Người thực hiện
Vũ Thị Tuyết Nhung
download by :
iii
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................................ii
MỤC LỤC ..................................................................................................................... iii
DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ................................................................ v
DANH MỤC BẢNG ...................................................................................................... vi
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ..................................................................vii
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1
1. Đặt vấn đề .................................................................................................................... 1
2. Mục tiêu đề tài ............................................................................................................. 2
3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................... 2
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn đề tài ........................................................................... 3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ĐỀ TÀI ............................................................................. 4
1.1. TÌNH HÌNH NẤM GÂY BỆNH TRÊN CÂY LÚA TẠI TỈNH AN GIANG VÀ
KIÊN GIANG .................................................................................................................. 4
1.1.1. Tình hình nấm gây bệnh trên lúa tại tỉnh An Giang ..............................................4
1.1.2. Tình hình nấm gây bệnh trên lúa tại tỉnh Kiên Giang ...........................................5
1.2. MỘT SỐ BỆNH HẠI THƯỜNG GẶP TRÊN CÂY LÚA ...................................... 5
1.2.1. Bệnh đạo ơn ...........................................................................................................5
1.2.2. Bệnh cháy lá ..........................................................................................................8
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC VÀ NGỒI NƯỚC ..................... 10
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 14
2.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ....................................................... 14
2.1.1. Thời gian ..............................................................................................................14
2.1.2. Địa điểm ..............................................................................................................14
2.2. ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU...................................................... 14
download by :
iv
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu .......................................................................................... 14
2.2.2. Dụng cụ và thiết bị .............................................................................................. 14
2.2.3. Mơi trường và hóa chất .......................................................................................15
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................................... 16
2.3.1. Phương pháp thu mẫu .......................................................................................... 16
2.3.2. Phân lập và làm thuần.......................................................................................... 16
2.3.3. Thí nghiệm lây bệnh nhân tạo .............................................................................17
2.3.4. Định danh nấm bằng phương pháp phân tích hình thái học và bằng phương pháp
giải trình tự vùng gen ITS.............................................................................................. 18
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 23
3.1. THU MẪU .............................................................................................................. 23
3.1.1. Thu mẫu tại tỉnh An Giang ..................................................................................23
3.1.2. Thu mẫu tại tỉnh Kiên Giang ...............................................................................23
3.2. PHÂN LẬP, LÀM THUẦN VÀ QUAN SÁT HÌNH THÁI ................................. 24
3.2.1. Phân lập, làm thuần và quan sát hình thái ở tỉnh An Giang ................................ 24
3.2.2. Phân lập, làm thuần và quan sát hình thái ở tỉnh Kiên Giang ............................. 30
3.3. TÁI NHIỄM THEO QUY TẮC KOCH................................................................. 38
3.4. ĐỊNH DANH CÁC CHỦNG NẤM ĐƯỢC PHÂN LẬP BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SINH HỌC PHÂN TỬ .................................................................................................. 44
3.4.1 Khuếch đại vùng gen ITS .....................................................................................44
3.4.2 Giải trình tự gene ITS ........................................................................................... 45
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................ 51
4.1. KẾT LUẬN ............................................................................................................ 51
4.2. KIẾN NGHỊ ............................................................................................................ 51
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 52
PHỤ LỤC ........................................................................................................................ 1
download by :
v
DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
P:C:I
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol
CTAB
Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide
ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long
DNA
Deoxyribonucleotide Acid
EDTA
Ethylene Diamin Tetracetic Acid
ETS
External Transcribed Spacer
NCBI
National Center for Biotechnology Informatic
PCR
Polymerase Chain Reaction
PDA
Potato Dextrose Agar
RNA
Ribonucleic acid
SHPT
Sinh học phân tử
download by :
vi
DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Kết quả phân lập làm thuần mẫu ở tỉnh An Giang............................. 24
