Tài liệu TIỂU LUẬN: Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản doc

Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản

1




BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG…………………….





TIỂU LUẬN

Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản







Chương I .Các rủi ro trong sinh sản [10]
1.Vô sinh
a. Khái niệm:
Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản

2

Vô sinh là mất hoặc thiếu khả năng sinh sản khi hai người chung sống và có
quan hệ trong vòng 2 năm. Biểu hiện là không thấy thụ thai, hoặc có thụ thai
nhưng lần nào cũng sẩy.
Hiện nay vô sinh khá phổ biến chiếm tỷ lệ 10-15%. Có hai loại vô sinh:
Vô sinh nguyên phát : chưa có thai lần nào sau 2 năm chung sống.
Vô sinh thứ phát : có thai 1 lần và không có thai lại sau 2 năm chung sống.
b. Nguyên nhân gây vô sinh:
 Rượu có tác hại đến thai nhi, nhưng khi nữ uống rượu vừa phải có lẽ không
tác hại đến khả năng thụ thai. Nam uống rượu quá nhiều sẽ làm giảm khả
năng sinh sản.
 Nữ hút thuốc lá nhiều sẽ bị giảm khả năng thụ thai và sớm mãn kinh. Ở nam,
thuốc lá cũng là một tác nhân ảnh hưởng đến khả năng sinh sản.
 Cà phê chưa có đủ chứng cứ khoa học cho rằng có ảnh hưởng đến khả năng
thụ thai.
 Phụ nữ quá béo phì thường bị chứng không rụng trứng, và nếu có rụng trứng
sẽ ít khả năng thụ thai. Chứng béo phì ờ nam không có ảnh hưởng đến khả
năng sinh sản.
Những yếu tố gây vô sinh ở phái nữ:
 Bất thường trong chu kỳ rụng trứng
 Bất thường trong ống dẫn trứng
 Lạc nội mạc tử cung
Ngoài ra những yếu tố sau đây có thể làm thai khó đậu hoặc dễ hư thai:
 Tuổi trên 37
 U tử cung
 Bướu trong tử cung
 Bất thường cấu trúc tử cung
Những yếu tố gây vô sinh ở phái nam:
 Tinh trùng chất lượng và số lượng kém, di động kém.
 Tinh dịch chất lượng kém và thể tích kém.
Nguyên nhân do nữ 30-40% các trường hợp

Nguyên nhân do nam 30% các trường hợp
Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản

3

Nguyên nhân có cả nam lẫn nữ 20% các trường hợp
Không tìm thấy nguyên nhân 10-15% các trường hợp
c. Phương pháp điều trị:
- Bơm tinh trùng vào buồng tử cung (thụ tinh nhân tạo): Tinh trùng được chọn lọc
và bơm vào buồng tử cung người vợ cho những trường hợp vô sinh chưa rõ nguyên
nhân, cổ tử cung bất thường.
- Kích thích buồng trứng.
- Thụ tinh trong ống nghiệm (TTTÔN): Tinh trùng của người chồng và trứng của
người vợ được thụ tinh trong phòng thí nghiệm, sau đó phôi được cấy vào tử cung
người vợ. Áp dụng cho các trường hợp tắc và tổn thương vòi trứng, vô sinh không
rõ guyên nhân, bất thường tinh trùng nhẹ.
- Xin trứng, TTTÔN: Tinh trùng của người chồng và trứng của người cho được thụ
tinh trong ống nghiệm, sau đó được cấy vào tử cung người vợ. Áp dụng cho những
người bị suy buồng trứng sớm, bị cắt 2 buồng trứng.
- Xin tinh trùng: Cho các trường hợp không có tinh trùng.
- Mang thai hộ: Tinh trùng của người chồng và trứng của người vợ được TTTÔN,
sau đó cấy phôi vào người mang thai hộ. Áp dụng cho những trường hợp người vợ
không thể mang thai do bệnh lý, tử cung bị bất thường, dị dạng.
- ICSI và MESA ICSI: Áp dụng cho trường hợp người chồng không có tinh trùng
trong tinh dịch do bị tắc nghẽn đường dẫn tinh. ICSI là phương pháp thụ tinh trong
ống nghiệm bằng cách tiêm tinh trùng vào bào tương trứng. Còn trong MESA
ICSI, người chồng sẽ được mổ để lấy tinh trùng, đồng thời người vợ được chọc hút
lấy trứng, sau đó thực hiện các thủ thuật TTTÔN.
- Canh ngày rụng trứng và giao hợp xung quanh thời điểm đó: Áp dụng với những
cặp vợ chồng trẻ mới phát hiện bị vô sinh, nguyên nhân chưa rõ ràng.

2. Thai ngoài dạ con
a. Khái niệm: Chửa ngoài tử cung là trường hợp trứng không làm tổ ở buồng tử
cung mà trứng làm tổ ở bất kì nơi nào trên đường đi của nó.
- Vòi trứng chiếm 95%
Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản

4

- Chửa trên bề mặt buồng trứng chiếm 3%
- Chửa trong ổ bụng chiếm 2%
b. Nguyên nhân
Tất cả những yếu tố làm chậm trễ hay ngừng di chuyển của trứng thụ tinh
vào trong tử cung đều là nguyên nhân gây thai ngoài tử cung. Thông thường, có 3
nhóm nguyên nhân chính gây nên hiện tượng này.

Nhóm 1: Viêm nhiễm vòi trứng
Viêm nhiễm vòi trứng sẽ gây tắc, hẹp vòi trứng và dễ gây ra tình trạng thai
ngoài tử cung. Viêm nhiễm vòi trứng thường do bệnh lây truyền qua đường tình
dục gây nên như: trực khuẩn lậu hay bệnh do chlamydia trachomatis. Trước khi bị
viêm phần phụ, bệnh nhân thường bị bít vòi trứng hoàn toàn dẫn đến vô sinh. Nạo
phá thai cũng là một nguyên nhân gây viêm nhiễm vòi trứng.
Nhóm 2:
Các bệnh phụ khoa như: Khối u phần phụ, dị dạng bẩm sinh vòi trứng…
Vòi trứng có thể bị tắc hoặc hẹp bởi bệnh lạc nội mạc tử cung, khối u phần phụ
chèn ép vòi trứng, những phẫu thuật lên vùng bụng gây dị dạng vòi trứng như: vòi
trứng bị kéo dài, bị gập góc… hoặc những tác động trực tiếp lên vòi trứng từ trước
như: triệt sản, nối vòi trứng…
Vòi trứng còn có thể bị tắc, hẹp bẩm sinh. Ngoài ra, hẹp vòi trứng có thể do:
- Dị dạng bẩm sinh vòi trứng.
- Bệnh lạc nội mạc tử cung.