Bảng 3.2. Kết quả phân lập làm thuần mẫu ở tỉnh Kiên Giang .......................... 30
Bảng 3.3. Kết quả phân lập làm thuần mẫu tái nhiễm ........................................ 40
Bảng 3.4. Trình tự tương đồng trên ngân hàng gen NCBI chủng nấm T 1.3 ..... 46
Bảng 3.5. Trình tự tương đồng trên ngân hàng gen NCBI chủng nấm T 2.3 ..... 47
Bảng 3.6. Trình tự tương đồng trên ngân hàng gen NCBI chủng nấm T 3.3 ..... 48
Bảng 3.7. Trình tự tương đồng trên ngân hàng gen NCBI chủng nấm T 4.3 ..... 48
download by :
vii
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Bệnh đạo ơn trên lúa ......................................................................................7
Hình 1.2. Bệnh cháy lá trên lá lúa...................................................................................9
Hình 3.1. Mẫu lá lúa bị nhiễm bệnh thu được tại tỉnh An Giang .................................23
Hình 3.2. Mẫu lá lúa bị nhiễm bệnh thu được tại tỉnh Kiên Giang .............................. 24
Hình 3.3. Hình thái nấm trên mơi trường PDA và hình thái bào tử mẫu .....................26
Hình 3.4. Hình thái nấm trên mơi trường PDA và hình thái bào tử mẫu .....................27
Hình 3.5. Hình thái nấm trên mơi trường PDA và hình thái bào tử mẫu .....................28
Hình 3.6. Hình thái nấm trên mơi trường PDA và hình thái bào tử mẫu .....................28
Hình 3.7. Hình thái nấm trên mơi trường PDA và hình thái bào tử mẫu .....................29
Hình 3.8. Hình thái nấm trên mơi trường PDA và hình thái bào tử mẫu .....................29
Hình 3.9. Hình thái nấm trên mơi trường PDA và hình thái bào tử mẫu .....................30
Hình 3.10. Hình thái nấm trên mơi trường PDA và hình thái bào tử mẫu ...................34
Hình 3.11. Hình thái nấm trên mơi trường PDA và hình thái bào tử mẫu ...................34
Hình 3.12. Hình thái nấm trên mơi trường PDA và hình thái bào tử mẫu ...................35
Hình 3.13. Hình thái nấm trên mơi trường PDA và hình thái bào tử mẫu ...................35
Hình 3.14. Hình thái nấm trên mơi trường PDA và hình thái bào tử mẫu ...................36
Hình 3.15. Hình thái nấm trên mơi trường PDA và hình thái bào tử mẫu ...................36
Hình 3.16. Hình thái nấm trên mơi trường PDA và hình thái bào tử mẫu ...................37
Hình 3.17. Hình thái nấm trên mơi trường PDA và hình thái bào tử mẫu ...................38
Hình 3.18. Mẫu lúa BC15 trước và sau khi tái nhiễm ..................................................40
Hình 3.19. Hình thái nấm trên mơi trường PDA và hình thái bào tử mẫu ...................42
Hình 3.20. Hình thái nấm trên mơi trường PDA và hình thái bào tử mẫu ...................42
Hình 3.21. Hình thái nấm trên mơi trường PDA và hình thái bào tử mẫu ...................43
Hình 3.22. Hình thái nấm trên mơi trường PDA và hình thái bào tử mẫu ...................44
Hình 3.23. Phổ điện di của đoạn ITS được khuếch đại của 4 Chủng nấm ...................45
Hình 3.24. Cây phát sinh lồi dựa trên phân tích trình tự vùng gen ITS ......................49
download by :
1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Lúa là loài cây lương thực có sản lượng đứng thứ ba trên thế giới sau ngơ,
và lúa mì, đứng thứ hai trên thế giới về diện tích gieo trồng chỉ sau lúa mì. Lúa
được trồng ở 112 nước, là lương thực của hơn 54% dân số thế giới [1], [2]. Đặc
biệt ở các nước Đông Nam Á, lúa là cây lương thực đứng vị trí hàng đầu do có
giá trị dinh dưỡng cao và nhiều công dụng khác, về giá trị kinh tế lúa gạo là mặt
hàng xuất khẩu của một số nước trong khu vực [2].
Cây lúa đã và đang là cây trồng số một của nền sản xuất nông nghiệp Việt
Nam, là cây lương thực quan trọng nhất đối với vấn đề an ninh lương thực ở nước
ta [3]. Trong những năm gần đây Việt Nam đã có nhiều thành tựu trong sản xuất
nông nghiệp, nhiều tiến bộ khoa học về giống, cơ cấu sản xuất, biện pháp canh
tác,… được áp dụng vào sản xuất đã góp phần nâng cao năng suất lúa gạo. Theo
Hội nghị lúa gạo vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long tại An Giang năm 2017, vùng
Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) chiếm hơn 50% sản lượng và hơn 90%
lượng gạo xuất khẩu của cả nước [4], [5], [6]. Tuy nhiên, cùng với sự gia tăng
năng suất và diện tích cây trồng thì tình hình dịch bệnh ngày càng lây lan nhanh
và khó kiểm sốt, gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành sản xuất lúa [7].
Bệnh đạo ôn và cháy lá là bệnh gây hại nhiều trên cây, bệnh được ghi nhận
ở hầu hết các quốc gia trồng lúa trên thế giới và ngày càng trở nên nghiêm trọng
hơn do ảnh hưởng của quá trình thâm canh trong sản xuất nơng nghiệp kết hợp
với tác động của biến đổi khí hậu tạo điều kiện thuận lợi cho nấm gây bệnh hại
phát triển [7]. Bệnh đạo ôn do nấm Pyricularia oryzae gây ra, bệnh gây hại
nghiêm trọng trên cả lá và cổ bông, mức độ tác hại của bệnh liên quan nhiều đến
nhiều yếu tố như giống lúa, thời kỳ sinh trưởng của cây lúa. Bệnh gây hại trên lá
làm cho bộ lá bị lụi, cháy khô, trổ kém, nấm xâm nhập vào cổ bông, cổ gié làm
cho bông gãy, hạt bị lép, lửng, làm giảm nghiêm trọng đến năng suất, thậm chí
khơng cho thu hoạch. Bệnh cháy lá do vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây ra là
một trong những bệnh hại phổ biến trong các nước trồng lúa. Ở Việt Nam, công
tác chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá chưa được coi trọng có thể do khả năng
download by :
2
lây lan thành dịch không cao như các bệnh dịch hại khác như rầy nâu, đạo ôn. Tuy
nhiên, những bằng chứng cụ thể đã cho thấy dịch bệnh này không hề thua kém
những dịch hại khác. Theo ước tính của FAO, thiệt hại do bệnh này gây ra làm
giảm năng suất lúa trung bình từ 0,7 - 17,5%, những nơi thiệt hại nặng có thể làm
giảm đến 80% [8], [9]. Ở Việt Nam, bệnh đạo ôn xuất hiện và gây hại các vùng
trồng lúa ở cả 3 miền Bắc, Trung và Nam. Riêng Đồng bằng sông Cửu Long trước
đây bệnh đạo ôn và cháy lá chỉ thường gây hại ở vụ Đơng Xn khi nhiệt độ thấp
(16-20oC) kết hợp có sương mù kéo dài, tuy nhiên hiện nay bệnh đạo ôn và cháy
lá thường xuất hiện và gây hại nặng ở tất cả các vụ lúa trong năm [7], [8].
Tại Đồng bằng sông Cửu Long, tỉnh Kiên Giang là tỉnh có diện tích trồng
lúa lớn nhất và An Giang hiện đang là tỉnh dẫn đầu về sản lượng lúa, với hệ thống
sơng ngịi dày đặc và độ ẩm cao rất thuận lợi cho nấm bệnh gây hại phát triển, đặc
biệt nghiêm trọng vào các vụ mùa Đông xuân [4], [5], [6]. Nấm bệnh làm giảm
năng suất chất lượng lúa ảnh hưởng lớn tới tình hình sản xuất và đời sống của
người dân trên địa bàn.
Do đó, việc phát hiện kịp thời và chính xác các tác nhân gây bệnh trên lúa
sẽ giúp ích cho việc đưa ra các biện pháp phòng ngừa và điều trị sớm, kịp thời và
hiệu quả. Xuất phát từ nhu cầu thực tế đề tài: “Xác định các loài nấm hiện diện
trên cây lúa (Oryza sativa) nhiễm bệnh đạo ôn và cháy lá thu thập tại tỉnh An
Giang và Kiên Giang” được thực hiện.
2. Mục tiêu đề tài
Xác định một số loài nấm hiện diện trên cây lúa nhiễm bệnh đạo ôn và cháy
lá thu thập tại tỉnh An Giang và Kiên Giang.
3. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Thu thập mẫu lúa bị nhiễm nấm bệnh tại tỉnh An Giang và
Kiên Giang.
Nội dung 2: Phân lập, làm thuần và quan sát hình thái.
Nội dung 3: Tái nhiễm nhân tạo theo quy tắc Koch.
download by :
3
Nội dung 4: Định danh nấm bằng phương pháp phân tích hình thái học và
bằng phương pháp giải trình tự vùng gen ITS.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn đề tài
Cây lúa là loại lương thực quan trọng được trồng nhiều trên thế giới đặc
biệt là ở các nước châu Á, trong đó có Việt Nam. Nó có vai trị quan trọng trong
sản xuất nơng nghiệp, là nguồn cung cấp lương thực chính. Tuy nhiên do ảnh
hưởng của quá trình thâm canh trong sản xuất nơng nhiệp, tình hình dịch bệnh có
nhiều biến đổi dẫn đến năng suất và chất lượng lúa đang bị suy giảm do sự tác
động của nấm bệnh, đặc biệt là các bệnh như đạo ôn, bệnh đốm nâu,… gây hại ở
tất cả các giai đoạn sinh trưởng của cây lúa. Triệu chứng ban đầu của các bệnh
này trên lá khá giống nhau, vì vậy việc xác định các tác nhân gây bệnh này thường
rất mất thời gian và khó khăn. Do đó, việc phát hiện kịp thời và chính xác các tác
nhân gây bệnh trên lúa sẽ giúp ích cho việc đưa ra các biện pháp phòng ngừa và
điều trị sớm, kịp thời và hiệu quả.
download by :
4
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ĐỀ TÀI
1.1. TÌNH HÌNH NẤM GÂY BỆNH TRÊN CÂY LÚA TẠI TỈNH AN
GIANG VÀ KIÊN GIANG
Theo Cục Bảo vệ Thực vật (Bộ NN-PTNT) cho biết, hiện nay nông dân các
tỉnh ĐBSCL đang vào cao điểm sản xuất vụ lúa hè thu năm 2020, với tổng diện
tích hơn 1,5 triệu ha. Tính đến thời điểm này, ở các tỉnh Đồng Tháp, Kiên Giang,
Hậu Giang, An Giang đã có hơn 1.199 ha lúa bị nhiễm bệnh vàng lùn, lùn xoắn
lá, tăng hơn 665 ha so cùng kỳ năm trước. Bên cạnh đó, ở ĐBSCL cịn có khoảng
9.422 ha lúa bị đốm nâu; 6.967 ha bị bệnh đạo ôn; 7.143 ha bị bệnh lem lép hạt
[5], [6].
1.1.1. Tình hình nấm gây bệnh trên lúa tại tỉnh An Giang
Trước nguy cơ dịch hại bộc phát, Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn
tỉnh An Giang đã đưa ra cảnh báo dịch hại có thể xảy ra trên ruộng lúa trong năm
2019 [5].
Khoảng từ tháng 6 đến tháng 10/2019, trong điều kiện mơi trường có ẩm
độ cao như mưa giơng, bão kéo dài nhiều ngày, bệnh cháy bìa lá sẽ phát triển
mạnh và nặng, bệnh có khả năng gây hại từ nhẹ đến nặng xuất hiện trên lúa giai
đoạn làm đồng đến trổ đều và ngập sữa, trên các giống nhiễm như: OM6976,
OM4900, Jasmine 85, OM4218 [5].
Bên cạnh đó, ngành nơng nghiệp tỉnh An Giang cũng khuyến cáo bệnh đạo
ôn, đạo ôn cổ bông và lem lép hạt cũng có khả năng phát sinh và gây hại mạnh
trên các ruộng sử dụng giống nhiễm bệnh, gieo sạ dày, bón thừa đạm,... trong điều
kiện thời tiết lạnh, ban ngày trời âm u, đêm và sáng sớm có sương mù hoặc là trời
có mưa nắng xen nhau [5].