- Khối u phần phụ chèn ép vòi trứng.
- Những phẫu thuật ở vòi trứng trước đó như: triệt sản, nối vòi trứng.
Nhóm 3: Chất nicotin
Các nghiên cứu cho thấy, thuốc lá không chỉ làm chậm và khó thụ thai, sảy
thai tự nhiên mà còn gây nên hiện tượng thai ngoài tử cung ở các thai phụ.
Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản

5

Chất nicotin có trong thuốc lá làm hỏng các nhung mao phủ trên các thành
ống và làm giảm cử động của các vòi trứng, gây khó khăn cho quá trình trứng thụ
tinh tiến về tử cung. Từ đó dẫn đến trứng làm tổ trong vòi trứng và phát triển thành
thai ngoài tử cung, gây nguy cơ vỡ vòi trứng. Những phụ nữ hút từ 10 điếu
thuốc/ngày trở lên có nguy cơ mắc chứng này gấp 1,5 lần người khác.
3. Chửa trứng
a. Khái niệm:
Chửa trứng là bệnh của tế bào nuôi do các gai rau thái hóa phồng lên tạo
thành túi ối chứa dịch dính vào nhau như chùm nho. Thường toàn bộ tử cung chứa
các túi dịch (như trứng ếch). Trong trường hợp chửa trứng, nhau thai phát triển
thành khối không được kiểm soát. Đa số trường hợp không có bào thai, được gọi là
"chửa trứng hoàn toàn", một số trường hợp có bào thai nhưng không sống được gọi
là "chửa trứng bán phần".
b. Nguyên nhân:
Là hiện tượng thai nghén không bình thường, trong đó tổn thương đã làm
trứng hỏng, gai rau vẫn được nuôi dưỡng bằng máu mẹ nên tiếp tục hoạt động chế
tiết gây tinh dịch trong lớp đệm rau và tế bào nuôi tăng sinh.
c. Phương pháp điều trị:
Nạo sạch "trứng" với người có nhu cầu sinh con hoặc cắt tử cung đối với
người không có nhu cầu sinh đẻ nữa. Sau khi xử trí chửa trứng, người bệnh cần xét
nghiệm máu, nước tiểu 2 tuần/lần cho đến khi lượng HCG trở về bình thường.

Tiếp theo sẽ thử nước tiểu 4 tuần/lần. Thời gian theo dõi 6 tháng. Ngoài ra
trong các lần khám, có thể siêu âm nếu thấy cần thiết.
Nếu bệnh trở thành chửa trứng xâm nhập hoặc ung thư nhau thai, sẽ dùng
các phương pháp chữa bệnh sau:
 Chữa bằng hoá chất: dùng thuốc để diệt ung thư.
 Chữa bằng phẫu thuật: ở một số trường hợp.
 Chữa bằng tia xạ: dùng tia phóng xạ để diệt ung thư, chỉ trong một số
trường hợp.
4. Đa thai
Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản

6

a. Khái niệm:
Đa thai là sự phát triển đồng thời hai hay nhiều thai trong lòng tử cung người
mẹ. Có 2 loại đa thai:
Đa thai một trứng
Đó là hiện tượng khi chỉ có một noãn thụ tinh nhưng trong quá trình phát
triển chúng bị phân đôi hoặc phân ba, bốn…
Đặc điểm
Đa thai một trứng luôn cùng giới tính, giống y nhau về mặt di truyền và có
đặc điểm sinh học rất giống nhau. Tuy vậy, trẻ đa thai cùng trứng vẫn có thể có các
điểm khác biệt do môi trường ngoài gây ra, thí dụ như do mạch máu trong bánh
nhau phân phối không đều cho các thai khiến một thai phát triển hơn thai kia.
Đa thai cùng trứng thường xảy ra ở giai đoạn phôi nang, khoảng cuối tuần
thứ nhất và chia đôi mầm phôi thành hai hoặc nhiều phôi. Hệ quả là hai hoặc nhiều
mầm phôi với các túi ối riêng, nhưng chỉ có một túi đệm và một bánh rau (nhau)
chung.
Nếu sự phân chia diễn ra sớm khoảng một đến ba ngày sau khi thụ thai thì
các bé sẽ phát triển riêng biệt và đồng đều nhau.

Nếu sự phân chia diễn ra muộn hơn, từ khoảng ngày thứ 5 đến ngày thứ 10
sau khi thụ thai thì hai bé vẫn phát triển riêng biệt nhưng không đồng đều nhau,
một thai có thể phát triển to béo, đôi khi phù nề, tăng hồng cầu; trong khi thai còn
lại thì còi cọc, thiếu máu, thậm chí có thể teo và chết đi. Thường có sự thông
thương tuần hoàn giữa hai thai nhi, do đó máu đến nuôi có thể dồn hẳn về một thai
nhi, trong khi thai kia thì rất ít hoặc không được nuôi dưỡng.
Khi sự phân chia muộn hơn nữa, sự tách đôi không xảy ra hoàn toàn được
nên còn một chỗ nào đó dính nhau: Hai bé có thể dính nhau ở một phần thân thể
hoặc có chung một cơ quan, bộ phận nào đó. Các trường hợp này được gọi tên theo
vị trí dính thai (thí dụ như song thai dính ở vùng ngực - thoracopagus, song thai
dính nhau vùng chậu hông - ischiopagi).
Trường hợp mầm phôi tách đôi muộn (trong tuần lễ thứ 2) sẽ dẫn đến đa thai
cùng trứng chỉ có một túi ối và một túi đệm. Các trường hợp này thai ít khi sống
được do dây rốn rối nhiều, tuần hoàn máu qua dây rốn bị nghẽn và một hay cả hai
Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản

7

thai sẽ chết. Tỷ lệ đa thai cùng trứng có một ối chiếm tỷ lệ 1/4 trong tổng số các
trường hợp song thai cùng trứng.
Đa thai khác trứng
Đây là trường hợp các thai nhi được sinh ra do việc thụ tinh bởi các trứng và
tinh trùng khác nhau. Trứng có thể rụng từ một buồng trứng, hoặc từ hai buồng
trứng. Tinh trùng có thể từ cùng một người đàn ông hoặc từ những người đàn ông
khác nhau. Các trứng được thụ tinh có thể xảy ra trong cùng một lần giao hợp,
hoặc các lần giao hợp khác nhau nhưng phải trong cùng một chu kỳ kinh nguyệt -
do vậy còn gọi là sự bội thụ tinh đồng kỳ. Sự bội thụ tinh khác kỳ (các trứng thụ
tinh ở các tháng khác nhau) chưa thấy xảy ra ở loài người.
Đặc điểm
Vì là các tinh trùng khác nhau thụ tinh với các trứng khác nhau, nên khi sinh