Bệnh vàng lá (vàng lá chín sớm) có thể phát sinh, bệnh gây hại nặng ở
những ruộng lúa sạ dày lại bón quá nhiều phân đạm, trên các giống nếp, giống lúa
thơm trong điều kiện biên độ nhiệt chênh lệch lớn giữa ngày và đêm. Do đó,
khuyến cáo nơng dân cần chú ý đến sâu đục thân, bệnh đốm vằn,... gây hại cục bộ
để áp dụng các biện pháp quản lý và phòng trị kịp thời [5].
download by :
5
Bên cạnh đó, bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá có khả năng phát sinh tiềm ẩn và
lây lan do rầy nâu di trú vẫn có mang virus gây bệnh [5].
1.1.2. Tình hình nấm gây bệnh trên lúa tại tỉnh Kiên Giang
Tổng diện tích bệnh gây trên lúa Đơng Xn 2018-2019 là 39.325 ha, Các
đối tượng gây hại chủ yếu gồm:
- Lem lép hạt: tổng diện tích nhiễm là 9.376 ha, tỉ lệ 5-20%, cấp bệnh 13, trong đó có 8.168 ha nhiễm nhẹ tỉ lệ 5-10%, xuất hiện ở các huyện như: Hòn
Đất, Giồng Riềng, Gò Quao, Kiên Lương, Giang Thành, Rạch Giá và Châu
Thành, diện tích nhiễm trung bình là 1193 ha, tỉ lệ 10-20%, diện tích nhiễm nặng
là 15 ha, tỉ lệ >20%, xuất hiện ở huyện Kiên Lương [6].
- Bệnh đạo ơn: tổng diện tích nhiễm 5.206 ha. Trong đó diện tích nhiễm đạo
ơn lá là 637 ha , diện tích chủ yếu nhiễm nhẹ, tỉ lệ 5-10%, cấp bệnh 1-3. Diện tích
nhiễm đạo ơn cổ bơng là 4.569 ha, tỉ lệ 2,5->10%, cấp bệnh 1-7, trong đó diện
tích nhiễm nhẹ là 3.948 ha, tỉ lệ 2.5-5%, diện tích nhiễm trung bình là 618 ha, tỉ
lệ 5-10%, xuất hiện ở các huyện Hòn Đất, Giồng Riềng, Gò Quao, Giang Thành,
Kiên Lương, Rạch Giá, Tân Hiệp và Châu Thành, diện tích nhiễm nặng là 3 ha, tỉ
lệ >10%, xuất hiện ở huyện Kiên Lương [6].
- Cháy bìa lá: tổng diện tích nhiễm là 906 ha, diện tích chủ yếu nhiễm nhẹ,
tỉ lệ 10-20%, cấp 1-3, xuất hiện ở huyện Hòn Đất, Giồng Riềng, Giang Thành và
Châu Thành [6].
- Thối thân: tổng diện tích nhiễm là 930 ha, trong đó diện tích nhiễm nhẹ là
550 ha, tỉ lệ 5-10%, diện tích nhiễm trung bình là 350 ha, tỉ lệ 10-20%, diện tích
nhiễm nặng là 30 ha, tỉ lệ >20%, xuất hiện ở huyện Hòn Đất [6].
1.2. MỘT SỐ BỆNH HẠI THƯỜNG GẶP TRÊN CÂY LÚA
1.2.1. Bệnh đạo ôn
Bệnh đạo ôn gây hại ở tất cả các giai đoạn và bộ phận của cây lúa, có thể
phát sinh từ thời kỳ mạ đến lúa chín và gây hại ở bẹ lá, lá, lóng thân, cổ bơng, gié
và hạt. Bệnh xảy ra quanh năm nhưng thường phát triển mạnh và gây thiệt hại
download by :
6
nặng trong vụ đông xuân. Điều kiện thời tiết lạnh, độ ẩm cao và sương mù về đêm
thời gian qua là điều kiện thuận lợi để bệnh này phát triển.
Tác nhân gây hại:
Bệnh đạo ôn do nấm Pyricularia oryzae gây ra, là một trong các loại dịch
hại nguy hiểm đối với cây lúa ở Việt Nam và nhiều nước khác trong khu vực [7],
[13]. Ở giai đoạn sinh sản vô tính, nấm có tên là Pyricularia oryzae thuộc họ
Moniliaseae, bộ Moniliales, lớp Hyphomycetes, ngành Deuteromycotia. Nấm có
giai đoạn sinh sản hữu tính là Magnaporthe oryzae, họ Magnaporthaceae, bộ
Diaporthales, lớp Sordariomycetes, ngành Ascomycota. Bào tử gây bệnh có kích
thước rất nhỏ, không thế thấy được bằng mắt thường, hiện diện rất nhiều trong
khơng khí, theo gió bay đi khắp nơi làm lây lan bệnh [7].