ra các em bé này có thể khác nhau hoàn toàn, một trai, một gái, hoặc cũng có thể
ngẫu nhiên cùng là con trai, hoặc cùng là con gái, nhưng sẽ không giống nhau như
hai giọt nước mà chỉ là giống nhau như anh em một nhà thôi. Các trường hợp đa
thai khác trứng có thể do yếu tố di truyền, yếu tố gia đình và còn có thể do dùng
thuốc kích thích rụng trứng trong khi điều trị vô sinh, làm cho hàng tháng không
chỉ một trứng chín và rụng, mà có khi 2-3 trứng cùng chín và cùng rụng. Và nếu tất
cả các trứng này đều may mắn gặp được "người hùng" của mình, thì khoảng 9
tháng sau, người mẹ sẽ cho ra đời không phải chỉ một bé mà là hai, ba bé.
Trẻ đa thai khác trứng có thể cùng giới hay khác giới, và như thế không
giống nhau về mặt di truyền. Điểm chung duy nhất của chúng là nằm trong tử cung
trong cùng một khoảng thời điểm.
Đa thai khác trứng luôn luôn có các túi ối và túi đệm riêng biệt, nhưng đĩa
đệm và phần bánh rau (nhau) có thể riêng hoặc kết nhập chung lại với nhau.Trường
hợp mầm phôi tách đôi sớm (giai đoạn từ 2-8 tế bào) thì hai thai có hai túi ối, 2 túi
đệm và hai bánh rau riêng biệt. Hai bánh rau này có thể kết nhập hay không kết
nhập lại thành một bánh. Trong trường hợp này rất khó phân biệt song thai cùng
trứng với song thai khác trứng nếu chỉ dựa trên sự phân tích rau thai. Muốn xác
định hai đứa trẻ sinh đôi có cùng giới tính, cùng nhóm máu có phải cùng trứng hay
khác trứng chúng ta phải chờ cho chúng lớn lên khi đó dựa vào yếu tố khác nhau
như màu mắt, vân tay v.v hoặc chúng ta có thể xác định sớm hơn thông qua phân
tích di truyền.

Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản

8

Chương II. Công nghệ hỗ trợ sinh sản
1. Khái niệm công nghệ hỗ trợ sinh sản (CNHTSS)
Kỹ thuật hỗ trợ sinh sản (tiếng Anh: Assisted Reproductive Technology A.R.T.)
bao gồm tất cả các phương pháp chữa trị chứng vô sinh trong đó cả trứng lẫn tinh trùng
Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản

9

đều được sử dụng. Nói chung ART là công tác phẫu thuật lấy trứng từ buồng trứng của
một người nữ, kết hợp với tinh trùng của một người nam, sao đó đem trở vào người nữ đó
hay một người nữ khác.
Những phương pháp giúp có thai đơn thuần hơn như bơm tinh trùng vào tử cung
(không trực tiếp động đến trứng) và kích thích tạo trứng (không trực tiếp lấy tinh trùng)
không được xếp vào lãnh vực của ART.
2. Sơ lược lịch sử phát triển CNHTSS [7]
Trên thế giới

Lần đầu tiên vào năm 1959, Chang thành công khi thực hiện tụ tinh nhân tạo giữa
trứng và tinh trùng thỏ trong môi trường ống nghiệm; từ đó tới nay, các nhà khoa học
không ngừng nghiên cứu tìm kiếm những phương pháp mới cho việc điều trị vô sinh ở
người. IVF và ICSI là những kỹ thuật nhằm làm tăng tỷ lệ thụ tinh trong điều trị hiếm
muộn đã được báo cáo thành công trên thế giới từ những năm 1978 và 1992, cho tới nay
đã có hơn một triệu em bé ra đời từ những kỹ thuật trên.
1978, em bé đầu tiên từ TTTON, Louis Brown, ra đời đánh dấu bước đầu cho sự
phát triển của TTTON trên người. Sau đó, 2 trường hợp sanh khác từ TTTON cũng đã
được báo cáo tại Anh. Sau đó, chương trình này tại Anh bị gián đoạn trong 2 năm.
1980, em bé TTTON thứ tư trên thế giới được sinh ra tại Úc. Trung tâm Monash ở
Úc được ghi nhận là nơi thứ hai trên thế giới thực hiện thành công TTTON. Trung tâm
này sau đó liên tục báo cáo các trường hợp sanh sau TTTON. Do trung tâm TTTON đầu
tiên ở Anh tạm ngưng hoạt động sau 3 trường hợp sanh đầu tiên, người ta ghi nhận rằng
12 trong số 15 em bé TTTON đầu tiên trên thế giới được ra đời từ trung tâm Monash ở
Úc.
1981, em bé TTTON đầu tiên ở Mỹ ra đời. Đây cũng là trường hợp TTTON đầu
tiên sử dụng gonadotropin để kích thích buồng trứng.
Sau đó, trong những năm 80, kỹ thuật TTTON đã phát triển rất mạnh và lần lượt được
báo cáo thành công tại nhiều nước trên thế giới, kể cả ở Châu Á. Trong đó, Singapore
được ghi nhận là nơi thực hiện thành công TTTON đầu tiên ở Châu Á vào năm 1983 bởi
nhóm nghiên cứu của SC Ng và cộng sự.
1984, kỹ thuật chuyển giao tử vào vòi trứng (GIFT) được báo cáo thành công tại
Mỹ.
1984, em bé đầu tiên ra đời từ trường hợp một phụ nữ không còn buồng trứng,
thực hiện xin trứng TTTON tại Úc.
1984, em bé đầu tiên sinh ra từ phôi người đông lạnh được báo cáo ở Úc bởi
Trounson và Mohr.
1986, Chen báo cáo trường hợp có thai từ trứng người sau động lạnh và rã đông tại
Úc. Tuy nhiên, tỷ lệ thành công được báo cáo rất thấp.
Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản

10

1988, trường hợp tiêm tinh trùng vào dưới màng trong suốt (SUZI) được báo cáo
thành công lần đầu tiên tại Singapore bởi SC Ng và cộng sự.
1989, kỹ thuật đục thủng màng trong suốt (PZD) để hỗ trợ thụ tinh được giới thiệu
ở Mỹ bởi Cohen.
1992, kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương trứng được báo cáo thành công lần
đầu tiên tại Bỉ bởi Palermo và cộng sự.
1994, trường hợp có thai đầu tiên từ trứng non trưởng thành trong ống nghiệm
(IVM) được báo cáo tại Úc.
1994, các trường hợp MESA-ICSI (hút tinh trùng từ mào tinh qua vi phẫu và tiêm
tinh trùng vào bào tương trứng) đầu tiên được báo cáo.
1995, kỹ thuật PESA-ICSI (chọc hút tinh trung từ mào tinh xuyên da và tiêm tinh
trùng vào bào tương trứng) được giới thiệu.
1995, kỹ thuật TESE-ICSI (phân lập tinh trùng từ tinh hoàn ở những trường hợp
giảm sinh tinh tại tinh hoàn và tiêm tinh trùng vào bào tương trứng) được báo cáo thành
công.
1997, trường hợp có thai ở phụ nữ 63 tuổi với kỹ thuật xin trứng TTTON được
báo cáo.
1997, trường hợp có thai đầu tiên từ trứng trữ lạnh và rã đông của Mỹ được báo
cáo. 11 năm sau trường hợp đầu tiên trên thế giới được báo cáo.
2001, phác đồ mới trong kỹ thuật trữ trứng được báo cáo, cải thiện đáng kể tỷ lệ
thành công. Đồng thời, những trường hợp sanh đầu tiên từ cả trứng và tinh trùng đông
lạnh được báo cáo tại Ý.