Đặc điểm sinh học, sinh thái và sự phát triển bệnh
Sự xâm nhiễm của mầm bệnh bắt đầu tiếp xúc và bám chặt vào biểu bì của
lá lúa, bào tử nảy mầm khi gặp điều kiện ẩm độ cao, nhiệt độ 26-28oC. Thời gian
nảy mầm từ khoảng 30 phút, đĩa áp hình thành trong khoảng 4-8 giờ và vịi xâm
nhiễm hình thành khoảng 24 giờ sau khi tiếp xúc với bề mặt ký chủ. Sau khi xâm
nhiễm khuẩn ty nhanh chóng phát triển trong mơ tế bào, vết bệnh xuất hiện khoảng
76-92 giờ sau khi xâm nhiễm [7]. Nấm sinh trưởng trong phạm vi nhiệt độ 8-37oC,
sản sinh bào tử trong môi trường từ 10-35oC, nhiệt độ tối ưu cho quá trình sinh
sản bào tử là 28oC, ẩm độ tương đối khơng khí ≥ 93%. Một vết bệnh điển hình có
thế sản sinh bào tử từ 2.000-6.000 bào tử/ngày trong thời gian 14 ngày, nhiều nhất
là từ ngày thứ 3-8 từ khi có vết bệnh [7].
Triệu chứng gây bệnh:
Trên lá: Bệnh gây hại chủ yếu ở giai đoạn mạ đẻ nhánh. Lúc đầu vết bệnh
chỉ nhỏ như đầu mũi kim, màu xám xanh giống như bị nước sơi, sau đó chuyển
sang màu nâu, rồi lan rộng dần ra thành hình thoi, xung quanh màu nâu đậm, giữa
màu xám trắng. Nếu nặng, nhiều vết bệnh liên kết lại với nhau làm lá bị cháy khô,
cây lúa bị lụi xuống, ruộng lúa sẽ bị thất thu nghiêm trọng [7], [11], [12].
download by :
7
a
b
c
Hình 1.1. Bệnh đạo ơn trên lúa (a: Đạo ơn lá; b: Đạo ôn cổ bông; c: Đạo ôn hạt)
Trên cổ bông, đốt thân, gié lúa: Nấm bệnh tấn công trên đốt thân, trên cổ
bông và trên gié lúa. Chỗ bị bệnh lúc đầu có mầu xám xanh, sau chuyển dần sang
màu nâu, nâu đậm. Trên cổ bông, nếu ẩm độ khơng khí cao, chỗ vết bệnh sẽ mọc
một lớp nấm mốc màu xám xanh, nếu trời khô vết bệnh sẽ khơ tóp lại. Gặp gió to
chỗ vết bệnh bị gẫy gập, ruộng lúa trở nên xơ xác. Do cản trở việc vận chuyển
chất dinh dưỡng từ cây lúa lên nuôi hạt, làm cho hạt lúa bị lép lửng. Nếu nặng
bệnh có thể làm cho hạt lúa bị lép hồn tồn [7], [11].
Trên hạt: Vết bệnh có hình đốm trịn, viền nâu, tâm mầu xám trắng, đường
kính khoảng 1-2 mm. Nếu nặng có thể làm cho hạt lúa bị lem lép lửng [7].
Biện pháp phòng ngừa
download by :
8
Không gieo trồng giống nhiễm bệnh, không lấy lúa ở những ruộng đã bị
bệnh đạo ôn ở vụ trước để làm giống cho vụ sau.
Chọn giống có gen kháng bệnh đạo ôn.
Chọn giống sạch bệnh: xử lý hạt giống bằng nước nóng 54°C trong 10 phút
hoặc xử lý bằng thuốc hoá học.
Xử lý giống bằng cách trộn giống với nước muối 15%.
Điều tra bệnh, phân tích các yếu tố: nguồn bệnh, thời tiết, sinh trưởng của
cây, đất đai, phân bón, cơ cấu giống lúa.
Để canh tác cho vụ lúa tiếp theo không bị nhiễm bệnh đạo ôn mỗi đồng
ruộng phải được dọn sạch tàn dư rơm rạ của mùa vụ trước. Mạ lúa được gieo
không quá dày, mỗi ha chỉ gieo khoảng 100 – 120 kg mạ giống, nếu dùng máy
chỉ cần 70 – 80 kg mạ giống. Quá trình bón phân cho cây lúa cần lưu ý khơng bón
q nhiều phân đạm, nhất là thời kỳ cuối đẻ nhánh và sau khi trỗ. Phải bón cân
đối giữa phân đạm, lân và phân kali. Nên bón theo bảng so màu lá lúa để cây lúa
luôn khỏe mạnh, không bị tốt lốp, có sức chống đỡ với bệnh hại cao. Thường
xuyên kiểm tra ruộng lúa để kịp thời phát hiện và có biện pháp phịng trị bệnh kịp
thời. Nếu phát hiện cây lúa có bệnh thì phải ngưng bón phân đạm, không để ruộng
bị khô nước và tiến hành phun xịt thuốc kịp thời [7].
1.2.2. Bệnh cháy lá
Bệnh cháy lá là một bệnh mãn tính trên cây lúa, hầu như chưa có giống nào
kháng hoặc chống chịu được với bệnh này. Bệnh cháy lá phát sinh và phá hại từ
thời kỳ mạ đến chín, nhưng triệu chứng điển hình là sau khi lúa đẻ nhánh đến trổ
và chín sữa.
Tác nhân gây hại
Bệnh do vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây ra [7]. Vi khuẩn này có tế bào
hình que với đầu trịn, với chiều dài từ 0,8 đến 1 μm, chiều rộng 0,4 đến 0,7 μm,
bao quanh tế bào là một màng nhầy. Đây là loại vi khuẩn Gram âm và không sinh
bào tử, khuẩn lạc hình trịn, lồi, bề mặt nhẵn, màu vàng. Vi khuẩn này chủ yếu
download by :
9
xâm nhập vào hệ thống mạch dẫn rồi dẫn đến nhiễm trùng tồn thân cây lúa. Ngồi
ra vi khuẩn cịn có thể xâm nhập qua lỗ thùy khổng ở mép lá, đầu mút lá dễ dàng
gây tổn thương dọc theo gân lá [13].
Triệu chứng gây bệnh
Ở vụ Hè, bệnh thường phát sinh và gây hại giai đoạn cuối vụ. Đặc biệt, sau
những cơn mưa giơng đầu mùa, kèm theo gió lớn vào thời kỳ lúa làm địng - trổ
chín là điều kiện thuận lợi cho bệnh phát sinh lây lan nhanh, gây hại nặng trên các
giống mẫn cảm, những chân ruộng sâu, ruộng bón thừa đạm,… Khi độ ẩm khơng
khí ≥90%, nhiệt độ 26-30oC, thời tiết âm u, mưa bão nhiều bệnh rất nặng. Vi
khuẩn có thể sống trong nước 15-38 ngày, có thể tồn tại trong hạt giống 7-8 tháng
và trong rơm rạ 3-4 tháng [7], [12].
Vết bệnh tạo thành các sọc từ mép lá gần đỉnh, phát triển dần cả chiều dài
và rộng tạo thành vết cháy màu vàng xám nhạt. Giữa vết cháy và phần xanh còn
lại của lá có ranh giới rõ ràng bởi một đường nâu sẫm. Vào sáng sớm hoặc ngày
mưa dầm ẩm ướt trên vết bệnh có những giọt keo màu vàng hoặc khơ lại thành
hạt nhỏ. Bệnh nặng làm tồn bộ lá, kể cả lá địng bị khơ nhanh trước khi lúa chín,
làm hạt kém mẩy và vỏ trấu bị đen.
Hình 1.2. Bệnh cháy lá trên lá lúa
download by :
10
Biện pháp phòng ngừa
Để cây lúa phát triển tốt và đạt năng suất cao, điều đầu tiên cần quan tâm
đến là việc chọn giống kháng bệnh để gieo trồng (tham khảo cán bộ khuyến nông
của địa phương, hoặc trên tài liệu, trên thông tin của truyền thông). Khi đã chọn
được giống lúa thích hợp việc tiếp theo cần làm là vệ sinh đồng ruộng, dọn sạch
tàn dư cây bệnh vụ trước (trục và dìm kỹ gốc rạ), dọn sạch cỏ dại quanh bờ. Đến
giai đoạn gieo sạ, mạ lúa được gieo không quá dày để cây lúa phát triển khỏe
mạnh, kháng được bệnh [13].
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC VÀ NGỒI NƯỚC
Do ảnh hưởng của q trình thâm canh trong sản xuất nơng nghiệp, tình
hình dịch bệnh có nhiều biến đổi dẫn đến năng suất và chất lượng lúa đang bị suy
giảm do sự tác động của nấm bệnh, đặc biệt là các bệnh như đạo ôn, bệnh đốm
nâu, cháy lá,... gây hại ở tất cả các giai đoạn sinh trưởng của cây lúa. Bởi bệnh
ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất và gián tiếp đến phẩm chất gạo, dẫn đến giảm
thị trường xuất khẩu lúa gạo trên thế giới. Vì vậy, các nghiên cứu về thành phần
nấm gây hại cụ thể ở từng địa phương và biện pháp thân thiện môi trường giúp
quản lý bệnh trên cây lúa đang cấp thiết. Ngày nay cùng với sự phát triển của khoa
học kỹ thuật, đặc biệt là công nghệ sinh học, nhiều kỹ thuật mới nhằm xác định
các tác nhân gây bệnh cây trồng, tiết kiệm thời gian và tính chính xác cao, tìm ra
được tác nhân gây bệnh ngay ở giai đoạn đầu khi mới nhiễm bệnh sẽ giúp ích rất
nhiều trong việc đưa ra các biện pháp phòng trị sớm, kịp thời và hiệu quả.
Một số nghiên cứu trong nước
Hiện nay, các loài nấm bệnh gây hại trên cây lúa đang là vấn đề cần thiết
được các nhà nghiên cứu quan tâm để đánh giá hiện trạng nấm bệnh gây ra trên
các đồng ruộng để đưa ra các giải pháp phòng ngừa và nâng cao sản lượng của
cây lúa. Để giải quyết tốt vấn đề này, trước hết, cần nghiên cứu thành phần tác
nhân nấm gây hại trên cây lúa tại địa phương. Các nghiên cứu về nấm đạo ôn hiện
nay như nghiên cứu của Hà Viết Cường và cộng sự năm 2015 đã tiến hành đánh
giá đa dạng nấm đạo ôn lúa (Pyricularia oryzae) tại Đồng bằng sông Hồng bằng
download by :
11
kỹ thuật REP-PCR. Kết quả cho thấy phản ứng PCR dùng bộ mồi REP đã tạo
nhiều sản phẩm đa hình, phân tích Rep-PCR đã chứng tỏ quần thể nấm đạo ôn
Đồng bằng sông Hồng rất đa dạng về di truyền giống như các cơng bố trước đây,
khơng có mối liên hệ rõ rệt giữa các nhóm nấm được xác định dựa trên phân tích
Rep-PCR và các đặc điểm khác của nấm như màu sắc tản nấm, địa điểm thu thập
và chủng nấm [14]. Năm 2016, nghiên cứu của Đoàn Thị Hòa và cộng sự đã ứng
dụng phương pháp PCR trong việc xác định nấm gây bệnh đạo ôn trên lúa, xác
định nấm đạo ôn bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi chuyên biệt nhằm giúp giảm chi
phí, thời gian và cơng sức. Kết quả đã chỉ ra được tính chun biệt của Pot2
transposon trong việc phát hiện nấm đạo ôn và lá/cổ bông nhiễm đạo ôn trên lúa
[15]. Năm 2018, nghiên cứu của Lê Minh Trí đã điều tra, phân lập, tình hình gây
hại của bệnh đạo ơn Pyricularia oryzae Cav. gây hại trên một số giống lúa ở Thừa
Thiên Huế và kiểm sốt tính gây bệnh. Kết quả thu được 188 mẫu bệnh, phân lập
được 82 mẫu nấm bệnh đạo ôn [16]. Nghiên cứu của Đỗ Văn Chủng năm 2019 đã
đánh giá khả năng phòng trừ một số bệnh hại lúa của vi khuẩn Bacillus spp. tại
huyện Châu Phú tỉnh An Giang. Kết quả đã tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus
spp. có hiệu quả đối kháng cao đối với một số tác nhân gây bệnh quan trọng trên
lúa trong điều kiện in vitro. Đánh giá hiệu quả kiểm soát một số bệnh hại quan
trọng trên lúa ở điều kiện ngoài đồng. Xác định thời điểm và số lần xử lý vi khuẩn
cho hiệu quả kiểm sốt bệnh đạo ơn, bệnh cháy bìa lá lúa và lem lép hạt do nấm
[17].