Tại Việt Nam
Bắt đầu thực hiện TTTON từ năm 1997, đến năm 1998 có 3 em bé TTTON đầu
tiên tại Việt Nam ra đời và năm 1999 em bé đầu tiên ra đời từ kỹ thuật ICSI, và cho tới
nay đã có 3438 em bé chào đời từ các kỹ thuật tại bệnh viện Từ Dũ, trong đó hầu hết cá

chu kỳ thực hiện đều có hỗ trợ cuả ICSI.
Sự phát triển các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản hiện đại tại Việt Nam
Sự kiện Năm Nơi thực
hiện
Thế giới
Thực hiện thành công trữ lạnh tinh trùng người 1995 BV. Từ Dũ 1964
Thực hiện thành công kỹ thuật IUI với tinh trùng
lọc rửa
1995 BV. Từ Dũ cuối 1970
Thực hiện thành công kỹ thuật TTTON đầu tiên 1997 BV. Từ Dũ 1971
Các trường hợp TTTON đầu tiên ra đời 1998 BV. Từ Dũ 1978
Em bé đầu tiên ra đời từ kỹ thuật ICSI 1999 BV. Từ Dũ 1993
Em bé đầu tiên ra đời từ chu kỳ TTTON sử dụng 2000 BV. Từ Dũ 1995
Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản

11

rec. FSH
Em bé đầu tiên ra đời từ kỹ thuật cho trứng –
TTTON
2000 BV. Từ Dũ 1984
Em bé đầu tiên ra đời từ kỹ thuật TTTON – mang
thai hộ
2001 BV. Từ Dũ 1984
Em bé đầu tiên ra đời từ kỹ thuật giảm thai sau
TTTON
2001 BV. Từ Dũ 1999 (*)
Thực hiện thành công trữ lạnh phôi người 2002 BV. Từ Dũ 1983
Em bé đầu tiên ra đời từ kỹ thuật MESA – ICSI 2003 BV. Từ Dũ 1995
Em bé đầu tiên ra đời từ kỹ thuật PESA – ICSI 2003 BV. Từ Dũ 1995

Em bé đầu tiên từ chu kỳ TTTON sử dụng GnRH
antagonist
2003 BV. Từ Dũ 1995
Em bé đầu tiên ra đời từ phôi đông lạnh 2003 BV. Từ Dũ 1984
Em bé TTTON thứ 1000 tại BV. Từ Dũ 2003 BV. Từ Dũ 1984
Em bé đầu tiên ra đời từ chu kỳ TTTON sử dụng
rec LH
2003 BV. Từ Dũ 1984
Thai lâm sàng đầu tiên từ cả trứng và TT người
đông lạnh
2003 BV. Từ Dũ 2001
Em bé đầu tiên ra đời từ kỹ thuật TESE – ICSI 2004 BV. Từ Dũ 1995

3. Kỹ thuật chuẩn bị giao tử [1,2]
3.1. Chuẩn bị trứng:
Năm 1978, trường hợp thụ tinh trong ống nghiệm đầu tiên trên thế giới
thành công sau khi chuyển 1 phôi từ 1 trứng duy nhất chọc hút được từ chu kỳ tự
nhiên không kích thích. Tuy nhiên, những lần thụ tinh trong ống nghiệm sau được
lặp lại với chu kỳ tự nhiên cho kết quả thành công rất thấp, bởi lẽ với 1 trứng duy
nhất, nếu thụ tinh không xảy ra hoặc xảy ra thụ tinh nhưng phôi ngưng phát triển
do chất lượng trứng kém, bệnh nhân sẽ không có phôi để chuyển. Còn trong trường
hợp có 1 phôi để chuyển, tỉ lệ có thai của bệnh nhân cũng chỉ dao động quanh con
số từ 10 đến 15% - một tỉ lệ rất thấp cùng với chi phí cao và tốn nhiều thời gian.
Vì lẽ đó, để nâng khả năng thành công trong thụ tinh trong ống nghiệm, cần kích
thích buồng trứng để tạo ra nhiều nang trứng hơn, từ đó tăng số trứng chọc hút
được trong một chu kỳ điều trị, tăng số trứng có chất lượng tốt, tăng số phôi tạo
thành và số phôi tốt để chuyển, dẫn đến tăng tỉ lệ có thai. Số trứng mong đợi thu
được từ kích thích buồng trứng trong thụ tinh trong ống nghiệm là từ 10-12 trứng.
Đối với những trường hợp xin – cho trứng, việc kích thích buồng trứng càng trở
nên quan trọng hơn nhằm tăng tỉ lệ thành công và hạn chế việc người cho trứng bị

gây mê và chọc hút trứng nhiều lần.
Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản

12

a. Thu nhận trứng
Các tác nhân được sử dụng để tối đa hóa sản xuất trứng bao gồm:
 GnRH - Được sử dụng để ngăn chặn việc sản xuất tự nhiên của hormone kích
thích nang (FSH) và hormone luteinizing (LH) kích thích tố để kiểm soát chu
kỳ kinh nguyệt và cải thiện số lượng trứng được lấy ra.
 Gonadotropin (FSH) - tổng hợp các hình thức của các hormon tuyến yên được
sử dụng để kích thích sự phát triển của nang trứng trong buồng trứng, nuôi
dưỡng trứng. Tăng trưởng nang lông là cần thiết trong quá trình kích thích để
sản xuất trứng khỏe mạnh.
 Nhân Gonadoropin màng đệm (hCG) - Được sử dụng ở phần cuối của một chu
kỳ kích thích để kích thích sự trưởng thành cuối cùng của trứng. Trong khi các
loại thuốc này đôi khi được sử dụng để gây rụng trứng, khi được đưa ra trong
quá trình này, việc thu hồi trứng được hẹn giờ để cho phép những quả trứng
được thu thập trước khi rụng trứng xảy ra.
Trong quá trình sử dụng gonadotropins, nồng độ estrogen và progesterone
lưu thông trong máu đạt đến mức độ cao hơn bình thường. Trong một chu kỳ kích
thích điển hình, khoảng năm xét nghiệm máu sẽ được thu thập trong quá trình dùng
thuốc để theo dõi mức độ này.Tốc độ tăng trưởng nang lông cũng sẽ được theo dõi
bằng siêu âm âm đạo. Một khi kích thước nang thích hợp đạt được, FSH được
ngưng và một liều duy nhất của hCG được đưa ra cho sự trưởng thành cuối cùng
của trứng. Việc thu hồi trứng thường xảy ra 35-36 giờ sau đó.
Thao tác thực hiện:
- Tiêm GnRHa (DecapepTil 0,1mg) dưới da người cho trứng/ngày /14 ngày
(từ ngày 21 CK kinh nguyệt).
-Thử lại LH và E2, nếu hàm lượng LH<5 IU/L và E2<100pg/ml thì kích

thích buồng trứng với FSH/hMG, nếu chưa đạt, tiêm tiếp GnRHa.
-Tiêm phối hợp GnRHa (0,05mg) với FSH (Puregon 50 IU; 100 IU.
-Siêu âm từ 2-3 lần nhằm theo dõi kích thước và số lượng nang trứng. Theo
dõi hoocmone (LH, E2) từ ngày thứ 6 sau kích thích.
-Tiêm hCG (Pregnyl 5000 IU) khi xuất hiện ít nhất 2 nang trứng lớn nhất đạt
kích thước siêu âm 17mm nhằm kích thích trưởng thành nõan.
Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản

13

-Chọc hút trứng 35-36h sau khi tiêm hCG.
Chọc hút trứng là quá trình chọc hút các dịch nang trứng từ 2 buồng trứng.
Dịch nang trứng ngay sau khi chọc hút sẽ được chuyển ngay cho phòng lab IVF,
các chuyên viên phôi học sẽ tìm trứng trong dịch nang này dưới kính hiển vi.
Trứng và các tế bào bao quanh trứng (hình 1) thu nhận được sẽ được rửa trong môi
trường thích hợp, rồi được chuyển ngay vào đĩa có môi trường chuyên biệt và ủ
trong tủ ủ có CO2.

Hình 1. Phức hợp trứng – tế bào hạt
b.Gây rụng trứng nhiều:
- Kích thích chín và rụng trứng hàng lọat bằng hoocmon để thu nhiều trứng
chín một lúc.
Mục đích: thu nguồn trứng và cho thụ tinh tự nhiên để thu nhận nguồn phôi.
Sử dụng PMSG (huyết thanh ngựa chữa) để gây chín trứng nhanh và FSH
(chiết từ tuyến yên cừu/heo) kết hợp với hoocmon HCG (bò sữa sử dụng PMSG,
FSH và HMG)
FSH (Follicle Stimulating Hormone) là hóc-môn của thuỳ trước tuyến yên
có tác dụng chủ yếu là kích thích tế bào trứng phát sinh và phát triển.
Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản

14

LH (Luteinising Hormone) là hóc-môn của thuỳ trước tuyến yên có tác
dụng tăng cường quá trình phát dục của trứng, làm cho trứng chín và rụng, đồng
thời bảo đảm cho sựhình thành thể vàng.
Huyết thanh ngựa chửa - PMSG (Pregnant Mare Serum Gonadotropin)- là
kích tố của nhai thai ngựa có chức năng sinh lý tương tự như FSH và LH của thuỳ
trước tuyến yên. Tuy nhiên hoạt tính của nó giống FSH nhiều hơn.
- Kích tố của nhau thai người - HCG (Human Chorionic Gonadotropin) - là
kích tố của phụ nữ có chửa. Chức năng sinh lý của HCG gần giống với LH.
c. Thu nhận trứng:
Từ ống dẫn trứng sau khi rụng, từ nang trứng của buồng trứng, bằng nội soi-
siêu âm hoặc bằng giải phẫu con vật còn sống sử dụng dụng cụ thu nhận trứng
rụng
Kỹ thuật thu nhận trứng
+ Phương pháp chọc hút
+ Phương pháp rạch-múc
+ Phương pháp cắt nghiền buồng trứng
+ Kỹ thuật soi ổ bụng
+ Siêu âm xuyên qua niệu đạo
+ Phương pháp rửa nang trứng
Để có được trứng của buồng trứng, trước tiên cần nội soi ổ bụng. Phẫu thuật
nội soi là thương hiệu mới trong năm 1970 và được cho là một cách ít gây tổn
thương vào bụng (buồng trứng).
Chọc hút trứng được làm tại phòng Thụ tinh trong ống nghiệm. Trứng được
lấy qua một kim chọc hút trứng gắn vào một bộ phận lắp kim của đầu dò âm đạo
dưới hướng dẫn của siêu âm.
Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản

15

Siêu âm công nghệ tốt hơn nhiều, trứng và các nang không xâm lấn nhau. Vì
vậy, bây giờ hầu như tất cả các phương thu nhận trứng trên thế giới diễn ra được
thực hiện bằng phương pháp siêu âm. Cách đơn giản nhất để làm điều này là sử
dụng đầu dò siêu âm qua âm đạo được sử dụng để quan sát buồng trứng. Siêu âm
được thực hiện các thủ thuật như sinh thiết bằng kim, là thủ thuật đưa kim vào để
lấy một mẫu tế bào từ các nang và dịch nang trứng, và trứng có thể được lấy ra.
d. Quan sát và phân loại trứng:
Kỹ thuật:
+Làm dẹp phức hợp OCC (phức hợp trứng) để gây xung động mạnh đĩa nuôi
dưới KHV
+Phân tách khối cumulus bằng enzyme: phức hợp OCC đặt trong đĩa bốn
giếng chứa môi trường thu trứng có bổ sung 0,4% BSA và hialuronidase 80 IU/ml
tại 370C trong 30-60 giây, dùng pipiette tách lớp cumulus khỏi phức hợp OCC sau
đó rửa trứng vài lần bằng dung dịch thu trứng bổ sung 10% huyết thanh
Tiêu chí đánh giá
+Túi mầm: có nhân lớn (túi mầm) hiện diện→các TB bao quanh không phát
triển rộng và bám chặt vào xung quanh là trứng chưa trưởng thành.
Metaphase I: trứng bao lớp TB chặt chẽ và có lớp cumulus bám chặt xung
quanh, ĐK gấp 5 lần ĐK trứng
Metaphase II: Trước khi rụng trứng (từ nang Graff): TB vành corona áp dính
lên trứng,thể cực được đẩy ra. Lớp cumulus mở rộng thành một khối
Trưởng thành: trứng thấy rõ, lớp cumulus nhiều, cô đặc lớp TB cumulus, có
các giọt đen nhỏ bằng vành corona tái hình thành vây kín xung quanh TB trứng
Hòang thể hóa: TB mờ nhạt, lớp cumulus bị phá vỡ và trở thành một khối
keo xung quanh trứng
. Sẹo hóa: TB hạt bị phân mảnh, giống dây buộc, phân bố lệch về một phía
TB trứng
e. Nuôi trứng trưởng thành:
Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản

16

Trứng thu nhận, rửa và làm ấm 370C, nuôi trên môi trường có đệm HEPES,
huyết thanh và heparin (đã ủ ở 370C), tiếp tục rửa bằng môi trường nuôi chín sau
đó đưa vào các giọt môi trường nuôi trên đĩa petri, chứa 1-10 TB trứng/giọt.
Môi trường cho IVM gồm 2 loại:
+Đơn giản: hệ thống đệm bicacbonate chứa các chất như pyruvate, lactate và
glucose
+Phức tạp: thêm một số yếu tố như amino acid, VTM, purine và những chất
khác.
3.2. Chuẩn bị tinh trùng:[3,5]
3.2.1. Thu nhận tinh trùng
a. Phương pháp kích thích cơ học.
Các bước tiến hành:
- Chuẩn bị: Dụng cụ khai thác tinh dịch gồm có: găng tay bằng cao su mỏng,
lọ (hay bình) hứng tinh.
- Rửa sạch phần bụng, sát trùng bộ phận sinh dục đực, phần mông của giá
nhảy, lọ hứng tinh và găng cao su.
- Dùng khăn tẩm nước nóng từ 35-37
o
C, vắt khô, xoa vào vùng bẹn và bao
dương vật của heo đực để gây kích thích.
- Thu tinh dịch: Dùng tay kích thích vào bao đầu dương vật để heo đực hưng
phấn, nhảy lên ôm giá nhảy. Khi dương vật của heo đực bắt đầu thò ra, dùng
lòng bàn tay nắm nhẹ vào đầu dương vật (đoạn xoắn mũi khoan) và lái cho qui
đầu dương vật lệch ra ngoài giá nhảy. Lúc này, dương vật của heo đực sẽ giao
cấu trong lòng bàn tay. Bàn tay của người khai thu tinh cần nắm nhẹ dương vật (
giữ nguyên tư thế, lòng bàn tay), các ngón tay gây cử động nhẹ để gây kích
thích. Khi kích thích cao độ heo bắt đầu xuất tinh. Người thu tinh trùng dùng tay

kia cầm lọ hứng tinh kề gần vào qui đầu để hứng tinh dịch chảy ra.
Chú ý:
- Không nắm dương vật của heo quá chặt làm heo đau và sợ hãi, cũng không
nên nắm úa lỏng lẻo vì có thể làm cho dương vật tuột ra ngoài tầm tay.
Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản

17

- Không được để qui đầu chạm vào giá nhảy hoặc lọ hứng tinh vì dễ gây sây sát,
chảy máu làm cho heo sợ hãi, thậm chí dẫn tới ức chế phản xạ xuất tinh. Sau khi
heo xuất tinh xong mới nới lỏng bàn tay nắm dương vật để heo tự co dương vật
lạivà tụt khỏi giá nhảy.
- Khi hứng tinh phải để cho tinh chảy nhẹ theo thành lọ.
 Ưu điểm:
- Không cần nhiều trang thiết bị, dụng cụ.
- Người thu tinh dịch có thể quan sát trực tiếp được các pha trong quá trình
xuất tinh, từ đó đưa ra quyết định hứng tinh ở “pha” nào là tốt nhất, đặc biệt là
trong quá trình khai thác tinh dịch heo.
 Nhược điểm:
- Cần có sự luyện tập và thích ứng của đực giống.
- Dễ bị nhiễm bẩn cơ quan sinh dục hoặc lây bệnh cho người thu tinh dịch nếu
không vô trùng tốt hoặc các dụng cụ bảo hộ không đảm bảo an toàn vệ sinh.
- Kích thích không khoái cảm cho con đực dẽ gây ức chế khó xuất tinh và tinh
dịch thu được có số lượng và chất lượng tinh trùng thấp.
b. Phương pháp dùng âm đạo giả.
Nguyên lý của phương pháp này là cho con đực giao phối và xuất tinh trong
một loại dụng cụ gọi là âm đạo giả có các điều kiện (nhiệt độ, áp suất, độ
nhớt,…) tương tự như trong đường sinh dục con cái động dục. Đây là phương
pháp khai thác tinh cổ điển sản xuất.
Ưu điểm:

- Thu được toàn bộ lượng tinh dịch trong một lần xuất tinh.
- Không gây ảnh hưởng xấu đến cơ quan sinh dục đực.
- Không cần sự có mặt của con cái động dục.
 Nhược điểm:
- Phương pháp này cần có một số dụng cụ nhất định, công tác chuẩn bị lâu, thao
tác khi tiến hành thu phức tạp.
Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản

18

- Để tiến hành thu được tinh dịch bằng phương pháp âm đạo giả, người ta phải
huấn luyện cho con đực có phản xạ nhảy giá và giao phối trong âm đạo
giảnhưng hiện nay vẫn đang được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu.
Khi trứng lớn, chúng sẽ được hút ra khi đã chín nhưng chưa tự phóng.
Hormone gondotropins, loại hóc môn gây tắt kinh nguyệt của người được dùng
để kích thích rụng trứng. 36 giờ sau, bào tương (chứa tế bào trứng) sẽ được lấy
ra bằng đường âm đạo (bằng kim và siêu âm). Các trứng trong bào tương sẽ
được thụ tinh với tinh trùng đã lấy từ trước, và 2 trứng đã thụ tinh sẽ được đưa
lại vào tử cung người phụ nữ.
3.2.2. Thụ tinh trong ống nghiệm [7]
3.2.2.1. Khái niệm
Thụ tinh là quá trình kết hợp tế bào tinh trùng với tế bào trứng để tạo ra một
tế bào mới gọi là " hợp tử ", hợp tử sẽ phát triển thành cơ thể mới. Quá trình kết
hợp này thường xẩy ra trong cơ thể mẹ và tại 1/3 phía trên của ống dẫn trứng.
Thụ tinh trong ống nghiệm (In vitro Fertilization - IVF) là quá trình kết hợp
giữa tinh trùng với trứng để tạo ra hợp tử, được thực hiện bên ngoài cơ thể mẹ,
tại phòng thí nghiệm (trong hộp lồng, hộp petri). Tuy xảy ra ngoài cơ thể, nhưng
các điều kiện cho quá trình IVF như môi trường, nhiệt độ, độ ẩm, độ nhớt .v.v
cùng các chỉ tiêu sinh học khác phải giống như trong cơ thể mẹ.
Ý nghĩa của IVF:

- Khai thác được tiềm năng sinh sản ở những gia súc cái cao sản, đặc biệt với
những con cao sản nhưng vì lý do nào đó bị loại thải.
- Cung cấp vật liệu và làm cơ sở cho những nghiên cứu, lai ghép phôi, chuyển
cấy gen, cắt phôi nhân phôi .v.v . . .
- Giúp cho việc đánh giá con vật sớm hơn (rút ngắn được khoảng cách thế hệ).
- Tạo nhiều phôi, giá rẻ từ đó giảm giá thành công nghệ phôi, thành lập ngân
hàng phôi, trứng và làm cơ sở cho việc bảo tồn, lưu giữ phục hồi lại các giống
gia súc và các độngvật quý hiếm nhưng ít có giá trị về kinh tế.
Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản

19

- Khắc phục tình trạng vô sinh ở các con cái tốt, có buồng trứng hoạt động bình
thường nhưng bị tắc ống dẫn trứng hoặc do điều kiện nào đó mà trứng và tinh
trùng không gặp nhau được ở trong cơ thể.
IVF được tiến hành lần đầu tiên trên thỏ bởi Dauzier và cộng sự (1954), sau
đó là Thibault và Dauzier (1960, 1961). Kỹ thuật này được Brackett áp dụng và
phát triển vào chăn nuôi bò từ 1981. Từ đó, IVF được nghiên cứu và ứng dụng
rộng trong những nước chăn nuôi phát triển (Mỹ, Pháp, Anh, Nhật, Đức ). Các
bảng dưới đây phản ánh một phần lịch sử phát triển và mức độ thành công
củaIVF
Bảng 1. Một số động vật đã được IVF
Động

IVF

Kết quả Động IVF Kết quả
vật Tạo
phôi
Sau c

ấy
phôi
vật Tạo phôi

Sau c
ấy
phôi
Thỏ + + + Bò + + +
Chuột

+ + + Lợn + + +
Ngư
ời
*
+ + + Cừu + + +
Mèo + +/- - Ngựa

+ + +
Chó + - -

 Đến nay đã có trên 10.000 em bé được ra đời bằng kỹ thuật IVF. Ca đầu tiên
thành công năm 1978 ở Anh (do Steptoe và Edward tiến hành). ở Việt Nam ,
ngày 30/4/1998, 3 em bé đã ra đời nhờ IVF (đến nay đã lên đến vài chục
em).
Bảng 2. Những kết quả đầu tiên về IVF ở động vật

Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản

20

Động
vật
Năm Tác giả

Động
vật
Năm Tác giả
Thỏ 1954-
1959
Dauzier, Thibault
Chang
Bò 1982

Braket và cs.

Chu
ột túi
má
1963
Yanagimathi và
Chang
Dê 1981

Kim và Irtani

Chuột
nhắt
1969
Ywamatsu và
Chang

Cừu 1983

Wright và
Bondioli
Người 1978
Steptoe và
Edward
Lợn 1986

Cheng và cs.

3.2.2.2.Các bước của IVF
Gồm 4 khâu chủ yếu:
- Thu thập trứng chưa thụ tinh
- Nuôi trứng chín
- Cho trứng thụ tinh với tinh trùng
- Nuôi trứng đã thụ tinh cho đến giai đoạn phôi.
a. Thu thập tế bào trứng (0ocyte collection)
Thu thập tế bào trứng từ buồng trứng của con vật: có thể từ con vật còn sống
(qua nội soi hoặc giải phẫu), hoặc từ lò mổ (những con vật cao sản được giết
thịt).
Các kỹ thuật để lấy trứng: mổ nang trứng (Follicle dissection), chọc nang
trứng (Follicle puncturing); hút nang trứng (Follicle aspiration) hoặc cắt buồng
trứng thành từng lát mỏng (Ovary slicing). Cắt buồng trứng thành lát mỏng sẽ
cho số lượng trứng chưa thụ tinh nhiều hơn các phương pháp khác (Pawshe,
1994). Tuy vậy, các trứng chưa thụ tinh này thường không đồng nhất và rất khó
phát triển thành trứng chín, tỷ lệ thụ tinh của chúng cũng thấp (quãng 18,18%),
trong khi đó, tỷ lệ này ở phương pháp mổ nang trứng là 29,07%. Số lượng trứng
Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản

21

thu được có khác nhau là do khác nhau về cá thể, phương pháp và mùa vụ thu
hoạch. Nếu dùng phẫu thuật, một năm 1 bò có thể cho 100 trứng/buồng trứng
(Kruip, 1991). Nếu dùng cách hút, chỉ thu được 2,4-3,0 trứng/lần, (Lenergan,
1991). Bằng phương pháp cắt lát buồng trứng thu được từ lò mổ, chúng tôi thu
được 10-30 trứng/2 buồng trứng của gia súc.
Cách đánh giá phân loại trứng chưa thụ tinh (lấy từ buồng trứng): theo sự
hiện diện hoặc độ dầy, mỏng của tế bào cumullus (Cumullus cell).
Loại A: trứng có tế bào Cumullus bao vây hoàn toàn.
Loại B: trứng có tế bào Cumullus bao vây một phần loại B : chỉ có 1 đám rất
mỏng: tế bào Cumullus hoặc chỉ còn lại dấu vết của lớp tế bào này).
Loại C: trứng không có tế bào Cumullus bao quanh mà bao bọc chúng là các
sợi tơ huyết (fibrin).
Thường chỉ dùng trứng loại A và B để nuôi cấy và IVF. Tất nhiên việc thu
nhận buồng trứng từ lò mổ hoặc lấy trứng từ buồng trứng (bằng kỹ thuật phẫu
thuật hoặc nội soi) phải theo quy trình tương ứng với các môi trường nuôi cấy
nhất định.
b. Nuôi trứng chín (In vitro Maturation)
Sau khi thu thập, trứng được đánh giá phân loại theo mức độ tốt xấu. Trứng
đạt tiêu chuẩn sẽ được đưa vào môi trường nuôi cấy trứng chín. Sự chín của
trứng chưa thụ tinh có nghĩa là sự thay đổi hình thái học, sinh hoá học ở tế bào
chất, ở nhân tế bào và các bộ phận khác của tế bào để các trứng này có khả năng
thụ tinh và sau đó, sẽ phát triển thành phôi, thành cơ thể. Thời gian thành thục
và chín của trứng chưa thụ tinh thường từ 18-28h.
c. Cho trứng thụ tinh với tinh trùng (In vitro Fertilisation)
Để tiến hành quá trình thụ tinh (cho trứng gặp tinh trùng), người ta đưa tinh
trùng đã được hoạt hoá vào môi trường thụ tinh đã có trứng nuôi cấy chín. Giọt
môi trường thụ tinh đã để sãn trong hộp lồng. Sau khi đưa tinh trùng vào môi
trường nuôi trứng nói trên, chuyển hộp lồng vào tủ ấm nuôi cấy có 5% C0

2
,
nhiệt độ 38-38,5
0
C và độ ẩm 80%. Thời gian đảm bảo cho quá trình thụ tinh 4-
6h (thường là 5h). Tỷ lệ thụ tinh của trứng phụ thuộc vào khả năng hoạt hoá
(capitation) của tinh trùng và độ chín của trứng. ở chuột nhắt, tỷ lệ thụ tinh có
Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản

22

thể đạt 80% với sự có mặt của 2 tiền nhân (Maudlin và Faraser, 1987). Tỷ lệ thụ
tinh của các vật nuôi khác thì thấp hơn. Có thể nâng cao tỷ lệ thụ tinh bằng cách
sử dụng hoạt chất cafein và heparin trong quá trình hoạt hoá tinh trùng.
Tinh trùng dùng cho IVF: tinh trùng tươi dạng lỏng hoặc tinh trùng đông
lạnh. Đối với trứng: thường là trứng mới lấy từ lò mổ hoặc từ phẫu thuật nội soi
sẽ cho kết quả cao hơn trứng đã được đông lạnh. Michaelis Rubin và Halin
(1984) đã thí nghiệm trên trứng đông lạnh của chuột nhắt đạt được 60%, còn
trứng không đông lạnh đạt 72%. Kielm, 1987 đã thí nghiệm trên trứng đông lạnh
của chuột cống, tỷ lệ thụ tinh đạt 70%. Theo Daniel và Tuneja 1987, có thể lấy
trứng chưa thụ tinh từ buồng trứng được đông lạnh để IVF.
Số lượng tinh trùng cần thiết khi IVF: thường từ 5 đến 100 x 10
5
/ml. Trên
thực tế, số lượng này là 50 x 10
5
/ml sẽ cho kết quả tốt hơn về tỷ lệ thụ tinh và
phát triển thành phôi (Shioya, 1993).
Ngày nay, bằng kỹ thuật vi tiêm, người ta tiêm thẳng tinh trùng vào buồng
trứng. Bằng cách này chỉ cần tiêm 1 tinh trùng cho 1 trứng.

d. Nuôi trứng đã thụ tinh phát triển thành phôi (In vitro culture)
Trứng đã thụ tinh được chuyển sang các môi trường nuôi cấy (thường dùng
môi trường TCM199 có bổ sung huyết thanh bò). Trong môi trường nuôi cấy,
các tế bào Cumulus và các tế bào ống dẫn trứng có ảnh hưởng tích cực đến quá
trình phát triển của phôi. (Seidel và cs, 190; Shioya và cs., 1993).




3.2.2.3. Kỹ thuật IVF[2,9]
a. Thu nhận trứng và nuôi trứng chín
- Buồng trứng được thu nhận từ các lò mổ, đặt trong nước sinh lý ấm (25-30
0
C)
có bổ sung 100 UI penicillin và 100 mg streptomycin/ml. Sau đó được chuyển
về phòng thí nghiệm trong vòng 2-3h.
Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản

23

- Dùng xơranh với kim 18G hút các tế bào trứng từ các nang trứng nhỏ kích
thước 2mm.
- Dung dịch hút được đưa vào môi trường PBS có bổ sung huyết thanh bò đực
giống .v.v. . . và kháng sinh.
- Soi trứng, đánh giá phân loại trứng thu được qua kính hiển vi soi nổi. Căn cứ
vào vùng tế bào Cumulus để đánh giá chất lượng trứng.
- Chuyển các tế bào trứng đảm bảo chất lượng sang môi trường nuôi trứng chín.
Trứng được đưa vào tủ ấm ở 38-39
0
C, với hỗn hợp không khí: 5% C0

2
, 95%
không khí thường, thời gian để trứng phát triển thành thục và chín kéo dài 20-
30h.
b. Chuẩn bị tinh dịch để thụ tinh
- Giải đông 1-2 cọng rạ tinh dịch ở nhiệt độ 35-37
0
C, hoặc dùng tinh tươi.
- Trộn với 6ml dung dịch rửa tinh dịch trong ống ly tâm sau đó ly tâm với vận
tốc 1800 vòng/phút trong 5 phút.
- Hút dịch ở trên đầu ống bằng pipet vô trùng.
- Cho thêm 0,5-0,8 ml dung dịch rửa tinh dịch để trầm tích và đo lường thể tích.
Thể tích ban đầu vào khoảng 0,6-0,8 ml.
- Kiểm tra sức kháng của tinh trùng bằng nước muối sinh lý và xác định nồng độ
tinh trùng bằng buồng đếm hồng cầu Newbauer.
Điều chỉnh nồng độ tinh trùng đạt 25x10
6
/ml bằng cách cho thêm vào dung
dịch rửa tinh dịch (pha loãng lần 1) sau đó điều chỉnh nồng độ tinh trùng đạt
12x10
6
/ml bằng cách tiếp tục cho thêm vào dung dịch rửa tinh dịch (pha loãng
lần 2).
- Xác định liều lượng thụ tinh, chuẩn bị 4 giọt (100 ml) trong đĩa hộp lồng
đường kính 35 mm, phủ bằng dầu vi lượng (mineral oil) và giữ ở trong tủ ấm.
c. Thụ tinh
- Chuẩn bị 2 đĩa hộp lồng ( 35 mm) với dung dịch rửa trứng chưa thụ tinh được
phủ dầu vi lượng.
- Chuyển 20-25 trứng chưa thụ tinh đến các giọt tinh trùng đã chuẩn bị sãn.
Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản

24

- Đưa vào tủ ấm trong khoảng 5-6h.
d. Thu hồi và nuôi cấy trứng đã thụ tinh
- Thu trứng đã thụ tinh từ các giọt chứa tinh trùng (giọt môi trường thụ tinh).
-Rửa trứng đã thụ tinh 3 lần trong môi trường nuôi trứng chín(TCM-199) đã
chuẩn bị sãn.
Đặt đĩa đã có trứng thụ tinh vào tủ ấm có nhiệt độ 38
0
C với 5% C0
2
trong 48h.
e. Nuôi cấy và kiểm tra trứng đã thụ tinh
- Sau khi đã thụ tinh, trứng được tiếp tục nuôi trong môi trường TCM-199 - 1
giọt 5% FCS với nhiệt độ 38
0
5 và 5% khí C0
2
.
- Trong ngày thứ nhất, động nhẹ tay (gõ) lên đĩa hộp lồng để tác động làm rời bỏ
các tế bào cumulus bao quanh noãn.
- Cứ 48h kiểm tra sự phát triển của phôi 1 lần.
- Từ ngày thứ 7 đến ngày thứ 10 quan sát sự phát triển của túi phôi.
- Đánh giá sự phát triển của phôi qua các mức độ: 2-4 tế bào, >4 tế bào (phôi
dâu, phôi nang) và phôi thoái hoá.
-Từ sau ngày thứ 7, kiểm tra phôi ngày 1 lần, phôi ở độ tuổi này trở đi hoặc đem
cấy chuyển ngay hoặc đem đông lạnh và cấy sau này.
3.2.2.4. Các môi trường dùng cho IVF
a. Dung dịch đệm Dulbeccos – PBS

STT

Thành phần Công thức g
1 Sodium chloride NaCl 8,00
2 Potasium chloride

KCl 0,20
3 Sodium
dihydrogen
Orthophosphate
NaH
2
P0
4
.2H
2
0 1,15
Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản

25

4 Disodium
hydrogen
Orthophosphate
Na
2
HP0
4
.2H
2

0 0,20
5 Glucose C
6
H
12
0
6
1,00
6 Sodium pyruvate 0,036
7 Calcium chloride CaCl
2
.2H
2
0 0,132
8 Magnesium
sulphate
MgS0
4
.7H
2
0 0,121
9 Lyopholized -
BSA
0,400
10
Penicilin G.
Sodium
**
11 Streptomicin
sulphate

0,05
12 Nước c
ất 2 lần
vừa đủ
***
Chú thích:
* Lọc thanh trùng bằng màng vi lọc 0,2 - 0,4 m
** 100UI/ml
***1000ml
b. Môi trường cơ sở BO (Bracket and Oliphant)