Từ việc xác định các lồi nấm gây bệnh thì song song với đó có các nghiên
cứu khác đưa ra các giải pháp khắc phục tình trạnh nấm bệnh hiện nay như nghiên
cứu của Nguyễn Thị Phong Lan và cộng sự năm 2015 đã thực hiện tuyển chọn
các chủng xạ khuẩn (Streptomyces spp.) đối kháng nấm Pyricularia grisea gây
bệnh đạo ôn hại lúa. Kết quả đã tuyển chọn được các chủng xạ khuẩn có khả năng
kiểm sốt các nguồn nấm gây bệnh đạo ôn (P. grisea) ở ĐBSCL đã được thực
hiện nhằm phát huy tiềm năng của nguồn vi sinh vật bản địa trong hệ sinh thái cây
lúa nước vùng ĐBSCL [18]. Năm 2017, nghiên cứu của Nguyễn Thị Phong Lan
và cộng sự đã nghiên cứu các giải pháp quản lý bền vững bệnh đạo ôn hại lúa
vùng Đồng Bằng Sơng Cửu Long để tìm ra được các giải pháp khoa học trong
download by :
12
quản lý bền vững bệnh đạo ôn hại lúa ở vùng ĐBSCL, góp phần xây dựng thành
cơng chiến lược phát triển nơng nghiệp bền vững, giúp nhà quản lý có cơ sở khoa
học trong định hướng đúng việc quản lý loại dịch hại quan trọng trên lúa và các
giải pháp phối hợp nhằm giúp người nơng dân có thể quản lý bền vững và hiệu
quả bệnh đạo ôn trong điều kiện bất thường của biến đổi khí hậu trên cánh đồng
thâm canh cao vùng ĐBSCL. Kết quả cho thấy, triển khai 18 ha mơ hình ứng dụng
qui trình quản lý tổng hợp bệnh đạo ôn giúp giảm 75,11- 82,08% tỷ lệ bệnh đạo
ôn lá; 81,8 - 82,6% bệnh đạo ôn cổ bơng [19].
Một số nghiên cứu ngồi nước
Trên thế giới hiện nay, các nhà khoa học tập trung vào nghiên cứu các giải
pháp khắc phục tình trạng nấm gây bệnh hại. Theo nghiên cứu của Priyanka và
cộng sự năm 2017 là nghiên cứu đầu tiên trên cây lúa báo cáo việc xác định
lncRNA trong dịng lúa kháng có và khơng có chủng M. oryzae. Kết quả nghiên
cứu đạt được cho thấy sự phân bố đồng đều của lncRNA trên tất cả các nhiễm sắc
thể của cây lúa cho thấy rằng khơng có sự sai lệch trong phân bố nhiễm sắc thể
của các lncRNA liên gen và chống nhiễm trùng trong dòng kháng thuốc giả và M.
oryzae [20]. Năm 2017, nghiên cứu của Jodi và cộng sự đã cho thấy rõ rằng
Streptomyces spp. có khả năng được sử dụng làm chất diệt khuẩn hiệu quả cao
chống lại bệnh đạo ôn M. oryzae [21].
Năm 2018, nghiên cứu của Sukanya và cộng sự đã cho thấy chủng vi khuẩn
BAS23 được phân lập từ đất ruộng và được xác định là Bacillus
amyloliquefaciens. Dựa trên kết quả phương pháp nuôi cấy kép, vi khuẩn BAS23
thể hiện mạnh mẽ hoạt động ức chế in vitro trên sự phát triển của sợi nấm đối với
một loạt các nấm nấm bẩn mầm bệnh của cây lúa (Curvularia lunata, Fusarium
semitectum và Helminthosporium oryzae) [22].
Nghiên cứu của Wen-Ching và cộng sự năm 2019 đã nghiên cứu nhằm mục
đích phát triển các công thức diệt nấm sinh học mới bằng cách sử dụng vi khuẩn
đối kháng bản địa để giúp cải thiện kiểm sốt bệnh đạo ơn. Trình tự vi khuẩn có
thể được điều khiển bằng cách chỉnh sửa gen để thích nghi với các mơi trường lúa
khác nhau nhưng địi hỏi phải đánh giá thêm và hiểu biết toàn diện về hệ thống
download by :
13
mầm bệnh trước khi sửa đổi. Kết quả cho thấy thuốc trừ sâu sinh học mới đã ức
chế đáng kể cường độ bệnh đạo ơn với tỷ lệ kiểm sốt bệnh trung bình cao hơn
đối chứng khoảng 31% [23].
Nghiên cứu của Tomoko và cộng sự năm 2019 đã nghiên cứu tác dụng ức
chế của chiết xuất tế bào (CE) phân lập từ vi khuẩn chống lại Magnaporthe oryzae
trên cây lúa (Oryza sativa). Sự hình thành appressorium bất thường đã được quan
sát thấy trong sự hiện diện của CE được xử lý nhiệt. Kết quả của nghiên cứu này
cho thấy có thể bảo vệ cây lúa khỏi nấm đạo ôn do Magnaporthe oryzae gây ra
[24].
download by :
14
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
2.1.1. Thời gian
Thời gian thực hiện: Từ tháng 12/2019 đến tháng 10/2020.
2.1.2. Địa điểm
Đề tài được thực hiện tại phòng Vi sinh thuộc Viện Sinh học Nhiệt đới.
2.2. ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu
Các mẫu lúa nhiễm bệnh đạo ôn và cháy lá tập trung ở thân, lá, cổ, bông
trên cây lúa được thu tại tỉnh An Giang và Kiên Giang.
2.2.2. Dụng cụ và thiết bị
❖ Dụng cụ:
–
Đĩa petri
–
Đèn cồn
–
Ống nghiệm
–
Erlen
–
Que cấy
–
Dao
–
Ống đong
–
Lame, lamelle
–
Micropipet, pipetman
–
Đầu tip
–
Eppendorf.
❖ Thiết bị:
–
Cân phân tích (A&D HR – 200)
download by :
15
–
Nồi hấp khử trùng (TOMY ES – 315)
–
Máy vortex (GENIE)
–
Máy lắc
–
Bể ổn nhiệt (Cole Parmer BT – 15)
– Máy ly tâm thường (Hettich Mikro 20), máy ly tâm lạnh (Hettich Mikro
220R)
–
Kính hiển vi quang học
–
Máy PCR (Sprint Thermo Cycler)
–
Máy điện di.
2.2.3. Mơi trường và hóa chất
- Mơi trường PDA (Potato Dextrose Agar) bổ sung Chloramphenicol:
0,05g; D-Glucose: 20g; Potatose: 4g; Agar: 15g; Nước cất: 1L.
- Hóa chất sử dụng trong định danh
+ Agarose 1% (BIOLINE-UK)
+ Dung dịch nạp mẫu Gelred Loading buffer (Việt Nam)
+ Mồi xuôi (Fw): ITS1F (5’- CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA3’); Mồi ngược (Rv): ITS4 (5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)
(Gardes and Burns, 1993)
+ Ethanol absolute, Ethanol 70%
+ (P:C:I)(25:24:1)
+ Đệm CTAB (0,2M Tris-Cl pH 7,5; 2M NaCl; 0,05M EDTA; 2%
CTAB)
+ Isoprophenol
+ TE buffer (TE 1X-pH 8; 10mM Tris; 1mM EDTA)
download by :
16
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phương pháp thu mẫu
Các mẫu lúa bị nhiễm bệnh, tập trung thu các mẫu lúa bị bệnh đạo ôn và
bệnh cháy lá lúa, mẫu được thu nhận tại các địa điểm:
+ Tỉnh An Giang: huyện Châu Thành, huyện Tịnh Biên, huyện Châu Phú,
huyện Tri Tôn.
+ Tỉnh Kiên Giang: huyện Giồng Riềng, huyện Châu Thành, huyện Gò Quao,
huyện U minh Thượng, huyện Tân Hiệp, huyện Hòn Đất, Tp.Rạch Giá, đường
ven biển phía Nam.
+ Thời gian thu mẫu: Tháng 2 năm 2019
Mô tả đặc điểm bệnh trên lá, thân, cổ bông, bông lúa, hạt: xuất hiện các vết
bệnh nhỏ màu nâu, các vết bệnh lớn có màu nâu, tâm màu xám, nếu cây bị bệnh
nặng các vết bệnh liên kết lại với nhau tạo thành mảng lớn và làm cây bị cháy
khô. Mẫu được giữ trong túi PE, được dán nhãn để phân biệt và mang đến phịng
thí nghiệm để phân lập nấm gây bệnh [25].
2.3.2. Phân lập và làm thuần
- Chuẩn bị môi trường PDA được hấp khử trùng 121oC/ 1atm/ 20phút. Đổ
môi trường 1/3 đĩa petri đã hấp khử trùng để nguội [25]. Các thao tác được thực
hiện trong điều kiện vô trùng.
+ Mẫu được khử trùng bằng cồn 70o.
+ Cắt mẫu bệnh thành những đoạn nhỏ có kích thước 3 – 5mm sau đó ủ trên
môi trường PDA để hạn chế nhiễm khuẩn. Ủ 28oC/ 5-7 ngày.
+ Dùng dao cấy cắt một miếng thạch có sợi nấm cấy truyền sang đĩa mới để
làm thuần.
+ Cấy lặp lại đến khi đĩa môi trường chứa khuẩn lạc đặc trưng sau 5-7 ngày
ủ.
❖ Phương pháp bảo quản chủng nấm
download by :
